JP2004508364A - 酸感受性化合物、該化合物の製造および使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも親水性置換基および酸感受性である環状オルトエステルを有する新規な酸感受性化合物、ならびにそれらの塩に関する。その化合物は、生物活性物質を取り込んだ粒子を安定化し、次にそれらを酸性媒体中で不安定化するノニオン系界面活性剤として、あるいは治療性分子に共有結合的に結合していることで、その治療性分子をpHが酸性である細胞組織または区画で放出するベクターとして、生物活性物質と結合体(リポソーム、複合体、ナノ粒子)を形成する上で、そしてそれらをpHが酸性である細胞組織または区画で放出する上で有用である。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、酸感受性化合物およびその化合物の製造に関する。これらの化合物は、少なくとも1個の親水性置換基および酸感受性である環状オルトエステルを有する。これらの化合物は、生物活性物質と結合体(リポソーム、複合体、ナノ粒子など)を形成し、それらをpHが酸性である細胞組織または区画に放出するのに有用であるか、あるいは生物活性物質を包み込んだ粒子を安定化し、それを酸性媒体中で不安定化するためのノニオン系界面活性剤として有用であるか、あるいは治療性分子に共有結合的に結合して、それをpHが酸性である細胞組織または区画に放出するベクターとして有用である。
【0002】
(背景技術)
生理的に正常のものと比較して酸性度の高い組織または細胞への生物活性物質の放出は、多くの研究が取り挙げている既知の問題であって、現在のところ、結果的に完全に満足な結果が得られていない。そこで、多くのpH感受性リポソームを設計して、ある種の組織またはエンドソームの酸性化を利用することで生物活性物質を放出することが行われている。
【0003】
例えばヤトビンら(Yatvin et al., Science, Vol. 210, 1980, pp.1253−4)は、下記式の従来のリポソームの脂質二重層内に挿入され得るpH感受性脂質を設計している。
【0004】
【化5】
この脂質に存在するホモシステインは、中性またはアルカリ性のpHでは開環型であり、その場合には、リポソームの二重層内に完全に挿入される脂肪酸に似ている。酸性のpHでは、それは閉環型で存在する。それは次に、環状チオラクトンを形成することで、リポソーム二重層を不安定化することで活性物質の放出を可能とする中性脂質に似ている。そのような分子は、pHが生理的pHより低い身体領域、例えば原発腫瘍、転移または炎症部位および感染部位における医薬分子の放出を可能とするものである。
【0005】
米国特許第5965434号には、下記式のカチオン性pH感受性親水性部分を有する両親媒性脂質が提案されている。
【0006】
【化6】
式中、R1およびR2は互いに独立に、CH3(CH2)14、CH3(CH2)12、CH3(CH2)7CHCH(CH2)7を表し;R3は、置換基1−メチルイミダゾール、イミダゾール、4,9−ジオキソ−1,12−ドデカンジアミン、システアミン、1−(3−アミノプロピル)イミダゾール、モルホリン、4−アミノピリジン、ピリジン、グアニジン、ヒドラジン、チオウロニウムまたはピペラジンを表す。
【0007】
これらの化合物は、pHが8.0から4.5に低下すると増加する全体的な正電荷(化合物R3のレベルで)を有するという特徴的特性を有する。この電荷調節はリポソームの立体配座的変形を誘発することで、リポソームにその内容物を放出させる。そこでこれらの脂質は、pHが4.5以下で変動する酸性媒体中に医薬分子または核酸分子を放出させる。
【0008】
さらに、特許出願WO 97/31624には、細胞質で分解し得るビニルエーテル官能基を有し、下記一般式の構造を有するpH感受性リン脂質(「誘発性(triggerable)脂質)が提案されている。
【0009】
【化7】
式中、pおよびqは0または1であり;これら二つのうちの少なくとも一つは1であり;R1およびR2は互いに独立に、炭素原子数12〜24のアルキルまたはアルケンを表し;Rは2−アミノエチル、2−(トリメチルアミノ)エチル、2−(N,N−ジメチルアミノ)エチル、2−(トリメチル−アンモニウム)エチル、2−カルボキシ−2−アミノエチル、スクシンアミド−エチルまたはイノシチルから選択される基を表す。
【0010】
これらのリン脂質を、それ自体が細胞受容体リガンドと複合体を形成する他のリン脂質と混合して、酸性pHで立体配座変化を受けることができるリポソームを形成する。そのようなリポソームによって、多くの医薬物質の包み込み、そしてさらには遺伝子療法用の核酸の包み込みを行うことができる。
【0011】
別の手法も報告されており(Kratz et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1999, 16(3), pp.245−88)、そこでは、治療性分子を酸感受性結合を介してポリマーに共有結合的に結合させて、前記治療性分子を、弱酸性の腫瘍組織あるいは高分子結合体の細胞取り込み後のエンドソームおよびリソソームに放出させる。そうして、多くの可能な結合が報告されており、例えばアセタール、ジスルフィド、ヒドラゾン、シス−アコニトリル(cis−aconitrile)、トリチルまたはシリル化エーテル結合などがある。
【0012】
しかしながら、今日までに開発されたいずれのpH感受性化合物も、その感受性に関して調節できないという欠点を有する。従って、標的の組織もしくは細胞、放出される生物活性物質または想到される用途などに応じて感受性を調節可能な酸不安定性化合物を持つことができることは、非常に有利であるものと考えられる。より一般的には、製造が容易であって、特に核酸のトランスフェクションにおいて有効な新たなpH感受性化合物を持つことも有利であると考えられる。
【0013】
(発明の開示)
この問題を解決するため、本出願人は、環状オルトエステルならびにポリアルキレングリコール類、単糖類もしくは多糖類、親水性治療性分子またはポリアミン型の基から選択される少なくとも一つの親水性置換基を有することを特徴とする新規な種類の酸感受性化合物を開発した。
【0014】
そのような化合物は、酸感受性である環状オルトエステル官能基によって、身体の酸性領域への生物活性物質の指向(vectorization)および放出において有用である。それらは、中心の炭素上に存在する置換基およびオルトエステル環の大きさの選択に応じて化合物のpH感受性を調節可能であることにより、特に有利である。従って、その化合物の加水分解の動力学を広い範囲で変動させることが可能であり、従って生物活性物質の放出に要する時間を調節することが可能である。さらに、本発明による酸感受性化合物は、自己触媒的に酸性媒体中で分解するようになるという別の長所を有する。実際に、本発明による酸感受性化合物の部分分解によって、pH低下を誘発する酸(例えば、原料化合物がオルトギ酸エステル由来の場合にはギ酸、あるいは原料化合物がオルト酢酸エステル由来である場合には酢酸、あるいは原料化合物がオルト安息香酸エステル由来である場合には安息香酸)が徐々に放出され、その分解がさらに促進される。
【0015】
より詳細には、本発明による酸感受性化合物は、下記式の構造を有する。
【0016】
【化8】
式中、
・gは0、1、2、3または4の値を取り得る整数であり;
・Gは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数1〜6のアルキル基、またはアリール基を表し;
・G1およびG2は、
(a)一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(b)一方が炭素原子数10〜24であって、1以上の不飽和を有していても良い疎水性直鎖アルキル基を表し;他方が下記一般式の基:
【0017】
【化9】
(式中、iは1〜4(両端を含む)から選択される整数であり;jは9〜23(両端を含む)から選択される整数であり;親水性置換基は、ポリアミン型の基から選択される)を表し;あるいは
(c)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が、ポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表し;あるいは
(d)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体、疎水性デンドリマー、あるいは単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体もしくは疎水性デンドリマーとモノマー単位1〜20個を有するポリアルキレングリコール分子との間の共有結合結合体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(e)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が治療性分子を表し;あるいは
(f)一方が親水性の治療性分子を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表す。
【0018】
オルトエステルの中心炭素上にある置換基Gを選択して、本発明による酸感受性化合物の感受性を調節する。そこで、基Gの電子供与性が高いほど化合物の酸感受性が高く、基Gの電子吸引性が高いほど化合物の酸感受性は低い。従って、基Gの選択が一般式(I)の酸感受性化合物の特性を決定および調節する上で特に重要であるように思われる。本発明の好ましい態様によればGは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形での炭素原子数1〜6のアルキル基あるいはアリール基から選択される。さらに有利な形では、Gは水素、メチル、エチルまたはフェニルから選択される。
【0019】
(発明を実施するための最良の形態)
本発明に関して、「アリール基」という表現は、1価の芳香族炭化水素基を意味するものである。本発明におけるアリール基は、一般に6〜14個の炭素原子を有する。好ましくは本発明におけるアリール基は、フェニル、ナフチル(例えば1−ナフチルもしくは2−ナフチル)、ビフェニリル(例えば2−ビフェニリル、3−ビフェニリルまたは4−ビフェニリル)、アントリルまたはフルオレニルから選択される。フェニルが特に好ましい。アリール基、特にフェニルは置換されていても良く、例えばモノ置換、ジ置換、トリ置換またはテトラ置換されており、それらの置換基は同一でも異なっていても良い。好ましくはその置換基は、ハロゲン原子、(C1〜C8)アルキル基または(C1〜C8)アルコキシ基から選択される。モノ置換フェニル基の場合、前記置換基は2位、3位または4位に置換されていても良い。ジ置換フェニル基の場合、前記置換基は2,3位、2,4位、2,5位、2,6位、3,4位または3,5位にあることができる。トリ置換フェニル基の場合、その置換基は、例えば2,3,4位、2,3,5位、2,4,5位、2,4,6位、2,3,6位または3,4,5位にあることができる。
【0020】
場合に応じて、置換基G1およびG2のそれぞれは、環状オルトエステルに直接結合しているか、あるいは当業者には公知であるものから選択される「スペーサー」分子を介して間接的に連結されている。そのような「スペーサー」分子によって、結合を形成するだけでなく、対象の置換基を環状オルトエステルから離れさせて、酸感受性環状オルトエステルとそれの置換基との間の望ましくない相互作用を低減することもできる。好ましいスペーサー分子は、例えばアルキル類(炭素原子数1〜6)、カルボニル、エステル、エーテル、アミド、カーバメートもしくはチオカーバメート結合、グリセリン、尿素、チオ尿素またはそれらの基のいくつかの組み合わせから、置換基G1またはG2の性質に応じて選択することができる。例えば、疎水性置換基がステロイド誘導体の場合、スペーサー分子はカーバメート−N−C(O)−O−型の結合であることができるか、あるいは疎水性置換基が二重鎖アルキルの場合、スペーサー分子は式−アルキル−C(O)−Nの基から選択することができ、その場合2個のアルキル鎖が窒素原子に固定されている。
【0021】
本発明の好ましい態様によれば、ポリアミン型の基とは、少なくとも3個の炭素原子を有し、少なくとも1個のメチレン基がアミノ基で置き換わっていても良く、そのアミノ基は置換されていても良く(例えばメチル基で)、末端メチルが(1級、2級、3級または4級)アミン類、グアニジン類または環状グアニジン類から選択される1以上の基で置換されている直鎖または分岐のアルキルであると定義することができる。これらのポリアミン型の基は好ましくは、すでに公知であって、核酸の指向について文献に、例えば公開WO96/17823、WO97/18185、WO98/54130またはWO99/51581に記載のポリアミン基から選択される。詳細には、それには例えば、下記一般式のポリアミン類などがあり得る。
【0022】
【化10】
式中、
−Rは、非存在であることから環状オルトエステルとの共有結合を表すただ1個のR基を除いて水素原子であり;
−nは1〜9(両端を含む)の整数であり;
−mは2〜6(両端を含む)の整数であり、mの値は異なる−(CH)m−NH−基内で同一でも異なっていても良い。
【0023】
別の態様によれば、それはまた、下記一般式のポリアミン型の基を含むことができる。
【0024】
【化11】
式中、
−R1、R2およびR3は互いに独立に、水素原子または基−(CH2)q−NRR=を表し、qは1、2、3、4、5および6の間で変動することができ、それは、異なる基R1、R2およびR3間で独立であり;RおよびR=は互いに独立に、水素原子または−(CH2)q=−NH2を表し、q=は1、2、3、4、5および6の間で変動することができ、それは異なる基RおよびR=の間で独立であり;
−mおよびpは互いに独立に、1〜6の間で変動し得る整数を表し;
−nは、0〜6の間で変動し得る整数を表し;nが1より大きい場合、mは異なる値を取ることができ、R3は前記一般式において異なる意味を有し、nが0である場合、R1およびR2のうちの少なくとも一方は水素とは異なる。
【0025】
本発明の別の態様によれば、ポリアミン型の基は、前記のものと同一の一般式を有する置換基であって、RおよびR=が互いに独立に、水素原子または下記式(1)の基を表すもので表すことができる。
【0026】
【化12】
上記式中、rは0〜6(両端を含む)で変動し得る整数であり;基R5は互いに独立に、水素原子、アルキル、カーバメートまたは脂肪族もしくは芳香族アシル置換基を表し;その置換基はハロゲン化されていても良く;基R1、R2およびR3のうちの少なくとも一つが少なくとも1個の式(1)の基を有するものである。
【0027】
そこで、1以上の末端グアニジン官能基を有するポリアミン型の基が得られる。
【0028】
本発明の別の態様によれば、ポリアミン型の基はまた、上記したようなポリアミンであって、下記式(2)の環状グアニジン型の末端基(アミンやグアニジンに代えて)を有するものも表すことができる。
【0029】
【化13】
式中、
・mおよびnは互いに独立に、0〜3(両端を含む)の整数であって、m+nは1以上となるものであり;
・R1は、下記式(3)の基を表し
【0030】
【化14】
上記式中、pおよびqは互いに独立に、0〜10(両端を含む)の整数であり;Yはカルボニル、アミノ、メチルアミノまたはメチレン基を表し;Yは異なる[(CH2)p−Y]基で異なる意味を有することができ;(*)は、水素原子または共有結合を表し;R1はZを含む一般式(2)のいずれの原子にも連結されていることができること、また式(2)には1個の基R1があること;
・Xは基NR2またはCHR2を表し;R2は水素原子または上記で定義の基R1との結合であり;
・基
【0031】
【化15】
は、次のものを表す。
*第1の場合
下記一般式(4)の基:
【0032】
【化16】
[式中、W=はCHR===またはNR===を表し;R==およびR===は互いに独立に、水素原子、メチルまたは上記で定義の基R1との結合である]または
*第2の場合
下記一般式(5)の基:
【0033】
【化17】
[式中、W=はCHR===またはNR===を表し;R=およびR===は互いに独立に、水素原子、メチルまたは上記で定義の基R1との結合である]
を表す。
【0034】
一般には、特に静電相互作用による核酸との結合について当業者には公知の任意のポリアミン型の他の基も好適であり得る。
【0035】
本発明に関して、単鎖または二重鎖アルキルとは、炭素原子数10〜24であって、1以上の不飽和を有していても良い1個または2個の直鎖アルキル鎖からなる疎水性基を表す。二重鎖アルキルの場合、それは例えば、窒素原子に結合していることで、ジアルキルアミノ置換基を形成している2個のアルキル鎖を含むことができ、その2個のアルキル鎖は例えば、直鎖であって、炭素原子数10〜24であり、1以上の不飽和を有していても良い。それは例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸またはミリスチン酸などの飽和または不飽和脂肪酸などであり得る。好ましくは、単鎖または二重鎖アルキルは炭素原子12〜18個を有しており、さらに好ましくはそれは、炭素原子12個、14個、16個または18個(各アルキル鎖について)を有する基から選択される。
【0036】
本発明に関して「ステロイド誘導体」とは、例えばステロール類、ステロイド類およびステロイドホルモン類から選択される置換基を意味する。より好ましくはステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、3−α−5−シクロ−5−α−コレスタン−6β−オール、コール酸、ギ酸コレステリル、ギ酸コレスタニル、ギ酸3α,5−シクロ−5α−コレスタン−6β−イル、コレステリルアミン、6−(1,5−ジメチルヘキシル)−3a,5a−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ−[a]シクロプロパ[2,3]シクロペンタ[1,2−f]ナフタレン−10−イル−アミン、コレスタニルアミンまたはデキサメタゾンから選択される。
【0037】
本発明における疎水性デンドリマーは好ましくは、疎水性ポリ(アルキルエーテル)類または疎水性ポリ(アリールエーテル)類から選択される。特に有利な形態では、本発明における疎水性デンドリマーは、ポリ(ベンジルエーテル)類から選択される。
【0038】
本発明に関して、ポリアルキレングリコール類は好ましくは、平均分子量102〜105ダルトン(Da)を有し、標的指向要素に共有結合的に連結していても良いポリアルキレングリコール類から選択される。特に有利な形態では、本発明におけるポリアルキレングリコール類は、平均分子量102〜105Da、より好ましくは500〜105Daを有するポリエチレングリコール類(PEG)から選択される。
【0039】
本発明に関して、「単糖類または多糖類」とは、標的指向要素に共有結合的に連結していても良い1以上の糖からなる分子を意味する。例として、ピラノース類およびフラノース類を挙げることができ、例えばグルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトースまたはマルトース、乳糖、サッカロース、ショ糖、フコース、セロビオース、アロース、ラミナロビオース(laminarobiose)、ゲンチオビオース、ソホロース、メリビオースなどがある。さらにそれは、いわゆる「複合」糖を含むこともできる。すなわち互いに共有結合的に結合しているいくつかの糖であり、各糖は好ましくは上記で挙げたものから選択される。好適な多糖類としては、デキストラン類、α−アミロース、アミロペクチン、フルクタン類、マンナン類、キシラン類およびアラビナン類があり得る。好ましくは本発明における単糖類または多糖類は、天然糖類、シクロデキストリン類またはデキストラン類などの薬理用途に適合する天然または商業的誘導体から選択される。
【0040】
本発明の別の形態によれば、ポリアルキレングリコールまたは単糖類もしくは多糖類は、標的指向要素に共有結合的に連結されていても良い。その場合それには、本発明による酸感受性化合物またはそれを含む組成物を、ある細胞種またはある所望の組織(腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞など)に向かわせることができる細胞外標的指向要素を含むことができるか、あるいはある種の好ましい細胞区画(ミトコンドリア、核など)に指向させることができる細胞内標的指向要素を含むことができる。
【0041】
本発明の文脈で使用することができる標的指向要素の中で言及できるものとしては、糖類、ペプチド類、蛋白類、オリゴヌクレオチド類、脂質類、神経伝達物質、ホルモン類、ビタミン類またはそれらの誘導体がある。好ましくはそれには、糖類、ペプチド類、ビタミン類または蛋白類があり、例えば抗体もしくは抗体断片、細胞受容体のリガンドもしくはそれの断片、受容体または受容体断片などがある。例えばそれには、成長因子受容体のリガンド、サイトカイン受容体、細胞レクチン型の受容体、葉酸受容体またはインテグリン類などの接着蛋白の受容体に対して親和性を有する配列RGDを持つリガンドなどがあり得る。トランスフェリン、HDL類およびLDL類または葉酸輸送体の受容体も挙げることができる。標的指向要素はまた、アシアロ糖蛋白の受容体またはシアリルルイスXのようなシアライド(syalydes)の受容体のようなレシチン類、あるいは抗体Fab断片、または単鎖抗体(ScFv)を指向させることが可能な糖であることもできる。
【0042】
本発明に関して、「ポリアルキレンイミン類」とは、公開WO 96/02655に記載のポリマー、すなわち下記一般式のモノマー単位を有するポリマーを表す。
【0043】
【化18】
式中、
Rは水素原子または下記式の基であることができ;
【0044】
【化19】
nは2〜10の整数であり;pおよびqは、合計p+qがポリマーの平均分子量が100〜107Daとなるように選択される整数である。
【0045】
この式では、nの値は異なる−NR−(CH2)n−単位間で変動し得る。そこで、この式は単独重合体とヘテロ重合体の両方を包含するものである。市販のポリアルキレンイミン類が有利な選択肢である。ポリエチレンイミン類(PEI)が最も好ましく、より具体的にはPEI25K(平均分子量25KDaのPEI)、PEI50K、PEI100KまたはPEI200Kである。
【0046】
本発明において、「治療性分子」とは、生理的に正常なものと比較して酸性度の高い身体領域で発現する病気を予防または治療することを可能とする分子を意味する。そのような領域はより具体的には、
−腫瘍、詳細には生理的に正常なものより高い局所酸性度を示す腫瘍細胞およびその腫瘍細胞付近の正常細胞(例えば、腫瘍の内皮細胞)(N. Raghunand et al., Drug Resistance Updates, 2000, 3, pp.30−38);
−虚血の影響を受けた筋肉、例えば部分的に糖型の炭化水素または脂肪酸の嫌気性発酵によって産生される乳酸のために酸性症が生じている心筋;
−大食細胞による超酸化物イオンの産生が多量の酸素を消費する炎症領域;あるいは
−代謝、感染または炎症障害が局所酸性症を生じている組織
であるが、これらに限定されるものではない。
【0047】
別の形態によれば、本発明における「治療性分子」は、酸性の細胞区画、例えば酸性である細胞のエンドソームへのそれの放出によって、病気を予防または治療することができる。
【0048】
そこで治療性分子は、例えばペプチド類、オリゴペプチド類、蛋白類、抗原類およびそれの抗体類、酵素類およびそれの阻害剤類、ホルモン、抗生物質、鎮痛薬、気管支拡張薬、抗微生物薬、抗高血圧薬、心血管薬、中枢神経系に作用する薬剤、抗ヒスタミン薬、抗鬱薬、精神安定薬、抗痙攣薬、抗炎症物質、刺激薬、鎮吐薬、利尿薬、鎮痙薬、抗虚血薬、細胞死を制限する薬剤または抗癌剤から選択することができる。
【0049】
さらに、「生物活性物質」とは、上記の治療性分子または核酸から選択される物質を意味する。
【0050】
本発明に関して「核酸」とは、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を意味する。これは、天然または合成の配列を含むことができ、詳細にはゲノムDNA(gDNA)、相補DNA(cDNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、ハイブリッド配列または合成もしくは半合成配列、修飾を受けたもしくは受けていないオリゴヌクレオチドがある。これらの核酸は、例えばヒト、動物、植物、細菌、ウィルスまたは合成由来のものであることができる。これらは当業者には公知の方法によって得ることができ、詳細にはライブラリーのスクリーニング、化学合成あるいはライブラリーのスクリーニングによって得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む組み合わせ方法によって得ることができる。それは化学的に修飾することができる。
【0051】
より詳細にデオキシリボ核酸については、1本鎖または2本鎖、さらには短いオリゴヌクレオチドまたは相対的に長い配列であることができる。詳細には、核酸は有利には、例えばプラスミド、ベクター、エピソームまたは発現カセットからなる。これらのデオキシリボ核酸は詳細には、標的細胞、1以上のマーカー遺伝子、転写もしくは複製の調節に関する配列、治療対象の遺伝子、修飾を受けていてもよいアンチセンス配列あるいは他の細胞要素に結合する領域で機能性を発揮することもある複製起点を有することができる。
【0052】
好ましくは核酸は、標的細胞で活性である1以上のプロモーターおよび転写ターミネーターの制御下にある治療対象の1以上の遺伝子からなる発現カセットを有する。
【0053】
本発明に関して、「該当遺伝子の発現カセット」とは、特定の制限部位でベクターに挿入することができるDNA断片を意味する。そのDNA断片は、RNAまたは対象の核ペプチドをコードする核酸配列を有し、さらに、その配列の発現に必要な配列(活性化、プロモーター、ポリアデニル化配列など)を有する。このカセットおよび制限部位は、転写および翻訳の適切な読取枠への発現カセットの挿入を行うように設計されている。
【0054】
それには、1以上の治療該当遺伝子を有するプラスミドまたはエピゾームが含まれる。例を挙げると、特許出願WO96/26270およびWO97/10343(参照によって本明細書に組み込まれる)に記載のプラスミドがある。
【0055】
本発明に関して治療該当遺伝子とは、特に、治療効果を有する蛋白産生物をコードする遺伝子を意味する。そのようにコードされた蛋白産生物は特に、蛋白またはペプチドであることができる。この蛋白産生物は、標的細胞に対して外因性、相同性または内因性であることができる。すなわち、標的細胞が病気を示さない場合に標的細胞で正常に発現される産生物である。その場合、蛋白の発現によって、例えば細胞での不十分な発現または修飾のために不活性であるか活性の弱い蛋白の発現を補償したり、あるいはその蛋白を過剰発現することが可能となる。治療該当遺伝子は、例えば高い安定性または変化した活性を有する細胞蛋白の突然変異体をコードすることもできる。蛋白産生物は、標的細胞に関して異種であることもできる。その場合、発現蛋白は例えば、細胞において欠乏している活性を補給または提供することで、病気と戦うことができるようにしたり、あるいは免疫応答を刺激することができる。
【0056】
本発明に関する治療性産生物の中では、より詳細には、酵素、血液誘導体、ホルモン類、リンフォカイン類、インターロイキン類、インターフェロン類またはTNF(例:FR92/03120)、成長因子、神経伝達物質またはそれらの前駆体もしくは合成酵素、栄養因子(例:BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5またはHARP/プレイオトロフィン(pleiotrophin))、アポリポ蛋白(例:ApoAI、ApoAIVまたはApoE:FR93/05125)、ジストロフィン(dystrophin)またはミニジストロフィン(minidystrophin)(FR91/11947)、嚢胞性線維症関連蛋白CFTR、腫瘍抑制遺伝子(例:p53、Rb、Rap1A、DCCまたはk−rev:FR93/04745)、凝血に関与する因子をコードする遺伝子(因子VII、VIII、IX)、DNA修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子(チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ)、ヘモグロビンその他の蛋白キャリアの遺伝子、代謝酵素、分解酵素などを挙げることができる。
【0057】
治療該当核酸はまた、標的細胞での発現によって遺伝子の発現または細胞性mRNAの転写を制御することが可能となる遺伝子またはアンチセンス配列であることもできる。そのような配列は例えば、特許EP140308に記載の方法に従って、細胞性mRNAに対して相補的であることから、蛋白へのそれの翻訳を遮断するRNAに標的細胞で転写することができる。その治療性遺伝子はまた、選択的に標的RNAを破壊することができるリボザイムをコードする配列を有する(EP321201)。
【0058】
上記のようにその核酸は、ヒトまたは動物において免疫応答を生じることができる抗原ペプチドをコードする1以上の遺伝子を有することもできる。その特定の実施形態では、本発明によって、特に微生物、ウィルスまたは癌に対してヒトまたは動物に施されるワクチンまたは免疫療法治療薬の生産を行うことができる。それには特に、エプスタイン−バールウイルス、HIVウィルス、B型肝炎ウィルス(EP185573)、仮性狂犬病ウイルス、シンシチア(syncitia)形成ウィルス、他のウィルスに対して特異的な抗原ペプチドまたは腫瘍に対して特異的な抗原ペプチド(EP259212)などがあり得る。
【0059】
好ましくは核酸は、所望の細胞または臓器で、治療該当遺伝子および/または抗原ペプチドをコードする遺伝子の発現を行うことができる配列も有する。それには、自然において感染細胞でその配列が機能することができる場合に考えられる遺伝子の発現に関与する配列などがあり得る。それにはまた、異なる起源の配列もあり得る(他の蛋白の発現に関与するもの、あるいは合成のもの)。詳細にはそれには、真核生物遺伝子またはウィルス遺伝子のプロモーター配列などがあり得る。例えばそれには、感染することが望ましい細胞のゲノム由来のプロモーター配列などがあり得る。同様にそれには、ウィルスのゲノム由来のプロモーター配列などがあり得る。その点に関しては例えば、E1A、MLP、CMVおよびRSV遺伝子などのプロモーターを挙げることができる。さらに、これらの発現配列は、活性化配列または調節配列などの付加によって修飾することができる。それにはさらに、誘導性または抑制性のプロモーターなどもあり得る。
【0060】
さらに前記核酸は、特に該当の治療遺伝子の上流で、標的細胞の分泌経路で合成される治療性産生物を指向するシグナル配列を有することもできる。このシグナル配列は、治療性産生物の天然シグナル配列であることができるが、他の機能性シグナル配列または合成シグナル配列であることもできる。前記核酸は、合成される治療性産生物を、細胞の特定の区画に指向させるシグナル配列を有することもできる。
【0061】
本発明の好ましい態様によれば、酸感受性化合物はより具体的には、下記一般式の化合物から選択される。
【0062】
【化20】
式中、
・gは0または1である整数であり;
・Gは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数1〜6のアルキル置換基、またはアリールを表し;
・G1およびG2は、
(a)一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(b)一方が炭素原子数10〜24であって、1以上の不飽和を有していても良い疎水性直鎖アルキル基を表し;他方が下記一般式の基:
【0063】
【化21】
(式中、iは1〜4の範囲の整数であり;jは9〜23の範囲の整数であり;親水性置換基は、ポリアミン型の基から選択される)を表し;あるいは
(c)一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し;他方が、ポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表し;あるいは
(d)一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し;他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体、あるいは単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体とモノマー単位1〜20個を有するポリアルキレングリコール分子との間の共有結合結合体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(e)一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し;他方が治療性分子を表す。
【0064】
さらに好ましくは本発明の酸感受性化合物は、下記一般式の化合物から選択される。
【0065】
【化22】
式中、
・gは0または1である整数であり;
・Gは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数1〜6のアルキル置換基、またはフェニルを表し;
・G1およびG2は、
(a)一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(d)一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し;他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表す。
【0066】
一般式(I)の新規な酸感受性化合物は、無毒性かつ製薬上許容される塩の形で提供することができる。その無毒性塩には、無機酸(塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸または硝酸)または有機酸(酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、フマル酸、メタンスルホン酸またはシュウ酸)との塩が含まれる。
【0067】
本発明による酸感受性化合物は、環状オルトエステル基を有する分子の合成について文献に記載の方法から選択される多くの方法に従って製造することができる(例えば、総説Synthesis, Robert H. DeWolfe, 1974, pp.153−172にある例を挙げることができる)。想到され得る別法によれば、一般式(I)の酸感受性化合物は例えば、式G1OHのアルコールを下記一般式のオルトエステルと反応させることで得ることができる。
【0068】
【化23】
式中、g、G、G1およびG2は一般式(I)について定義した通りであり;Zは炭素原子数1〜4個の直鎖または分岐アルキル基を表す。
【0069】
この置換は、酸触媒の存在下に行うことができ、および/または溶媒を使用しもしくはせずに50〜150℃の温度で加熱して活性化することができる。溶媒存在下での操作を行うことを選択する場合、その溶媒は、例えば有機塩素系溶媒、芳香族溶媒またはエーテル類などの従来の有機化学溶媒から選択される。触媒を用いる場合、それは無機もしくは有機酸、ルイス酸もしくはブレンステッド酸であることができる。例えばその触媒は、塩酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたは塩化マグネシウムから選択することができる。この置換はまた、アルコールZOHがアルコールG1OHより揮発性が高い場合に、その反応中に生成するZOHを蒸留することで促進することもできる。その連続蒸留は、常圧または減圧下で加熱することで行うことができる。
【0070】
原料のアルコールG1OHは市販されているか、あるいは当業者には公知の方法、例えば相当するアルケンの水和、相当するハロゲン化誘導体の加水分解、あるいは相当するカルボニル含有誘導体の還元によって合成することができる。
【0071】
本発明の別の形態によれば、基Zはすでに基G1を表すことができ、その場合には、一般式(III)のオルトエステルとアルコールG1OHの間の反応段階は必要ない。
【0072】
一般式(III)の化合物は、下記一般式(IV)のトリアルキルオルトエステル:
【0073】
【化24】
[式中、ZおよびGは上記で定義の通りであり;Z1およびZ2は同一でも異なっていても良く、炭素原子数1〜4個の直鎖または分岐のアルキル基を表す]の下記一般式(V)のジオール:
【0074】
【化25】
[式中、gおよびG2は上記で定義の通りである]に対する作用によって得ることができる。
【0075】
この反応は、例えばグリーンら(T. W. Greene and P. G. M. Wuts, ″Protective Groups in Organic Synthesis″ (2nd Ed., Wiley−Interscience, pp. 135−136))によって示されている方法に従って、ジオールをオルトエステルとして保護する従来の方法に従って行うことができる。この方法は一般的には、酸触媒存在下に従来の有機溶媒(例えば、有機塩素系溶媒、芳香族溶媒、エーテル類など)中で行う。その触媒は、無機もしくは有機酸、ルイス酸もしくはブレンステッド酸であることができる。例えば、塩酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたは塩化マグネシウムを用いることができる。
【0076】
一般式(IV)のトリアルキルオルトエステルは市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って、例えば相当するエステルから、あるいは別の市販のトリアルキルオルトエステルを原料とするアルコキシ基の置換によって合成することができる。
【0077】
一般式(V)のジオールは市販されているか、あるいは市販のジオールとG2との間の反応によって得ることができるか、あるいはG2のジオールへの直接官能化によって得ることができる。この官能化は例えば、相当するアルケンの酸化、あるいは当業者には公知の方法による相当するエポキシドの開環であることができる。
【0078】
G1およびG2のいずれかがポリアミン型の基を表す場合、それは市販されているか、あるいは当業者には公知の従来の方法に従って、例えば先行技術に記載の方法(例:公開WO96/17823、WO97/18185、WO98/54130またはWO99/51581)に従って、あるいは類似の方法に従って得られる。
【0079】
G1およびG2のいずれかが単鎖または二重鎖アルキルから選択される疎水性置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来の方法に従って得られる。例えば、それが長い炭素鎖を有するジアルキルアミノ置換基を有する場合、アルキル化(ハロゲン化アルキルのモノ置換)によって、アルキル化還元(アルデヒドから)によって、あるいは縮合/還元(酸からのアミド官能基の形成とそれに続く還元)によって相当する1級アミンから製造することができる。
【0080】
G1およびG2のいずれかがステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表す場合、それは好ましくは市販品から選択される。
【0081】
G1およびG2のいずれかがポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法によって、詳細には重合によって得られる。その置換基が標的指向要素に共有結合的に連結されている場合、上記の本発明による酸感受性化合物の合成は、当業者の従来法によって、前記標的指向要素のその置換基への結合の前または後に行うことができる。
【0082】
G1およびG2のいずれかがポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って、あるいは先行技術、例えば公開WO96/02655に記載の方法に従って得られる。
【0083】
上記の製造方法は、単に例示方法を構成するものであって、他の均等な製造方法も使用可能であることは当然である。例えば、基G2を持たないが、代わりに保護されていても良い官能基(例えば、保護アミン)を有する一般式(V)のジオールを原料とする反応を、基G2の結合を行う追加の最終段階(例えば、アミンの脱保護とそれに続く式G2COOHの酸の縮合)を行うことで行うことが可能である。
【0084】
本発明の別の主題は、上記で定義の一般式(I)の酸感受性化合物を少なくとも1個含む組成物に関する。本発明の別形態によれば、前記組成物は、少なくとも1種類の生物活性物質ならびにG1およびG2が(a)、(b)、(c)または(d)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物を含む。
【0085】
本発明による組成物はさらに、本発明による酸感受性化合物と生物活性物質との間で形成される複合体と結合することができる1以上の補助剤を含む。従って別の実施形態において本発明は、少なくとも1種類の生物活性物質、G1およびG2が(a)、(b)、(c)または(d)で示した定義を有する式(I)の酸感受性化合物、ならびに1以上の補助剤を含む組成物に関する。この種の補助剤(例えば、脂質、ペプチドまたは蛋白)が存在することで、生物活性物質がトランスフェクションされる核酸である場合に、化合物のトランスフェクション力を高めることができるという効果を得ることができる。
【0086】
この点で、本発明による組成物は、補助剤として1以上の中性脂質を含むことができる。実際、中性脂質を加えることで、核脂質粒子(生物活性物質が核酸である場合)の形成を促進し、膜不安定化による細胞へのその粒子の侵入を促進することができることが明らかになっている。
【0087】
より好ましくは、前記中性脂質は、2個の脂肪族鎖を有する脂質である。特に有利な形態では、天然または合成の両性イオン性脂質または生理条件下ではイオン電荷を持たない脂質を用いる。それらはより詳細には、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびに1〜3回N−メチル化されたそれらの誘導体、ホスファチジルグリセリン類、ジアシルグリセリン類、グリコシルジアシルグリセリン類、セレブロシド類(特に、ガラクトセレブロシド類など)、スフィンゴ脂質(特に、スフィンゴミエリン類など)、あるいはアシアロガングリオシド類(特に、アシアロGM1およびGM2など)から選択することができる。
【0088】
これらの各種脂質は、当業者には公知の従来の方法により、合成によって、あるいは臓器(例:脳)または卵からの抽出によって得ることができる。詳細には、天然脂質の抽出は、有機溶媒によって行うことができる(Lehninger, Biochemistryも参照)。
【0089】
好ましくは、生物活性物質が核酸である場合、本発明の組成物は、モル/モル基準で1当量の核酸について0.01〜20当量の補助剤、より好ましくは0.5〜5当量の補助剤を含む。
【0090】
本発明による酸感受性化合物は、環状オルトエステルのいずれかの側にある置換基G1およびG2に応じて各種用途を有することができる。
【0091】
置換基G1およびG2が一般式(I)での(a)、(b)または(c)に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、生物活性物質と直接結合体(例えば、リポソーム、複合体またはナノ粒子などの種類)を形成することができ、それを次に、生理的に正常なものより酸性が高い組織または細胞区画中に放出することができる。詳細にはその酸感受性化合物は、核酸のトランスフェクションにおいて特に有用である。
【0092】
置換基G1およびG2が一般式(I)での(d)に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、生物活性物質を包み込んだ粒子を安定化し、さらには身体において非常に弱酸性ないし酸性である領域、特にはpHが酸性であって約4〜約7である領域での分解によって前記生物活性物質を放出するという両方の作用を可能とするノニオン系界面活性剤を構成する。
【0093】
さらに、多糖類またはポリアルキレングリコール置換基、より具体的にはポリエチレングリコール(PEG)は、血清蛋白の非特異的吸着、および結果的に大食細胞によるその粒子の認識を阻害することで、それらが関連する粒子上にある種の「被覆性」を与えることが知られている(例えば、Torchilin et al., Biochim. Biophys. Acta 1994, 1195, pp.11−20またはPapahadjopoulos et al., PNAS 1991, 88, p.11460−4参照)。そこで、本発明によるPEG分子を有する酸感受性化合物は、安全の観点から長所を有し、それらが他の蛋白と干渉する危険性を低下させるという意味での別の長所を有する。身体の酸性領域のレベルでは、本発明による化合物中に存在するオルトエステルの分解によって、粒子の残りの部分からPEG分子を分離することが可能となり、生物活性物質が再度「利用可能」となる(実際には、「被覆性の消失」がある。)。そこで、酸性組織に関して、選択的転移を期待することができる。
【0094】
最後に、置換基G1およびG2が一般式(I)での(e)または(f)に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、治療性分子との共有結合的結合体を構成することで、それの指向化が可能となり、身体の酸性領域でのそれの放出が可能となる。その共有結合的結合体は、クラッツら(Kratz et al.)が報告したものと同じ種類であるが、治療性分子と「ベクター」部分との間に現時点で用いられているpH感受性結合と比較して調節可能な感受性があるという利点を有する新規な酸感受性結合を有する。
【0095】
そこで本発明の主題は、疾患を治療するための医薬品製造における、上記で定義の一般式(I)の酸感受性化合物の使用でもある。その場合、標的となる疾患によって、生物活性物質の選択が決まる。
【0096】
特に有利な形態によれば、生物活性物質が核酸である場合、G1およびG2が(a)、(b)または(c)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物を、in vitro、ex vivoまたはin vivoでの核酸のトランスフェクション、特には一次細胞または定着した細胞系へのトランスフェクション用の医薬品の製造において用いることができる。それには例えば、分化型または多分化能型(前駆体)での線維芽細胞、筋細胞、神経細胞(ニューロン、星状細胞、神経膠細胞)、肝細胞、造血系の細胞(リンパ球、CD34、樹状細胞など)または上皮細胞などがあり得る。
【0097】
最後に、本発明の別の形態によれば、G1およびG2が(e)または(f)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物を、医薬品として用いることができる。
【0098】
以上の説明では、本発明による酸感受性化合物は、pHが生理的に正常なものより酸性の組織または細胞区画で分解するようになる。しかしながら別の形態によれば、当業者には公知の全身または局所処置によって、身体の標的領域での酸性を誘発または上昇させることが可能である。例として、処置対象領域への酸性物質の注射または腫瘍組織の特異的酸性化を引き起こすグルコースの静脈注射などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない(T. Volk et al.; Br. J. Cancer; 1993, 68(3), 492−500)。そこで、本発明による酸感受性化合物を、元来は非酸性であるが、当業者に公知の処置によって酸性となった領域で用いることもできる。
【0099】
上記の本発明による酸感受性化合物の全ての使用に関して、
−G1およびG2が(e)または(f)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物;あるいは
−G1およびG2が(a)、(b)、(c)または(d)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物および生物活性物質
を含む本発明による組成物を、例えば局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、経鼻、静脈、筋肉、皮下、眼球、経皮、気管内または腹腔内の経路による投与用に製剤することができる。好ましくは本発明の組成物は、注射製剤用、特には所望の臓器への直接注射用、あるいは局所経路による投与用(皮膚および/または粘膜に対して)の製薬上許容される媒体を含む。それには特に、等張性で無菌の溶液、あるいは乾燥した、特に状況に応じて滅菌水もしくは生理食塩水を添加することで注射溶液を調製することができる凍結乾燥組成物などがあり得る。注射用に用いられる生物活性物質の用量ならびに投与回数は、各種パラメータに応じて調節可能であり、特には、使用される投与形態、関連する病気、生物活性物質が核酸である場合に発現される鎖または所望の投与期間に応じて調節可能である。より詳細な投与形態に関して、それには例えば腫瘍または循環経路のレベルでの組織への直接注射、あるいは培養細胞の処理とそれのin vivoでの再移植、注射もしくは移植などがあり得る。本発明の文脈での関連組織には、例えば筋肉、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、睾丸、卵巣、直腸、神経系、眼球、腺または結合組織などがある。
【0100】
以上の構成以外に本発明は、添付の実施例および図面からわかる他の特徴および利点をも有するものであり、それら実施例および図面は本発明を説明するものと考えるべきであって、本発明の範囲を限定するものではない。特に本出願人らは、各種の操作記録や一般式(I)の化合物を製造するのに用いることができる反応中間体を提案するが、それに限定するものではない。当然のことながら、これらの操作記録および/または中間体生成物から類推して同様の手順を開発することで、本発明による他の式(I)の化合物に到達することは、当業者であれば可能である。
【0101】
図面の簡単な説明
図1は、カチオン性脂質または酸感受性化合物0.4または1.7または6.0nmol/DNAμgという3種類の異なる比率で、DNAと対照カチオン性脂質または酸感受性化合物A シンもしくはトランスとの間で形成される複合体のpH5での時間の関数としての蛍光レベルの変動を示す図である。
【0102】
図2は、血清を含む場合または含まない場合での、各種使用比率でのDNAと化合物A シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質との間で形成された複合体のHeLa細胞へのin vitroでのトランスフェクションの効率を示す図である。y軸はpg/ウェル/蛋白μgでのルシフェラーゼの発現を表す。x軸は、化合物A シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質/DNA使用量比を示す。
【0103】
図3は、DNA量に関して使用される化合物Cまたは化合物DまたはBrij700または化合物Dの非酸感受性類縁体(類縁体D)の量(重量比)の関数としての対照カチオン性脂質/DNA核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。径が小さいということは、核脂質粒子が安定化されていることを示している。非常に大きい粒径は、それとは逆に、核脂質粒子の不安定化があって、それらが凝集する傾向を有することを示す。
【0104】
図4は、pHが5の場合の各種比率(重量比)での、時間の関数としての対照カチオン性脂質/DNA/化合物もしくは類縁体D核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。小さい径の核脂質粒子は、それが安定化されていることを示している。非常に大きい粒径は、それとは逆に、核脂質粒子の不安定化があって、それらが凝集する傾向を有することを示す。
【0105】
図5は、各種pH(pH4、pH5、pH6およびpH7.4)での時間の関数としての、対照カチオン性脂質/DNA/化合物Cもしくは化合物E核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。化合物Cもしくは化合物E/DNA比は1に設定してある(nmol/DNAμg)。
【0106】
図6は、プラスミドpXL3031の模式図である。
【0107】
図7は、カチオン性脂質/DOPE/DNA(5/5/1)複合体が介在するin vivoでの遺伝子転移活性に対する化合物Dについての用量/応答曲線を示す図である。化合物「類縁体D」は、陰性対照として使用する。データは、皮下M109腫瘍を有するBalb/cマウスについての平均(線)および個々の値(点)である。
【0108】
実施例
トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、無水トリフルオロ酢酸、ブロモ酢酸tert−ブチル、ブチロラクトン、3−アミノプロパン−1,2−ジオール、セリノール(2−アミノプロパン−1,3−ジオール)、オルトギ酸トリメチル、オルト酢酸トリメチル、パラトルエンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたはベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム(BOP)ヘキサフルオロホスフェートなどの通常の試薬および触媒は市販のものである。
【0109】
洗浄は、飽和塩化ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および0.5mol/Lの濃硫酸水素カリウム溶液で行う。
【0110】
親水性ポリマー(各種大きさのポリエチレングリコール類)は市販品である。ポリアミン型の親水性置換基も市販されているか、あるいは詳細には下記の実施例で示されている当業者には公知の従来の方法によって合成することができる。疎水性置換基(単鎖または二重鎖ジアルキルアミン類、脂肪族アルコール類など)は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って合成される。例えば、単鎖または二重鎖ジアルキルアミン類は、下記の実施例に示した方法に従って、1級アミンおよび相当するハロゲン化アルキル誘導体から合成することができる。
【0111】
プロトン核磁気共鳴(1H NMR)スペクトラムは、ブルカー(Bruker)300、400および600MHzスペクトル装置で記録した。化学(clinical)シフトはppm(1/1000000)単位で表してあり、多重度は通常の略称で表してある。
【0112】
使用したプラスミドは、刊行物(Gene Therapy (1999) 6, pp, 1482−1488)に記載のpXL3031であり、それはサイトメガロウィルスCMV E/Pプロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードするluc遺伝子を有する。このプラスミドは図6に示してある。それの大きさは3671bpである。使用のプラスミド溶液は、注射用水で1.262g/Lに希釈する。
【0113】
実施例1:2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド(「オルト1」)の合成
2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド(「オルト1」)は下記式の構造を有する。
【0114】
【化26】
それは、3−アミノプロパン−1,2−ジオールから2段階で得ることができる。
【0115】
1)N−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−2,2,2−トリフルオロアセトアミドの製造
3−アミノプロパン−1,2−ジオール15g(164.6mmol)を、磁気撹拌子を入れた丸底フラスコ中で、テトラヒドロフラン100mLに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却して0℃とし、トリフルオロ酢酸エチル21.5mL(181.1mmol)を徐々に加える。反応混合物を室温で2時間撹拌する。粗反応生成物を溶媒留去して乾固させる。そうして、純粋な無色油状物29gが得られ(収率95%)、その生成物をそれ以上精製せずに用いる。
【0116】
2)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド(オルト1)の製造
前段階で得られたN−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−2,2,2−トリフルオロアセトアミド29g(155mmol)を、オルトギ酸トリメチル75mL(685mmol)を加えた塩化メチレン75mLに溶かす。パラトルエンスルホン酸300mg(1.7mmol)を加え、反応混合物を室温で2時間撹拌する。
【0117】
その粗生成物を塩化メチレン500mLで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム200mLで3回洗浄し、次に飽和塩化ナトリウム200mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮して乾固させる。そうして、それ以上精製せずに、純粋な油状生成物30gが得られる(収率:85%)。
【0118】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm単位))。50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0119】
*3.33および3.37(2s:計3H);3.35〜3.80(mt:3H);4.10〜4.25(mt:1H);4.50(mt:1H);5.73および5.78(2s:計1H);6.66および7.55(2つの未分離の複雑なピーク:計1H)。
【0120】
実施例2:2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−2−メチル−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミド(「オルト2」)の合成
2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−2−メチル−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミド(「オルト2」)は、下記式の構造を有する。
【0121】
【化27】
それは、2−アミノプロパン−1,3−ジオール(セリノール)から2段階で得ることができる。
【0122】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−ヒドロキシ−1−ヒドロキシメチルエチル)アセトアミドの製造
2−アミノプロパン−1,3−ジオール4g(43.9mmol)に、テトラヒドロフラン20mLを加える。反応混合物を氷浴で冷却して0℃とし、トリフルオロ酢酸エチル5.8mL(48.3mmol)を徐々に加える。その溶液を室温で2時間撹拌する。
【0123】
反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレンに3回取ってテトラヒドロフランを完全に留去する。白色粉末8.1g(収率:99%)が純粋な形で得られ、それをそれ以上精製せずに次の段階で用いる。
【0124】
2)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−2−メチル−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミド(オルト2)の製造
前段階で得られた2,2,2−トリフルオロ−N−(2−ヒドロキシ−1−ヒドロキシメチルエチル)アセトアミド7.9g(42.2mmol)を、オルトギ酸トリメチル16.1mL(126.7mmol)を加えた塩化メチレン30mLに溶かす。パラトルエンスルホン酸73mg(0.42mmol)を加え、反応混合物を室温で3時間撹拌する。
【0125】
その粗生成物を塩化メチレン150mLで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液50mLで3回、次に飽和塩化ナトリウム溶液50mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮して乾固させる。そうして白色固体9.9gが、それ以上精製せずに純品として得られる(収率:96%)。
【0126】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm単位))。約75/25の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0127】
*1.49および1.50(2s:計3H);3.34および3.35(2s:計3H);3.66および3.82(それぞれdmt、J=12Hzおよびdd、J=11および8Hz:計2H);3.90〜4.00および4.20〜4.35(2mt:計1H);3.97および4.33(それぞれdd、J=11および5Hzならびにdmt、J=12Hz:計2H);6.38および7.04(2つの広い未分離の複雑なピーク:計1H)。
【0128】
実施例3:シンおよびトランス化合物4−{4−[(2−{3−[4−(3−アミノ−プロピルアミノ)ブチルアミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−オクタデシルブチルアミド・テトラアセテートの合成
本実施例は、下記式の2種類の異なるジアステレオマー型シンおよびトランスの形での酸感受性化合物Aの合成経路を説明するものである。
【0129】
【化28】
a−シンおよびトランス4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジオクタデシルブチルアミド(脂質部分−O−オルト1−NH 2 )の合成
この合成は、3段階で行う。ジオクタデシルアミンのアルコールへの官能基化と基オルト1への付加と、それに続く保護基の開裂である。
【0130】
1)4−ヒドロキシ−N,N−ジオクタデシルブチルアミドの製造
塩化アルミニウム4.6g(34mmol)にクロロホルム25mLを加え、全体をサーモスタット調節の浴で約10℃まで冷却する。トリエチルアミン6.4mL(46mmol)のクロロホルム(15mL)溶液を滴下し、反応混合物を室温に戻す。ジオクタデシルアミン6g(11.5mmol)をブチロラクトン1mL(13.8mmol)とクロロホルム110mL中で混合し、それを滴下漏斗を用いて前記の混合物に徐々に加える。
【0131】
室温で2時間磁気撹拌子撹拌した後、反応にそれ以上の変化がなくなる。水75mLを加え、反応混合物を30分間撹拌する。粗生成物をセライト濾過し、クロロホルムで洗浄する。濾液を放置することで分離し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液50mLで3回洗浄する。クロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。シリカでのクロマトグラフィー後に、白色粉末4.9gが得られる(収率:70%)。
【0132】
2)シンおよびトランスN,N−ジオクタデシル−4−{4−[2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}ブチルアミドの製造
前段階で得られた4−ヒドロキシ−N,N−ジオクタデシルブチルアミド2.8g(4.6mmol)を2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド2.6g(オルト1、11.5mmol)および塩化マグネシウム90mg(0.92mmol)を混合する。全体を無溶媒で80℃にて2時間加熱する。
【0133】
粗反応生成物をシクロヘキサン150mLに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液30mLで3回洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液30mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。精製をシリカでのクロマトグラフィーによって行う。2種類の予想されるジアステレオマーであるシンおよびトランス1.2gおよび1.1gが、白色粉末の形で単離される(収率:62%)。
【0134】
化合物シンの1H NMR(300MHz、CDCl3、δ(ppm)):0.89(t、J=7Hz:6H);1.15〜1.40(mt:60H);1.52(mt:4H);1.94(mt:2H);2.39(t、J=7Hz:2H);3.20(広いt、J=8Hz:2H);3.29(mt:2H);3.61(t、J=5Hz:2H);3.66(mt:2H);3.79(dd、J=8および7Hz:1H);4.11(t、J=8Hz:1H);4.50(mt:1H);5.82(s:1H);8.13(未分離の複雑なピーク:1H)。
【0135】
化合物トランスの1H NMR(300MHz、CDCl3、δ(ppm)):0.89(t、J=7Hz:6H);1.15〜1.40(mt:60H);1.52(mt:4H);1.94(mt:2H);2.38(t、J=7Hz:2H);3.21(広いt、J=8Hz:2H);3.29(広いt、J=8Hz:2H);3.44(mt:1H);3.55〜3.75(mt:1H);3.60(t、J=6Hz:2H);3.69(dd、J=8.5および5Hz:1H);4.19(dd、J=8.5および7Hz:1H);4.50(mt:1H);5.87(s:1H);6.70(未分離の複雑なピーク:1H)。
【0136】
3)シンおよびトランス4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジオクタデシルブチルアミドの製造
前段階で得られたN,N−ジオクタデシル−4−{4−[(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}ブチルアミド1.1g(1.37mmol、シンまたはトランス)をテトラヒドロフラン10mLに溶かし、4モル%水酸化ナトリウム10mLを高撹拌しながら加える。反応を室温で終夜放置する。
【0137】
テトラヒドロフランを濃縮し、生成物をジエチルエーテル150mLで3回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。そうして予想される生成物840mgが単離される(収率:86%)。それをそのまま次の段階で用いる。
【0138】
b−(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)酢酸(親水性部分ポリアミン−COOH)の合成
この合成は、スペルミンの4つのアミンの保護とそれに続く1級アミンのうちの一つの保護ブロモ酢酸による置換という2段階で行われる。
【0139】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]−N−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アセトアミドの合成
スペルミン8g(39.5mmol)を塩化メチレン75mLに溶かす。トリエチルアミン33mL(237mmol)を加え、反応混合物を氷浴で冷却して0℃とする。塩化メチレン100mLで希釈した無水トリフルオロ酢酸41.5gを、滴下漏斗を用いて1時間かけて滴下する。反応混合物を室温に戻し、反応液を撹拌しながら終夜放置する。
【0140】
5%炭酸水素ナトリウム溶液75mLを反応混合物に加え、溶液を室温で15分間撹拌する。水相を塩化メチレン150mLで3回抽出する。有機相を合わせ、0.5Mの濃硫酸水素カリウム溶液100mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液100mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。純粋な黄色粉末22.5gが、それ以上の精製を行わずに単離される(収率:97%)。
【0141】
2)(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)酢酸の製造
水素化ナトリウム1g(60%オイル中分散品、すなわち25.6mmol)に脱水ジメチルホルムアミド60mLを加える。反応混合物をアルゴン気流下に水浴で冷却し、脱水ジメチルホルムアミド40mLに溶かした上記で得られた2,2,2−トリフルオロ−N−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]−N−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アセトアミド10g(17mmol)を滴下する。反応混合物を室温で1時間放置し、再度氷浴で冷却し、ブロモ酢酸tert−ブチル3.66g(18.7mmol)を加える。反応混合物を室温で終夜撹拌する。
【0142】
酢酸エチル500mLを加え、混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液100mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液100mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。そうして、予想される不純物を含む黄色油状物が、tert−ブチルエステルの形で単離される。
【0143】
この粗反応生成物を塩化メチレン50mLで希釈し、トリフルオロ酢酸50mLを加える。溶液を室温で3時間撹拌する。反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン50mLで希釈する。生成物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液150mLで3回抽出する。得られた水相を塩化メチレン30mLで3回洗浄してから、濃塩酸を加えることで酸性とする。次に、生成物を塩化メチレン300mLで3回抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。精製をシリカでのクロマトグラフィーによって続ける(溶離液:塩化メチレン/メタノール8/2)。そうして、黄色粉末3.5gを回収する(2段階の全体収率:32%)。
【0144】
1H NMR(400MHz、温度373Kの(CD3)2SO−d6、δd(ppm)):1.62(mt:4H);1.80〜2.00(mt:4H);3.28(mt:2H);3.30〜3.60(mt:10H);4.01(s:2H);9.15〜9.35(未分離の複雑なピーク:1H)。
【0145】
c−シンおよびトランス4−{4−[(2−{3−[4−(3−アミノプロピルアミノ)ブチルアミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−オクタデシルブチルアミド・テトラアセテート(酸感受性化合物A)の合成
この合成は、直前のaおよびbで合成を説明した2種類の分子の縮合、次にポリアミンの脱保護、最後の塩化という3段階で行う。生成物シンおよびトランスについて同じ操作記録を用いた。
【0146】
1)シンおよびトランスN,N−ジオクタデシル−4−(4−{[2−(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)アセチルアミノ]メチル}−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)ブチルアミドの合成
上記の段階(段階a)で得られた4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジオクタデシルブチルアミド800mg(1.13mmol、シンまたはトランス)を塩化メチレン10mLに溶かしたものに、トリエチルアミン390μL(2.8mmol)、上記段階bにて得られた(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)酢酸800mg(1.24mmol)およびBOP 600mgをその順序で加える。溶液を室温で2時間撹拌する。
【0147】
粗反応生成物を濃縮し、酢酸エチル150mL中に取り、飽和炭酸水素ナトリウム溶液40mLで3回、次に飽和塩化ナトリウム溶液40mLで3回洗浄する。硫酸マグネシウムでの脱水、濾過、溶媒留去後、生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(溶離液:酢酸エチル)。そうして、白色粉末1.1gを単離する(収率:73%)。
【0148】
2)シンおよびトランス4−{4−[(2−{3−[4−(3−アミノプロピルアミノ)ブチルアミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジオクタデシルブチルアミドの製造
上記で得られたN,N−ジオクタデシル−4−(4−{[2−(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)アセチルアミノ]メチル}−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)ブチルアミド290mg(0.22mmol、シンまたはトランス)をテトラヒドロフラン3mLに溶かし、4モル%水酸化ナトリウム3mLを高撹拌しながら加える。反応を室温で終夜放置する。
【0149】
次に溶媒を濃縮し、粗生成物を塩化メチレン/メタノールの1/1混合液中に取る。その粗溶液をシリカでのクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール/アンモニア、45/45/10)によって精製する。生成物を濃縮し、水を加えた後に凍結乾燥する。そうして、白色の凍結乾燥生成物180mgが得られる(収率:87%)。
【0150】
3)4−{4−[(2−{3−[4−(3−アミノプロピルアミノ)ブチルアミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジオクタデシルブチルアミドのジアステレオマーシンおよびトランスの製造(化合物A)
遊離塩基の形で前の段階で得られた生成物を、イオン交換樹脂によって定量的に塩化する。それを水/エタノール混合液に溶かし、大過剰のアセテート樹脂(BIO−RAD;AG1−X2樹脂)を充填したカラムで溶出する。
【0151】
化合物シンの1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):0.89(t、J=7Hz:6H);1.20〜1.40(mt:60H);1.52(mt:4H);1.65〜1.90(mt:8H);1.93(mt:2H);1.97(s:3H);2.37(t、J=7Hz:2H);2.73(mt:4H);2.81(t、J=6.5Hz:2H);2.89(mt:4H);2.95(t、J=6.5Hz:2H);3.15〜3.30(mt:4H);3.32(AB、J=17Hz:2H);3.45(dt、J=14および6.5Hz:1H);3.55〜3.65(mt:1H);3.61(分裂t、J=7および2Hz:2H);3.74(t、J=8Hz:1H);4.06(t、J=8Hz:1H);4.31(mt:1H);5.79(s:1H);7.81(t、J=5.5Hz:1H)。
【0152】
化合物トランスの1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):0.88(t、J=7Hz:6H);1.05〜1.45(mt:60H);1.51(mt:4H);1.65〜1.90(mt:8H);1.92(mt:2H);1.97(s:3H);2.37(t、J=7Hz:2H);2.73(mt:4H);2.80(t、J=6Hz:2H);2.88(mt:4H);2.96(t、J=6Hz:2H);3.15〜3.55(mt:8H);3.57(広いt、J=6Hz:2H);3.69(dd、J=7.5および5.5Hz:1H);4.11(t、J=7.5Hz:1H);4.43(mt:1H);5.85(s:1H);7.73(広いt、J=5.5Hz:1H)。
【0153】
実施例4:4−{4−[(2−{3−[ビス(3−アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジテトラデシルブチルアミド・4塩酸塩の合成
この実施例は、下記式の2種類のジアステレオマーであるシンおよびトランスの等モル混合物の形での酸感受性化合物Bの合成経路を説明するものである。
【0154】
【化29】
a−4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジテトラデシルブチルアミド(脂質部分−O−オルト1−NH 2 )の合成
この合成は、ジテトラデシルアミンの合成とそれに続くアルコールへの官能化、そして基オルト1への付加とその保護基の開裂という4段階で行う。
【0155】
1)ジテトラデシルアミン塩酸塩
ブロモテトラデカン74g(267.1mmol)にエタノール400mLおよびテトラデシルアミン57g(267.1mmol)を加える。炭酸ナトリウム70.8g(667mmol)を懸濁状態で入れ、反応混合物を終夜加熱還流する。反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン1.5リットル中に取り、水200mLで3回、次に飽和塩化ナトリウム溶液400mLで1回洗浄する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濃縮する。
【0156】
高い温度で粗生成物を5N塩酸のイソプロパノール溶液300mLを加えたイソプロパノール600mLに溶かすことで、塩化を行う。そうして得られた透明溶液を放冷することで、予想生成物の結晶化を誘発する。濾過およびイソプロパノールによる洗浄後に、凝集白色粉末48.4gを得る(収率:41%)。
【0157】
2)4−ヒドロキシ−N,N−ジテトラデシルブチルアミドの製造
塩化アルミニウム22.4g(168.1mmol)にクロロホルム75mLを加え、全体を氷水浴で冷却して約10℃とする。トリエチルアミン39mL(280.1mmol)のクロロホルム(100mL)溶液を滴下し、反応混合物を室温に戻す。ジテトラデシルアミン塩酸塩25g(56mmol)をブチロラクトン(67.2mmol)のクロロホルム(350mL)溶液と混合したものを、機械撹拌しながら前記混合物に徐々に加える。室温で2時間後に、反応にそれ以上の変化が生じなくなる。
【0158】
水200mLを加え、反応混合物を30分間撹拌する。粗生成物をセライト濾過し、クロロホルムで洗浄する。濾液を放置後に分離し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液150mLで3回洗浄する。クロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。シリカでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/シクロヘキサン1/1)でのクロマトグラフィー後に、白色粉末21.2gを収率76%で得る。
【0159】
3)N,N−ジテトラデシル−4−{4−[(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}ブチルアミドの製造
前段階で得られた4−ヒドロキシ−N,N−ジテトラデシルブチルアミド3.5g(7.1mmol)を、2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド1.8g(オルト1、7.8mmol)およびパラトルエンスルホン酸ピリジニウム18mg(PPTS、0.071mmol)と混合する。全体を無溶媒で80℃にて3時間加熱する。
【0160】
粗反応生成物をヘプタン200mLに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液50mLで3回、アセトニトリル50mLで3回洗浄し、濃縮して乾固させる。
【0161】
少量の粗生成物についてシリカでの精製を行って、この中間体の特性決定を行う、残りはそのまま次の段階で用いる。シリカでのクロマトグラフィー(シクロヘキサン/酢酸エチル7/3(体積比))によって、油状生成物数mgを単離することができる。
【0162】
4)4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジテトラデシルブチルアミドの製造
前段階で得られた粗生成物を、4%水酸化ナトリウム20mLを加えたテトラヒドロフラン20mLに溶かす。反応混合物を室温で高撹拌しながら終夜放置する。
【0163】
次に、テトラヒドロフランを濃縮し、生成物をジエチルエーテル200mLで3回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。シリカでのクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール9/1(体積比))によって、無色油状物1.6gを単離することができる(2段階での収率:38%)。
【0164】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm)):50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0165】
*0.89(t、J=7Hz:6H);1.15〜1.45(mt:44H);1.52(mt:4H);1.58(未分離の複雑なピーク:2H);1.95(5重線、J=6.5Hz:2H);2.39(t、J=6.5Hz:2H);2.75〜3.00(mt:2H);2.31(mt:2H);3.29(mt:2H);3.60(mt:2H);3.71および3.80(それぞれdd、J=7.5Hzおよび6Hzならびにt、J=7.5Hz:計1H);4.06および4.14(2t、J=7.5Hz:計1H);4.21および4.33(2mt:計1H);5.82および5.85(2s:計1H)。
【0166】
b−トリフルオロ酢酸塩の形での[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸の合成(ポリアミン−COOH型の親水性部分)
この合成は、3−アミノプロパノールおよび3,3′−イミノビスプロピルアミンを原料とする6段階で行う。
【0167】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−{3−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピルアミノ]プロピル}アセトアミドの製造
3,3′−イミノビスプロピルアミン35g(266.7mmol)を、アルゴン気流下に脱水テトラヒドロフラン150mLに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却して0℃とし、トリフルオロ酢酸エチル65mL(546.8mmol)を滴下漏斗を用いて(非常にゆっくりと)滴下する。滴下終了後(3時間後)、反応混合物を室温に戻し、撹拌をアルゴン下で数時間維持する。
【0168】
反応混合物を濾紙で濾過する。濾液を濃縮乾固させ、塩化メチレン中に数回取り、スライド羽根ロータリー真空ポンプによる真空下40℃での乾燥機で16時間にわたって最終の乾燥を行う。白色粉末85.3gが、それ以上精製せずに単離される(収率:99%)。
【0169】
2)(3−ヒドロキシプロピルアミノ)酢酸tert−ブチルの製造
3−アミノプロパノール196mL(2.56mol)を塩化メチレン250mLで希釈し、全体を氷浴で冷却して0℃とする。反応混合物を0℃に維持しながら、ブロモ酢酸tert−ブチル20g(102.5mmol)を塩化メチレン200mLに溶かしたものを滴下する。滴下終了後(2時間後)、反応混合物を室温で3時間放置する。
【0170】
その粗生成物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液150mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液150mLで3回洗浄する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。そうして、無色油状物17.8gが単離される(収率:92%)。
【0171】
3)[(3−ヒドロキシプロピル)−トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチルの製造
(3−ヒドロキシプロピルアミノ)酢酸tert−ブチル17.65g(93.3mmol)を塩化メチレン100mLに溶かし、全体を氷浴で冷却して0℃とする。トリエチルアミン26mL(186.6mmol)を加え、次に滴下漏斗を用いて無水トリフルオロ酢酸21.5g(102.6mmol)を滴下する。滴下終了後、反応混合物を、磁気撹拌子撹拌しながら室温で終夜放置する。
【0172】
その溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液50mLで3回、0.5M硫酸水素カリウム溶液50mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液50mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。そうして、淡黄色油状物24.5gが単離される(収率:92%)。
【0173】
4)[(3−ブロモプロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチルの製造
[(3−ヒドロキシプロピル)−トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチル10g(35mmol)をテトラヒドロフラン150mLに溶かす。トリフェニルホスフィン12.4g(47.3mmol)を加え、反応混合物をサーモスタットで15〜20℃とする。四臭化炭素15.1g(45.6mmol)をアセトニトリル60mLに溶かしたものを滴下漏斗を用いて滴下し、全体を室温で4時間撹拌する。
【0174】
反応混合物を濃縮して乾固させ、酢酸エチル中に取り、濾紙で濾過する。濾液を濃縮乾固させ、シクロヘキサン中に取り、焼結材No.3で濾過する。濾液を再度濃縮し、シリカでのクロマトグラフィー(シクロヘキサン/酢酸エチル8/2(体積比))によって精製する。そうして、淡黄色油状物10.4gが単離される(収率:85%)。
【0175】
5)[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチルの製造
[(3−ブロモプロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチル26g(74.7mmol)および2,2,2−トリフルオロ−N−{3−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピルアミノ]プロピル}アセトアミド24.1g(74.7mmol)をアセトニトリル130mLに溶かす。炭酸カリウム30g(224mmol)を懸濁状態で入れ、全体を6時間加熱還流する。
【0176】
反応混合物を濾紙で濾過し、濃縮乾固する。粗生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(シクロヘキサン/酢酸エチル2/8(体積比))。そうして、淡黄色油状物16.6g(収率:38%)を単離する。
【0177】
6)[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸のトリフルオロ酢酸塩の製造
[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチル15.8g(28.76mmol)に塩化メチレン50mLを加え、次にトリフルオロ酢酸50mLを加える。その混合物を室温で数時間撹拌する。反応混合物を濃縮乾固する。そうして、淡黄色粘稠物18.7gを単離する(収率:100%)。
【0178】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm)):室温で、回転異性体の混合物が認められる。
【0179】
*1.80〜2.10(mt:6H);3.12(mt:6H);3.29(mt:4H);3.50(mt:2H);4.13および4.29(それぞれ広いsおよびmt:計2H);9.50〜9.75(mt:2H)。
【0180】
c−4−{4−[(2−{3−[ビス(3−アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジテトラデシルブチルアミド・4塩酸塩(化合物B)の合成
この合成は、上記の工程aおよびbで得られた2種類の分子の縮合、それに続くポリアミンの脱保護および塩化という3段階で行う。
【0181】
1)4−[4−({2−[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]アセチルアミノ}メチル)−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ]−N,N−ジテトラデシルブチルアミドの製造
トリエチルアミン1.9mL(13.8mmol)、[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸2g(トリフルオロ酢酸塩、3.04mmol)およびBOP1.8g(4.14mmol)を順次、塩化メチレン30mLに溶かした4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジテトラデシルブチルアミド1.65g(2.76mmol)に加える。得られた溶液を室温で1時間撹拌する。
【0182】
粗反応生成物を濃縮して乾固させ、酢酸エチル200mL中に取り、飽和塩化ナトリウム溶液40mL、次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液40mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液40mLで3回洗浄する。生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(溶離液:酢酸エチル)。そうして、淡黄色粘稠物2.2gが単離される(収率:72%)。
【0183】
2)4−{4−[(2−{3−[ビス(3−アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジテトラデシルブチルアミドの製造
4−[4−({2−[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]アセチルアミノ}メチル)−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ]−N,N−ジテトラデシルブチルアミド2.1g(1.88mmol)をテトラヒドロフラン30mLに溶かし、4モル%水酸化ナトリウム30mLを高撹拌下に加える。反応液を室温で終夜放置する。
【0184】
溶媒を濃縮し、粗生成物を塩化メチレン/メタノール1/1混合液中に取る。その粗溶液をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(塩化メチレン/メタノール/アンモニア、45/45/10(体積比))。生成物を濃縮し、水を加えた後に凍結乾燥する。そうして、白色の凍結乾燥生成物1.3gが得られる(収率:84%)。
【0185】
3)4−{4−[(2−{3−[ビス(3−アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジテトラデシルブチルアミド・4塩酸塩(化合物B)の合成
遊離塩基の形での前段階で得られた生成物を、イオン交換樹脂によって定量的に塩化する。それを水に溶かし、大過剰のクロライド樹脂(FLUKA;DOWEX21K)を充填したカラムで溶出する。得られる白色の凍結乾燥生成物の構造を1H NMRで確認する。
【0186】
1H NMR(300MHz、(CD3)2SO−d6、δd(ppm)):50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0187】
*0.89(t、J=7Hz:6H);1.15〜1.40(mt:44H);1.40〜1.60(mt:4H);1.72(mt:8H);2.31(mt:2H);2.40〜2.55(mt:6H);2.70〜2.90(mt:6H);3.15〜3.75−4.00〜4.40(2つのmt:計13H);5.83および5.86(2s:計1H)。
【0188】
実施例5:PEG化脂質CおよびDの合成
本実施例は、互いに脂質部分のみが異なる、すなわち化合物Cではオクタデカノールであり、化合物DではコレステロールであるPEG化脂質オクタデカノール−オルト1−PEG5000−OMeおよびコレステロール−オルト1−PEG5000−OMeの合成経路を説明するものである。これら2種類の酸感受性化合物は下記一般式の構造を有する。
【0189】
【化30】
a−C−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イル)メチルアミンおよびC−{2−[17−(1,5−ジメチルヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン− 3−イルオキシ]−[1,3]ジオキソラン−4−イル}メチルアミン(脂質部分−O−オルト1−NH 2 )の合成
この合成は、化合物オルト1を原料とし、環外メトキシ基の脂肪族アルコール(コレステロールまたはオクタデカノール)による置換とそれに続くアミンの脱保護による2段階で行われる。
【0190】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミドの製造
2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド3g(オルト1、13.09mmol)をオクタデカノール3.54g(13.09mmol)と混合する。混合物を80℃で溶融させ、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム32mg(0.13mmol)を加えた後に2時間放置する。粗反応生成物をシクロヘキサンに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、次に飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮乾固させる。その粗生成物をそのまま次の段階で用いる。
【0191】
1′)N−{2−[17−(1,5−ジメチルヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシ]−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル}−2,2,2−トリフルオロアセトアミドの製造
この操作記録は上記のものと同じであり、この反応は触媒を用いずに行うこともできる。
【0192】
2)C−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イル)メチルアミンの製造
前段階1の粗反応生成物6.12g(13.09mmol)をテトラヒドロフラン20mLに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却し、4%水酸化ナトリウム30mLを加える。試薬が完全に消失するまで、混合物を室温で撹拌する(4時間かけて)。
【0193】
次に、溶媒をある程度濃縮し、ジエチルエーテル200mLで3回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。粗反応生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(塩化メチレン/メタノール9/1(体積比))。そうして、白色粉末2.6gが回収される(収率:上記一連の2段階1および2で53%)。
【0194】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm))。ほぼ50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0195】
*0.89(t、J=7Hz:3H);1.20〜1.45および1.58(2mt:計32H);2.75〜3.00(mt:2H);3.53(mt:2H);3.65〜3.85(mt:1H);4.00〜4.40(mt:2H);5.81および5.84(2s:計1H)。
【0196】
2′)C−{2−[17−(1,5−ジメチルヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシ]−[1,3]ジオキソラン−4−イル}メチルアミンの製造
この操作記録は、段階2)のものと同じである。そうして、白色粉末1.4gが回収される(収率:2連続段階1′および2″で22%)。
【0197】
1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm))。ほぼ50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0198】
*0.69(s:3H);0.85〜1.75および2.00(mt:計26H);0.88(mt:6H);0.93(d、J=7Hz:3H);1.01(s:3H);2.33(mt:2H);2.75〜3.00(mt:2H);3.50(mt:1H);3.71〜3.85〜4.05および4.16(4mt:計2H);4.20および4.35(2mt:計1H);5.36(mt:1H);5.93および5.96(2s:計1H)。
【0199】
b−メトキシポリエチレングリコール5000の酸の合成(親水性部分MeO−PEG 5000 −COOH)
市販のメトキシポリエチレングリコールの末端水酸基の酸化という1段階が必要である。
【0200】
MeO−PEG5000−OH20g(4mmol)を等量の水/アセトニトリル混合液100mLに溶かす。2,2,6,6−テトラメチルピペリジニルオキシル312mg(2mmol)および[ビス(アセトキシ)ヨード]ベンゼン6.4g(20mmol)を加え、反応混合物を室温で16時間撹拌する。
【0201】
その粗反応生成物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン/エタノール(1:1;体積比)混合液40mL中に取り、ジエチルエーテル500mLを加えることで沈殿させる。そうして、濾過およびエーテル洗浄によって、白色粉末19gが単離される(収率:95%)。
【0202】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm):3.39(s:3H);3.40〜3.95(mt:404H);4.15(s:2H)。
【0203】
c−メトキシ−(ポリエチレングリコール5000)−(N−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アミド(化合物C)およびメトキシ−(ポリエチレングリコール5000)−N−{2−[17−(1,5−ジメチルヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシ]−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル}アミド(化合物D)の合成
化合物C
前段階で得られたMeO−PEG5000−COOH1.2g(0.24mmol)を塩化メチレン5mLに溶かす。トリエチルアミン188μL(1.34mmol)を加え、次にC−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イル)メチルアミン100mg(0.27mmol)を加える。BOP143mg(0.32mmol、1.2当量)を加え、反応液を室温で1時間撹拌する。
【0204】
ジエチルエーテル(60mL)を加えることで反応混合物を沈殿させ、遠心分離し、エーテルで洗浄し、分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に注入する。最も純粋な分画を単離することで、白色凍結乾燥生成物415mgを得る(収率:32%)。
【0205】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm)):ほぼ50/50の割合の2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0206】
*0.90(t、J=7Hz:3H);1.20〜1.40および1.50〜1.75(mt:32H);3.39(s:3H);3.40〜3.95(mt:448H);4.02および4.03(2s:計2H);4.00〜4.25(mt:計3H):5.80および5.84(2s:計1H)。
【0207】
化合物D
この操作記録は、化合物Cの製造について示したものと同じである。最も純粋な分画を単離することで、白色の凍結乾燥生成物395mgが得られる(収率:30%)。
【0208】
1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):ほぼ50/50の割合の2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0209】
*0.68(s:3H);0.85〜1.75−1.85および2.00(mt:計26H);0.87(mt:6H);0.92(d、J=7Hz:3H);1.00(s:3H);2.33(mt:2H);3.39(s:3H);3.40〜3.90(mt:448H);4.00〜4.20(mt:計1H);4.01および4.04(2s:計2H);4.28および4.46(2mt:計1H);5.35(mt:1H);5.90および5.95(2s:計1H)。
【0210】
実施例6:PEG化脂質Eの合成
本実施例は、下記一般式の構造を有するPEG化脂質オクタデカノール−オルト2−PEG5000−OMeの合成経路について説明するものである。
【0211】
【化31】
a−2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イルアミンの合成(疎水性脂質部分−O−オルト2−NH 2 )
この合成は、上記で合成について説明した基質オルト2を原料とする、環外メトキシ基のオクタデカノールによる置換およびそれに続くアミンの脱保護により、2段階で行われる。
【0212】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミドの製造
2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−2−メチル−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミド3g(12.34mmol)をオクタデカノール3g(11.1mmol)と混合する。混合物を80℃で溶融させ、2時間放置して、アルコール交換中に生成する全てのメタノールを蒸発させる。
【0213】
溶融反応混合物をアセトニトリル50mL中に投入することで沈殿を生じさせる。予想生成物を、アセトニトリルからの再結晶によって精製する。そうして、白色粉末2.85gを単離する(収率:再結晶後で53%)。
【0214】
2)2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イルアミンの製造
前段階のトリフルオロアセトアミド誘導体1g(2.08mmol)をテトラヒドロフラン10mLに溶かし、それに4モル%水酸化ナトリウム10mLを加える。試薬が完全に消失するまで、混合物を室温で高撹拌する(4時間かけて)。
【0215】
次に、溶媒をある程度濃縮し、ジエチルエーテル100mLで3回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去して乾固させる。そうして、それ以上精製せずに、白色粉末810mgが回収される(収率:100%)。
【0216】
1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):0.89(t、J=7Hz:3H);1.20〜1.50(mt:計30H);1.49(s:3H);1.62(mt:2H);1.67(広いs:2H);2.71(mt:1H);3.46(t、J=7Hz:2H);3.54(広いd、J=10Hz:2H);4.30(dd、J=10および1.5Hz:2H)。
【0217】
b−メトキシ−(ポリエチレングリコール5000)−N−(2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イル)アミド(化合物E)の合成
この最後の段階では、脂質アミンとPEGの酸(それの合成は実施例5に記載)との縮合を行う。
【0218】
MeO−PEG5000−COOH1.15g(0.23mmol)を塩化メチレン5mLに溶かす。トリエチルアミン181μL(1.30mmol)を加え、次に2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イルアミン100mg(0.26mmol)を加える。BOP172mg(0.39mmol)を加え、反応液を室温で1時間撹拌する。
【0219】
ジエチルエーテル(60mL)を加えることで反応混合物を沈殿させ、遠心分離し、エーテルで洗浄し、分取HPLCに注入する。最も純粋な分画を単離することで、白色凍結乾燥生成物420mgを得る(収率:34%)。
【0220】
1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):0.89(t、J=7Hz:3H);1.20〜1.50(mt:30H);1.48(s:3H);1.55〜1.75(mt:2H);3.39(s:3H);3.40〜3.90(mt:448H);3.89(広いd、J=8.5Hz:1H);4.05(s:2H);4.30(広いd、J=12Hz:2H);7.57(d、J=8.5Hz:1H)。
【0221】
実施例7:酸感受性化合物AシンおよびトランスによるDNA取り込みに関する試験
上記で製造される酸感受性化合物Aのシン型およびトランス型は、DNAの非ウィルストランスフェクションに従来使用されているカチオン性脂質と類似の構造を有し、それらはそれ自体で構造中に、それらを酸感受性とする上で寄与する環状オルトエステル官能基を有する。
【0222】
従って本実施例の目的は、酸感受性化合物Aシンおよびトランスが、カチオン性脂質に対して特異的なトランスフェクション対象のDNAを取り込む能力を保持しながら、酸性媒体中で分解することから、取り込まれたDNAを放出する能力を有することを示すことにある。それは、臭化エチジウム(EtBr)を用いる蛍光試験によって容易に示すことができる。蛍光がなければ、遊離のDNAが存在しないことを反映しており、それはDNAが取り込まれていることを意味する。
【0223】
以下の説明においては、実施例3で製造した酸感受性化合物Aの2種類の型であるシンおよびトランスを用い、公開WO97/18185に記載されていて、H2N−(CH2)3−NH−(CH2)4−NH−(CH2)3−NH−CH2−CO−Gly−N[(CH2)17−CH3]2という式を有する非酸感受性類縁体を対照として用いた。この非酸感受性類縁体は、下記の説明において「対照カチオン性脂質」と称する。
【0224】
異なる力価を有する脂質溶液とDNA溶液を等量混合することで、対照カチオン性脂質または酸感受性化合物Aシンもしくはトランスを増量させながら、それとDNAを接触させる。そうして、濃度10μg/mLを有するDNA複合体800μLのサンプルを、対照カチオン性脂質または酸感受性化合物Aシンもしくはトランスの量を増加させながら、150mMの塩化ナトリウム溶液中で調製する。
【0225】
時間t=0で、濃度0.1mol/Lを有しpH5の緩衝液200μLをそれらのサンプルに加え、サンプルを37℃の乾燥機に入れる。臭化エチジウム(EtBr)による蛍光を、励起波長および発光波長をそれぞれ260nmおよび590nmとするフルオロマックス(FluoroMax)−2(Jobin Yvon−Spex)を用いて経時的に測定する(20℃で測定)。励起および発光用のスリット幅は、5nmに設定する。蛍光値は、DNA/カチオン性脂質もしくはDNA/酸感受性化合物溶液1mL当たり1g/L(DNA0.01mg/mL)の臭化エチジウム3μLを加えた後に、蛍光値を記録する。
【0226】
結果を図1にまとめてある。pH5では、DNAを取り込むのに用いられる酸感受性化合物Aシンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質の量が低すぎる場合(脂質0.4nmol/DNAμg)、従ってDNAが完全に取り込まれているわけではない場合、経時的に蛍光に有意な変動は測定されない。他方、それより多量(脂質1.7nmol/DNAμgおよび脂質6.0nmol/DNAμg)の場合には、(非酸感受性)対照カチオン性脂質に関して、酸感受性化合物Aシンおよびトランスの異なる挙動が認められ、DNAの完全な取り込みが可能である。実際、酸感受性化合物Aシンおよびトランスは、蛍光の増加によって示されるように、経時的にDNAを放出するが、酸感受性ではない対照カチオン性脂質の場合にはその放出はない。さらに、そのDNA放出は酸添加(pH5および37℃)から数時間後に生じる。
【0227】
使用される酸感受性化合物の量に応じて、DNA放出の動力学にも変化が認められる。使用される酸感受性化合物Aの量が少なくなるほど、DNA放出が急速になる。
【0228】
この試験は、酸感受性化合物Aシンおよびトランスの顕著な特性を示すものである。これら化合物は、DNAを取り込むことでそれと複合体を形成することができ、それの酸性媒体中での分解によって、DNAと形成された複合体の分解が生じ、従ってDNAが放出される。従ってこれらの酸感受性化合物は、細胞へのDNAの非ウィルストランスフェクションの文脈で特に有用である。
【0229】
実施例8: in vitro での酸感受性化合物Aシンおよびトランスのトランスフェクション力についての試験
本実施例は、前述の実施例に記載の非酸感受性類縁体(対照カチオン性脂質)と比較した、酸感受性化合物Aシンおよびトランスのin vitroでのトランスフェクション力を示すものである。
【0230】
本試験は、脂質1.0または4.0または6.0または10.0nmol/DNAμgという4種類の異なる使用比で行った。これら各条件について、ウシ胎仔血清を使用した場合および使用しない場合(「+および−血清」)で試験を行った。
【0231】
細胞の培養
ヒト頸部上皮癌由来のHeLa細胞(American type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA)を、2mM L−グルタミン、50単位/mLのペニシリンおよび50単位/mLのストレプトマイシンを加えたMEM(「最小必須培地」)型の培地存在下に培養する。培地および添加剤は、ギブコ/BRLライフテクノロジーズ(Gibco/BRL life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)から入手される。細胞を、インキュベータ中、37℃および5%二酸化炭素でフラスコ中にて培養する。
【0232】
トランスフェクション
トランスフェクション前日にHeLa細胞を、細胞数30000〜50000/ウェルで24ウェルプレートに移し入れる。これらの希釈液は、24時間後に約80%集密状態となる。
【0233】
トランスフェクションのため、細胞を2回洗浄し、血清を含む(10%FCS(体積比))または血清を含まない培地500μLとともに37℃でインキュベートする。
【0234】
プラスミドDNA 0.5μgを含む複合体50μLを各ウェルに加える(複合体は、ウェルへの添加の少なくとも30分前に調製する)。37℃で2時間後、血清を含まないプレートに10%(体積比)のFCS(「ウシ胎仔血清」)を補給する。
【0235】
全てのプレートを37℃および5%二酸化炭素に36時間置く。
【0236】
ルシフェラーゼ活性の測定
短時間で、トランスフェクション細胞をPBS(リン酸緩衝液)500μLで2回洗浄し、試薬(プロメガ(Promega)細胞培養物溶解試薬、ルシフェラーゼアッセイシステムキットから)250μLで溶解する。
【0237】
4℃で5分間遠心分離した(12000×g)溶解物の上清10μLの小分けサンプルを、光度計(Wallac Victor2光度計(1420 Multilabel couter))で測定する。
【0238】
ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン、補酵素AおよびATP存在下に10秒間にわたり発光によって定量し、2000個の処理細胞に関して表す。そこで、ルシフェラーゼ活性は、相対光単位(「RLU」:「相対光単位」)として表し、ピアースBCAキット(Pierce BCA kit, Rockford, IL, USA)を用いて得られるサンプルでの蛋白濃度で正規化する。
【0239】
図2にまとめた結果は、調べた3種類の化合物(酸感受性化合物Aシンおよびトランスならびに対照カチオン性脂質)について高いトランスフェクション活性を示している。それらの間で有意差は認められない。血清が存在しないと、トランスフェクションのレベルは全ての場合で高く(105〜107RLU/蛋白μg)、トランスフェクション力は使用される酸感受性化合物または対照カチオン性脂質の量に応じて上昇する。血清の存在によって、全ての場合でトランスフェクションの阻害が誘発される。
【0240】
従って本実施例は、シン型およびトランス型での酸感受性化合物Aのトランスフェクション力が、それの非酸感受性類縁体(対照カチオン性脂質)と比較して保存されることを示している。より一般的には、非ウィルストランスフェクションで有用であることが知られているカチオン性脂質型の分子への酸感受性環状オルトエステル官能基の導入は、その化合物が効率良くDNAをトランスフェクションする能力を破壊しない。
【0241】
実施例9:DNA/カチオン性脂質トランスフェクション性複合体のコロイド安定化のためのノニオン系界面活性剤としての酸感受性化合物CおよびDの使用
本実施例は、本願において(d)で定義の種類の酸感受性PEG化脂質を、DNA/カチオン性脂質トランスフェクション性粒子に関してコロイド安定化の役割を果たすノニオン系界面活性剤として使用することができることを示すものである。
【0242】
本実施例において使用するカチオン性脂質は、実施例7および8ですでに使用され、公開WO97/18185に式H2N−(CH2)3−NH−(CH2)4−NH−(CH2)3−NH−CH2−CO−Gly−N[(CH2)17−CH3]2(対照カチオン性脂質)で記載されているものである。
【0243】
実施例5で製造された化合物CおよびDを、酸感受性PEG化脂質として用いる。対照としては、BRIJ700(SIGMA)および下記式のPEG化脂質:
【0244】
【化32】
を用い、それらはそれぞれ化合物CおよびDの非酸感受性類縁体であり、ノニオン系界面活性剤として知られている(例えば、公開WO98/34648参照)。これら2種類の対照を水中10g/Lで用いる。
【0245】
核脂質複合体(DNA/対照カチオン性脂質)のサンプル1mLを、75mMの塩化ナトリウム溶液中10μg/mLのDNAから、対照カチオン性脂質およびPEG化脂質(化合物Cまたは化合物DまたはBrij700または類縁体D)の溶液とDNA溶液とを等量混合することで調製する。これらのサンプルはいずれも、1.5(DNA1μg当たりの脂質nmol単位)の対照カチオン性脂質/DNA比を有し、含有PEG化脂質量を増加させる(ポリマー/DNAの重量比として表す)。
【0246】
得られる粒子の径の測定は、混合後30分に行い、特に対照カチオン性脂質/DNA複合体の安定化に対する酸感受性PEG化脂質(化合物CまたはD)または非酸感受性PEG化脂質(Brij700または類縁体D)の量の影響を調べることができる。流体力学的直径の測定は、DNA 0.01mg/mLを含む異なる溶液800μLを充填したプラスチックキュベット(4つの透明な面)を用いるコールター(Coulter)N4Plus装置で行い、測定は単一モードで90°にて行う。
【0247】
結果を図3に示してあるが、この図は使用される化合物CもしくはDまたはBrij700もしくは類縁体Dの量の関数としての対照カチオン性脂質/DNA粒子の径における変動を示したものである。
【0248】
酸感受性PEG化脂質とそれの安定な対照が、ある最小量に達した時に粒径の小さい(100nm未満)対照カチオン性脂質/DNA粒子を形成することができ、しかもその同じ対照カチオン性脂質/DNA粒子が、酸感受性や非酸感受性PEG脂質が存在しない場合、または後者の量が非常に低い場合には、自然に凝集する(1μmより大きい粒径)ことが認められる。
【0249】
そこで本実施例では、化合物CおよびD、より一般的には本願の一般式(I)において(d)で定義の種類の酸感受性PEG化脂質をノニオン系界面活性剤として用いることができ、それのコロイド安定化力が、核脂質粒子のコロイド安定化に従来使用されている安定なノニオン系界面活性剤(すなわち、例えばBrij700などの非酸感受性のもの)の力に匹敵することが示される。
【0250】
実施例10:化合物CおよびDによるDNA/カチオン性ベクター複合体のコロイド安定化に対するpHの影響
本実施例は、本願の一般式(I)における(d)で定義される種類の酸感受性PEG化脂質であって、DNA/カチオン性脂質核脂質複合体を安定化するノニオン系界面活性剤として使用されるものを、酸性pHで分解することができ、従って前記核脂質複合体を放出することができることを示すものである。
【0251】
ここで使用される顕著な特性は、PEG化脂質を脂質部分を持たないPEGに置き換えた場合に、コロイド安定化がないことである。実際、カチオン性ベクターおよび酸感受性PEG化脂質の存在下でのDNAの緩衝剤を含まない媒体中での製剤によって、小さい粒子が生じる(上記の実施例9参照)。他方、PEGのみ(すなわち、脂質部分に結合していない)を用いる同じ試験では安定化は得られない。
【0252】
本実施例で使用される酸感受性PEG化脂質は、実施例5で製造の化合物D、ならびに前記実施例および後述の説明で「類縁体D」と称されるそれの非酸感受性類縁体である。
【0253】
核脂質複合体(DNA/対照カチオン性脂質)のサンプル1mLを、75mMの塩化ナトリウム溶液中10μg/mLのDNAから、対照カチオン性脂質および化合物Dまたは非酸感受性類縁体Dを含む溶液とDNA溶液とを等量混合することで調製する。これらのサンプルはいずれも、対照カチオン性脂質/DNA比が1.5(DNA1μg当たりの脂質nmol単位)であり、含有PEG化脂質量を増加させる(ポリマー/DNAの重量比として表す)。
【0254】
pH5の酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(0.1mol/L)100μLを、換気式乾燥機中37℃にサーモスタット調節したこれらサンプルに加える。粒子径を時間の関数として測定する。
【0255】
得られる結果を図4に示してあり、その図は時間の関数として、さらに酸感受性もしくは非酸感受性PEG化脂質/DNA比(3種類の重量比で試験:0.5または0.75または1)に従っての核脂質粒子粒径を表す。
【0256】
類縁体D(非酸感受性PEG化脂質)の場合、pHは粒子のコロイド安定性に影響しない。形成される粒子は、使用される類縁体D/DNA比とは無関係に、100nm程度の小さい粒径を有する。時間t=0では、化合物D/DNA比とは無関係に、化合物では同じ安定性が認められる。
【0257】
他方、化合物Dを酸性pH(pH5)でのノニオン系界面活性剤として用いる場合に、時間の関数としての核脂質粒子の粒径の上昇が認められる。化合物D/DNA比が低いほど、核脂質粒子の粒径におけるその上昇が急速になる。そこで、4時間後に、比率が低い場合(0.5)には粒子は完全に凝集体になっており、大過剰の化合物Dを用いる場合(比率1)にはそれが全くないかごくわずかである。
【0258】
従ってその結果から、化合物DがpH値に対して感受性であると推測することができる。実際、時間の関数としての核脂質粒子粒径の増加は、酸性媒体を用いた場合の酸感受性PEG化脂質(化合物D)の分解を反映している(実際に、その化合物の酸感受性部分のレベルで脂質部分の「脱離」がある)。
【0259】
さらに、酸感受性PEG化脂質/DNA比を上昇させることで、凝集に要する時間も増加し、それは酸感受性PEG化脂質の使用量が増えるに連れて、その中で核脂質粒子の凝集が起こる閾値を超える前に分解を起こすべきものが増えることを示す傾向を有している。そこで、酸感受性コロイド安定化剤の量を調節することで、所定のpHで有効成分を放出するのに要する時間をプログラムすることが可能である。
【0260】
実施例11:カチオン性脂質/中性共脂質( co−lipid )/化合物D混合物で調整されるDNAの in vivo でのトランスフェクション
本実施例は、カチオン性脂質系のリポソームで調整されるDNA転移の効率に対する化合物Dなどのノニオン系界面活性剤の影響を示すものである。
【0261】
1)リポソームの製造
それぞれクロロホルムに溶かした下記式:
【0262】
【化33】
のカチオン性脂質および中性脂質DOPE(Avanti Polar Lipids, Birmingham, ALから入手)を等モル量ずつ混合する。
【0263】
適切な量の化合物Dをクロロホルムに溶かし、混合物に加える。使用する化合物Dの量は、総脂質量のモル%で示す。
【0264】
次に、有機溶媒をアルゴン気流下で留去することで、試験管の底に脂質薄膜を形成する。この薄膜を少なくとも1時間にわたり真空乾燥し、pH7.4の20mM HEPES緩衝液および5%ブドウ糖で、4℃にて2時間にわたり再水和させる。そうして得られる脂質懸濁液を50℃で30分間加熱し、次に5分間超音波処理して、約100nmのリポソームの均一懸濁液を形成する。
【0265】
使用するDNAは、CMVプロモーターの制御下でCAT遺伝子を含むプラスミドDNAである。使用されるプラスミドDNAは、エンドトキシンレベルが20U/mg未満であり、超らせんDNAの量が90%より大きく、大腸菌DNAの混入が5%未満であり、RNAの混入が5%未満であり、蛋白の混入が1%未満であるという基準を有する。
【0266】
2)DNA/脂質複合体の製造
急速かつ激しく撹拌しながら、DNA溶液に等容量のリポソーム懸濁液(適切な濃度で)を急速に加える。全体として、DNA 1μgがカチオン性脂質5nmolと複合体を形成する。この形成された複合体は、約100〜240nmの直径を有する。
【0267】
3) in vivo での投与
全ての実験で、約6週齢の雌Balb/Cマウスを用いる。各マウスには、右脇腹に106個のM109細胞を皮下注射する。腫瘍が約300mm3の大きさに達した時に、マウスに対して静脈注射にて、DNA50μgを含むDNA/脂質複合体200μLを投与する。注射から24時間後に組織を摘出し、用時まで−70℃で保存する。
【0268】
4)CATアッセイ
「ファストプレプ細胞破壊装置FP120(FastPrep Cell Disrupter FP120)」(Bio 101/Savant)を用いて組織を均質化する。次にサンプルを、5分間にわたり100回転/分で遠心分離する。発現されるCAT導入遺伝子の量を、標準的なCAT ELISA法(Roche, IN)を用いて求める。
【0269】
5)結果
DNA/カチオン性脂質/DOPE複合体の遺伝子転移活性に関する化合物Dの用量−応答曲線を調べた。陰性対照としては、化合物「類縁体D」を用いた。予想通り、最も高い遺伝子転移は肺で起こる。化合物「類縁体D」を用いることで、用量依存的に肺および腫瘍でのトランスフェクション活性が阻害されることが認められた。化合物Dの量を増やすことでも、肺でのトランスフェクション活性が阻害される。他方、遺伝子転移は腫瘍では影響を受けないように思われる。これらの結果は、腫瘍の酸性環境により、管外溢出後に粒子の残りの部分からPEG部分が分離するという仮説と一致している。
【0270】
こうして得られ、図7に示した結果は、化合物Dにより、肺と比較して腫瘍に対して特異的な遺伝子転移活性を40倍上昇させることができることを示している。
【0271】
実施例12:pHの関数としての酸感受性化合物の安定性についての試験
本実施例は、本発明による酸感受性化合物が、存在するオルトエステル環(5員環または6員環)の性質に応じて調節可能である酸感受性を有することを示すものである。
【0272】
この趣旨において、各種範囲の感受性を網羅することができる各種酸感受性PEG化脂質について、pHおよび時間の関数として核脂質複合体(実施例9および10で用いたものと同じもの)の粒径の変動を測定する。これらの試験は、一定の対照カチオン性脂質/DNA比および酸感受性PEG化脂質/DNA比で行う。
【0273】
DNA/対照カチオン性脂質/酸感受性PEG化脂質複合体のサンプル1mLを、以下のようになるように調製する。
【0274】
−対照カチオン性脂質/DNA比が1.5nmol/μgである。
【0275】
−酸感受性PEG化脂質/DNA比が0.5または1である。
【0276】
−DNA濃度が、75mMの塩化ナトリウム溶液中20μg/mLである。
【0277】
30分後、0.05mol/Lの緩衝液500μLおよび150mMの塩化ナトリウム溶液500μLを、換気式乾燥機中37℃でサーモスタット調節された上記サンプルに加える。そうして酸性pHとし、粒径を時間の関数として測定する。
【0278】
サンプルの最終濃度は、75mMの塩化ナトリウム溶液中DNA10μg/mLである。使用する緩衝液は、pH4、pH5およびpH6のクエン酸/クエン酸ナトリウム緩衝液、ならびにpH7.4のHepes/水酸化ナトリウム緩衝液である。
【0279】
得られた結果を図5に示してあり、その図は、前記実施例で製造され、使用されるオルトエステル環(5員環もしくは6員環)の性質のみが異なる酸感受性化合物CおよびEについての、pHおよび時間の関数としての核脂質粒子の粒径における変動を示すものである。
【0280】
これら2種類の化合物について、pHが酸性の場合には、時間の関数としての核脂質粒子の粒径に上昇が認められ、それは分解を反映している。他方、pHが7.4の場合には、時間の関数としての核脂質粒子の粒径に上昇は認められない。さらに、pHが低くなるにつれて、核脂質粒子の凝集が急速に増える。
【0281】
最後に、試験を行った2種類の化合物CおよびEの間で、動力学に大きい相違が認められる。pH6では、化合物Eを用いた場合には酸性化から約1時間後に核脂質粒子の凝集が開始するが、化合物Cを用いた場合には少なくとも4時間にわたって安定化を行うことができる。
【0282】
これらの結果は、酸感受性化合物CおよびE、より一般的には本発明によるその種の酸感受性化合物に下記のようないくつかの顕著な特性があることを示している。
【0283】
−それらはいずれも、酸性pH値で高い感受性を示し、いずれの場合もpHが低いほど、それの不安定化が急速になる。
【0284】
−それらはいずれも、生理的pH(pH7.4)では比較的安定である。
【0285】
−それらの分解の動力学は、使用されるオルトエステル基(5員環または6員環)に応じて非常に異なる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
カチオン性脂質または酸感受性化合物0.4または1.7または6.0nmol/DNAμgという3種類の異なる比率で、DNAと対照カチオン性脂質または酸感受性化合物A シンもしくはトランスとの間で形成される複合体のpH5での時間の関数としての蛍光レベルの変動を示す図である。
【図2】
血清を含む場合または含まない場合での、各種使用比率でのDNAと化合物A シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質との間で形成された複合体のHeLa細胞へのin vitroでのトランスフェクションの効率を示す図である。
【図3】
DNA量に関して使用される化合物Cまたは化合物DまたはBrij700または化合物Dの非酸感受性類縁体(類縁体D)の量(重量比)の関数としての対照カチオン性脂質/DNA核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。
【図4】
pHが5の場合の各種比率(重量比)での、時間の関数としての対照カチオン性脂質/DNA/化合物もしくは類縁体D核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。
【図5】
各種pH(pH4、pH5、pH6およびpH7.4)での時間の関数としての、対照カチオン性脂質/DNA/化合物Cもしくは化合物E核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。
【図6】
プラスミドpXL3031の模式図である。
【図7】
カチオン性脂質/DOPE/DNA(5/5/1)複合体が介在するin vivoでの遺伝子転移活性に対する化合物Dについての用量/応答曲線を示す図である。
(技術分野)
本発明は、酸感受性化合物およびその化合物の製造に関する。これらの化合物は、少なくとも1個の親水性置換基および酸感受性である環状オルトエステルを有する。これらの化合物は、生物活性物質と結合体(リポソーム、複合体、ナノ粒子など)を形成し、それらをpHが酸性である細胞組織または区画に放出するのに有用であるか、あるいは生物活性物質を包み込んだ粒子を安定化し、それを酸性媒体中で不安定化するためのノニオン系界面活性剤として有用であるか、あるいは治療性分子に共有結合的に結合して、それをpHが酸性である細胞組織または区画に放出するベクターとして有用である。
【0002】
(背景技術)
生理的に正常のものと比較して酸性度の高い組織または細胞への生物活性物質の放出は、多くの研究が取り挙げている既知の問題であって、現在のところ、結果的に完全に満足な結果が得られていない。そこで、多くのpH感受性リポソームを設計して、ある種の組織またはエンドソームの酸性化を利用することで生物活性物質を放出することが行われている。
【0003】
例えばヤトビンら(Yatvin et al., Science, Vol. 210, 1980, pp.1253−4)は、下記式の従来のリポソームの脂質二重層内に挿入され得るpH感受性脂質を設計している。
【0004】
【化5】
この脂質に存在するホモシステインは、中性またはアルカリ性のpHでは開環型であり、その場合には、リポソームの二重層内に完全に挿入される脂肪酸に似ている。酸性のpHでは、それは閉環型で存在する。それは次に、環状チオラクトンを形成することで、リポソーム二重層を不安定化することで活性物質の放出を可能とする中性脂質に似ている。そのような分子は、pHが生理的pHより低い身体領域、例えば原発腫瘍、転移または炎症部位および感染部位における医薬分子の放出を可能とするものである。
【0005】
米国特許第5965434号には、下記式のカチオン性pH感受性親水性部分を有する両親媒性脂質が提案されている。
【0006】
【化6】
式中、R1およびR2は互いに独立に、CH3(CH2)14、CH3(CH2)12、CH3(CH2)7CHCH(CH2)7を表し;R3は、置換基1−メチルイミダゾール、イミダゾール、4,9−ジオキソ−1,12−ドデカンジアミン、システアミン、1−(3−アミノプロピル)イミダゾール、モルホリン、4−アミノピリジン、ピリジン、グアニジン、ヒドラジン、チオウロニウムまたはピペラジンを表す。
【0007】
これらの化合物は、pHが8.0から4.5に低下すると増加する全体的な正電荷(化合物R3のレベルで)を有するという特徴的特性を有する。この電荷調節はリポソームの立体配座的変形を誘発することで、リポソームにその内容物を放出させる。そこでこれらの脂質は、pHが4.5以下で変動する酸性媒体中に医薬分子または核酸分子を放出させる。
【0008】
さらに、特許出願WO 97/31624には、細胞質で分解し得るビニルエーテル官能基を有し、下記一般式の構造を有するpH感受性リン脂質(「誘発性(triggerable)脂質)が提案されている。
【0009】
【化7】
式中、pおよびqは0または1であり;これら二つのうちの少なくとも一つは1であり;R1およびR2は互いに独立に、炭素原子数12〜24のアルキルまたはアルケンを表し;Rは2−アミノエチル、2−(トリメチルアミノ)エチル、2−(N,N−ジメチルアミノ)エチル、2−(トリメチル−アンモニウム)エチル、2−カルボキシ−2−アミノエチル、スクシンアミド−エチルまたはイノシチルから選択される基を表す。
【0010】
これらのリン脂質を、それ自体が細胞受容体リガンドと複合体を形成する他のリン脂質と混合して、酸性pHで立体配座変化を受けることができるリポソームを形成する。そのようなリポソームによって、多くの医薬物質の包み込み、そしてさらには遺伝子療法用の核酸の包み込みを行うことができる。
【0011】
別の手法も報告されており(Kratz et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1999, 16(3), pp.245−88)、そこでは、治療性分子を酸感受性結合を介してポリマーに共有結合的に結合させて、前記治療性分子を、弱酸性の腫瘍組織あるいは高分子結合体の細胞取り込み後のエンドソームおよびリソソームに放出させる。そうして、多くの可能な結合が報告されており、例えばアセタール、ジスルフィド、ヒドラゾン、シス−アコニトリル(cis−aconitrile)、トリチルまたはシリル化エーテル結合などがある。
【0012】
しかしながら、今日までに開発されたいずれのpH感受性化合物も、その感受性に関して調節できないという欠点を有する。従って、標的の組織もしくは細胞、放出される生物活性物質または想到される用途などに応じて感受性を調節可能な酸不安定性化合物を持つことができることは、非常に有利であるものと考えられる。より一般的には、製造が容易であって、特に核酸のトランスフェクションにおいて有効な新たなpH感受性化合物を持つことも有利であると考えられる。
【0013】
(発明の開示)
この問題を解決するため、本出願人は、環状オルトエステルならびにポリアルキレングリコール類、単糖類もしくは多糖類、親水性治療性分子またはポリアミン型の基から選択される少なくとも一つの親水性置換基を有することを特徴とする新規な種類の酸感受性化合物を開発した。
【0014】
そのような化合物は、酸感受性である環状オルトエステル官能基によって、身体の酸性領域への生物活性物質の指向(vectorization)および放出において有用である。それらは、中心の炭素上に存在する置換基およびオルトエステル環の大きさの選択に応じて化合物のpH感受性を調節可能であることにより、特に有利である。従って、その化合物の加水分解の動力学を広い範囲で変動させることが可能であり、従って生物活性物質の放出に要する時間を調節することが可能である。さらに、本発明による酸感受性化合物は、自己触媒的に酸性媒体中で分解するようになるという別の長所を有する。実際に、本発明による酸感受性化合物の部分分解によって、pH低下を誘発する酸(例えば、原料化合物がオルトギ酸エステル由来の場合にはギ酸、あるいは原料化合物がオルト酢酸エステル由来である場合には酢酸、あるいは原料化合物がオルト安息香酸エステル由来である場合には安息香酸)が徐々に放出され、その分解がさらに促進される。
【0015】
より詳細には、本発明による酸感受性化合物は、下記式の構造を有する。
【0016】
【化8】
式中、
・gは0、1、2、3または4の値を取り得る整数であり;
・Gは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数1〜6のアルキル基、またはアリール基を表し;
・G1およびG2は、
(a)一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(b)一方が炭素原子数10〜24であって、1以上の不飽和を有していても良い疎水性直鎖アルキル基を表し;他方が下記一般式の基:
【0017】
【化9】
(式中、iは1〜4(両端を含む)から選択される整数であり;jは9〜23(両端を含む)から選択される整数であり;親水性置換基は、ポリアミン型の基から選択される)を表し;あるいは
(c)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が、ポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表し;あるいは
(d)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体、疎水性デンドリマー、あるいは単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体もしくは疎水性デンドリマーとモノマー単位1〜20個を有するポリアルキレングリコール分子との間の共有結合結合体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(e)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が治療性分子を表し;あるいは
(f)一方が親水性の治療性分子を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表す。
【0018】
オルトエステルの中心炭素上にある置換基Gを選択して、本発明による酸感受性化合物の感受性を調節する。そこで、基Gの電子供与性が高いほど化合物の酸感受性が高く、基Gの電子吸引性が高いほど化合物の酸感受性は低い。従って、基Gの選択が一般式(I)の酸感受性化合物の特性を決定および調節する上で特に重要であるように思われる。本発明の好ましい態様によればGは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形での炭素原子数1〜6のアルキル基あるいはアリール基から選択される。さらに有利な形では、Gは水素、メチル、エチルまたはフェニルから選択される。
【0019】
(発明を実施するための最良の形態)
本発明に関して、「アリール基」という表現は、1価の芳香族炭化水素基を意味するものである。本発明におけるアリール基は、一般に6〜14個の炭素原子を有する。好ましくは本発明におけるアリール基は、フェニル、ナフチル(例えば1−ナフチルもしくは2−ナフチル)、ビフェニリル(例えば2−ビフェニリル、3−ビフェニリルまたは4−ビフェニリル)、アントリルまたはフルオレニルから選択される。フェニルが特に好ましい。アリール基、特にフェニルは置換されていても良く、例えばモノ置換、ジ置換、トリ置換またはテトラ置換されており、それらの置換基は同一でも異なっていても良い。好ましくはその置換基は、ハロゲン原子、(C1〜C8)アルキル基または(C1〜C8)アルコキシ基から選択される。モノ置換フェニル基の場合、前記置換基は2位、3位または4位に置換されていても良い。ジ置換フェニル基の場合、前記置換基は2,3位、2,4位、2,5位、2,6位、3,4位または3,5位にあることができる。トリ置換フェニル基の場合、その置換基は、例えば2,3,4位、2,3,5位、2,4,5位、2,4,6位、2,3,6位または3,4,5位にあることができる。
【0020】
場合に応じて、置換基G1およびG2のそれぞれは、環状オルトエステルに直接結合しているか、あるいは当業者には公知であるものから選択される「スペーサー」分子を介して間接的に連結されている。そのような「スペーサー」分子によって、結合を形成するだけでなく、対象の置換基を環状オルトエステルから離れさせて、酸感受性環状オルトエステルとそれの置換基との間の望ましくない相互作用を低減することもできる。好ましいスペーサー分子は、例えばアルキル類(炭素原子数1〜6)、カルボニル、エステル、エーテル、アミド、カーバメートもしくはチオカーバメート結合、グリセリン、尿素、チオ尿素またはそれらの基のいくつかの組み合わせから、置換基G1またはG2の性質に応じて選択することができる。例えば、疎水性置換基がステロイド誘導体の場合、スペーサー分子はカーバメート−N−C(O)−O−型の結合であることができるか、あるいは疎水性置換基が二重鎖アルキルの場合、スペーサー分子は式−アルキル−C(O)−Nの基から選択することができ、その場合2個のアルキル鎖が窒素原子に固定されている。
【0021】
本発明の好ましい態様によれば、ポリアミン型の基とは、少なくとも3個の炭素原子を有し、少なくとも1個のメチレン基がアミノ基で置き換わっていても良く、そのアミノ基は置換されていても良く(例えばメチル基で)、末端メチルが(1級、2級、3級または4級)アミン類、グアニジン類または環状グアニジン類から選択される1以上の基で置換されている直鎖または分岐のアルキルであると定義することができる。これらのポリアミン型の基は好ましくは、すでに公知であって、核酸の指向について文献に、例えば公開WO96/17823、WO97/18185、WO98/54130またはWO99/51581に記載のポリアミン基から選択される。詳細には、それには例えば、下記一般式のポリアミン類などがあり得る。
【0022】
【化10】
式中、
−Rは、非存在であることから環状オルトエステルとの共有結合を表すただ1個のR基を除いて水素原子であり;
−nは1〜9(両端を含む)の整数であり;
−mは2〜6(両端を含む)の整数であり、mの値は異なる−(CH)m−NH−基内で同一でも異なっていても良い。
【0023】
別の態様によれば、それはまた、下記一般式のポリアミン型の基を含むことができる。
【0024】
【化11】
式中、
−R1、R2およびR3は互いに独立に、水素原子または基−(CH2)q−NRR=を表し、qは1、2、3、4、5および6の間で変動することができ、それは、異なる基R1、R2およびR3間で独立であり;RおよびR=は互いに独立に、水素原子または−(CH2)q=−NH2を表し、q=は1、2、3、4、5および6の間で変動することができ、それは異なる基RおよびR=の間で独立であり;
−mおよびpは互いに独立に、1〜6の間で変動し得る整数を表し;
−nは、0〜6の間で変動し得る整数を表し;nが1より大きい場合、mは異なる値を取ることができ、R3は前記一般式において異なる意味を有し、nが0である場合、R1およびR2のうちの少なくとも一方は水素とは異なる。
【0025】
本発明の別の態様によれば、ポリアミン型の基は、前記のものと同一の一般式を有する置換基であって、RおよびR=が互いに独立に、水素原子または下記式(1)の基を表すもので表すことができる。
【0026】
【化12】
上記式中、rは0〜6(両端を含む)で変動し得る整数であり;基R5は互いに独立に、水素原子、アルキル、カーバメートまたは脂肪族もしくは芳香族アシル置換基を表し;その置換基はハロゲン化されていても良く;基R1、R2およびR3のうちの少なくとも一つが少なくとも1個の式(1)の基を有するものである。
【0027】
そこで、1以上の末端グアニジン官能基を有するポリアミン型の基が得られる。
【0028】
本発明の別の態様によれば、ポリアミン型の基はまた、上記したようなポリアミンであって、下記式(2)の環状グアニジン型の末端基(アミンやグアニジンに代えて)を有するものも表すことができる。
【0029】
【化13】
式中、
・mおよびnは互いに独立に、0〜3(両端を含む)の整数であって、m+nは1以上となるものであり;
・R1は、下記式(3)の基を表し
【0030】
【化14】
上記式中、pおよびqは互いに独立に、0〜10(両端を含む)の整数であり;Yはカルボニル、アミノ、メチルアミノまたはメチレン基を表し;Yは異なる[(CH2)p−Y]基で異なる意味を有することができ;(*)は、水素原子または共有結合を表し;R1はZを含む一般式(2)のいずれの原子にも連結されていることができること、また式(2)には1個の基R1があること;
・Xは基NR2またはCHR2を表し;R2は水素原子または上記で定義の基R1との結合であり;
・基
【0031】
【化15】
は、次のものを表す。
*第1の場合
下記一般式(4)の基:
【0032】
【化16】
[式中、W=はCHR===またはNR===を表し;R==およびR===は互いに独立に、水素原子、メチルまたは上記で定義の基R1との結合である]または
*第2の場合
下記一般式(5)の基:
【0033】
【化17】
[式中、W=はCHR===またはNR===を表し;R=およびR===は互いに独立に、水素原子、メチルまたは上記で定義の基R1との結合である]
を表す。
【0034】
一般には、特に静電相互作用による核酸との結合について当業者には公知の任意のポリアミン型の他の基も好適であり得る。
【0035】
本発明に関して、単鎖または二重鎖アルキルとは、炭素原子数10〜24であって、1以上の不飽和を有していても良い1個または2個の直鎖アルキル鎖からなる疎水性基を表す。二重鎖アルキルの場合、それは例えば、窒素原子に結合していることで、ジアルキルアミノ置換基を形成している2個のアルキル鎖を含むことができ、その2個のアルキル鎖は例えば、直鎖であって、炭素原子数10〜24であり、1以上の不飽和を有していても良い。それは例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸またはミリスチン酸などの飽和または不飽和脂肪酸などであり得る。好ましくは、単鎖または二重鎖アルキルは炭素原子12〜18個を有しており、さらに好ましくはそれは、炭素原子12個、14個、16個または18個(各アルキル鎖について)を有する基から選択される。
【0036】
本発明に関して「ステロイド誘導体」とは、例えばステロール類、ステロイド類およびステロイドホルモン類から選択される置換基を意味する。より好ましくはステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、3−α−5−シクロ−5−α−コレスタン−6β−オール、コール酸、ギ酸コレステリル、ギ酸コレスタニル、ギ酸3α,5−シクロ−5α−コレスタン−6β−イル、コレステリルアミン、6−(1,5−ジメチルヘキシル)−3a,5a−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ−[a]シクロプロパ[2,3]シクロペンタ[1,2−f]ナフタレン−10−イル−アミン、コレスタニルアミンまたはデキサメタゾンから選択される。
【0037】
本発明における疎水性デンドリマーは好ましくは、疎水性ポリ(アルキルエーテル)類または疎水性ポリ(アリールエーテル)類から選択される。特に有利な形態では、本発明における疎水性デンドリマーは、ポリ(ベンジルエーテル)類から選択される。
【0038】
本発明に関して、ポリアルキレングリコール類は好ましくは、平均分子量102〜105ダルトン(Da)を有し、標的指向要素に共有結合的に連結していても良いポリアルキレングリコール類から選択される。特に有利な形態では、本発明におけるポリアルキレングリコール類は、平均分子量102〜105Da、より好ましくは500〜105Daを有するポリエチレングリコール類(PEG)から選択される。
【0039】
本発明に関して、「単糖類または多糖類」とは、標的指向要素に共有結合的に連結していても良い1以上の糖からなる分子を意味する。例として、ピラノース類およびフラノース類を挙げることができ、例えばグルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトースまたはマルトース、乳糖、サッカロース、ショ糖、フコース、セロビオース、アロース、ラミナロビオース(laminarobiose)、ゲンチオビオース、ソホロース、メリビオースなどがある。さらにそれは、いわゆる「複合」糖を含むこともできる。すなわち互いに共有結合的に結合しているいくつかの糖であり、各糖は好ましくは上記で挙げたものから選択される。好適な多糖類としては、デキストラン類、α−アミロース、アミロペクチン、フルクタン類、マンナン類、キシラン類およびアラビナン類があり得る。好ましくは本発明における単糖類または多糖類は、天然糖類、シクロデキストリン類またはデキストラン類などの薬理用途に適合する天然または商業的誘導体から選択される。
【0040】
本発明の別の形態によれば、ポリアルキレングリコールまたは単糖類もしくは多糖類は、標的指向要素に共有結合的に連結されていても良い。その場合それには、本発明による酸感受性化合物またはそれを含む組成物を、ある細胞種またはある所望の組織(腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞など)に向かわせることができる細胞外標的指向要素を含むことができるか、あるいはある種の好ましい細胞区画(ミトコンドリア、核など)に指向させることができる細胞内標的指向要素を含むことができる。
【0041】
本発明の文脈で使用することができる標的指向要素の中で言及できるものとしては、糖類、ペプチド類、蛋白類、オリゴヌクレオチド類、脂質類、神経伝達物質、ホルモン類、ビタミン類またはそれらの誘導体がある。好ましくはそれには、糖類、ペプチド類、ビタミン類または蛋白類があり、例えば抗体もしくは抗体断片、細胞受容体のリガンドもしくはそれの断片、受容体または受容体断片などがある。例えばそれには、成長因子受容体のリガンド、サイトカイン受容体、細胞レクチン型の受容体、葉酸受容体またはインテグリン類などの接着蛋白の受容体に対して親和性を有する配列RGDを持つリガンドなどがあり得る。トランスフェリン、HDL類およびLDL類または葉酸輸送体の受容体も挙げることができる。標的指向要素はまた、アシアロ糖蛋白の受容体またはシアリルルイスXのようなシアライド(syalydes)の受容体のようなレシチン類、あるいは抗体Fab断片、または単鎖抗体(ScFv)を指向させることが可能な糖であることもできる。
【0042】
本発明に関して、「ポリアルキレンイミン類」とは、公開WO 96/02655に記載のポリマー、すなわち下記一般式のモノマー単位を有するポリマーを表す。
【0043】
【化18】
式中、
Rは水素原子または下記式の基であることができ;
【0044】
【化19】
nは2〜10の整数であり;pおよびqは、合計p+qがポリマーの平均分子量が100〜107Daとなるように選択される整数である。
【0045】
この式では、nの値は異なる−NR−(CH2)n−単位間で変動し得る。そこで、この式は単独重合体とヘテロ重合体の両方を包含するものである。市販のポリアルキレンイミン類が有利な選択肢である。ポリエチレンイミン類(PEI)が最も好ましく、より具体的にはPEI25K(平均分子量25KDaのPEI)、PEI50K、PEI100KまたはPEI200Kである。
【0046】
本発明において、「治療性分子」とは、生理的に正常なものと比較して酸性度の高い身体領域で発現する病気を予防または治療することを可能とする分子を意味する。そのような領域はより具体的には、
−腫瘍、詳細には生理的に正常なものより高い局所酸性度を示す腫瘍細胞およびその腫瘍細胞付近の正常細胞(例えば、腫瘍の内皮細胞)(N. Raghunand et al., Drug Resistance Updates, 2000, 3, pp.30−38);
−虚血の影響を受けた筋肉、例えば部分的に糖型の炭化水素または脂肪酸の嫌気性発酵によって産生される乳酸のために酸性症が生じている心筋;
−大食細胞による超酸化物イオンの産生が多量の酸素を消費する炎症領域;あるいは
−代謝、感染または炎症障害が局所酸性症を生じている組織
であるが、これらに限定されるものではない。
【0047】
別の形態によれば、本発明における「治療性分子」は、酸性の細胞区画、例えば酸性である細胞のエンドソームへのそれの放出によって、病気を予防または治療することができる。
【0048】
そこで治療性分子は、例えばペプチド類、オリゴペプチド類、蛋白類、抗原類およびそれの抗体類、酵素類およびそれの阻害剤類、ホルモン、抗生物質、鎮痛薬、気管支拡張薬、抗微生物薬、抗高血圧薬、心血管薬、中枢神経系に作用する薬剤、抗ヒスタミン薬、抗鬱薬、精神安定薬、抗痙攣薬、抗炎症物質、刺激薬、鎮吐薬、利尿薬、鎮痙薬、抗虚血薬、細胞死を制限する薬剤または抗癌剤から選択することができる。
【0049】
さらに、「生物活性物質」とは、上記の治療性分子または核酸から選択される物質を意味する。
【0050】
本発明に関して「核酸」とは、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を意味する。これは、天然または合成の配列を含むことができ、詳細にはゲノムDNA(gDNA)、相補DNA(cDNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、ハイブリッド配列または合成もしくは半合成配列、修飾を受けたもしくは受けていないオリゴヌクレオチドがある。これらの核酸は、例えばヒト、動物、植物、細菌、ウィルスまたは合成由来のものであることができる。これらは当業者には公知の方法によって得ることができ、詳細にはライブラリーのスクリーニング、化学合成あるいはライブラリーのスクリーニングによって得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む組み合わせ方法によって得ることができる。それは化学的に修飾することができる。
【0051】
より詳細にデオキシリボ核酸については、1本鎖または2本鎖、さらには短いオリゴヌクレオチドまたは相対的に長い配列であることができる。詳細には、核酸は有利には、例えばプラスミド、ベクター、エピソームまたは発現カセットからなる。これらのデオキシリボ核酸は詳細には、標的細胞、1以上のマーカー遺伝子、転写もしくは複製の調節に関する配列、治療対象の遺伝子、修飾を受けていてもよいアンチセンス配列あるいは他の細胞要素に結合する領域で機能性を発揮することもある複製起点を有することができる。
【0052】
好ましくは核酸は、標的細胞で活性である1以上のプロモーターおよび転写ターミネーターの制御下にある治療対象の1以上の遺伝子からなる発現カセットを有する。
【0053】
本発明に関して、「該当遺伝子の発現カセット」とは、特定の制限部位でベクターに挿入することができるDNA断片を意味する。そのDNA断片は、RNAまたは対象の核ペプチドをコードする核酸配列を有し、さらに、その配列の発現に必要な配列(活性化、プロモーター、ポリアデニル化配列など)を有する。このカセットおよび制限部位は、転写および翻訳の適切な読取枠への発現カセットの挿入を行うように設計されている。
【0054】
それには、1以上の治療該当遺伝子を有するプラスミドまたはエピゾームが含まれる。例を挙げると、特許出願WO96/26270およびWO97/10343(参照によって本明細書に組み込まれる)に記載のプラスミドがある。
【0055】
本発明に関して治療該当遺伝子とは、特に、治療効果を有する蛋白産生物をコードする遺伝子を意味する。そのようにコードされた蛋白産生物は特に、蛋白またはペプチドであることができる。この蛋白産生物は、標的細胞に対して外因性、相同性または内因性であることができる。すなわち、標的細胞が病気を示さない場合に標的細胞で正常に発現される産生物である。その場合、蛋白の発現によって、例えば細胞での不十分な発現または修飾のために不活性であるか活性の弱い蛋白の発現を補償したり、あるいはその蛋白を過剰発現することが可能となる。治療該当遺伝子は、例えば高い安定性または変化した活性を有する細胞蛋白の突然変異体をコードすることもできる。蛋白産生物は、標的細胞に関して異種であることもできる。その場合、発現蛋白は例えば、細胞において欠乏している活性を補給または提供することで、病気と戦うことができるようにしたり、あるいは免疫応答を刺激することができる。
【0056】
本発明に関する治療性産生物の中では、より詳細には、酵素、血液誘導体、ホルモン類、リンフォカイン類、インターロイキン類、インターフェロン類またはTNF(例:FR92/03120)、成長因子、神経伝達物質またはそれらの前駆体もしくは合成酵素、栄養因子(例:BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5またはHARP/プレイオトロフィン(pleiotrophin))、アポリポ蛋白(例:ApoAI、ApoAIVまたはApoE:FR93/05125)、ジストロフィン(dystrophin)またはミニジストロフィン(minidystrophin)(FR91/11947)、嚢胞性線維症関連蛋白CFTR、腫瘍抑制遺伝子(例:p53、Rb、Rap1A、DCCまたはk−rev:FR93/04745)、凝血に関与する因子をコードする遺伝子(因子VII、VIII、IX)、DNA修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子(チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ)、ヘモグロビンその他の蛋白キャリアの遺伝子、代謝酵素、分解酵素などを挙げることができる。
【0057】
治療該当核酸はまた、標的細胞での発現によって遺伝子の発現または細胞性mRNAの転写を制御することが可能となる遺伝子またはアンチセンス配列であることもできる。そのような配列は例えば、特許EP140308に記載の方法に従って、細胞性mRNAに対して相補的であることから、蛋白へのそれの翻訳を遮断するRNAに標的細胞で転写することができる。その治療性遺伝子はまた、選択的に標的RNAを破壊することができるリボザイムをコードする配列を有する(EP321201)。
【0058】
上記のようにその核酸は、ヒトまたは動物において免疫応答を生じることができる抗原ペプチドをコードする1以上の遺伝子を有することもできる。その特定の実施形態では、本発明によって、特に微生物、ウィルスまたは癌に対してヒトまたは動物に施されるワクチンまたは免疫療法治療薬の生産を行うことができる。それには特に、エプスタイン−バールウイルス、HIVウィルス、B型肝炎ウィルス(EP185573)、仮性狂犬病ウイルス、シンシチア(syncitia)形成ウィルス、他のウィルスに対して特異的な抗原ペプチドまたは腫瘍に対して特異的な抗原ペプチド(EP259212)などがあり得る。
【0059】
好ましくは核酸は、所望の細胞または臓器で、治療該当遺伝子および/または抗原ペプチドをコードする遺伝子の発現を行うことができる配列も有する。それには、自然において感染細胞でその配列が機能することができる場合に考えられる遺伝子の発現に関与する配列などがあり得る。それにはまた、異なる起源の配列もあり得る(他の蛋白の発現に関与するもの、あるいは合成のもの)。詳細にはそれには、真核生物遺伝子またはウィルス遺伝子のプロモーター配列などがあり得る。例えばそれには、感染することが望ましい細胞のゲノム由来のプロモーター配列などがあり得る。同様にそれには、ウィルスのゲノム由来のプロモーター配列などがあり得る。その点に関しては例えば、E1A、MLP、CMVおよびRSV遺伝子などのプロモーターを挙げることができる。さらに、これらの発現配列は、活性化配列または調節配列などの付加によって修飾することができる。それにはさらに、誘導性または抑制性のプロモーターなどもあり得る。
【0060】
さらに前記核酸は、特に該当の治療遺伝子の上流で、標的細胞の分泌経路で合成される治療性産生物を指向するシグナル配列を有することもできる。このシグナル配列は、治療性産生物の天然シグナル配列であることができるが、他の機能性シグナル配列または合成シグナル配列であることもできる。前記核酸は、合成される治療性産生物を、細胞の特定の区画に指向させるシグナル配列を有することもできる。
【0061】
本発明の好ましい態様によれば、酸感受性化合物はより具体的には、下記一般式の化合物から選択される。
【0062】
【化20】
式中、
・gは0または1である整数であり;
・Gは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数1〜6のアルキル置換基、またはアリールを表し;
・G1およびG2は、
(a)一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(b)一方が炭素原子数10〜24であって、1以上の不飽和を有していても良い疎水性直鎖アルキル基を表し;他方が下記一般式の基:
【0063】
【化21】
(式中、iは1〜4の範囲の整数であり;jは9〜23の範囲の整数であり;親水性置換基は、ポリアミン型の基から選択される)を表し;あるいは
(c)一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し;他方が、ポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表し;あるいは
(d)一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し;他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体、あるいは単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体とモノマー単位1〜20個を有するポリアルキレングリコール分子との間の共有結合結合体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(e)一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し;他方が治療性分子を表す。
【0064】
さらに好ましくは本発明の酸感受性化合物は、下記一般式の化合物から選択される。
【0065】
【化22】
式中、
・gは0または1である整数であり;
・Gは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数1〜6のアルキル置換基、またはフェニルを表し;
・G1およびG2は、
(a)一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(d)一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し;他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表す。
【0066】
一般式(I)の新規な酸感受性化合物は、無毒性かつ製薬上許容される塩の形で提供することができる。その無毒性塩には、無機酸(塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸または硝酸)または有機酸(酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、フマル酸、メタンスルホン酸またはシュウ酸)との塩が含まれる。
【0067】
本発明による酸感受性化合物は、環状オルトエステル基を有する分子の合成について文献に記載の方法から選択される多くの方法に従って製造することができる(例えば、総説Synthesis, Robert H. DeWolfe, 1974, pp.153−172にある例を挙げることができる)。想到され得る別法によれば、一般式(I)の酸感受性化合物は例えば、式G1OHのアルコールを下記一般式のオルトエステルと反応させることで得ることができる。
【0068】
【化23】
式中、g、G、G1およびG2は一般式(I)について定義した通りであり;Zは炭素原子数1〜4個の直鎖または分岐アルキル基を表す。
【0069】
この置換は、酸触媒の存在下に行うことができ、および/または溶媒を使用しもしくはせずに50〜150℃の温度で加熱して活性化することができる。溶媒存在下での操作を行うことを選択する場合、その溶媒は、例えば有機塩素系溶媒、芳香族溶媒またはエーテル類などの従来の有機化学溶媒から選択される。触媒を用いる場合、それは無機もしくは有機酸、ルイス酸もしくはブレンステッド酸であることができる。例えばその触媒は、塩酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたは塩化マグネシウムから選択することができる。この置換はまた、アルコールZOHがアルコールG1OHより揮発性が高い場合に、その反応中に生成するZOHを蒸留することで促進することもできる。その連続蒸留は、常圧または減圧下で加熱することで行うことができる。
【0070】
原料のアルコールG1OHは市販されているか、あるいは当業者には公知の方法、例えば相当するアルケンの水和、相当するハロゲン化誘導体の加水分解、あるいは相当するカルボニル含有誘導体の還元によって合成することができる。
【0071】
本発明の別の形態によれば、基Zはすでに基G1を表すことができ、その場合には、一般式(III)のオルトエステルとアルコールG1OHの間の反応段階は必要ない。
【0072】
一般式(III)の化合物は、下記一般式(IV)のトリアルキルオルトエステル:
【0073】
【化24】
[式中、ZおよびGは上記で定義の通りであり;Z1およびZ2は同一でも異なっていても良く、炭素原子数1〜4個の直鎖または分岐のアルキル基を表す]の下記一般式(V)のジオール:
【0074】
【化25】
[式中、gおよびG2は上記で定義の通りである]に対する作用によって得ることができる。
【0075】
この反応は、例えばグリーンら(T. W. Greene and P. G. M. Wuts, ″Protective Groups in Organic Synthesis″ (2nd Ed., Wiley−Interscience, pp. 135−136))によって示されている方法に従って、ジオールをオルトエステルとして保護する従来の方法に従って行うことができる。この方法は一般的には、酸触媒存在下に従来の有機溶媒(例えば、有機塩素系溶媒、芳香族溶媒、エーテル類など)中で行う。その触媒は、無機もしくは有機酸、ルイス酸もしくはブレンステッド酸であることができる。例えば、塩酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたは塩化マグネシウムを用いることができる。
【0076】
一般式(IV)のトリアルキルオルトエステルは市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って、例えば相当するエステルから、あるいは別の市販のトリアルキルオルトエステルを原料とするアルコキシ基の置換によって合成することができる。
【0077】
一般式(V)のジオールは市販されているか、あるいは市販のジオールとG2との間の反応によって得ることができるか、あるいはG2のジオールへの直接官能化によって得ることができる。この官能化は例えば、相当するアルケンの酸化、あるいは当業者には公知の方法による相当するエポキシドの開環であることができる。
【0078】
G1およびG2のいずれかがポリアミン型の基を表す場合、それは市販されているか、あるいは当業者には公知の従来の方法に従って、例えば先行技術に記載の方法(例:公開WO96/17823、WO97/18185、WO98/54130またはWO99/51581)に従って、あるいは類似の方法に従って得られる。
【0079】
G1およびG2のいずれかが単鎖または二重鎖アルキルから選択される疎水性置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来の方法に従って得られる。例えば、それが長い炭素鎖を有するジアルキルアミノ置換基を有する場合、アルキル化(ハロゲン化アルキルのモノ置換)によって、アルキル化還元(アルデヒドから)によって、あるいは縮合/還元(酸からのアミド官能基の形成とそれに続く還元)によって相当する1級アミンから製造することができる。
【0080】
G1およびG2のいずれかがステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表す場合、それは好ましくは市販品から選択される。
【0081】
G1およびG2のいずれかがポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法によって、詳細には重合によって得られる。その置換基が標的指向要素に共有結合的に連結されている場合、上記の本発明による酸感受性化合物の合成は、当業者の従来法によって、前記標的指向要素のその置換基への結合の前または後に行うことができる。
【0082】
G1およびG2のいずれかがポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って、あるいは先行技術、例えば公開WO96/02655に記載の方法に従って得られる。
【0083】
上記の製造方法は、単に例示方法を構成するものであって、他の均等な製造方法も使用可能であることは当然である。例えば、基G2を持たないが、代わりに保護されていても良い官能基(例えば、保護アミン)を有する一般式(V)のジオールを原料とする反応を、基G2の結合を行う追加の最終段階(例えば、アミンの脱保護とそれに続く式G2COOHの酸の縮合)を行うことで行うことが可能である。
【0084】
本発明の別の主題は、上記で定義の一般式(I)の酸感受性化合物を少なくとも1個含む組成物に関する。本発明の別形態によれば、前記組成物は、少なくとも1種類の生物活性物質ならびにG1およびG2が(a)、(b)、(c)または(d)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物を含む。
【0085】
本発明による組成物はさらに、本発明による酸感受性化合物と生物活性物質との間で形成される複合体と結合することができる1以上の補助剤を含む。従って別の実施形態において本発明は、少なくとも1種類の生物活性物質、G1およびG2が(a)、(b)、(c)または(d)で示した定義を有する式(I)の酸感受性化合物、ならびに1以上の補助剤を含む組成物に関する。この種の補助剤(例えば、脂質、ペプチドまたは蛋白)が存在することで、生物活性物質がトランスフェクションされる核酸である場合に、化合物のトランスフェクション力を高めることができるという効果を得ることができる。
【0086】
この点で、本発明による組成物は、補助剤として1以上の中性脂質を含むことができる。実際、中性脂質を加えることで、核脂質粒子(生物活性物質が核酸である場合)の形成を促進し、膜不安定化による細胞へのその粒子の侵入を促進することができることが明らかになっている。
【0087】
より好ましくは、前記中性脂質は、2個の脂肪族鎖を有する脂質である。特に有利な形態では、天然または合成の両性イオン性脂質または生理条件下ではイオン電荷を持たない脂質を用いる。それらはより詳細には、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびに1〜3回N−メチル化されたそれらの誘導体、ホスファチジルグリセリン類、ジアシルグリセリン類、グリコシルジアシルグリセリン類、セレブロシド類(特に、ガラクトセレブロシド類など)、スフィンゴ脂質(特に、スフィンゴミエリン類など)、あるいはアシアロガングリオシド類(特に、アシアロGM1およびGM2など)から選択することができる。
【0088】
これらの各種脂質は、当業者には公知の従来の方法により、合成によって、あるいは臓器(例:脳)または卵からの抽出によって得ることができる。詳細には、天然脂質の抽出は、有機溶媒によって行うことができる(Lehninger, Biochemistryも参照)。
【0089】
好ましくは、生物活性物質が核酸である場合、本発明の組成物は、モル/モル基準で1当量の核酸について0.01〜20当量の補助剤、より好ましくは0.5〜5当量の補助剤を含む。
【0090】
本発明による酸感受性化合物は、環状オルトエステルのいずれかの側にある置換基G1およびG2に応じて各種用途を有することができる。
【0091】
置換基G1およびG2が一般式(I)での(a)、(b)または(c)に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、生物活性物質と直接結合体(例えば、リポソーム、複合体またはナノ粒子などの種類)を形成することができ、それを次に、生理的に正常なものより酸性が高い組織または細胞区画中に放出することができる。詳細にはその酸感受性化合物は、核酸のトランスフェクションにおいて特に有用である。
【0092】
置換基G1およびG2が一般式(I)での(d)に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、生物活性物質を包み込んだ粒子を安定化し、さらには身体において非常に弱酸性ないし酸性である領域、特にはpHが酸性であって約4〜約7である領域での分解によって前記生物活性物質を放出するという両方の作用を可能とするノニオン系界面活性剤を構成する。
【0093】
さらに、多糖類またはポリアルキレングリコール置換基、より具体的にはポリエチレングリコール(PEG)は、血清蛋白の非特異的吸着、および結果的に大食細胞によるその粒子の認識を阻害することで、それらが関連する粒子上にある種の「被覆性」を与えることが知られている(例えば、Torchilin et al., Biochim. Biophys. Acta 1994, 1195, pp.11−20またはPapahadjopoulos et al., PNAS 1991, 88, p.11460−4参照)。そこで、本発明によるPEG分子を有する酸感受性化合物は、安全の観点から長所を有し、それらが他の蛋白と干渉する危険性を低下させるという意味での別の長所を有する。身体の酸性領域のレベルでは、本発明による化合物中に存在するオルトエステルの分解によって、粒子の残りの部分からPEG分子を分離することが可能となり、生物活性物質が再度「利用可能」となる(実際には、「被覆性の消失」がある。)。そこで、酸性組織に関して、選択的転移を期待することができる。
【0094】
最後に、置換基G1およびG2が一般式(I)での(e)または(f)に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、治療性分子との共有結合的結合体を構成することで、それの指向化が可能となり、身体の酸性領域でのそれの放出が可能となる。その共有結合的結合体は、クラッツら(Kratz et al.)が報告したものと同じ種類であるが、治療性分子と「ベクター」部分との間に現時点で用いられているpH感受性結合と比較して調節可能な感受性があるという利点を有する新規な酸感受性結合を有する。
【0095】
そこで本発明の主題は、疾患を治療するための医薬品製造における、上記で定義の一般式(I)の酸感受性化合物の使用でもある。その場合、標的となる疾患によって、生物活性物質の選択が決まる。
【0096】
特に有利な形態によれば、生物活性物質が核酸である場合、G1およびG2が(a)、(b)または(c)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物を、in vitro、ex vivoまたはin vivoでの核酸のトランスフェクション、特には一次細胞または定着した細胞系へのトランスフェクション用の医薬品の製造において用いることができる。それには例えば、分化型または多分化能型(前駆体)での線維芽細胞、筋細胞、神経細胞(ニューロン、星状細胞、神経膠細胞)、肝細胞、造血系の細胞(リンパ球、CD34、樹状細胞など)または上皮細胞などがあり得る。
【0097】
最後に、本発明の別の形態によれば、G1およびG2が(e)または(f)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物を、医薬品として用いることができる。
【0098】
以上の説明では、本発明による酸感受性化合物は、pHが生理的に正常なものより酸性の組織または細胞区画で分解するようになる。しかしながら別の形態によれば、当業者には公知の全身または局所処置によって、身体の標的領域での酸性を誘発または上昇させることが可能である。例として、処置対象領域への酸性物質の注射または腫瘍組織の特異的酸性化を引き起こすグルコースの静脈注射などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない(T. Volk et al.; Br. J. Cancer; 1993, 68(3), 492−500)。そこで、本発明による酸感受性化合物を、元来は非酸性であるが、当業者に公知の処置によって酸性となった領域で用いることもできる。
【0099】
上記の本発明による酸感受性化合物の全ての使用に関して、
−G1およびG2が(e)または(f)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物;あるいは
−G1およびG2が(a)、(b)、(c)または(d)で示した定義を有する一般式(I)の酸感受性化合物および生物活性物質
を含む本発明による組成物を、例えば局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、経鼻、静脈、筋肉、皮下、眼球、経皮、気管内または腹腔内の経路による投与用に製剤することができる。好ましくは本発明の組成物は、注射製剤用、特には所望の臓器への直接注射用、あるいは局所経路による投与用(皮膚および/または粘膜に対して)の製薬上許容される媒体を含む。それには特に、等張性で無菌の溶液、あるいは乾燥した、特に状況に応じて滅菌水もしくは生理食塩水を添加することで注射溶液を調製することができる凍結乾燥組成物などがあり得る。注射用に用いられる生物活性物質の用量ならびに投与回数は、各種パラメータに応じて調節可能であり、特には、使用される投与形態、関連する病気、生物活性物質が核酸である場合に発現される鎖または所望の投与期間に応じて調節可能である。より詳細な投与形態に関して、それには例えば腫瘍または循環経路のレベルでの組織への直接注射、あるいは培養細胞の処理とそれのin vivoでの再移植、注射もしくは移植などがあり得る。本発明の文脈での関連組織には、例えば筋肉、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、睾丸、卵巣、直腸、神経系、眼球、腺または結合組織などがある。
【0100】
以上の構成以外に本発明は、添付の実施例および図面からわかる他の特徴および利点をも有するものであり、それら実施例および図面は本発明を説明するものと考えるべきであって、本発明の範囲を限定するものではない。特に本出願人らは、各種の操作記録や一般式(I)の化合物を製造するのに用いることができる反応中間体を提案するが、それに限定するものではない。当然のことながら、これらの操作記録および/または中間体生成物から類推して同様の手順を開発することで、本発明による他の式(I)の化合物に到達することは、当業者であれば可能である。
【0101】
図面の簡単な説明
図1は、カチオン性脂質または酸感受性化合物0.4または1.7または6.0nmol/DNAμgという3種類の異なる比率で、DNAと対照カチオン性脂質または酸感受性化合物A シンもしくはトランスとの間で形成される複合体のpH5での時間の関数としての蛍光レベルの変動を示す図である。
【0102】
図2は、血清を含む場合または含まない場合での、各種使用比率でのDNAと化合物A シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質との間で形成された複合体のHeLa細胞へのin vitroでのトランスフェクションの効率を示す図である。y軸はpg/ウェル/蛋白μgでのルシフェラーゼの発現を表す。x軸は、化合物A シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質/DNA使用量比を示す。
【0103】
図3は、DNA量に関して使用される化合物Cまたは化合物DまたはBrij700または化合物Dの非酸感受性類縁体(類縁体D)の量(重量比)の関数としての対照カチオン性脂質/DNA核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。径が小さいということは、核脂質粒子が安定化されていることを示している。非常に大きい粒径は、それとは逆に、核脂質粒子の不安定化があって、それらが凝集する傾向を有することを示す。
【0104】
図4は、pHが5の場合の各種比率(重量比)での、時間の関数としての対照カチオン性脂質/DNA/化合物もしくは類縁体D核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。小さい径の核脂質粒子は、それが安定化されていることを示している。非常に大きい粒径は、それとは逆に、核脂質粒子の不安定化があって、それらが凝集する傾向を有することを示す。
【0105】
図5は、各種pH(pH4、pH5、pH6およびpH7.4)での時間の関数としての、対照カチオン性脂質/DNA/化合物Cもしくは化合物E核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。化合物Cもしくは化合物E/DNA比は1に設定してある(nmol/DNAμg)。
【0106】
図6は、プラスミドpXL3031の模式図である。
【0107】
図7は、カチオン性脂質/DOPE/DNA(5/5/1)複合体が介在するin vivoでの遺伝子転移活性に対する化合物Dについての用量/応答曲線を示す図である。化合物「類縁体D」は、陰性対照として使用する。データは、皮下M109腫瘍を有するBalb/cマウスについての平均(線)および個々の値(点)である。
【0108】
実施例
トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、無水トリフルオロ酢酸、ブロモ酢酸tert−ブチル、ブチロラクトン、3−アミノプロパン−1,2−ジオール、セリノール(2−アミノプロパン−1,3−ジオール)、オルトギ酸トリメチル、オルト酢酸トリメチル、パラトルエンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたはベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム(BOP)ヘキサフルオロホスフェートなどの通常の試薬および触媒は市販のものである。
【0109】
洗浄は、飽和塩化ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および0.5mol/Lの濃硫酸水素カリウム溶液で行う。
【0110】
親水性ポリマー(各種大きさのポリエチレングリコール類)は市販品である。ポリアミン型の親水性置換基も市販されているか、あるいは詳細には下記の実施例で示されている当業者には公知の従来の方法によって合成することができる。疎水性置換基(単鎖または二重鎖ジアルキルアミン類、脂肪族アルコール類など)は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って合成される。例えば、単鎖または二重鎖ジアルキルアミン類は、下記の実施例に示した方法に従って、1級アミンおよび相当するハロゲン化アルキル誘導体から合成することができる。
【0111】
プロトン核磁気共鳴(1H NMR)スペクトラムは、ブルカー(Bruker)300、400および600MHzスペクトル装置で記録した。化学(clinical)シフトはppm(1/1000000)単位で表してあり、多重度は通常の略称で表してある。
【0112】
使用したプラスミドは、刊行物(Gene Therapy (1999) 6, pp, 1482−1488)に記載のpXL3031であり、それはサイトメガロウィルスCMV E/Pプロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードするluc遺伝子を有する。このプラスミドは図6に示してある。それの大きさは3671bpである。使用のプラスミド溶液は、注射用水で1.262g/Lに希釈する。
【0113】
実施例1:2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド(「オルト1」)の合成
2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド(「オルト1」)は下記式の構造を有する。
【0114】
【化26】
それは、3−アミノプロパン−1,2−ジオールから2段階で得ることができる。
【0115】
1)N−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−2,2,2−トリフルオロアセトアミドの製造
3−アミノプロパン−1,2−ジオール15g(164.6mmol)を、磁気撹拌子を入れた丸底フラスコ中で、テトラヒドロフラン100mLに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却して0℃とし、トリフルオロ酢酸エチル21.5mL(181.1mmol)を徐々に加える。反応混合物を室温で2時間撹拌する。粗反応生成物を溶媒留去して乾固させる。そうして、純粋な無色油状物29gが得られ(収率95%)、その生成物をそれ以上精製せずに用いる。
【0116】
2)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド(オルト1)の製造
前段階で得られたN−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−2,2,2−トリフルオロアセトアミド29g(155mmol)を、オルトギ酸トリメチル75mL(685mmol)を加えた塩化メチレン75mLに溶かす。パラトルエンスルホン酸300mg(1.7mmol)を加え、反応混合物を室温で2時間撹拌する。
【0117】
その粗生成物を塩化メチレン500mLで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム200mLで3回洗浄し、次に飽和塩化ナトリウム200mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮して乾固させる。そうして、それ以上精製せずに、純粋な油状生成物30gが得られる(収率:85%)。
【0118】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm単位))。50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0119】
*3.33および3.37(2s:計3H);3.35〜3.80(mt:3H);4.10〜4.25(mt:1H);4.50(mt:1H);5.73および5.78(2s:計1H);6.66および7.55(2つの未分離の複雑なピーク:計1H)。
【0120】
実施例2:2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−2−メチル−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミド(「オルト2」)の合成
2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−2−メチル−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミド(「オルト2」)は、下記式の構造を有する。
【0121】
【化27】
それは、2−アミノプロパン−1,3−ジオール(セリノール)から2段階で得ることができる。
【0122】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−ヒドロキシ−1−ヒドロキシメチルエチル)アセトアミドの製造
2−アミノプロパン−1,3−ジオール4g(43.9mmol)に、テトラヒドロフラン20mLを加える。反応混合物を氷浴で冷却して0℃とし、トリフルオロ酢酸エチル5.8mL(48.3mmol)を徐々に加える。その溶液を室温で2時間撹拌する。
【0123】
反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレンに3回取ってテトラヒドロフランを完全に留去する。白色粉末8.1g(収率:99%)が純粋な形で得られ、それをそれ以上精製せずに次の段階で用いる。
【0124】
2)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−2−メチル−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミド(オルト2)の製造
前段階で得られた2,2,2−トリフルオロ−N−(2−ヒドロキシ−1−ヒドロキシメチルエチル)アセトアミド7.9g(42.2mmol)を、オルトギ酸トリメチル16.1mL(126.7mmol)を加えた塩化メチレン30mLに溶かす。パラトルエンスルホン酸73mg(0.42mmol)を加え、反応混合物を室温で3時間撹拌する。
【0125】
その粗生成物を塩化メチレン150mLで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液50mLで3回、次に飽和塩化ナトリウム溶液50mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮して乾固させる。そうして白色固体9.9gが、それ以上精製せずに純品として得られる(収率:96%)。
【0126】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm単位))。約75/25の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0127】
*1.49および1.50(2s:計3H);3.34および3.35(2s:計3H);3.66および3.82(それぞれdmt、J=12Hzおよびdd、J=11および8Hz:計2H);3.90〜4.00および4.20〜4.35(2mt:計1H);3.97および4.33(それぞれdd、J=11および5Hzならびにdmt、J=12Hz:計2H);6.38および7.04(2つの広い未分離の複雑なピーク:計1H)。
【0128】
実施例3:シンおよびトランス化合物4−{4−[(2−{3−[4−(3−アミノ−プロピルアミノ)ブチルアミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−オクタデシルブチルアミド・テトラアセテートの合成
本実施例は、下記式の2種類の異なるジアステレオマー型シンおよびトランスの形での酸感受性化合物Aの合成経路を説明するものである。
【0129】
【化28】
a−シンおよびトランス4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジオクタデシルブチルアミド(脂質部分−O−オルト1−NH 2 )の合成
この合成は、3段階で行う。ジオクタデシルアミンのアルコールへの官能基化と基オルト1への付加と、それに続く保護基の開裂である。
【0130】
1)4−ヒドロキシ−N,N−ジオクタデシルブチルアミドの製造
塩化アルミニウム4.6g(34mmol)にクロロホルム25mLを加え、全体をサーモスタット調節の浴で約10℃まで冷却する。トリエチルアミン6.4mL(46mmol)のクロロホルム(15mL)溶液を滴下し、反応混合物を室温に戻す。ジオクタデシルアミン6g(11.5mmol)をブチロラクトン1mL(13.8mmol)とクロロホルム110mL中で混合し、それを滴下漏斗を用いて前記の混合物に徐々に加える。
【0131】
室温で2時間磁気撹拌子撹拌した後、反応にそれ以上の変化がなくなる。水75mLを加え、反応混合物を30分間撹拌する。粗生成物をセライト濾過し、クロロホルムで洗浄する。濾液を放置することで分離し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液50mLで3回洗浄する。クロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。シリカでのクロマトグラフィー後に、白色粉末4.9gが得られる(収率:70%)。
【0132】
2)シンおよびトランスN,N−ジオクタデシル−4−{4−[2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}ブチルアミドの製造
前段階で得られた4−ヒドロキシ−N,N−ジオクタデシルブチルアミド2.8g(4.6mmol)を2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド2.6g(オルト1、11.5mmol)および塩化マグネシウム90mg(0.92mmol)を混合する。全体を無溶媒で80℃にて2時間加熱する。
【0133】
粗反応生成物をシクロヘキサン150mLに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液30mLで3回洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液30mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。精製をシリカでのクロマトグラフィーによって行う。2種類の予想されるジアステレオマーであるシンおよびトランス1.2gおよび1.1gが、白色粉末の形で単離される(収率:62%)。
【0134】
化合物シンの1H NMR(300MHz、CDCl3、δ(ppm)):0.89(t、J=7Hz:6H);1.15〜1.40(mt:60H);1.52(mt:4H);1.94(mt:2H);2.39(t、J=7Hz:2H);3.20(広いt、J=8Hz:2H);3.29(mt:2H);3.61(t、J=5Hz:2H);3.66(mt:2H);3.79(dd、J=8および7Hz:1H);4.11(t、J=8Hz:1H);4.50(mt:1H);5.82(s:1H);8.13(未分離の複雑なピーク:1H)。
【0135】
化合物トランスの1H NMR(300MHz、CDCl3、δ(ppm)):0.89(t、J=7Hz:6H);1.15〜1.40(mt:60H);1.52(mt:4H);1.94(mt:2H);2.38(t、J=7Hz:2H);3.21(広いt、J=8Hz:2H);3.29(広いt、J=8Hz:2H);3.44(mt:1H);3.55〜3.75(mt:1H);3.60(t、J=6Hz:2H);3.69(dd、J=8.5および5Hz:1H);4.19(dd、J=8.5および7Hz:1H);4.50(mt:1H);5.87(s:1H);6.70(未分離の複雑なピーク:1H)。
【0136】
3)シンおよびトランス4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジオクタデシルブチルアミドの製造
前段階で得られたN,N−ジオクタデシル−4−{4−[(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}ブチルアミド1.1g(1.37mmol、シンまたはトランス)をテトラヒドロフラン10mLに溶かし、4モル%水酸化ナトリウム10mLを高撹拌しながら加える。反応を室温で終夜放置する。
【0137】
テトラヒドロフランを濃縮し、生成物をジエチルエーテル150mLで3回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。そうして予想される生成物840mgが単離される(収率:86%)。それをそのまま次の段階で用いる。
【0138】
b−(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)酢酸(親水性部分ポリアミン−COOH)の合成
この合成は、スペルミンの4つのアミンの保護とそれに続く1級アミンのうちの一つの保護ブロモ酢酸による置換という2段階で行われる。
【0139】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]−N−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アセトアミドの合成
スペルミン8g(39.5mmol)を塩化メチレン75mLに溶かす。トリエチルアミン33mL(237mmol)を加え、反応混合物を氷浴で冷却して0℃とする。塩化メチレン100mLで希釈した無水トリフルオロ酢酸41.5gを、滴下漏斗を用いて1時間かけて滴下する。反応混合物を室温に戻し、反応液を撹拌しながら終夜放置する。
【0140】
5%炭酸水素ナトリウム溶液75mLを反応混合物に加え、溶液を室温で15分間撹拌する。水相を塩化メチレン150mLで3回抽出する。有機相を合わせ、0.5Mの濃硫酸水素カリウム溶液100mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液100mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。純粋な黄色粉末22.5gが、それ以上の精製を行わずに単離される(収率:97%)。
【0141】
2)(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)酢酸の製造
水素化ナトリウム1g(60%オイル中分散品、すなわち25.6mmol)に脱水ジメチルホルムアミド60mLを加える。反応混合物をアルゴン気流下に水浴で冷却し、脱水ジメチルホルムアミド40mLに溶かした上記で得られた2,2,2−トリフルオロ−N−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]−N−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アセトアミド10g(17mmol)を滴下する。反応混合物を室温で1時間放置し、再度氷浴で冷却し、ブロモ酢酸tert−ブチル3.66g(18.7mmol)を加える。反応混合物を室温で終夜撹拌する。
【0142】
酢酸エチル500mLを加え、混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液100mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液100mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。そうして、予想される不純物を含む黄色油状物が、tert−ブチルエステルの形で単離される。
【0143】
この粗反応生成物を塩化メチレン50mLで希釈し、トリフルオロ酢酸50mLを加える。溶液を室温で3時間撹拌する。反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン50mLで希釈する。生成物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液150mLで3回抽出する。得られた水相を塩化メチレン30mLで3回洗浄してから、濃塩酸を加えることで酸性とする。次に、生成物を塩化メチレン300mLで3回抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。精製をシリカでのクロマトグラフィーによって続ける(溶離液:塩化メチレン/メタノール8/2)。そうして、黄色粉末3.5gを回収する(2段階の全体収率:32%)。
【0144】
1H NMR(400MHz、温度373Kの(CD3)2SO−d6、δd(ppm)):1.62(mt:4H);1.80〜2.00(mt:4H);3.28(mt:2H);3.30〜3.60(mt:10H);4.01(s:2H);9.15〜9.35(未分離の複雑なピーク:1H)。
【0145】
c−シンおよびトランス4−{4−[(2−{3−[4−(3−アミノプロピルアミノ)ブチルアミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−オクタデシルブチルアミド・テトラアセテート(酸感受性化合物A)の合成
この合成は、直前のaおよびbで合成を説明した2種類の分子の縮合、次にポリアミンの脱保護、最後の塩化という3段階で行う。生成物シンおよびトランスについて同じ操作記録を用いた。
【0146】
1)シンおよびトランスN,N−ジオクタデシル−4−(4−{[2−(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)アセチルアミノ]メチル}−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)ブチルアミドの合成
上記の段階(段階a)で得られた4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジオクタデシルブチルアミド800mg(1.13mmol、シンまたはトランス)を塩化メチレン10mLに溶かしたものに、トリエチルアミン390μL(2.8mmol)、上記段階bにて得られた(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)酢酸800mg(1.24mmol)およびBOP 600mgをその順序で加える。溶液を室温で2時間撹拌する。
【0147】
粗反応生成物を濃縮し、酢酸エチル150mL中に取り、飽和炭酸水素ナトリウム溶液40mLで3回、次に飽和塩化ナトリウム溶液40mLで3回洗浄する。硫酸マグネシウムでの脱水、濾過、溶媒留去後、生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(溶離液:酢酸エチル)。そうして、白色粉末1.1gを単離する(収率:73%)。
【0148】
2)シンおよびトランス4−{4−[(2−{3−[4−(3−アミノプロピルアミノ)ブチルアミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジオクタデシルブチルアミドの製造
上記で得られたN,N−ジオクタデシル−4−(4−{[2−(トリフルオロアセチル−{3−[トリフルオロアセチル−(4−{トリフルオロアセチル−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}ブチル)アミノ]プロピル}アミノ)アセチルアミノ]メチル}−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)ブチルアミド290mg(0.22mmol、シンまたはトランス)をテトラヒドロフラン3mLに溶かし、4モル%水酸化ナトリウム3mLを高撹拌しながら加える。反応を室温で終夜放置する。
【0149】
次に溶媒を濃縮し、粗生成物を塩化メチレン/メタノールの1/1混合液中に取る。その粗溶液をシリカでのクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール/アンモニア、45/45/10)によって精製する。生成物を濃縮し、水を加えた後に凍結乾燥する。そうして、白色の凍結乾燥生成物180mgが得られる(収率:87%)。
【0150】
3)4−{4−[(2−{3−[4−(3−アミノプロピルアミノ)ブチルアミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジオクタデシルブチルアミドのジアステレオマーシンおよびトランスの製造(化合物A)
遊離塩基の形で前の段階で得られた生成物を、イオン交換樹脂によって定量的に塩化する。それを水/エタノール混合液に溶かし、大過剰のアセテート樹脂(BIO−RAD;AG1−X2樹脂)を充填したカラムで溶出する。
【0151】
化合物シンの1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):0.89(t、J=7Hz:6H);1.20〜1.40(mt:60H);1.52(mt:4H);1.65〜1.90(mt:8H);1.93(mt:2H);1.97(s:3H);2.37(t、J=7Hz:2H);2.73(mt:4H);2.81(t、J=6.5Hz:2H);2.89(mt:4H);2.95(t、J=6.5Hz:2H);3.15〜3.30(mt:4H);3.32(AB、J=17Hz:2H);3.45(dt、J=14および6.5Hz:1H);3.55〜3.65(mt:1H);3.61(分裂t、J=7および2Hz:2H);3.74(t、J=8Hz:1H);4.06(t、J=8Hz:1H);4.31(mt:1H);5.79(s:1H);7.81(t、J=5.5Hz:1H)。
【0152】
化合物トランスの1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):0.88(t、J=7Hz:6H);1.05〜1.45(mt:60H);1.51(mt:4H);1.65〜1.90(mt:8H);1.92(mt:2H);1.97(s:3H);2.37(t、J=7Hz:2H);2.73(mt:4H);2.80(t、J=6Hz:2H);2.88(mt:4H);2.96(t、J=6Hz:2H);3.15〜3.55(mt:8H);3.57(広いt、J=6Hz:2H);3.69(dd、J=7.5および5.5Hz:1H);4.11(t、J=7.5Hz:1H);4.43(mt:1H);5.85(s:1H);7.73(広いt、J=5.5Hz:1H)。
【0153】
実施例4:4−{4−[(2−{3−[ビス(3−アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジテトラデシルブチルアミド・4塩酸塩の合成
この実施例は、下記式の2種類のジアステレオマーであるシンおよびトランスの等モル混合物の形での酸感受性化合物Bの合成経路を説明するものである。
【0154】
【化29】
a−4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジテトラデシルブチルアミド(脂質部分−O−オルト1−NH 2 )の合成
この合成は、ジテトラデシルアミンの合成とそれに続くアルコールへの官能化、そして基オルト1への付加とその保護基の開裂という4段階で行う。
【0155】
1)ジテトラデシルアミン塩酸塩
ブロモテトラデカン74g(267.1mmol)にエタノール400mLおよびテトラデシルアミン57g(267.1mmol)を加える。炭酸ナトリウム70.8g(667mmol)を懸濁状態で入れ、反応混合物を終夜加熱還流する。反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン1.5リットル中に取り、水200mLで3回、次に飽和塩化ナトリウム溶液400mLで1回洗浄する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濃縮する。
【0156】
高い温度で粗生成物を5N塩酸のイソプロパノール溶液300mLを加えたイソプロパノール600mLに溶かすことで、塩化を行う。そうして得られた透明溶液を放冷することで、予想生成物の結晶化を誘発する。濾過およびイソプロパノールによる洗浄後に、凝集白色粉末48.4gを得る(収率:41%)。
【0157】
2)4−ヒドロキシ−N,N−ジテトラデシルブチルアミドの製造
塩化アルミニウム22.4g(168.1mmol)にクロロホルム75mLを加え、全体を氷水浴で冷却して約10℃とする。トリエチルアミン39mL(280.1mmol)のクロロホルム(100mL)溶液を滴下し、反応混合物を室温に戻す。ジテトラデシルアミン塩酸塩25g(56mmol)をブチロラクトン(67.2mmol)のクロロホルム(350mL)溶液と混合したものを、機械撹拌しながら前記混合物に徐々に加える。室温で2時間後に、反応にそれ以上の変化が生じなくなる。
【0158】
水200mLを加え、反応混合物を30分間撹拌する。粗生成物をセライト濾過し、クロロホルムで洗浄する。濾液を放置後に分離し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液150mLで3回洗浄する。クロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。シリカでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/シクロヘキサン1/1)でのクロマトグラフィー後に、白色粉末21.2gを収率76%で得る。
【0159】
3)N,N−ジテトラデシル−4−{4−[(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}ブチルアミドの製造
前段階で得られた4−ヒドロキシ−N,N−ジテトラデシルブチルアミド3.5g(7.1mmol)を、2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド1.8g(オルト1、7.8mmol)およびパラトルエンスルホン酸ピリジニウム18mg(PPTS、0.071mmol)と混合する。全体を無溶媒で80℃にて3時間加熱する。
【0160】
粗反応生成物をヘプタン200mLに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液50mLで3回、アセトニトリル50mLで3回洗浄し、濃縮して乾固させる。
【0161】
少量の粗生成物についてシリカでの精製を行って、この中間体の特性決定を行う、残りはそのまま次の段階で用いる。シリカでのクロマトグラフィー(シクロヘキサン/酢酸エチル7/3(体積比))によって、油状生成物数mgを単離することができる。
【0162】
4)4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジテトラデシルブチルアミドの製造
前段階で得られた粗生成物を、4%水酸化ナトリウム20mLを加えたテトラヒドロフラン20mLに溶かす。反応混合物を室温で高撹拌しながら終夜放置する。
【0163】
次に、テトラヒドロフランを濃縮し、生成物をジエチルエーテル200mLで3回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。シリカでのクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール9/1(体積比))によって、無色油状物1.6gを単離することができる(2段階での収率:38%)。
【0164】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm)):50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0165】
*0.89(t、J=7Hz:6H);1.15〜1.45(mt:44H);1.52(mt:4H);1.58(未分離の複雑なピーク:2H);1.95(5重線、J=6.5Hz:2H);2.39(t、J=6.5Hz:2H);2.75〜3.00(mt:2H);2.31(mt:2H);3.29(mt:2H);3.60(mt:2H);3.71および3.80(それぞれdd、J=7.5Hzおよび6Hzならびにt、J=7.5Hz:計1H);4.06および4.14(2t、J=7.5Hz:計1H);4.21および4.33(2mt:計1H);5.82および5.85(2s:計1H)。
【0166】
b−トリフルオロ酢酸塩の形での[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸の合成(ポリアミン−COOH型の親水性部分)
この合成は、3−アミノプロパノールおよび3,3′−イミノビスプロピルアミンを原料とする6段階で行う。
【0167】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−{3−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピルアミノ]プロピル}アセトアミドの製造
3,3′−イミノビスプロピルアミン35g(266.7mmol)を、アルゴン気流下に脱水テトラヒドロフラン150mLに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却して0℃とし、トリフルオロ酢酸エチル65mL(546.8mmol)を滴下漏斗を用いて(非常にゆっくりと)滴下する。滴下終了後(3時間後)、反応混合物を室温に戻し、撹拌をアルゴン下で数時間維持する。
【0168】
反応混合物を濾紙で濾過する。濾液を濃縮乾固させ、塩化メチレン中に数回取り、スライド羽根ロータリー真空ポンプによる真空下40℃での乾燥機で16時間にわたって最終の乾燥を行う。白色粉末85.3gが、それ以上精製せずに単離される(収率:99%)。
【0169】
2)(3−ヒドロキシプロピルアミノ)酢酸tert−ブチルの製造
3−アミノプロパノール196mL(2.56mol)を塩化メチレン250mLで希釈し、全体を氷浴で冷却して0℃とする。反応混合物を0℃に維持しながら、ブロモ酢酸tert−ブチル20g(102.5mmol)を塩化メチレン200mLに溶かしたものを滴下する。滴下終了後(2時間後)、反応混合物を室温で3時間放置する。
【0170】
その粗生成物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液150mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液150mLで3回洗浄する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。そうして、無色油状物17.8gが単離される(収率:92%)。
【0171】
3)[(3−ヒドロキシプロピル)−トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチルの製造
(3−ヒドロキシプロピルアミノ)酢酸tert−ブチル17.65g(93.3mmol)を塩化メチレン100mLに溶かし、全体を氷浴で冷却して0℃とする。トリエチルアミン26mL(186.6mmol)を加え、次に滴下漏斗を用いて無水トリフルオロ酢酸21.5g(102.6mmol)を滴下する。滴下終了後、反応混合物を、磁気撹拌子撹拌しながら室温で終夜放置する。
【0172】
その溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液50mLで3回、0.5M硫酸水素カリウム溶液50mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液50mLで3回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。そうして、淡黄色油状物24.5gが単離される(収率:92%)。
【0173】
4)[(3−ブロモプロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチルの製造
[(3−ヒドロキシプロピル)−トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチル10g(35mmol)をテトラヒドロフラン150mLに溶かす。トリフェニルホスフィン12.4g(47.3mmol)を加え、反応混合物をサーモスタットで15〜20℃とする。四臭化炭素15.1g(45.6mmol)をアセトニトリル60mLに溶かしたものを滴下漏斗を用いて滴下し、全体を室温で4時間撹拌する。
【0174】
反応混合物を濃縮して乾固させ、酢酸エチル中に取り、濾紙で濾過する。濾液を濃縮乾固させ、シクロヘキサン中に取り、焼結材No.3で濾過する。濾液を再度濃縮し、シリカでのクロマトグラフィー(シクロヘキサン/酢酸エチル8/2(体積比))によって精製する。そうして、淡黄色油状物10.4gが単離される(収率:85%)。
【0175】
5)[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチルの製造
[(3−ブロモプロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチル26g(74.7mmol)および2,2,2−トリフルオロ−N−{3−[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピルアミノ]プロピル}アセトアミド24.1g(74.7mmol)をアセトニトリル130mLに溶かす。炭酸カリウム30g(224mmol)を懸濁状態で入れ、全体を6時間加熱還流する。
【0176】
反応混合物を濾紙で濾過し、濃縮乾固する。粗生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(シクロヘキサン/酢酸エチル2/8(体積比))。そうして、淡黄色油状物16.6g(収率:38%)を単離する。
【0177】
6)[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸のトリフルオロ酢酸塩の製造
[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸tert−ブチル15.8g(28.76mmol)に塩化メチレン50mLを加え、次にトリフルオロ酢酸50mLを加える。その混合物を室温で数時間撹拌する。反応混合物を濃縮乾固する。そうして、淡黄色粘稠物18.7gを単離する(収率:100%)。
【0178】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm)):室温で、回転異性体の混合物が認められる。
【0179】
*1.80〜2.10(mt:6H);3.12(mt:6H);3.29(mt:4H);3.50(mt:2H);4.13および4.29(それぞれ広いsおよびmt:計2H);9.50〜9.75(mt:2H)。
【0180】
c−4−{4−[(2−{3−[ビス(3−アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジテトラデシルブチルアミド・4塩酸塩(化合物B)の合成
この合成は、上記の工程aおよびbで得られた2種類の分子の縮合、それに続くポリアミンの脱保護および塩化という3段階で行う。
【0181】
1)4−[4−({2−[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]アセチルアミノ}メチル)−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ]−N,N−ジテトラデシルブチルアミドの製造
トリエチルアミン1.9mL(13.8mmol)、[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]酢酸2g(トリフルオロ酢酸塩、3.04mmol)およびBOP1.8g(4.14mmol)を順次、塩化メチレン30mLに溶かした4−(4−アミノメチル−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ)−N,N−ジテトラデシルブチルアミド1.65g(2.76mmol)に加える。得られた溶液を室温で1時間撹拌する。
【0182】
粗反応生成物を濃縮して乾固させ、酢酸エチル200mL中に取り、飽和塩化ナトリウム溶液40mL、次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液40mLで3回、飽和塩化ナトリウム溶液40mLで3回洗浄する。生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(溶離液:酢酸エチル)。そうして、淡黄色粘稠物2.2gが単離される(収率:72%)。
【0183】
2)4−{4−[(2−{3−[ビス(3−アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジテトラデシルブチルアミドの製造
4−[4−({2−[(3−{ビス[3−(2,2,2−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]アミノ}プロピル)トリフルオロアセチルアミノ]アセチルアミノ}メチル)−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ]−N,N−ジテトラデシルブチルアミド2.1g(1.88mmol)をテトラヒドロフラン30mLに溶かし、4モル%水酸化ナトリウム30mLを高撹拌下に加える。反応液を室温で終夜放置する。
【0184】
溶媒を濃縮し、粗生成物を塩化メチレン/メタノール1/1混合液中に取る。その粗溶液をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(塩化メチレン/メタノール/アンモニア、45/45/10(体積比))。生成物を濃縮し、水を加えた後に凍結乾燥する。そうして、白色の凍結乾燥生成物1.3gが得られる(収率:84%)。
【0185】
3)4−{4−[(2−{3−[ビス(3−アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ}アセチルアミノ)メチル]−[1,3]ジオキソラン−2−イルオキシ}−N,N−ジテトラデシルブチルアミド・4塩酸塩(化合物B)の合成
遊離塩基の形での前段階で得られた生成物を、イオン交換樹脂によって定量的に塩化する。それを水に溶かし、大過剰のクロライド樹脂(FLUKA;DOWEX21K)を充填したカラムで溶出する。得られる白色の凍結乾燥生成物の構造を1H NMRで確認する。
【0186】
1H NMR(300MHz、(CD3)2SO−d6、δd(ppm)):50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0187】
*0.89(t、J=7Hz:6H);1.15〜1.40(mt:44H);1.40〜1.60(mt:4H);1.72(mt:8H);2.31(mt:2H);2.40〜2.55(mt:6H);2.70〜2.90(mt:6H);3.15〜3.75−4.00〜4.40(2つのmt:計13H);5.83および5.86(2s:計1H)。
【0188】
実施例5:PEG化脂質CおよびDの合成
本実施例は、互いに脂質部分のみが異なる、すなわち化合物Cではオクタデカノールであり、化合物DではコレステロールであるPEG化脂質オクタデカノール−オルト1−PEG5000−OMeおよびコレステロール−オルト1−PEG5000−OMeの合成経路を説明するものである。これら2種類の酸感受性化合物は下記一般式の構造を有する。
【0189】
【化30】
a−C−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イル)メチルアミンおよびC−{2−[17−(1,5−ジメチルヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン− 3−イルオキシ]−[1,3]ジオキソラン−4−イル}メチルアミン(脂質部分−O−オルト1−NH 2 )の合成
この合成は、化合物オルト1を原料とし、環外メトキシ基の脂肪族アルコール(コレステロールまたはオクタデカノール)による置換とそれに続くアミンの脱保護による2段階で行われる。
【0190】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミドの製造
2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アセトアミド3g(オルト1、13.09mmol)をオクタデカノール3.54g(13.09mmol)と混合する。混合物を80℃で溶融させ、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム32mg(0.13mmol)を加えた後に2時間放置する。粗反応生成物をシクロヘキサンに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、次に飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮乾固させる。その粗生成物をそのまま次の段階で用いる。
【0191】
1′)N−{2−[17−(1,5−ジメチルヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシ]−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル}−2,2,2−トリフルオロアセトアミドの製造
この操作記録は上記のものと同じであり、この反応は触媒を用いずに行うこともできる。
【0192】
2)C−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イル)メチルアミンの製造
前段階1の粗反応生成物6.12g(13.09mmol)をテトラヒドロフラン20mLに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却し、4%水酸化ナトリウム30mLを加える。試薬が完全に消失するまで、混合物を室温で撹拌する(4時間かけて)。
【0193】
次に、溶媒をある程度濃縮し、ジエチルエーテル200mLで3回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。粗反応生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する(塩化メチレン/メタノール9/1(体積比))。そうして、白色粉末2.6gが回収される(収率:上記一連の2段階1および2で53%)。
【0194】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm))。ほぼ50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0195】
*0.89(t、J=7Hz:3H);1.20〜1.45および1.58(2mt:計32H);2.75〜3.00(mt:2H);3.53(mt:2H);3.65〜3.85(mt:1H);4.00〜4.40(mt:2H);5.81および5.84(2s:計1H)。
【0196】
2′)C−{2−[17−(1,5−ジメチルヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシ]−[1,3]ジオキソラン−4−イル}メチルアミンの製造
この操作記録は、段階2)のものと同じである。そうして、白色粉末1.4gが回収される(収率:2連続段階1′および2″で22%)。
【0197】
1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm))。ほぼ50/50の割合での2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0198】
*0.69(s:3H);0.85〜1.75および2.00(mt:計26H);0.88(mt:6H);0.93(d、J=7Hz:3H);1.01(s:3H);2.33(mt:2H);2.75〜3.00(mt:2H);3.50(mt:1H);3.71〜3.85〜4.05および4.16(4mt:計2H);4.20および4.35(2mt:計1H);5.36(mt:1H);5.93および5.96(2s:計1H)。
【0199】
b−メトキシポリエチレングリコール5000の酸の合成(親水性部分MeO−PEG 5000 −COOH)
市販のメトキシポリエチレングリコールの末端水酸基の酸化という1段階が必要である。
【0200】
MeO−PEG5000−OH20g(4mmol)を等量の水/アセトニトリル混合液100mLに溶かす。2,2,6,6−テトラメチルピペリジニルオキシル312mg(2mmol)および[ビス(アセトキシ)ヨード]ベンゼン6.4g(20mmol)を加え、反応混合物を室温で16時間撹拌する。
【0201】
その粗反応生成物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン/エタノール(1:1;体積比)混合液40mL中に取り、ジエチルエーテル500mLを加えることで沈殿させる。そうして、濾過およびエーテル洗浄によって、白色粉末19gが単離される(収率:95%)。
【0202】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm):3.39(s:3H);3.40〜3.95(mt:404H);4.15(s:2H)。
【0203】
c−メトキシ−(ポリエチレングリコール5000)−(N−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル)アミド(化合物C)およびメトキシ−(ポリエチレングリコール5000)−N−{2−[17−(1,5−ジメチルヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシ]−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル}アミド(化合物D)の合成
化合物C
前段階で得られたMeO−PEG5000−COOH1.2g(0.24mmol)を塩化メチレン5mLに溶かす。トリエチルアミン188μL(1.34mmol)を加え、次にC−(2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキソラン−4−イル)メチルアミン100mg(0.27mmol)を加える。BOP143mg(0.32mmol、1.2当量)を加え、反応液を室温で1時間撹拌する。
【0204】
ジエチルエーテル(60mL)を加えることで反応混合物を沈殿させ、遠心分離し、エーテルで洗浄し、分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に注入する。最も純粋な分画を単離することで、白色凍結乾燥生成物415mgを得る(収率:32%)。
【0205】
1H NMR(300MHz、CDCl3、δd(ppm)):ほぼ50/50の割合の2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0206】
*0.90(t、J=7Hz:3H);1.20〜1.40および1.50〜1.75(mt:32H);3.39(s:3H);3.40〜3.95(mt:448H);4.02および4.03(2s:計2H);4.00〜4.25(mt:計3H):5.80および5.84(2s:計1H)。
【0207】
化合物D
この操作記録は、化合物Cの製造について示したものと同じである。最も純粋な分画を単離することで、白色の凍結乾燥生成物395mgが得られる(収率:30%)。
【0208】
1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):ほぼ50/50の割合の2種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【0209】
*0.68(s:3H);0.85〜1.75−1.85および2.00(mt:計26H);0.87(mt:6H);0.92(d、J=7Hz:3H);1.00(s:3H);2.33(mt:2H);3.39(s:3H);3.40〜3.90(mt:448H);4.00〜4.20(mt:計1H);4.01および4.04(2s:計2H);4.28および4.46(2mt:計1H);5.35(mt:1H);5.90および5.95(2s:計1H)。
【0210】
実施例6:PEG化脂質Eの合成
本実施例は、下記一般式の構造を有するPEG化脂質オクタデカノール−オルト2−PEG5000−OMeの合成経路について説明するものである。
【0211】
【化31】
a−2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イルアミンの合成(疎水性脂質部分−O−オルト2−NH 2 )
この合成は、上記で合成について説明した基質オルト2を原料とする、環外メトキシ基のオクタデカノールによる置換およびそれに続くアミンの脱保護により、2段階で行われる。
【0212】
1)2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミドの製造
2,2,2−トリフルオロ−N−(2−メトキシ−2−メチル−[1,3]ジオキサン−5−イル)アセトアミド3g(12.34mmol)をオクタデカノール3g(11.1mmol)と混合する。混合物を80℃で溶融させ、2時間放置して、アルコール交換中に生成する全てのメタノールを蒸発させる。
【0213】
溶融反応混合物をアセトニトリル50mL中に投入することで沈殿を生じさせる。予想生成物を、アセトニトリルからの再結晶によって精製する。そうして、白色粉末2.85gを単離する(収率:再結晶後で53%)。
【0214】
2)2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イルアミンの製造
前段階のトリフルオロアセトアミド誘導体1g(2.08mmol)をテトラヒドロフラン10mLに溶かし、それに4モル%水酸化ナトリウム10mLを加える。試薬が完全に消失するまで、混合物を室温で高撹拌する(4時間かけて)。
【0215】
次に、溶媒をある程度濃縮し、ジエチルエーテル100mLで3回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去して乾固させる。そうして、それ以上精製せずに、白色粉末810mgが回収される(収率:100%)。
【0216】
1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):0.89(t、J=7Hz:3H);1.20〜1.50(mt:計30H);1.49(s:3H);1.62(mt:2H);1.67(広いs:2H);2.71(mt:1H);3.46(t、J=7Hz:2H);3.54(広いd、J=10Hz:2H);4.30(dd、J=10および1.5Hz:2H)。
【0217】
b−メトキシ−(ポリエチレングリコール5000)−N−(2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イル)アミド(化合物E)の合成
この最後の段階では、脂質アミンとPEGの酸(それの合成は実施例5に記載)との縮合を行う。
【0218】
MeO−PEG5000−COOH1.15g(0.23mmol)を塩化メチレン5mLに溶かす。トリエチルアミン181μL(1.30mmol)を加え、次に2−メチル−2−オクタデシルオキシ−[1,3]ジオキサン−5−イルアミン100mg(0.26mmol)を加える。BOP172mg(0.39mmol)を加え、反応液を室温で1時間撹拌する。
【0219】
ジエチルエーテル(60mL)を加えることで反応混合物を沈殿させ、遠心分離し、エーテルで洗浄し、分取HPLCに注入する。最も純粋な分画を単離することで、白色凍結乾燥生成物420mgを得る(収率:34%)。
【0220】
1H NMR(400MHz、CDCl3、δd(ppm)):0.89(t、J=7Hz:3H);1.20〜1.50(mt:30H);1.48(s:3H);1.55〜1.75(mt:2H);3.39(s:3H);3.40〜3.90(mt:448H);3.89(広いd、J=8.5Hz:1H);4.05(s:2H);4.30(広いd、J=12Hz:2H);7.57(d、J=8.5Hz:1H)。
【0221】
実施例7:酸感受性化合物AシンおよびトランスによるDNA取り込みに関する試験
上記で製造される酸感受性化合物Aのシン型およびトランス型は、DNAの非ウィルストランスフェクションに従来使用されているカチオン性脂質と類似の構造を有し、それらはそれ自体で構造中に、それらを酸感受性とする上で寄与する環状オルトエステル官能基を有する。
【0222】
従って本実施例の目的は、酸感受性化合物Aシンおよびトランスが、カチオン性脂質に対して特異的なトランスフェクション対象のDNAを取り込む能力を保持しながら、酸性媒体中で分解することから、取り込まれたDNAを放出する能力を有することを示すことにある。それは、臭化エチジウム(EtBr)を用いる蛍光試験によって容易に示すことができる。蛍光がなければ、遊離のDNAが存在しないことを反映しており、それはDNAが取り込まれていることを意味する。
【0223】
以下の説明においては、実施例3で製造した酸感受性化合物Aの2種類の型であるシンおよびトランスを用い、公開WO97/18185に記載されていて、H2N−(CH2)3−NH−(CH2)4−NH−(CH2)3−NH−CH2−CO−Gly−N[(CH2)17−CH3]2という式を有する非酸感受性類縁体を対照として用いた。この非酸感受性類縁体は、下記の説明において「対照カチオン性脂質」と称する。
【0224】
異なる力価を有する脂質溶液とDNA溶液を等量混合することで、対照カチオン性脂質または酸感受性化合物Aシンもしくはトランスを増量させながら、それとDNAを接触させる。そうして、濃度10μg/mLを有するDNA複合体800μLのサンプルを、対照カチオン性脂質または酸感受性化合物Aシンもしくはトランスの量を増加させながら、150mMの塩化ナトリウム溶液中で調製する。
【0225】
時間t=0で、濃度0.1mol/Lを有しpH5の緩衝液200μLをそれらのサンプルに加え、サンプルを37℃の乾燥機に入れる。臭化エチジウム(EtBr)による蛍光を、励起波長および発光波長をそれぞれ260nmおよび590nmとするフルオロマックス(FluoroMax)−2(Jobin Yvon−Spex)を用いて経時的に測定する(20℃で測定)。励起および発光用のスリット幅は、5nmに設定する。蛍光値は、DNA/カチオン性脂質もしくはDNA/酸感受性化合物溶液1mL当たり1g/L(DNA0.01mg/mL)の臭化エチジウム3μLを加えた後に、蛍光値を記録する。
【0226】
結果を図1にまとめてある。pH5では、DNAを取り込むのに用いられる酸感受性化合物Aシンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質の量が低すぎる場合(脂質0.4nmol/DNAμg)、従ってDNAが完全に取り込まれているわけではない場合、経時的に蛍光に有意な変動は測定されない。他方、それより多量(脂質1.7nmol/DNAμgおよび脂質6.0nmol/DNAμg)の場合には、(非酸感受性)対照カチオン性脂質に関して、酸感受性化合物Aシンおよびトランスの異なる挙動が認められ、DNAの完全な取り込みが可能である。実際、酸感受性化合物Aシンおよびトランスは、蛍光の増加によって示されるように、経時的にDNAを放出するが、酸感受性ではない対照カチオン性脂質の場合にはその放出はない。さらに、そのDNA放出は酸添加(pH5および37℃)から数時間後に生じる。
【0227】
使用される酸感受性化合物の量に応じて、DNA放出の動力学にも変化が認められる。使用される酸感受性化合物Aの量が少なくなるほど、DNA放出が急速になる。
【0228】
この試験は、酸感受性化合物Aシンおよびトランスの顕著な特性を示すものである。これら化合物は、DNAを取り込むことでそれと複合体を形成することができ、それの酸性媒体中での分解によって、DNAと形成された複合体の分解が生じ、従ってDNAが放出される。従ってこれらの酸感受性化合物は、細胞へのDNAの非ウィルストランスフェクションの文脈で特に有用である。
【0229】
実施例8: in vitro での酸感受性化合物Aシンおよびトランスのトランスフェクション力についての試験
本実施例は、前述の実施例に記載の非酸感受性類縁体(対照カチオン性脂質)と比較した、酸感受性化合物Aシンおよびトランスのin vitroでのトランスフェクション力を示すものである。
【0230】
本試験は、脂質1.0または4.0または6.0または10.0nmol/DNAμgという4種類の異なる使用比で行った。これら各条件について、ウシ胎仔血清を使用した場合および使用しない場合(「+および−血清」)で試験を行った。
【0231】
細胞の培養
ヒト頸部上皮癌由来のHeLa細胞(American type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA)を、2mM L−グルタミン、50単位/mLのペニシリンおよび50単位/mLのストレプトマイシンを加えたMEM(「最小必須培地」)型の培地存在下に培養する。培地および添加剤は、ギブコ/BRLライフテクノロジーズ(Gibco/BRL life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)から入手される。細胞を、インキュベータ中、37℃および5%二酸化炭素でフラスコ中にて培養する。
【0232】
トランスフェクション
トランスフェクション前日にHeLa細胞を、細胞数30000〜50000/ウェルで24ウェルプレートに移し入れる。これらの希釈液は、24時間後に約80%集密状態となる。
【0233】
トランスフェクションのため、細胞を2回洗浄し、血清を含む(10%FCS(体積比))または血清を含まない培地500μLとともに37℃でインキュベートする。
【0234】
プラスミドDNA 0.5μgを含む複合体50μLを各ウェルに加える(複合体は、ウェルへの添加の少なくとも30分前に調製する)。37℃で2時間後、血清を含まないプレートに10%(体積比)のFCS(「ウシ胎仔血清」)を補給する。
【0235】
全てのプレートを37℃および5%二酸化炭素に36時間置く。
【0236】
ルシフェラーゼ活性の測定
短時間で、トランスフェクション細胞をPBS(リン酸緩衝液)500μLで2回洗浄し、試薬(プロメガ(Promega)細胞培養物溶解試薬、ルシフェラーゼアッセイシステムキットから)250μLで溶解する。
【0237】
4℃で5分間遠心分離した(12000×g)溶解物の上清10μLの小分けサンプルを、光度計(Wallac Victor2光度計(1420 Multilabel couter))で測定する。
【0238】
ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン、補酵素AおよびATP存在下に10秒間にわたり発光によって定量し、2000個の処理細胞に関して表す。そこで、ルシフェラーゼ活性は、相対光単位(「RLU」:「相対光単位」)として表し、ピアースBCAキット(Pierce BCA kit, Rockford, IL, USA)を用いて得られるサンプルでの蛋白濃度で正規化する。
【0239】
図2にまとめた結果は、調べた3種類の化合物(酸感受性化合物Aシンおよびトランスならびに対照カチオン性脂質)について高いトランスフェクション活性を示している。それらの間で有意差は認められない。血清が存在しないと、トランスフェクションのレベルは全ての場合で高く(105〜107RLU/蛋白μg)、トランスフェクション力は使用される酸感受性化合物または対照カチオン性脂質の量に応じて上昇する。血清の存在によって、全ての場合でトランスフェクションの阻害が誘発される。
【0240】
従って本実施例は、シン型およびトランス型での酸感受性化合物Aのトランスフェクション力が、それの非酸感受性類縁体(対照カチオン性脂質)と比較して保存されることを示している。より一般的には、非ウィルストランスフェクションで有用であることが知られているカチオン性脂質型の分子への酸感受性環状オルトエステル官能基の導入は、その化合物が効率良くDNAをトランスフェクションする能力を破壊しない。
【0241】
実施例9:DNA/カチオン性脂質トランスフェクション性複合体のコロイド安定化のためのノニオン系界面活性剤としての酸感受性化合物CおよびDの使用
本実施例は、本願において(d)で定義の種類の酸感受性PEG化脂質を、DNA/カチオン性脂質トランスフェクション性粒子に関してコロイド安定化の役割を果たすノニオン系界面活性剤として使用することができることを示すものである。
【0242】
本実施例において使用するカチオン性脂質は、実施例7および8ですでに使用され、公開WO97/18185に式H2N−(CH2)3−NH−(CH2)4−NH−(CH2)3−NH−CH2−CO−Gly−N[(CH2)17−CH3]2(対照カチオン性脂質)で記載されているものである。
【0243】
実施例5で製造された化合物CおよびDを、酸感受性PEG化脂質として用いる。対照としては、BRIJ700(SIGMA)および下記式のPEG化脂質:
【0244】
【化32】
を用い、それらはそれぞれ化合物CおよびDの非酸感受性類縁体であり、ノニオン系界面活性剤として知られている(例えば、公開WO98/34648参照)。これら2種類の対照を水中10g/Lで用いる。
【0245】
核脂質複合体(DNA/対照カチオン性脂質)のサンプル1mLを、75mMの塩化ナトリウム溶液中10μg/mLのDNAから、対照カチオン性脂質およびPEG化脂質(化合物Cまたは化合物DまたはBrij700または類縁体D)の溶液とDNA溶液とを等量混合することで調製する。これらのサンプルはいずれも、1.5(DNA1μg当たりの脂質nmol単位)の対照カチオン性脂質/DNA比を有し、含有PEG化脂質量を増加させる(ポリマー/DNAの重量比として表す)。
【0246】
得られる粒子の径の測定は、混合後30分に行い、特に対照カチオン性脂質/DNA複合体の安定化に対する酸感受性PEG化脂質(化合物CまたはD)または非酸感受性PEG化脂質(Brij700または類縁体D)の量の影響を調べることができる。流体力学的直径の測定は、DNA 0.01mg/mLを含む異なる溶液800μLを充填したプラスチックキュベット(4つの透明な面)を用いるコールター(Coulter)N4Plus装置で行い、測定は単一モードで90°にて行う。
【0247】
結果を図3に示してあるが、この図は使用される化合物CもしくはDまたはBrij700もしくは類縁体Dの量の関数としての対照カチオン性脂質/DNA粒子の径における変動を示したものである。
【0248】
酸感受性PEG化脂質とそれの安定な対照が、ある最小量に達した時に粒径の小さい(100nm未満)対照カチオン性脂質/DNA粒子を形成することができ、しかもその同じ対照カチオン性脂質/DNA粒子が、酸感受性や非酸感受性PEG脂質が存在しない場合、または後者の量が非常に低い場合には、自然に凝集する(1μmより大きい粒径)ことが認められる。
【0249】
そこで本実施例では、化合物CおよびD、より一般的には本願の一般式(I)において(d)で定義の種類の酸感受性PEG化脂質をノニオン系界面活性剤として用いることができ、それのコロイド安定化力が、核脂質粒子のコロイド安定化に従来使用されている安定なノニオン系界面活性剤(すなわち、例えばBrij700などの非酸感受性のもの)の力に匹敵することが示される。
【0250】
実施例10:化合物CおよびDによるDNA/カチオン性ベクター複合体のコロイド安定化に対するpHの影響
本実施例は、本願の一般式(I)における(d)で定義される種類の酸感受性PEG化脂質であって、DNA/カチオン性脂質核脂質複合体を安定化するノニオン系界面活性剤として使用されるものを、酸性pHで分解することができ、従って前記核脂質複合体を放出することができることを示すものである。
【0251】
ここで使用される顕著な特性は、PEG化脂質を脂質部分を持たないPEGに置き換えた場合に、コロイド安定化がないことである。実際、カチオン性ベクターおよび酸感受性PEG化脂質の存在下でのDNAの緩衝剤を含まない媒体中での製剤によって、小さい粒子が生じる(上記の実施例9参照)。他方、PEGのみ(すなわち、脂質部分に結合していない)を用いる同じ試験では安定化は得られない。
【0252】
本実施例で使用される酸感受性PEG化脂質は、実施例5で製造の化合物D、ならびに前記実施例および後述の説明で「類縁体D」と称されるそれの非酸感受性類縁体である。
【0253】
核脂質複合体(DNA/対照カチオン性脂質)のサンプル1mLを、75mMの塩化ナトリウム溶液中10μg/mLのDNAから、対照カチオン性脂質および化合物Dまたは非酸感受性類縁体Dを含む溶液とDNA溶液とを等量混合することで調製する。これらのサンプルはいずれも、対照カチオン性脂質/DNA比が1.5(DNA1μg当たりの脂質nmol単位)であり、含有PEG化脂質量を増加させる(ポリマー/DNAの重量比として表す)。
【0254】
pH5の酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(0.1mol/L)100μLを、換気式乾燥機中37℃にサーモスタット調節したこれらサンプルに加える。粒子径を時間の関数として測定する。
【0255】
得られる結果を図4に示してあり、その図は時間の関数として、さらに酸感受性もしくは非酸感受性PEG化脂質/DNA比(3種類の重量比で試験:0.5または0.75または1)に従っての核脂質粒子粒径を表す。
【0256】
類縁体D(非酸感受性PEG化脂質)の場合、pHは粒子のコロイド安定性に影響しない。形成される粒子は、使用される類縁体D/DNA比とは無関係に、100nm程度の小さい粒径を有する。時間t=0では、化合物D/DNA比とは無関係に、化合物では同じ安定性が認められる。
【0257】
他方、化合物Dを酸性pH(pH5)でのノニオン系界面活性剤として用いる場合に、時間の関数としての核脂質粒子の粒径の上昇が認められる。化合物D/DNA比が低いほど、核脂質粒子の粒径におけるその上昇が急速になる。そこで、4時間後に、比率が低い場合(0.5)には粒子は完全に凝集体になっており、大過剰の化合物Dを用いる場合(比率1)にはそれが全くないかごくわずかである。
【0258】
従ってその結果から、化合物DがpH値に対して感受性であると推測することができる。実際、時間の関数としての核脂質粒子粒径の増加は、酸性媒体を用いた場合の酸感受性PEG化脂質(化合物D)の分解を反映している(実際に、その化合物の酸感受性部分のレベルで脂質部分の「脱離」がある)。
【0259】
さらに、酸感受性PEG化脂質/DNA比を上昇させることで、凝集に要する時間も増加し、それは酸感受性PEG化脂質の使用量が増えるに連れて、その中で核脂質粒子の凝集が起こる閾値を超える前に分解を起こすべきものが増えることを示す傾向を有している。そこで、酸感受性コロイド安定化剤の量を調節することで、所定のpHで有効成分を放出するのに要する時間をプログラムすることが可能である。
【0260】
実施例11:カチオン性脂質/中性共脂質( co−lipid )/化合物D混合物で調整されるDNAの in vivo でのトランスフェクション
本実施例は、カチオン性脂質系のリポソームで調整されるDNA転移の効率に対する化合物Dなどのノニオン系界面活性剤の影響を示すものである。
【0261】
1)リポソームの製造
それぞれクロロホルムに溶かした下記式:
【0262】
【化33】
のカチオン性脂質および中性脂質DOPE(Avanti Polar Lipids, Birmingham, ALから入手)を等モル量ずつ混合する。
【0263】
適切な量の化合物Dをクロロホルムに溶かし、混合物に加える。使用する化合物Dの量は、総脂質量のモル%で示す。
【0264】
次に、有機溶媒をアルゴン気流下で留去することで、試験管の底に脂質薄膜を形成する。この薄膜を少なくとも1時間にわたり真空乾燥し、pH7.4の20mM HEPES緩衝液および5%ブドウ糖で、4℃にて2時間にわたり再水和させる。そうして得られる脂質懸濁液を50℃で30分間加熱し、次に5分間超音波処理して、約100nmのリポソームの均一懸濁液を形成する。
【0265】
使用するDNAは、CMVプロモーターの制御下でCAT遺伝子を含むプラスミドDNAである。使用されるプラスミドDNAは、エンドトキシンレベルが20U/mg未満であり、超らせんDNAの量が90%より大きく、大腸菌DNAの混入が5%未満であり、RNAの混入が5%未満であり、蛋白の混入が1%未満であるという基準を有する。
【0266】
2)DNA/脂質複合体の製造
急速かつ激しく撹拌しながら、DNA溶液に等容量のリポソーム懸濁液(適切な濃度で)を急速に加える。全体として、DNA 1μgがカチオン性脂質5nmolと複合体を形成する。この形成された複合体は、約100〜240nmの直径を有する。
【0267】
3) in vivo での投与
全ての実験で、約6週齢の雌Balb/Cマウスを用いる。各マウスには、右脇腹に106個のM109細胞を皮下注射する。腫瘍が約300mm3の大きさに達した時に、マウスに対して静脈注射にて、DNA50μgを含むDNA/脂質複合体200μLを投与する。注射から24時間後に組織を摘出し、用時まで−70℃で保存する。
【0268】
4)CATアッセイ
「ファストプレプ細胞破壊装置FP120(FastPrep Cell Disrupter FP120)」(Bio 101/Savant)を用いて組織を均質化する。次にサンプルを、5分間にわたり100回転/分で遠心分離する。発現されるCAT導入遺伝子の量を、標準的なCAT ELISA法(Roche, IN)を用いて求める。
【0269】
5)結果
DNA/カチオン性脂質/DOPE複合体の遺伝子転移活性に関する化合物Dの用量−応答曲線を調べた。陰性対照としては、化合物「類縁体D」を用いた。予想通り、最も高い遺伝子転移は肺で起こる。化合物「類縁体D」を用いることで、用量依存的に肺および腫瘍でのトランスフェクション活性が阻害されることが認められた。化合物Dの量を増やすことでも、肺でのトランスフェクション活性が阻害される。他方、遺伝子転移は腫瘍では影響を受けないように思われる。これらの結果は、腫瘍の酸性環境により、管外溢出後に粒子の残りの部分からPEG部分が分離するという仮説と一致している。
【0270】
こうして得られ、図7に示した結果は、化合物Dにより、肺と比較して腫瘍に対して特異的な遺伝子転移活性を40倍上昇させることができることを示している。
【0271】
実施例12:pHの関数としての酸感受性化合物の安定性についての試験
本実施例は、本発明による酸感受性化合物が、存在するオルトエステル環(5員環または6員環)の性質に応じて調節可能である酸感受性を有することを示すものである。
【0272】
この趣旨において、各種範囲の感受性を網羅することができる各種酸感受性PEG化脂質について、pHおよび時間の関数として核脂質複合体(実施例9および10で用いたものと同じもの)の粒径の変動を測定する。これらの試験は、一定の対照カチオン性脂質/DNA比および酸感受性PEG化脂質/DNA比で行う。
【0273】
DNA/対照カチオン性脂質/酸感受性PEG化脂質複合体のサンプル1mLを、以下のようになるように調製する。
【0274】
−対照カチオン性脂質/DNA比が1.5nmol/μgである。
【0275】
−酸感受性PEG化脂質/DNA比が0.5または1である。
【0276】
−DNA濃度が、75mMの塩化ナトリウム溶液中20μg/mLである。
【0277】
30分後、0.05mol/Lの緩衝液500μLおよび150mMの塩化ナトリウム溶液500μLを、換気式乾燥機中37℃でサーモスタット調節された上記サンプルに加える。そうして酸性pHとし、粒径を時間の関数として測定する。
【0278】
サンプルの最終濃度は、75mMの塩化ナトリウム溶液中DNA10μg/mLである。使用する緩衝液は、pH4、pH5およびpH6のクエン酸/クエン酸ナトリウム緩衝液、ならびにpH7.4のHepes/水酸化ナトリウム緩衝液である。
【0279】
得られた結果を図5に示してあり、その図は、前記実施例で製造され、使用されるオルトエステル環(5員環もしくは6員環)の性質のみが異なる酸感受性化合物CおよびEについての、pHおよび時間の関数としての核脂質粒子の粒径における変動を示すものである。
【0280】
これら2種類の化合物について、pHが酸性の場合には、時間の関数としての核脂質粒子の粒径に上昇が認められ、それは分解を反映している。他方、pHが7.4の場合には、時間の関数としての核脂質粒子の粒径に上昇は認められない。さらに、pHが低くなるにつれて、核脂質粒子の凝集が急速に増える。
【0281】
最後に、試験を行った2種類の化合物CおよびEの間で、動力学に大きい相違が認められる。pH6では、化合物Eを用いた場合には酸性化から約1時間後に核脂質粒子の凝集が開始するが、化合物Cを用いた場合には少なくとも4時間にわたって安定化を行うことができる。
【0282】
これらの結果は、酸感受性化合物CおよびE、より一般的には本発明によるその種の酸感受性化合物に下記のようないくつかの顕著な特性があることを示している。
【0283】
−それらはいずれも、酸性pH値で高い感受性を示し、いずれの場合もpHが低いほど、それの不安定化が急速になる。
【0284】
−それらはいずれも、生理的pH(pH7.4)では比較的安定である。
【0285】
−それらの分解の動力学は、使用されるオルトエステル基(5員環または6員環)に応じて非常に異なる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
カチオン性脂質または酸感受性化合物0.4または1.7または6.0nmol/DNAμgという3種類の異なる比率で、DNAと対照カチオン性脂質または酸感受性化合物A シンもしくはトランスとの間で形成される複合体のpH5での時間の関数としての蛍光レベルの変動を示す図である。
【図2】
血清を含む場合または含まない場合での、各種使用比率でのDNAと化合物A シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質との間で形成された複合体のHeLa細胞へのin vitroでのトランスフェクションの効率を示す図である。
【図3】
DNA量に関して使用される化合物Cまたは化合物DまたはBrij700または化合物Dの非酸感受性類縁体(類縁体D)の量(重量比)の関数としての対照カチオン性脂質/DNA核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。
【図4】
pHが5の場合の各種比率(重量比)での、時間の関数としての対照カチオン性脂質/DNA/化合物もしくは類縁体D核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。
【図5】
各種pH(pH4、pH5、pH6およびpH7.4)での時間の関数としての、対照カチオン性脂質/DNA/化合物Cもしくは化合物E核脂質粒子の粒径(nm単位)の変動を示す図である。
【図6】
プラスミドpXL3031の模式図である。
【図7】
カチオン性脂質/DOPE/DNA(5/5/1)複合体が介在するin vivoでの遺伝子転移活性に対する化合物Dについての用量/応答曲線を示す図である。
Claims (27)
- 環状オルトエステルならびにポリアルキレングリコール類、単糖類もしくは多糖類、親水性治療性分子またはポリアミン型の基から選択される少なくとも一つの親水性置換基を有することを特徴とする酸感受性化合物ならびに該化合物の塩。
- 下記式の構造を有する請求項1に記載の酸感受性化合物ならびに該化合物の塩。
・gは0、1、2、3または4の値を取り得る整数であり;
・Gは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数1〜6のアルキル基、またはアリール基を表し;
・G1およびG2は、
(a)一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(b)一方が炭素原子数10〜24であって、1以上の不飽和を有していても良い疎水性直鎖アルキル基を表し;他方が下記一般式の基:
(c)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が、ポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表し;あるいは
(d)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体、疎水性デンドリマー、あるいは単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体もしくは疎水性デンドリマーとモノマー単位1〜20個を有するポリアルキレングリコール分子との間の共有結合結合体から選択される疎水性置換基を表し;あるいは
(e)一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し;他方が治療性分子を表し;あるいは
(f)一方が親水性の治療性分子を表し;他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表す。] - Gが、水素、メチル、エチルまたはフェニルから選択される請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 前記単鎖または二重鎖アルキルが、炭素原子数10〜24であって、1以上の不飽和を有していても良い1個または2個の直鎖アルキル鎖からなる請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 前記ステロイド誘導体が、ステロール類、ステロイド類およびステロイドホルモン類から選択される請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 前記疎水性デンドリマーがポリ(ベンジルエーテル)である請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 前記ポリアルキレングリコール類が、平均分子量102〜105ダルトンを有するポリアルキレングリコール類から選択される請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 前記ポリアルキレングリコール類が、平均分子量102〜105ダルトンを有するポリエチレングリコール類(PEG)から選択される請求項7に記載の酸感受性化合物。
- 前記単糖類または多糖類が、ピラノース類、フラノース類、デキストラン類、α−アミロース、アミロペクチン、フルクタン類、マンナン類、キシラン類およびアラビナン類から選択される請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 前記ポリアルキレングリコールまたは前記単糖類もしくは多糖類が、標的指向要素に共有結合的に連結されている請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 前記標的指向要素が、糖類、ペプチド類、蛋白類、オリゴヌクレオチド類、脂質類、神経伝達物質、ホルモン類、ビタミン類またはそれらの誘導体から選択される請求項10に記載の酸感受性化合物。
- 前記置換基G1およびG2のそれぞれが、「スペーサー」分子を介して前記環状オルトエステルに間接的に連結されている請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 前記「スペーサー」分子が、アルキル類(炭素原子数1〜6)、カルボニル、エステル、エーテル、アミド、カーバメートもしくはチオカーバメート結合、グリセリン、尿素、チオ尿素またはそれらの基のいくつかの組み合わせから選択される請求項13に記載の酸感受性化合物。
- 前記治療性分子が、ペプチド類、オリゴペプチド類、蛋白類、抗原類およびそれの抗体類、酵素類およびそれの阻害剤類、ホルモン類、抗生物質、鎮痛薬、気管支拡張薬、抗微生物薬、抗高血圧薬、心血管薬、中枢神経系に作用する薬剤、抗ヒスタミン薬、抗鬱薬、精神安定薬、抗痙攣薬、抗炎症物質、刺激薬、鎮吐薬、利尿薬、鎮痙薬、抗虚血薬、細胞死を制限する薬剤または抗癌剤から選択される請求項2に記載の酸感受性化合物。
- 請求項1ないし15のいずれかに記載の酸感受性化合物を少なくとも1種類含む組成物。
- 少なくとも1種類の生物活性物質および請求項2に記載の酸感受性化合物を含み、G1およびG2が(a)、(b)、(c)または(d)で示される定義を有する組成物。
- 前記生物活性物質が、請求項15に記載の治療性分子または核酸である請求項17に記載の組成物。
- さらに1以上の補助剤を含む請求項16および17のいずれかに記載の組成物。
- 前記補助剤が1以上の中性脂質である請求項19に記載の組成物。
- 前記補助剤が、天然または合成の両性イオン性脂質または生理条件下ではイオン電荷を持たない脂質から選択される請求項20に記載の組成物。
- 前記補助剤が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびに1〜3回N−メチル化されたそれらの誘導体、ホスファチジルグリセリン類、ジアシルグリセリン類、グリコシルジアシルグリセリン類、セレブロシド類(特に、ガラクトセレブロシド類など)、スフィンゴ脂質(特に、スフィンゴミエリン類など)あるいはアシアロガングリオシド類(特に、アシアロGM1およびGM2など)から選択される請求項21に記載の組成物。
- さらに、注射製剤用の製薬上許容される媒体を含む請求項16ないし22のいずれかに記載の組成物。
- さらに、皮膚および/または粘膜への投与用の製薬上許容される媒体を含む請求項16ないし22のいずれかに記載の組成物。
- 疾患治療用の医薬品製造における請求項1ないし15のいずれかに記載の酸感受性化合物の使用。
- 核酸トランスフェクション用の医薬品製造における、請求項2に記載されており、G1およびG2が(a)、(b)、(c)または(d)で示される定義を有する酸感受性化合物の使用。
- 医薬品として使用される、請求項2に記載されており、G1およびG2が(e)または(f)で示される定義を有する酸感受性化合物。
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