CN107531900A - 聚合物二甲双胍和其作为治疗剂和作为递送载体的用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含二甲双胍残基的聚合物(“PolyMet”)作为可用的治疗剂、递送载体和核苷酸转染试剂。本文还提供了治疗受试者的疾病或不需要的病况的方法，其中所述方法包括给予PolyMet作为治疗剂以对抗所述疾病或病况。本文还提供了治疗受试者的疾病或不需要的病况的方法，其中所述方法包括给予在包含PolyMet的递送载体中的治疗剂。本文进一步提供了制备PolyMet的方法。

Description

聚合物二甲双胍和其作为治疗剂和作为递送载体的用途
政府支持声明
本发明在政府支持下在国立卫生研究院授予的资助号CA151652、CA149363和DK100664下进行。政府对本发明具有一定权利。
发明领域
本发明涉及包含共价键合的二甲双胍残基的聚合物和大分子，在本文称为聚-二甲双胍(PolyMet)，其本身具有治疗剂性质，还可用作其它治疗剂的递送载体和作为转染试剂。
发明背景
二甲双胍经口服有效治疗2型糖尿病。二甲双胍被美国食品药品监督管理局批准用于治疗性治疗糖尿病。二甲双胍的化学名称是N,N-二甲基亚胺基二甲亚胺二酰胺。其是双胍，一种美国目前市售的抗高血糖药，呈其盐酸盐的形式1,1-二甲双胍盐酸盐。
已知二甲双胍在细胞水平上改进胰岛素作用，但不影响胰岛素分泌。二甲双胍不促进重量增加，具有对数种心血管风险因子的有益效果。因此，二甲双胍被广泛视为大多数2型糖尿病患者的药物选择。
尽管二甲双胍作为糖尿病药物的功效，但其仍具有一些缺点。尽管二甲双胍是糖尿病的一线疗法，但其从血浆中的快速清除要求多次高剂量，以得到持续活性的血浆浓度。特别是，尽管二甲双胍在小肠中被有效摄取，但其在结肠中吸收差(Marathe, Br. J.Clin., Pharmacol., 50, 325-332 (2000))。结果是，二甲双胍的有效血浆浓度的时间窗受到限制。因为这种狭窄的吸收窗，通常处方二甲双胍摄取约2-3次/天。
为此和其它原因，二甲双胍具有未被充分开发的潜在用途。本公开内容解决了许多这些缺点。
发明简述
本文提供了包含二甲双胍残基的聚合物(“PolyMet”)。PolyMet是有用的治疗剂、递送载体和遗传物质、例如核酸的转染试剂。
本文还提供了治疗受试者的疾病或不需要的病况的方法，其中所述方法包括给予PolyMET作为治疗剂以对抗所述疾病或病况。
本文还提供了治疗受试者的疾病或不需要的病况的方法，其中所述方法包括给予在包含PolyMet的递送载体、例如纳米颗粒中的治疗剂。
本文进一步提供了制备PolyMet的方法。
这些和其它方面在下文完全详细地公开。
附图简述
图1A描述二甲双胍、PEI和PolyMet在220-300 nm的范围内的UV光谱。PolyMet和二甲双胍二者在大约230 nm具有最大吸光度，表明二者具有类似的功能结构，而PEI不是如此。图1B描述二甲双胍、PEI和PolyMet的细胞毒性。在暴露于二甲双胍、PolyMet和PEI溶液24 h后，使用MTT测定法测量H460细胞利用率。数据为均值± S.D. (n = 8)。图1C描述PEI和PolyMet的最大可耐受剂量(MTD)。CD-1小鼠经IV注射各种浓度的聚合物/0.9% NaCl溶液。*MTD是在IV注射24小时内低于任何致死剂量0.5 mg/kg。每个剂量测试至少三只小鼠。
图2描述PEI和PolyMet的MALDI-TOF质谱。将地蒽酚(20 mg/ml，在THF中，NaTFA 1mg/ml)与样品混合，和α-氰基-4-羟基肉桂酸用于样品制备。对于PEI，高于30%的强度信号广泛出现在515.4和1244.1 (m/z)之间的范围。PolyMet谱中高于30%的强度信号出现在670.5-3820.2 (m/z)。与PEI谱的峰位置相比，PolyMet光谱溶液的谱中的峰向更高的质量范围位移。这样的位移表明，PolyMet的分子质量高于PEI，显示PEI被双氰胺成功修饰。
图3描述复合物的制剂优化。PEI-HA (A)和PolyMet-HA (B)的N/P比率对复合物的粒度(蓝色)和ζ电位(红色)的影响。
图4，PolyMet/HA复合物(A, C) LPH-PolyMet (B, D)的A和B示意图和(C, D)代表性的透射电子显微术(TEM)图像。图4E描述纳米颗粒的动态光散射(DLS)测量。
图5A描述全血的血液学检验；图5B描述血清的血液生物化学检验；和图5C描述从注射PBS、二甲双胍、LPH-PEI和LPH-PolyMet后收集的主要器官的H&E染色。数据为均值±S.D. (n = 5/组)。
图6A描述二甲双胍和PolyMet抑制H460肿瘤生长。PBS、二甲双胍、LPH-PEI和LPH-PolyMet每隔一天经静脉内给予，和最终注射后24小时处死小鼠。在图6A中，每天测量肿瘤体积；图6B描述最后注射后当天测量肿瘤重量，并与体重比较以确定肿瘤负荷的百分率；图6C描述在结束时间点在各治疗组中H460肿瘤大小的视觉观察；(n = 5/组)。
图7A描述通过激活AMPK，抑制mTOR途径，二甲双胍和PolyMet抑制肿瘤生长；图7B描述诱导自噬和细胞凋亡机制。带有H460肿瘤的小鼠每隔一天经IV注射，和第二次注射后24 h准备分析肿瘤蛋白。自噬下的细胞通过LC3b抗体染色(红色)，和细胞的凋亡通过TUNEL测定法显示(绿色)。细胞核染成蓝色。百分比分别表示LC3b阳性细胞(红色)的平均百分比和TUNEL阳性细胞(绿色)的百分比。5个随机选择的显微镜视野在ImageJ上定量分析。数据为均值± S.D. (n = 5/组)。
图8描述不同的LPH纳米颗粒的体外和体内基因沉默效果。对于体外研究，如图8A所示，H460/Luc细胞用含不同剂量的siRNA的不同LPH制剂在37°C下孵育4小时。孵育结束时，细胞用PBS洗涤，和在无siRNA培养基中培养另外24小时。分析细胞的萤光素酶活性，并通过蛋白标准化。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。数据为均值± S.D。(n=8/组)。对于体内研究，包含PolyMet的LPH纳米颗粒可经系统递送抗-细胞凋亡BCL2 siRNA至肿瘤部位和抑制肿瘤生长。带H460肿瘤的小鼠每隔一天经静脉内注射；图8B描述2次注射后肿瘤BCL2蛋白水平通过蛋白质印迹法分析测量；图8C描述每天测量肿瘤体积；图8D描述在体内用不同制剂的siRNA处理后H460肿瘤细胞的TUNEL染色。百分比表示TUNEL阳性细胞(绿色)的平均百分比。5个随机选择的显微镜视野在ImageJ上定量分析。数据为均值± S.D. (n =5/组)。与对照相比，*P < 0.05, **P < 0.01。
图9是指包含PolyMet的LPH纳米颗粒系统递送抗-细胞凋亡VEGF siRNA至肿瘤部位和抑制肿瘤生长。带H460肿瘤的小鼠每隔一天经静脉内注射。图9A描述2次注射后肿瘤VEGF蛋白水平通过蛋白质印迹法分析测量；图9B描述每天测量肿瘤体积；图9C描述在体内用不同制剂的siRNA处理后H460肿瘤细胞的TUNEL染色。百分比表示TUNEL阳性细胞(绿色)的平均百分比。5个随机选择的显微镜视野在ImageJ上定量分析。数据为均值± S.D. (n =5/组)。与对照相比，*P < 0.05, **P < 0.01；图9D描述小鼠中LPH-PolyMet-siVEGF沉默。
图10描述以指定的N/P比率，(A) L-PEI和L-PolyMet和(B) B-PEI和B-PolyMet的转染效率。在96-孔板中萤光素酶pDNA浓度是0.5 μg/孔。数据为均值± S.D. (n = 6/组)。
图11是基因递送特性的图示。
图12是使用LPH-PolyMet的siRNA递送的图示。
图13是使用LPH-PolyMet的pDNA递送的图示。
图14描述显示在H460细胞中萤光素酶质粒活性的数据。
图15描述显示在H460细胞中RFP质粒活性的数据。
图16描述显示在H460异种移植物中不同的LPH纳米颗粒的体内基因沉默效果的数据。在图16A中，带H460肿瘤的小鼠每隔一天经静脉内注射和每天测量肿瘤体积。图16B显示在结束时间点在各治疗组中的H460肿瘤。在图16C中，8次注射后H460肿瘤VEGF蛋白水平通过蛋白质印迹法分析测量。图16C中的柱形图表示使用Image J，标准化VEGF条带强度的定量分析。数据为均值± SEM (n = 5/组)，通过带Tukey校正的双向ANOVA分析。自(A)或代表三个独立实验的(B和C)合并数据。n.s = 不显著, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.005。
图17描述带H460肿瘤的小鼠每隔一天经静脉内注射二甲双胍和包含PolyMet或PEI的LPH纳米颗粒。每天测量肿瘤体积。数据为均值± SEM，通过带Tukey校正的双向ANOVA分析；自三个独立实验合并数据；5小鼠/组/实验，n.s. = 不显著, *P < 0.05, **P <0.01, ***P < 0.005。
图18描述不同分子量的PEI和PolyMet LPH纳米颗粒对肿瘤生长的影响。带H460肿瘤的小鼠每隔一天经静脉内注射和每天测量肿瘤体积。5小鼠/组/实验, n.s. = 不显著,*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005。
图19描述在H460异种移植物中不同的分子量的PEI和PolyMet LPH的体内基因沉默效果。带H460肿瘤的小鼠每隔一天经静脉内注射和每天测量肿瘤体积。5小鼠/组/实验,n.s. = 不显著, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005。
图20描述胆甾醇基氯甲酸酯(图20A)、胆甾醇基乙二胺(图20B)和胆甾醇基双胍(胆甾醇基二甲双胍) (图20C)的1H NMR (1)和13C NMR (2)光谱。
图21描述来自MET-Chol/DOPE (图21A)和EDA-Chol/DOPE (图21B)的脂质体的TEM形态学。
图22描述以不同的鱼精蛋白/HA/siRNA N/P摩尔比率，PH与siRNA的结合能力的凝胶阻留测定法。
图23描述鱼精蛋白/(HA+siRNA)比率对PH核心的大小和包裹效率的影响。
图24描述各种制剂的特征。
图25描述(图25A) PH核心和来自EDA-Chol/DOPE (图25B)和MET-Chol/DOPE (图25C)的靶向LPH-NP的TEM形态学。如本文所用的，PH是指鱼精蛋白 + 透明质酸复合物。LPH-NP是指脂质-聚阳离子-透明质酸纳米颗粒。EDA-Chol是指乙二胺胆固醇。MET-Chol是指二甲双胍修饰的胆固醇。DOPE是指二油酰基磷脂酰乙醇胺。
图26描述在具有H460异种移植物的鼠模型中用图26A中的各种制剂处理后，肿瘤生长的抑制。如图26B所示，在最后注射后当天测量肿瘤重量，并与体重比较以确定肿瘤负荷的百分比。
图27描述在具有H460异种移植物的鼠模型中用图27A中的各种siRNA制剂处理后，肿瘤生长的抑制。如图27B所示，在最后注射后当天测量肿瘤重量，并与体重比较以确定肿瘤负荷的百分比。
图28描述在最后注射后24 h分析的肿瘤中，p-AMPK、p-mTOR蛋白(图28A)和VEGF蛋白(图28B)的表达。
图29描述通过各种制剂诱导的细胞凋亡的TUNEL测定法。
图30描述通过各种siRNA制剂诱导的细胞凋亡的TUNEL测定法。
图31描述在各种制剂处理后主要器官的H&E染色。
图32描述包含Cy-3标记的siRNA的各种制剂在小鼠中的生物分布。
图33描述包含Cy-3标记的siRNA的各种制剂在H460异种移植物模型的肿瘤中的分布。
图34描述DOBP的NMR光谱，其合成描述于方案3。
图35描述不同的制剂(DLS)的特征性参数。Lipo-DOTAP包含鱼精蛋白/透明质酸核心和DOTA/胆固醇脂质包衣。Lipo-DOBP包含鱼精蛋白/透明质酸核心和DOBP/胆固醇脂质包衣。
图36描述空白脂质体的体外抗肿瘤活性(MTT)。空白脂质体是指不含负荷的DNA的LPH-DOTAP和LPH-DOBP。
图37描述空白脂质体(5mg/kg的二甲双胍)的体内抗肿瘤活性。
图38描述不同的LPH纳米颗粒的细胞凋亡(TUNEL测定法)。
图39描述不同的LPH纳米颗粒的血清的血液生物化学检验。
图40描述在不同的LPH纳米颗粒处理后H&E染色的器官切片。
发明详述
现在将在下文更详细地描述本发明公开的主题。然而，本发明公开的主题所属领域的技术人员获得前文描述中提供的教导益处后将想出本文描述的本发明公开的主题的许多修改和其它实施方案。因此，应理解，本发明公开的主题不限于所公开的特定实施方案，和修改和其它实施方案意图包括在随附权利要求的范围内。
二甲双胍(N’,N’-二甲基双胍)，用于治疗2型糖尿病的最有效的药物之一，还具有作为各种类型的癌症的治疗剂的潜力。(Morales, D.R. & Morris, A.D. Metformin inCancer Treatment and Prevention. Annual review of medicine (2014))。该化合物和其制备公开于例如美国专利号3,174,901。二甲双胍盐酸盐也可市售购得。
使用具有药理学活性的新材料用于药物递送可协同地增强治疗功效。本文公开了聚合物二甲双胍，即包含二甲双胍残基的聚合物，统称为PolyMet的设计和合成。因为在实施方案中聚合物通过无活性碳骨架缀合，因此生物活性的胍部分本质上作为二甲双胍利用，和PolyMet提供治疗癌症的新机会。此外，PolyMet可提供增强的基因递送。包含胍鎓基团的聚合物具有比其包含胺的对应物更高的基因递送效率(Zhang, R., Zheng, N.,Song, Z., Yin, L. & Cheng, J. The effect of side-chain functionality andhydrophobicity on the gene delivery capabilities of cationic helicalpolypeptides. Biomaterials 35, 3443-3454 (2014). Nimesh, S. & Chandra, R.Guanidinium-grafted polyethylenimine: an efficient transfecting agent formammalian cells. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics: official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V 68, 647-655 (2008)。
PolyMet是药物递送载体，其本身具有药理学和治疗活性。因此，PolyMet可协同地增强治疗功效。PolyMet在体外和体内显著降低PEI的细胞毒性。鉴于其聚阳离子活性，PolyMet还可被配制成LPH (脂质体-聚阳离子-透明质酸)纳米颗粒(“LPH-PolyMet”)。如本文所示的，二甲双胍和LPH-PolyMet纳米颗粒二者显著抑制癌症发展，其可归因于激活AMP-活化蛋白激酶(AMPK)，抑制mTOR途径和/或诱导自噬和细胞凋亡。LPH-PolyMet纳米颗粒还可用作siRNA分子的递送载体，因此促进基因递送。因此，PolyMet在癌症疗法中具有许多用途。此外，PolyMet本身可促进遗传物质、例如质粒DNA转染至细胞。因此，PolyMet本身是药物和递送其它药物的药物载体和转染试剂。
PolyMet还提供了其它益处。明显的是，与PEI相比，PolyMet具有显著更低的细胞毒性(图1C)和更高的最大可耐受剂量(MTD, 图1D)，表明包含二甲双胍残基的PolyMet毒性低于其包含仲胺的对应物。
如本文全面描述的，PolyMet至少提供：
1. 作为抗糖尿病剂和作为抗肿瘤剂的治疗性质；
2. 治疗剂递送性质，特别是抗癌药和核苷酸化合物例如siRNA；pDNA；mRNA；和
3. 治疗剂递送性质，特别是抗癌药和大分子例如肽；蛋白。
如本文所用的，术语“PolyMet”是指二甲双胍的聚合物，即，包含二甲双胍残基的聚合物或大分子，其结构在本文别处描述。聚合物可具有各种分子量。PolyMet的这个和其它方面在下文中全面描述。PolyMet可从具有可用的伯胺和/或仲胺的碳链制备，例如：
或
其中X、Y是包含n个碳的线性或分支的烃，其中n是2-50,000；2-40,000；2-30,000；2-20,000；2-10,000；2-5,000；2-4,000；2-3,000；2-2,0002-8,000；2-7,000；2-6,000；2-5,000；2-4,000；2-3,000；2-2,000；2-1,000；2-500；2-200；2-100；或2-50的整数。如本文所述的，聚-二甲双胍(PolyMet)可通过线性或分支的聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯亚胺(PPI)、任何已知的聚合物、树枝状聚合物和双氰胺的反应以包含二甲双胍残基来合成。
如本文所用的，“PEI”是指聚乙烯亚胺，和“PPI”是指聚丙烯亚胺。当p是1时，下式表示PEI，和当p是2时表示PPI：
。
PEI是一种用于制备PolyMet的有用原料。PEI可以是线性或分支的。线性PEI具有以下化学结构：
,
其在本领域中亦称为：
或
或
或
在上述结构中，n是2-10,000或更大的整数。
如本文所用的，“PPI”是指聚丙烯亚胺。其是一种用于制备PolyMet的有用原料。PPI可以是线性或分支的。线性PPI具有以下化学结构：
,
其中n是2-10,000的整数。
聚乙二醇化的PEI或PPI衍生物的实例具有以下结构：
其中m是约0.1-约0.9，n是约0.1-约0.9，和其中m和n代表聚合物中每个单元的摩尔分数和m和n的总和是1，p是1或2，和x是1-约500的整数。在PEI聚合物中p是1。在PPI聚合物中p是2。
具有靶向修饰的聚乙二醇化PEI或PPI衍生物的实例具有以下结构：
其中m、n、p和x如上所述。
分支的PEI或PPI是指PEI或PPI单体单元，其进一步包含侧链的乙基胺单元或PEI部分，或侧链的丙基胺单元或PPI部分至骨架PEI/PPI。非限制性实例是：
,
其中在PEI聚合物中p是1，和在PPI聚合物中p是2；和
其中n是在分支的PEI结构(其中p是1)或PPI结构(其中p是2)中重复单元的数量。有用的n值是2-约1,000,000；2-约500,000；2-约100,000；2-约50,000；2-约25,000；2-约10,000；2-约5,000；2-约1,000或更小。分支的PEI或PPI可包含共价结合至任何可用的氮的另外的乙基胺单元或PEI部分或另外的丙基胺单元或PPI部分。这样的线性或分支的PEI/PPI是市售可得的，或可使用已知的方法容易地获得。在每种情况下，PEI的大小或分子量(MW)可通过整数“n”表示，其在本文别处描述。在上述结构中，任何氢可被二甲双胍残基替换。
聚丙烯亚胺(PPI)的具体实例包括第1代PPI：
;
第2代聚丙烯亚胺(PPI)：
;
并且，如本领域已知的和本文别处论述的，可制备其它代，由此在各个连续的代中，最外面的伯氮被进一步分支以形成树枝状聚合物，其在下文论述。
树枝状聚合物是具有紧密分支结构的聚合物，具有大量的反应性基团，其在本公开内容中是指伯氮和仲氮。树枝状聚合物包括重复单元的数层或数代，其全都包含一个或多个分支点。树枝状聚合物，包括超分支的树枝状聚合物，通过具有至少两个反应性基团的单体单元的缩合反应制备。树枝状聚合物通常由末端表面基团、具有大于或等于2的分支官能度的内部分支接合点、和共价连接邻近的分支接合点的二价连结物组成。
树枝状聚合物(dendimer)和树状物(dendron)的实例，和合成它们的方法描述于美国专利号4,507,466；4,558,120；4,568,737；4,587,329；4,631,337；4,694,064；4,713,975；4,737,550；4,871,779和4,857,599。超分支的聚合物的实例和制备其的方法描述于例如美国专利号5,418,301。用于衍生以制备PolyMet大分子的合适的树枝状聚合物的非限制性实例是：聚丙烯亚胺树枝状聚合物；聚酰胺基胺(PAMAM)树枝状聚合物；聚芳基醚树枝状聚合物；聚赖氨酸树枝状聚合物；聚酯树枝状聚合物；聚酰胺树枝状聚合物；树枝状聚甘油；和三嗪树枝状聚合物。树枝状聚合物可通过构成树枝状聚合物的聚合物，通过树枝状聚合物上存在的化学部分和/或树枝状聚合物的分子量来定义。如本文提供的，树枝状聚合物大小和表面官能度可影响胺的衍生百分比。
树枝状聚合物可通过汇集或发散合成来制备。树枝状聚合物的发散合成包括分子生长过程，其通过在径向朝外方向上在分支上一系列连续的几何渐进逐步添加分支以产生有序排列而发生。因此，各树枝状大分子可被认为包括核心单元、一层或多层内部单元和外层的表面单元，其中各个单元包括单一分支接合点。单元可以在化学结构和分支官能度方面相同或不同。表面分支单元可包含化学反应性或钝态官能团，化学反应性表面基团可用于进一步延伸树枝状生长或用于修饰树枝状分子表面。化学钝态基团可用于物理修饰树枝状表面，例如调节疏水与亲水末端的比率和/或改进树枝状聚合物对特定溶剂的溶解性。
树枝状聚合物的汇集合成包括生长过程，其开始于成为树状物或树枝状聚合物的表面，和径向朝焦点或核心前进。树枝状聚合物可以是完美的或不完美的，即，不完整的或有缺陷的。不完整通常是不完全的化学反应或不可避免的竞争性副反应的结果。在实践中，实际的树枝状聚合物通常是不完美的，即，包含一定量的结构不完整性。
超分支的树枝状网络是指一类树枝状聚合物，其包含高水平的不完美的不规则分支。特别是，超分支的聚合物包含相对高数量的不规则分支区域，其中并非每一个重复单元都包含分支接合点。树枝状聚合物、树状物、随机超分支的聚合物、受控超分支的聚合物和树枝状嫁接物的制备和表征是众所周知的。
如上所述，树枝状聚合物是重复分支的大分子。它们通常是对称的大分子。如本文所用的，树枝状聚合物包含外部或表面伯氨基。树枝状聚合物的非限制性实例是：
.
在又一个实施方案中，双十六烷基胺(HCl)具有以下结构(游离碱)：
,
其可被衍生，其中氮上的氢被替换和氮共价结合至二甲双胍残基，产生具有双胍头基的双链两亲化合物。
如本文所用的，“二甲双胍残基”意指聚合物骨架或大分子支架中的氮与二甲双胍残基一起形成在聚合物链中共价连接的二甲双胍分子，如本文所述的。聚合物链中的每个二甲双胍可与任何其它邻近的二甲双胍共有碳。二甲双胍残基的化学结构在下文描述。
根据PolyMet的独特性质，本发明的主题涉及以下实施方案，其利用PolyMet的有用性。
二甲双胍的聚合物
在一个实施方案中，本发明的主题涉及二甲双胍的聚合物Poly-MET，其具有以下化学式I：
其中n是2-100,000的整数；或特别是2-10,000或更小；p是1或2，其中X是氢或具有下式的二甲双胍残基：
,
其中PolyMet中至少5%的X是二甲双胍残基。然而，有用的PolyMet是其中X是以至少0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95或100%的X出现率的二甲双胍残基。
当二甲双胍残基结合至聚合物或树枝状聚合物上的伯胺和仲胺时，所述残基与A上的氮一起可以是单甲基双胍和具有以下通式结构：
,
其中A表示聚合物，在特定的实施方案中是树枝状聚合物。
上述PolyMet可具有在PolyMet中0.001 % wt/wt-大于90% wt/wt的% wt的二甲双胍残基。
有用的n值包括2-约10,000；2-约5,000；2-约4,000；2-约3,000；2-约2,000；2-约1,000；2-约500；2-约250；50-约10,000；100-约9,000；500-约8,000；1,000-约7,000；1,500-约6,000；2,000-约5,000；和2,500-约4,500。
在一个实施方案中，本发明的主题涉及二甲双胍的聚合物Poly-MET，其具有以下化学式II
其中p是1或2，和n是2-100,000，特别是2-10,000的整数。
在一个实施方案中，本发明的主题涉及二甲双胍的分支的聚合物Poly-MET，其具有上文所示的化学式I，其中X是氢、二甲双胍残基、具有以下化学式的乙基胺残基：
,
或具有以下化学式的丙基胺残基：
,
其中，在每种情况下，*N上的0、1或2个氢被以下取代：a) 另外的乙基胺或丙基胺残基，其在每种情况下还可以相同的方式被进一步取代，从而形成逐渐增加的分支(其也可以是树枝状)结构，和/或b) 二甲双胍残基，其中分支PEI/PPI中至少5%的伯*N被二甲双胍残基取代。特别有用的PolyMet是具有分支骨架的那些，其中以至少约0.0001, 0.001, 0.01,0.1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,85, 90, 95或约100%的*N出现率，*N共价结合至二甲双胍残基。
分支的PolyMet可具有在分支的PolyMet中0.001 % wt/wt-大于90% wt/wt的% wt的二甲双胍残基。
分支的PolyMet包括通式III的那些：
其中每个p独立地是1或2，n是0.1-1.0；q是0.1-1.0；m是0.1-1.0, 其中n、q和m代表聚合物中每个单元的摩尔分数和n、q和m的总和是1；z是0-1,000的整数；*N是可被二甲双胍残基或乙基胺或丙基胺衍生的氮，其任一将本身包含*N；X是氢或二甲双胍残基；和Y’和Y”独立地是氢、二甲双胍残基或乙基胺或丙基胺，其任一将本身包含*N。
式III的聚合物和树枝状聚合物可具有约100-约6,000,000；约100-约500,000；约200-约250,000；约200-约200,000；约200-约100,000；约200-约50,000；约200-约10,000；约200-约5,000；约200-约1,000；约200-约800；约200-约700；约200-约600；和约200-约500的分子量。
分支的PolyMet的非限制性实例包括：
,
其中p是1或2；
,
, 和
其中p是1或2和在每种情况下，n可以是如本文别处所述的整数，和Y是具有下式的二甲双胍残基：
,
其中在一个*N上Y”显示为乙基胺或丙基胺残基，其可被进一步取代；和
其中在一个*N上Y”显示为二甲双胍残基。
*N的每次出现独立于*N的任何其它出现。
通常，分支的PEI中初始存在的伯*N将被衍生至二甲双胍部分，这意味着包括单甲基双胍。还因为支链PEI通常包含表面伯胺，和仲胺和叔胺在内部，PolyMet可通常包含表面单甲基双胍基团。因此，线性和支链PolyMet的物理和化学性质可利用PEI、PPI、聚合物或树枝状聚合物上可用的化学性而调整。
因此，聚合物中存在的二甲双胍残基的量还可被描述为相对于整个聚合物的重量的二甲双胍的% wt，不包括骨架碳。在PolyMet中二甲双胍的% wt可以是0.0001 % wt/wt-大于90% wt/wt；至少0.1% wt/wt；至少0.5% wt/wt；至少1% wt/wt；至少2% wt/wt；至少3%wt/wt；至少4% wt/wt；至少5% wt/wt；至少10% wt/wt；至少15% wt/wt；至少20% wt/wt；至少25% wt/wt；至少30% wt/wt；至少35% wt/wt；至少40% wt/wt；至少45% wt/wt；至少50%wt/wt；至少55% wt/wt；至少60% wt/wt；至少65% wt/wt；至少70% wt/wt；至少75% wt/wt；至少80% wt/wt；和至少85% wt/wt。
在实施方案中，PolyMet包含嵌段共聚物，例如PEI-PPI和聚乙二醇化嵌段共聚物。
在实施方案中，嵌段共聚物具有以下通式：
其中x是约0.1-约0.9，y是约0.1-约0.9，和其中x和y代表聚合物中每个单元的摩尔分数，和x和y的总和是1；G和G’二者可以相同或不同，和在每种情况下选自：
其中p、*N、Y’和Y”如上所示；氢；二甲双胍残基；乙基胺或丙基胺残基，其各自可被乙基或丙基胺进一步取代，乙基或丙基胺可被进一步取代和可包含二甲双胍残基，其中嵌段共聚物具有0.001 % wt/wt-大于90% wt/wt；0.01 % wt/wt-约80% wt/wt；1.0 % wt/wt-约70% wt/wt；2.0% wt/wt-约60% wt/wt；3.0% wt/wt-约50% wt/wt；4.0% wt/wt-约40% wt/wt；5.0% wt/wt-约30% wt/wt；或大于0.001%但低于约60%, 50%, 40%；30%, 20%, 10%或5%wt/wt的量的% wt的共价结合的二甲双胍残基。
在实施方案中，PolyMet是衍生的树枝状聚合物。在树枝状聚合物的表面上是伯氨基。这些伯氨基以及可能的仲氨基是如上所述，用二甲双胍残基使树枝状聚合物衍生的位点，以制备一种类型的PolyMet。在实施方案中，本文所述的主题涉及PolyMet，其包含在树枝状聚合物上共价结合至二甲双胍残基的氮。衍生的树枝状聚合物具有以下结构：
,
其中树枝状聚合物的至少0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95或约100%的出现率的伯氮通过共价键合至至少一个二甲双胍残基而衍生。在上述结构中，在实施方案中，树枝状聚合物上的一些或所有可用的仲氮也可用二甲双胍残基衍生。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供聚丙烯亚胺(PPI)树枝状聚合物，其包含外部或表面伯胺。这些表面伯胺，和在一定程度上任何外部仲胺和任何内部或亚-表面伯胺和仲胺可被衍生至二甲双胍残基。
本文所述的任何PolyMet可被聚乙二醇化和还可包含靶向配体。聚乙二醇化的百分比可以是PolyMet的约0.001%-约50% wt/wt。
为测试PolyMet的特性，可进行三种制剂。第一种是使用带负电荷的脂质例如二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)，制备(脂质-聚阳离子-DNA) LPD。LPD将从带过量的正电荷的聚电解质核心复合物制备，即，来自PolyMet的电荷相较于DNA或透明质酸是过量的。DOPS脂质体然后被加入以包裹核心。然而，支链PolyMet可提供不同的化学性。第二种制剂是使用带正电荷的脂质例如1,2-二棕榈酰基3-三甲基-铵丙烷(DPTAP)，制备(脂质体-聚阳离子-透明质酸) LPH。LPH将通过首先形成带过量负电荷的聚电解质核心复合物制备，即，来自DNA/siRNA或透明质酸的电荷相较于PolyMet是过量的。DOTAP脂质体然后被加入以包裹核心。第三种制剂，不含任何脂质包衣的支链PolyMet/pDNA复合物，可经制备和测试以确定多聚复合物(polyplex)的转染能力。这可确定支链PolyMet的质子吸收活性是否足以裂解内体和递送DNA至细胞质。
PolyMet的有用分子量包括约200-约6,000,000。PolyMet的大小可通过用于制备聚合物的聚合物PEI、PPI等的分子量鉴定。例如，具有4k的MW或重复单元n= 93的PEI用于制备“PolyMet93”，其具有12K的MW。有用的PolyMet具有约100 (0.1k)-约6,000,000 (1000k)的MW。这些还包括特定的MW：约0.1k-约500k；约0.1k-约300k；约1k-约250k；约1k-约200k；约50k-约150k；约1k-约120k；约1k-约100k；约1k-约80k；约1k-约60k；约1k-约50k；约1k-约40k；约1k-约30k；约1k-约20k 约1k-约10k；或约1k-约5k。聚合物的长度使用本文所述的方法，通过操纵聚合物PEI、PPI等原料的大小，可容易地调整。不同MW的PolyMet通过使用不同MW (4k-100k)的PEI作为原料被系统地合成。
PolyMet的长度可决定PolyMet是否具有药物、药物载体(例如，货物递送载体)或二者的需要性质。如果需要的用途是作为货物递送载体，PolyMet的长度可对任何特定类型的货物微调。例如，如果所述货物是pDNA，PolyMet的大小可相应定制。不同的PolyMet用于pDNA转染的能力使用萤光素酶质粒测定。
在实施方案中，本文公开的主题涉及具有共价连接的二甲双胍残基的胆固醇类似物。
纳米颗粒
如上所述，二甲双胍是糖尿病的一线疗法。然而，其强亲水阳离子性质导致从血浆中快速清除，要求多次高剂量，以得到持续活性的血浆浓度。此外，与二甲双胍相比，本文所述的PolyMet纳米颗粒可在身体内循环相对延长的一段时间，从而降低在一段时间内给予多次剂量的不便利性。
然而，已知聚阳离子复合物不适合于血液循环(Chono, S., Li, S.D., Conwell,C.C. & Huang, L. An efficient and low immunostimulatory nanoparticleformulation for systemic siRNA delivery to the tumor. Journal of Controlled Release 131, 64-69 (2008))。如本文别处所述，制备LPH纳米颗粒，其包含脂质体外层以提高多聚复合物的稳定性。
纳米颗粒，通过被动和主动靶向，可提高癌症细胞中药物的细胞内浓度，同时避免对正常细胞的毒性。表面聚乙二醇化纳米颗粒可有效递送核酸、化学-药物和蛋白至实体肿瘤和转移部位。在其中纳米颗粒的表面被聚乙二醇化的实施方案中，这可增加循环中的胶体稳定性和降低单核巨噬细胞系统(MPS)的非特异性吸收。在一些实施方案中，这些纳米颗粒还被茴香酰胺(AA)官能化，以靶向肿瘤细胞上过表达的σ受体，促进细胞吸收。这些纳米颗粒的体外和体内性能可根据生物活性化合物的肿瘤-靶向递送而表征。另外，可检查全身毒性以建立这些纳米颗粒的安全性。
在一个实施方案中，PolyMet作为聚集体纳米颗粒形成。聚集体纳米颗粒的大小是小于1,000 nm, 小于500 nm, 约50 nm-约200 nm,或约100 nm。PolyMet聚集体纳米颗粒可以与货物，例如治疗剂或生物制剂复合。特别有用的PolyMet纳米颗粒包含PolyMet/核苷酸复合物，例如PolyMet/pDNA复合物。
在一个实施方案中，PolyMet是脂质体-聚阳离子-透明质酸(LPH)纳米颗粒的一部分。这些纳米颗粒在本文被称为“LPH-PolyMet”。在该实施方案中，本文所述的主题涉及纳米颗粒，其包含：
i. 脂质外膜；和
ii. 被脂质外膜包裹的PolyMet。
PolyMet可与货物，例如治疗剂或生物制剂复合或缔合。如本文所用的，术语“复合”或“缔合”意思是货物和PolyMet彼此紧密接触。
与PolyMet复合或缔合的具体货物包括治疗剂、生物活性化合物等，例如抗癌药和生物制剂。治疗剂包括生物活性化合物，例如多核苷酸、多肽、多糖、有机和无机小分子。术语“生物活性化合物”包括天然存在和合成的生物活性化合物二者。术语“生物活性化合物”可以指检测或诊断剂，其与生物分子相互作用以提供可检测的读出，所述读出反映了特定的生理学或病理学事件。治疗剂包括化学治疗药物。在其它实施方案中，治疗剂是目的多核苷酸或目的多肽，例如沉默元件(例如，siRNA)。
当治疗剂是药物时、其包括但不限于抗微生物剂、抗生素、抗分枝杆菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、肿瘤剂、影响免疫应答的试剂、血钙调节剂、可用于葡萄糖调节的试剂、抗凝血剂、抗血栓药、抗高脂血症剂、心脏药物、拟甲状腺素药和抗甲状腺药物、肾上腺素能药、降压药、胆碱能药、抗胆碱能药、镇痉剂、抗溃疡剂、骨骼肌和平滑肌松弛剂、前列腺素、过敏反应的一般抑制剂、抗组胺药、局部麻醉剂、镇痛药、麻醉拮抗剂、镇咳药、镇静催眠药、抗惊厥剂、抗精神病药、抗焦虑药、抗抑郁药、减食欲剂、非甾体抗炎药、甾体抗炎药、抗氧化剂、血管活性剂、骨活性剂、抗关节炎药和诊断剂。优选的抗病毒药物包括替诺福韦、阿德福韦、单磷酸阿昔洛韦和单磷酸L-胸苷。在优选的实施方案中、生物活性化合物是抗癌药。
抗癌药或“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN®)；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯并多巴、卡泊酮、meturedopa和uredopa；乙撑亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；多聚乙酰(特别是bullatacin和bullatacinone)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚、MARINOL®)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康、CAMPTOSAR®)、乙酰喜树碱、scopolectin和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；培美曲塞；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；TLK-286；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如Nicolaou等人Angew.Chem Intl. Ed. Engl.,33: 183-186 (1994))；dynemicin，包括dynemicin A；esperamicin；以及新制癌菌素发色团和相关的发色蛋白烯二炔抗生素发色团)、aclacinomysin、放线菌素、authramycin、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN®、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射剂(DOXIL®)和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR®)、替加氟(UFTORAL®)、卡培他滨(XELODA®)、epothilone和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；抗-肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如frolinic acid；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；类美登素，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK®多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene, OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦；长春地辛(ELDISINE®, FILDESIN®)；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL®)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)和多西他赛(TAXOTERE®)；chloranbucil；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱(VELBAN®)；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(ONCOVIN®)；奥沙利铂；leucovovin；长春瑞滨(NAVELBINE®)；诺消灵；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸类，例如视黄酸；上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，例如CHOP (环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的联合治疗的缩写)，以及FOLFOX (与奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和leucovovin的治疗方案的缩写)。
化学治疗剂的其它实例包括用于调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用，并且通常呈系统或全身治疗的形式的抗激素剂。它们可能是激素本身。实例包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX®他莫昔芬)、雷洛昔芬(EVISTA®)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FARESTON®)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；雌激素受体拮抗剂，如氟维司群(FASLODEX®)；用于抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂，如醋酸亮丙瑞林(LUPRON®和ELIGARD®)、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和tripterelin；抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；和抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MEGASE®)、依西美坦(AROMASIN®)、formestanie、法倔唑、伏氯唑(RIVISOR®)、来曲唑(FEMARA®)和阿那曲唑(ARIMIDEX®)。此外，化学治疗剂的这种定义包括二膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如BONEFOS®或OSTAC®)、依替膦酸盐(DIDROCAL®)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA®)、阿伦膦酸盐(FOSAMAX®)、帕米膦酸盐(AREDIA®)、替鲁膦酸(SKELID®)或利塞膦酸酯(ACTONEL®)；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号通路中基因表达的那些，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如THERATOPE®疫苗和基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗和VAXID®疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN®)；抗雌激素例如氟维司群；EGFR抑制剂例如厄洛替尼或西妥昔单抗；抗VEGF抑制剂例如贝伐单抗；伊立替康；rmRH(例如ABARELIX®)；17AAG(作为热休克蛋白(Hsp)90毒物的格尔德霉素衍生物)，以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
具体的抗癌药包括雷帕霉素、顺铂和其类似物、依托泊苷单磷酸盐、阿伦膦酸盐、帕米膦酸盐和吉西他滨单磷酸盐和其盐、酯、构象异构体和前药。
纳米颗粒可进一步包含在脂质体中包裹和任选与其中的PolyMet复合的透明质酸和/或核酸。
“脂质外膜”是一个很大程度上连续的层，其包含脂质，特别是阳离子脂质。脂质外膜可进一步包含靶向配体和/或聚乙二醇(PEG)。
如本文所用的，术语“脂质”是指一组有机化合物的成员，其具有亲脂或两亲性质，包括但不限于脂肪、脂肪油、精油、蜡、类固醇、甾醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂、色脂(脂色素)和脂肪酸。术语“脂质”包括天然存在和合成产生的脂质二者。具体的脂质包括DOTAP、DOPS和胆固醇。
脂质可包括阳离子脂质。如本文所用的，术语“阳离子脂质”包括在生理pH下携带净正电荷的许多脂质类别的任何一种，其可使用本领域技术人员已知的任何方法确定。这样的脂质包括但不限于2009年5月1日提交的题目为“Methods and CompositionsComprising Novel Cationic Lipids”的国际申请号PCT/US2009/042476中公开的式(I)的阳离子脂质，其通过引用以其整体结合到本文中。这些包括但不限于N-甲基-N-(2-(精氨酰基氨基)乙基)-N, N-双十八烷基氯化铵或双硬脂酰基精氨酰基氯化铵] (DSAA)、N,N-二-肉豆蔻酰基-N-甲基-N-2[N’-(N6-胍基-L-赖氨酰基)]氨基乙基氯化铵(DMGLA)、N,N-双肉豆蔻酰基-N-甲基-N-2[N2-胍基-L-赖氨酰基]氨基乙基氯化铵、N,N-双肉豆蔻酰基-N-甲基-N-2[N’-(N2, N6-二-胍基-L-赖氨酰基)]氨基乙基氯化铵和N,N-二-硬脂酰基-N-甲基-N-2[N’-(N6-胍基-L-赖氨酰基)]氨基乙基氯化铵(DSGLA)。可存在的阳离子脂质的其它非限制性实例包括N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵("DODAC")；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵("DOTAP")；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵("DOTMA")或其它N-(N,N-1-二烷氧基)-烷基-N,N,N-三取代的铵表面活性剂；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵("DDAB")；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇("DC-Chol")和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵("DMRIE")；1,3-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)；GAP-DLRIE；DMDHP；3-β[4N-(1N,8N-二胍基精脒)-氨基甲酰基]胆固醇(BGSC)；3-β[N,N-二胍基乙基-氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(BGTC)；N,N1,N2,N3四-甲基四棕榈基精胺(cellfectin)；N-t-丁基-N'-十四烷基-3-十四烷基-氨基丙脒(CLONfectin)；二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基鲸蜡基)-丙基酰胺(DOSPER)；4-(2,3-双-棕榈酰基氧基-丙基)-1-甲基-1H-咪唑(DPIM) N,N,N',N'-四甲基-N,N'-双(2-羟基乙基)-2,3二油酰基氧基-1,4-丁烷二铵碘化物) (Tfx-50)；1,2二油酰基-3-(4'-三甲基铵)丁醇-sn-甘油(DOBT)或胆甾醇基(4'三甲基铵)丁酸酯(ChOTB)，其中三甲基铵基团通过丁醇间隔臂连接至任一双链(对于DOTB)或胆甾醇基(对于ChOTB)；DL-1,2-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟基乙基铵(DORI)或DL-1,2-O-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟基乙基铵(DORIE)或其类似物，如国际申请公开号WO93/03709中公开的，其通过引用以其整体结合到本文中；1,2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-甘油胆碱酯(DOSC)；胆甾醇基半琥珀酸酯(ChOSC)；脂多胺，例如双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS)和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺基精胺(DPPES)或美国专利号5,283,185中公开的阳离子脂质，其通过引用以其整体结合到本文中；胆甾醇基-3β-羧基-酰胺基-亚乙基三甲基碘化铵；1-二甲基氨基-3-三甲基铵-DL-2-丙基-胆甾醇基甲酸酯碘化物；胆甾醇基-3-β-羧基酰胺基亚乙基胺；胆甾醇基-3-β-氧基琥珀酰胺基-亚乙基三甲基碘化铵；1-二甲基氨基-3-三甲基铵-DL-2-丙基-胆甾醇基-3-β-氧基琥珀酸酯碘化物；2-(2-三甲基铵)-乙基甲基氨基乙基-胆甾醇基-3-β-氧基琥珀酸酯碘化物；和3-β-N-(聚乙烯亚胺)-氨基甲酰基胆固醇。
脂质可包含带负电荷或中性的共-脂质。如本文所用的，“共-脂质”是指非-阳离子脂质，其包括中性(不带电荷)或阴离子脂质。术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电荷或中性两性离子的形式存在的许多脂质类型的任何一种。术语“阴离子脂质”包括在生理pH下带有净负电荷的许多脂质类型的任何一种。共-脂质可包括但不限于，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油、磷脂-相关物质例如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、心磷脂、磷脂酸、双十六烷基磷酸酯、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二油酰基磷脂酸(DOPA)、硬脂酰基胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、十六烷基硬脂酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺、溶血磷脂酰胆碱和双十八烷基二甲基溴化铵等。共-脂质还包括基于聚乙二醇的聚合物，例如PEG 2000、PEG 5000和与磷脂或神经酰胺缀合的聚乙二醇，如描述于美国专利号5,820,873，通过引用以其整体结合到本文中。
优选地，具有游离的磷酸基团的两亲脂质是二油酰基磷脂酸(DOPA)。
纳米颗粒的表面可被聚乙二醇化。术语“聚合物-PEG缀合物”还指这些聚合物-PEG-靶向配体缀合物和包含聚合物-PEG靶向配体缀合物的纳米颗粒。聚乙二醇化通过降低纳米颗粒通过网状内皮(RES)系统的清除率，提高循环半寿期。
在这些实施方案的一些中，表面包含浓度为表面的约4 mol%-约15 mol%的聚合物-PEG缀合物，包括但不限于约4 mol%, 约5 mol%, 约6 mol%, 约7 mol%, 8 mol%, 约9mol%, 约10 mol%, 约11 mol%, 约12 mol%, 约13 mol%, 约14 mol%和约15 mol% PEG。还已发现更高的百分比值(以mol%表示)的PEG是有用的。有用的mol%值包括约12 mol%-约50mol%。优选地，该值是约15 mol%-约40 mol%。该值还优选是约15 mol%-约35 mol%。最优选的值是约20 mol%-约25 mol%，例如23 mol%。
脂质-PEG缀合物的聚乙二醇部分可具有范围为约100-约20,000 g/mol的分子量，包括但不限于约100 g/mol, 约200 g/mol, 约300 g/mol, 约400 g/mol, 约500 g/mol,约600 g/mol, 约700 g/mol, 约800 g/mol, 约900 g/mol, 约1000 g/mol, 约5000 g/mol, 约10,000 g/mol, 约15,000 g/mol和约20,000 g/mol。在一些实施方案中，脂质-PEG缀合物包含具有约2000 g/mol的分子量的PEG分子。在某些实施方案中，脂质-PEG缀合物包含DSPE-PEG2000。
在一些实施方案中，表面包含靶向配体，从而形成靶向纳米颗粒。所谓“靶向配体”意指使物理缔合的分子或复合物靶向至靶细胞或组织的分子。如本文所用的，术语“物理缔合”是指2个分子之间的共价或非共价相互作用。
靶向配体可包括但不限于，小分子、肽、脂质、糖、寡核苷酸、激素、维生素、抗原、抗体或其片段、特异性的膜受体配体、能够与抗配体反应的配体、融合肽、核定位肽或这样的化合物的组合。靶向配体的非限制性实例包括无唾液酸基糖蛋白、胰岛素、低密度脂蛋白(LDL)、叶酸、苯甲酰胺衍生物、包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的肽，和针对细胞表面分子的单克隆和多克隆抗体。在一些实施方案中，小分子包括苯甲酰胺衍生物。在这些实施方案的一些中，苯甲酰胺衍生物包含茴香酰胺。
一些靶向配体包含在表面和靶向配体之间的插入分子，其共价键合至表面和靶向配体二者。在这些实施方案的一些中，插入分子是聚乙二醇(PEG)。
所谓的“靶细胞”意指靶向配体募集物理缔合的分子或复合物到其上的细胞。靶向配体可与靶细胞的一个或多个组分相互作用。靶细胞可以是任何细胞类型，或在任何发育阶段，显示各种表型和可处于各种病理学状态(即，异常和正常状态)。例如，靶向配体可与微生物(即，原核细胞(细菌)、病毒、真菌、原生动物或寄生虫)或真核细胞(例如，上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、感觉细胞、癌细胞、分泌细胞、恶性细胞、红细胞和淋巴细胞、干细胞)上的正常、异常和/或独特组分缔合。因此，靶向配体可与靶细胞上的组分缔合，所述组分为疾病-相关抗原，包括例如肿瘤-相关抗原和自身免疫疾病-相关抗原。这样的疾病-相关抗原包括例如，生长因子受体、细胞周期调节物、血管发生因子和信号传导因子。
在一些实施方案中，靶向配体与靶细胞上的细胞表面蛋白相互作用。在这些实施方案的一些中，在靶细胞中能够结合靶向配体的细胞表面蛋白的表达水平高于其它细胞。例如，癌细胞过量表达某些细胞表面分子，例如HER2受体(乳腺癌)或σ受体。在其中靶向配体包含苯甲酰胺衍生物例如茴香酰胺的某些实施方案中，靶向配体使缔合纳米颗粒寻靶至过量表达σ-受体的细胞，其可包括但不限于癌细胞，例如小细胞和非小细胞肺癌、肾癌、结肠癌、肉瘤、乳腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和前列腺癌(Aydar, Palmer和Djamgoz (2004) Cancer Res. 64:5029-5035)。
LPH-PolyMet纳米颗粒可具有任何大小，只要它们能够递送货物至细胞(例如，体外，体内)、生理部位或组织。如本文所用的，术语“纳米颗粒”是指任何形状的颗粒，具有小于约1000 nm的至少一个维度。在一些实施方案中，纳米颗粒具有范围为约1 nm-约1000 nm的至少一个维度，包括1 nm和1000 nm之间的任何整数值(包括约1, 2, 5, 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500和1000)。在某些实施方案中，纳米颗粒具有约150 nm的至少一个维度。球形纳米颗粒可具有小于约100 nm的直径，包括但不限于约5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95和100 nm。在具体的实施方案中，纳米颗粒具有小于约50 nm的直径。在具体的实施方案中，纳米颗粒具有约40 nm至约50 nm之间的直径。
在一些实施方案中，特别是其中纳米颗粒的直径小于100 nm的那些实施方案，纳米颗粒可用于跨越血脑屏障(BBB)递送生物活性化合物至中枢神经系统或跨越胎盘屏障。可用于靶向BBB的靶向配体的非限制性实例包括运铁蛋白和乳铁蛋白(Huang等(2008)Biomaterials 29(2):238-246, 其通过引用以其整体结合到本文中)。此外，纳米颗粒可经胞吞转运跨越内皮进入骨骼和心肌细胞。例如，外显子跳跃寡核苷酸可经递送以治疗杜兴肌营养不良(Moulton等(2009) Ann N Y Acad Sci 1175:55-60, 其通过引用以其整体结合到本文中)。
粒度可使用本领域已知的任何方法测定，包括但不限于，沉降场流动分级、光子关联能谱法、碟式离心法和动态光散射(使用，例如亚微米粒度分级器，例如来自AutodilutePAT Model 370；Santa Barbara, CA的NICOMP颗粒筛分系统)。
在具体的实施方案中，本文所述的纳米颗粒可具有约-20 mV至+20 mV的ζ电位。在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于-10 mV的ζ电位和在某些实施方案中，ζ电位是约+10mV至约+20 mV，包括但不限于约+14 mV, 约+15 mV, 约+16 mV, 约+17 mV, 约+18 mV, 约+19 mV和约+20 mV。
本文所述的纳米颗粒可以是自我装配的，基本上球形的囊。除了PolyMet外，纳米颗粒可进一步包含一种或多种不同的聚合物。有用的聚合物包括生物相容的已知聚合物。在本文使用术语“生物相容的”，因为其在本领域用于描述适合于药物应用的聚合物。生物相容的聚合物可以是生物再吸收聚合物，其随时间降解和被身体吸收。
聚合物是指通过聚合形成和主要由重复结构单元组成的化学化合物或化合物的混合物。有用的聚合物可以是体内或体外使用的合成材料，其能够形成纳米颗粒和意欲与生物系统相互作用。这些包括但不限于美国专利5,514,378中教导的那些(通过引用并入本文)。还已经描述了生物可降解的共聚物，包括脂肪族的聚酯、聚原酸酯、聚酐、聚α-氨基酸、聚肌磷酸和聚烷基氰基丙烯酸酯。脂肪族聚酯包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)和聚乙丙交酯(PLGA)。生物可降解的聚合物包括乳酸聚合物，例如聚(L-乳酸) (PLLA)、聚(DL-乳酸) (PLA)和(DL-乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)。(DL-乳酸-乙醇酸)共聚物的共-单体(丙交酯:乙交酯)比率优选地为100:0和50:50之间。最优选地，共-单体比率为85:15 (PLGA 85:15)和50:50 (PLGA 50:50)之间。可使用PLLA与PLGA的共混物，优选地PLGA 85:15和PLGA50:50。特别有用的聚合物是(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)。
二甲双胍具有抗肿瘤功效(Morales; Kisfalvi, K., Moro, A., Sinnett-Smith, J., Eibl, G. & Rozengurt, E. Metformin inhibits the growth of humanpancreatic cancer xenografts. Pancreas 42, 781-785 (2013))。包含PolyMet的LPH纳米颗粒(LPH-PolyMet)可协同地抑制肿瘤生长。本文提供了LPH-PolyMet和不同的纳米颗粒对H460异种移植物的影响的研究。
如图6所示，与PBS和LPH-PEI组相比，用二甲双胍或LPH-PolyMet治疗导致显著抑制癌症进展，这主要归因于呈游离或聚合物形式的二甲双胍的抗肿瘤功效。重要的是，二甲双胍和PolyMet的IV注射剂量是0.4 mg/kg体重，这明显小于之前的研究通过IV给予途径所使用的(Shi, W.Y.等Therapeutic metformin/AMPK activation blocked lymphoma cellgrowth via inhibition of mTOR pathway and induction of autophagy. Cell Death Dis 3 (2012))。然而，之前的报道表明低剂量的二甲双胍能够充分抑制肿瘤生长(Hu, T.等Reprogramming ovarian and breast cancer cells into non-cancerous cells bylow-dose metformin or SN-38 through FOXO3 activation. Scientific reports 4(2014); Gou, S.M.等Low Concentrations of Metformin Selectively Inhibit CD133(+) Cell Proliferation in Pancreatic Cancer and Have Anticancer Action. PloS one 8 (2013))。在LPH-PEI和LPH-PolyMet之间观察到肿瘤生长抑制的显著差异(图6)，表明PolyMet在提高抗肿瘤活性方面起重要作用。在最后一次治疗后，用LPH-PolyMet治疗的异种移植物的肿瘤大小低于总体重的1%，这显著小于LPH-PEI (4%)和PBS (6%)组(图6B)。
未观察到血液学、血清化学或主要组织的毒性(图5)。之前已经报道，二甲双胍抑制通过激活AMP-活化蛋白激酶(AMPK)和抑制雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)途径，实现癌症存活力(Dowling, R.J., Zakikhani, M., Fantus, I.G., Pollak, M. & Sonenberg,N. Metformin inhibits mammalian target of rapamycin-dependent translationinitiation in breast cancer cells. Cancer research 67, 10804-10812 (2007);Yue, W., Yang, C.S., DiPaola, R.S. & Tan, X.L. Repurposing of metformin andaspirin by targeting AMPK-mTOR and inflammation for pancreatic cancerprevention and treatment. Cancer prevention research 7, 388-397 (2014))。PolyMet可具有相同的癌症抑制机制。AMPK用作代谢肿瘤抑制剂，其控制葡萄糖和脂质代谢(LeRoith, D. Insulin-like growth factors and cancer: from basic biology totherapeutics. Humana Press, New York; 2012)。在许多情况下，AMPK的低水平磷酸化与治疗后差的预后有关(Zulato, E.等Prognostic significance of AMPK activation inadvanced stage colorectal cancer treated with chemotherapy plus bevacizumab.British journal of cancer 111, 25-32 (2014)。
已观察到用二甲双胍和LPH-PolyMet治疗后，AMPKα的磷酸化水平分别比PBS组持续提高约9和12倍，表明AMPK活性的刺激(图7A)；然而，AMPKα的激活在LPH-PEI组中不发生。这表明PolyMet是纳米颗粒中的关键因子，其可激活AMPKα途径。mTOR是AMPK的下游效应子(Kimura, N.等A possible linkage between AMP-activated protein kinase (AMPK)and mammalian target of rapamycin (mTOR) signalling pathway. Genes Cells 8,65-79 (2003)。AMPK活化抑制mTOR和其下游效应子激酶(Bolster, D.R., Crozier, S.J.,Kimball, S.R. & Jefferson, L.S. AMP-activated protein kinase suppressesprotein synthesis in rat skeletal muscle through down-regulated mammaliantarget of rapamycin (mTOR) signaling. J Biol Chem 277, 23977-23980 (2002))。
mTOR的磷酸化在癌细胞的增殖和存活中起中枢作用(Matsubara, S.等mTORplays critical roles in pancreatic cancer stem cells through specific andstemness-related functions. Scientific reports 3, 3230 (2013))。因此，评价了二甲双胍和LPH-PolyMet对mTOR的活性的影响(图7A)。二甲双胍和LPH-PolyMet治疗导致显著抑制mTOR活性，其通过与PBS和LPH-PEI相比，p-mTOR/mTOR水平分别降低2.3-倍和2.9-倍来指示。
自噬被认为是二甲双胍的潜在毒性机制，其导致癌症生长的抑制(Tomic, T.等Metformin inhibits melanoma development through autophagy and apoptosismechanisms. Cell Death Dis 2 (2011); Feng, Y.等Metformin promotes autophagyand apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma by downregulating Stat3signaling. Cell Death Dis 5 (2014))。我们因此评价了在PolyMet治疗后是否也可观察到自噬。微管相关蛋白轻链3b (LC3b)是自噬起始的特异性标记物(Mizushima, N.,Yoshimori, T. & Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell 140,313-326 (2010))。如图7B所示，二甲双胍和LPH-PolyMet治疗的肿瘤显示比其它组更高的LC3b-相关红色荧光，表明二甲双胍和LPH-PolyMet可诱导在肺异种移植物中的自噬。
接下来，治疗后抗肿瘤作用的机制通过TUNEL测定法来测定(图7B)。二甲双胍和LPH-PolyMet治疗后的凋亡细胞的百分比分别是18.8%和32.3%，而在其它组中未观察到显著的细胞凋亡诱导。这表明呈游离形式或聚合物形式的二甲双胍可诱导细胞凋亡和在调节癌细胞存活中起关键作用。总之，H460肺癌发展的二甲双胍和PolyMet抑制通过自噬和细胞凋亡机制二者介导。
治疗方法
在一个实施方案中，本发明的主题涉及通过给予受试者PolyMet或LPH-PolyMet来治疗疾病的方法。在这些实施方案中，所述方法可包括给予需要治疗的受试者有效量的PolyMet或LPH-PolyMet以实现需要的治疗效果。
待治疗的疾病或不需要的病况可包括可被治疗性治疗的任何类型的病况或疾病。特别是，在这些实施方案中，待治疗的疾病可以是代谢病症、遗传病症和/或癌症。在一些实施方案中，待治疗的疾病或不需要的病况是糖尿病。在一些实施方案中，待治疗的疾病或不需要的病况是癌症。
如本文别处所述，术语“癌症”包括任何类型的不受调节的细胞生长和包括所有形式的癌症。在一些实施方案中，待治疗的癌症是转移性癌症。特别是，癌症可以对已知疗法有抗性。检测癌症生长或进展的抑制的方法是本领域已知的，和包括但不限于测量原发性肿瘤的大小以检测其大小的减少，继发性肿瘤的出现延迟，继发性肿瘤的发展减慢，继发性肿瘤的出现率降低，和疾病的继发性影响的严重性减慢或降低。
因此，在一些实施方案中，PolyMet或LPH-PolyMet靶向癌细胞。术语“癌症”或“癌”是指或描述哺乳动物的生理情况，其特征通常为不受调节的细胞生长。癌细胞能够局部侵袭和/或转移至非临近的部位。术语“癌症”包括所有类型的癌症，包括但不限于所有形式的癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，包括但不限于膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食管癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、喉癌、肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、甲状腺癌、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、室管膜瘤、尤因肉瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌样癌症和肾胚细胞瘤(维尔姆斯肿瘤)。
任选包含另外的治疗剂的PolyMet或LPH-PolyMet可用于治疗受试者的疾病或不需要的病况，其中生物活性化合物当在细胞中表达或引入细胞时具有对疾病或不需要的病况的治疗活性。生物活性化合物以治疗有效量给予受试者。在其中生物活性化合物包含多核苷酸的那些实施方案中，当目的多核苷酸以治疗有效量给予受试者时，目的多核苷酸或由其编码的多肽能够治疗疾病或不需要的病况。
本领域技术人员将理解，PolyMet或LPH-PolyMet可单独或与其它治疗形式结合使用，所述其它治疗形式包括但不限于手术疗法、放射疗法或用任何类型的治疗剂例如药物治疗。在其中受试者罹患癌症的那些实施方案中，PolyMet或LPH-PolyMet可与本领域众所周知的任何化学治疗剂组合递送。
所谓“治疗活性”当涉及生物活性化合物时意指该分子当给予有需要的受试者时能够引发需要的药理学或生理效果。
如本文所用的，术语“治疗”或“预防”是指获得需要的药理学和/或生理学效果。该效果在完全或部分地防止特定感染或疾病或其征兆或症状方面可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈感染或疾病和/或归因于感染或疾病的不良反应方面可以是治疗性的。因此，该方法“预防” (即，延迟或抑制)和/或“减少” (即，降低、减慢或改善)接受本发明的组合物的受试者的疾病或病症的有害效果。
如本文所用的，“受试者”可以是任何动物，包括哺乳动物，例如人，和包括但不限于驯养动物，例如猫科动物或犬科动物受试者，农场动物，例如但不限于牛、马、山羊、绵羊和猪受试者，野生动物(野生的或者在动物园中)，研究用动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、狗、猫等，禽类，例如鸡、火鸡、鸣禽等，即用于兽医用途。需要治疗疾病或不需要的病况的受试者可以是显示这样的疾病或病况的症状的人，已被诊断的受试者，处于缓解的受试者，或具有发生疾病或病况的风险(例如，遗传倾向、某些膳食或环境暴露)增加的受试者。
“有效量”是至少实现特定病症的可测量改进或预防所需要的最小浓度。本文的有效量可根据因素例如疾病状态，患者的年龄、性别和重量，和抗体在受试者中引发需要的反应的能力而改变。因此，给予受试者的剂量将取决于许多其它因素，包括给药方法和部位、患者年龄、重量和状况。本领域普通技术人员可对于给定类型的给药、给定患者和给定的治疗应用容易地调整剂量。
有效量还是其中治疗的任何毒性或有害作用被治疗有益效果超越的量。对于预防用途，有益或需要的结果包括结果例如消除或降低风险，减轻严重性，或延迟疾病发作(包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理学表型)。对于治疗用途，有益或需要的结果包括临床结果例如降低由疾病产生的一个或多个症状，增加患有疾病的患者的生活质量，降低治疗疾病所需的其它药物的剂量，增强其它药物的效果(例如通过寻靶)，延迟疾病进展和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可在减少癌细胞数量；减少肿瘤大小；抑制(即，减慢至一定程度或理想地，停止)癌细胞侵润至周围器官；抑制(即，减慢至一定程度和理想地，停止)肿瘤转移；抑制肿瘤生长至一定程度；和/或减轻与病症有关的一个或多个症状至一定程度方面具有作用。有效量可在一次或多次给药中给予。药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景下所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可以或可以不结合其它药物、化合物或药物组合物来实现。因此，可在给予一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，和如果结合一种或多种其它药剂，可实现或实现需要的结果的话，单一药剂可被认为以有效量给予。
在一些实施方案中，PolyMet或LPH-PolyMet以约0.001 µg/kg至约1000 mg/kg之间的剂量给予受试者，包括但不限于约0.001 µg/kg, 0.01 µg/kg, 0.05 µg/kg, 0.1 µg/kg, 0.5 µg/kg, 1 µg/kg, 10 µg/kg, 25 µg/kg, 50 µg/kg, 100 µg/kg, 250 µg/kg,500 µg/kg；5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg和200 mg/kg；或约0.01 mg/kg-10 mg/kg；0.05 mg/kg-5 mg/kg；0.07 mg/kg-2 mg/kg；0.1 mg/kg-0.9 mg/kg；0.2 mg/kg-0.7 mg/kg；0.3 mg/kg-0.5 mg/kg。
在其中PolyMet或LPH-PolyMet具有生物制剂货物的一些实施方案中，它们可以约0.01 mg/kg至约1000 mg/kg之间的剂量给予受试者，包括但不限于约0.01 mg/kg, 0.05mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg,50 mg/kg, 100 mg/kg和250 mg/kg；或约0.01 mg/kg-10 mg/kg；0.05 mg/kg-5 mg/kg；0.07 mg/kg-2 mg/kg；0.1 mg/kg-0.9 mg/kg；0.2 mg/kg-0.7 mg/kg;和0.3 mg/kg-0.5mg/kg。
在一个实施方案中，本文所述的主题涉及在受试者体内递送货物至靶标的方法。该方法包括给予与PolyMet或LPH-PolyMet缔合的货物至受试者，其中所述货物通过PolyMet或LPH-PolyMet递送至受试者体内的靶标。货物可以是本文别处所述的治疗剂。在该实施方案中，所述方法包括给予与货物复合或缔合的PolyMet或LPH-PolyMet至受试者，其中PolyMet或LPH-PolyMet提供货物至受试者体内的靶标。
转染方法和试剂盒
本文所述的PolyMet和LPH-PolyMet可用作转染试剂以修饰细胞的遗传物质。任何外源遗传物质可与PolyMet和LPH-PolyMet复合或缔合，使得遗传物质可被递送至细胞，从而修饰细胞的遗传物质。因此，本文所述的PolyMet和LPH-PolyMet可用于转染细胞。
在一个实施方案中，本文所述的主题涉及修饰细胞的遗传物质的方法，包括：使细胞和与外源遗传物质复合或缔合的PolyMet或LPH-PolyMet接触，其中细胞的遗传物质被修饰。术语“外源遗传物质”是指从细胞外递送的任何遗传物质。
在此实施方案中，细胞可以是真核细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或原核细胞。具体的细胞包括原代细胞培养物、传代细胞培养物或细胞系、人细胞系、动物细胞系和成纤维细胞。
遗传物质可以是核酸。本发明提供用核酸转染真核细胞、特别是高等真核细胞的组合物和方法。核酸，DNA和RNA二者，被引入细胞，使得它们保留其生物学功能。可通过本发明的方法转染的核酸包括来自任何来源的任何大小的DNA和RNA，其包含天然碱基或非天然的碱基，和包括编码和能够在细胞中表达治疗性或另外有用的蛋白的那些，抑制在细胞中不需要的核酸表达的那些，抑制不需要的酶活性或激活需要的酶的那些，催化反应的那些(核酶)和在诊断测定法中起作用的那些(例如，诊断性核酸)。治疗性核酸包括编码或可在细胞中表达治疗上有用的蛋白、肽或多肽的那些核酸，抑制在细胞中不需要的核酸表达的那些，和在细胞中抑制不需要的酶活性或激活需要的酶的那些。
测定在LPH制剂中siRNA的基因沉默效果。H460/Luc细胞是用萤火虫萤光素酶基因稳定转染的细胞。在LPH-PEI-siLuc和LPH-PolyMet-siLuc制剂中配制的siRNA具有类似的粒度(大约80 nm)和ζ电位(大约+20 mV)。如图8所示，类似于Lipofectamine，LPH-PolyMet-siLuc用低至60 nM siRNA达到50%沉默基因表达，而LPH-PEI-siLuc仅可达到约10%沉默。体外用PolyMet纳米颗粒的这种有效的siRNA沉默是高度需要的。
测定PolyMet体内递送基因物质的能力。尽管PolyMet可潜在地递送许多siRNA，但选择BCL-2 siRNA作为研究的实例基因之一。作为一种抗凋亡蛋白，BCL-2促进细胞存活，和BCL-2的抑制提高癌细胞对标准疗法的敏感性(Tabuchi, Y.等Resistance to paclitaxeltherapy is related with Bcl-2 expression through an estrogen receptormediated pathway in breast cancer. Int J Oncol 34, 313-319 (2009))。治疗后BCL-2的生物活性水平通过蛋白质印迹法测定(图8B)。与所有其它组相比，LPH-PolyEMT-siBCL2经历提高的BCL-2水平下调，和提供稳健和持续的肿瘤生长抑制(图8C)。TUNEL测定法进一步证实在肿瘤中诱导凋亡细胞。LPH-PolyMet-siBCL2治疗后TUNEL-阳性凋亡细胞的数量是约70%，其显著高于所有其它组(图8D)。这表明升高的细胞凋亡在下调BCL2表达后发生。
重要的是，还观察到LPH-PolyMet-siCtrl显示比PBS或LPH-PEI-siCtrl显著更高的肿瘤抑制，这证实了在LPH-PolyMet纳米颗粒中观察到的发现结果(图6)。
还研究了经设计以抑制有助于触发血管发生的血管内皮生长因子(VEGF)产生的siRNA。肿瘤生长显著受到抑制，和在LPH-PolyMet-siVEGF治疗后VEGF的水平显著降低(图9)。
不同的PolyMet用于pDNA转染的能力使用萤光素酶质粒测定，和图10显示不同的N/P比率的多聚复合物的转染效率和细胞毒性。在0.5-15的N/P范围内，PolyMet的相对发光单位(RLU)值显示典型的钟形曲线，其中最佳N/P比率是8。以此比率，与所有其它试剂相比，PolyMet100k/pDNA复合物具有最高的转染能力，甚至是常规转染试剂Lipofectamine的1.5倍。在我们之前的研究中鱼精蛋白用作siRNA和pDNA的药物载体；然而，如图10所示，鱼精蛋白不促进转染效率。
对于本文别处所述的治疗应用，转染试剂和转染增强剂可在各种药物组合物和剂型中提供。一般而言，药物组合物应包含足够的转染试剂和任何增强剂以提供足够高水平的核酸引入至靶细胞或靶组织，使得其中的核酸具有需要的治疗效果。靶细胞或组织中将是治疗有效的核酸水平将取决于抑制或其它生物功能的效率和核酸必须影响的位点数量。
与细胞体外接触或体内给予受试者的转染试剂的剂量将取决于许多其它因素，包括给药方法和部位，患者年龄、重量和状况。本领域普通技术人员可容易地调整对于给定的给药类型、给定的患者和给定的治疗应用的剂量。
转染组合物的组分可在试剂盒中提供。一般而言，试剂盒包含PolyMet或LPH-PolyMet作为转染试剂。遗传物质可随试剂盒提供，或终端用户可添加遗传物质至PolyMet或LPH-PolyMet。试剂盒组分可包括合适的介质或溶剂。
胆固醇的新的阳离子衍生物，胆固醇-二甲双胍，也已被合成和用于制备基因疗法用的脂质体(方案2)。双胍基团可促进体外和体内的有效核酸转染，同时显示对治疗的细胞和器官的低毒性。
应注意，术语“甾醇”是指一类化学实体，其是甾族化合物的一个亚类，其中羟基位于A环的3位上。它们具有特定的四环骨架，根据特定的甾醇，其在立体化学和取代基方面不同。一般而言，甾醇包含约27-约30个碳原子，和有时包含一个双键。甾醇的实例包括但不限于胆固醇、油菜甾醇、谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、nicasterol、羊毛甾醇、氧化甾醇、链甾醇、珊瑚甾醇(gorgosterol)和黑海甾醇(dinosterol)。
合成方法
在一个实施方案中，本文所述的主题涉及制备PolyMet的方法，包括使PEI与双氰胺在酸的存在下接触。酸可以是任何无机或有机酸。特别有用的酸包括HCl。
PolyMet在双氰胺被酸例如HCl在直链或分支的PEI的存在下质子化后而合成。参见方案1。不受任何理论的束缚，认为分子内氢键被打断，允许位于PEI的中心氮上的孤电子对的亲核攻击。PolyMet使用MALDI-TOF来表征，其表明实现PEI被双氰胺修饰(图2)。
方案1. 制备聚-二甲双胍(PolyMet)的合成途径。
在此实施方案中，本文所述的主题涉及制备二甲双胍的聚合物的方法，包括：
a. 使线性或分支的聚乙烯亚胺与双氰胺在溶剂中接触，以制备第一混合物；
b. 使第一混合物与酸接触以制备第二混合物；和
c. 加热第二混合物一段时间，
其中制备二甲双胍的聚合物。
有用的溶剂包括水性溶剂，包括水、甲醇、乙醇、DMF、氯仿、THF、DMSO等。
有用的酸包括有机和无机酸，包括HCl、硫酸、硝酸、硼酸。
有用的催化剂包括金属离子催化剂，或静电催化剂，包括Fe3+, Cu2+, Zn2+, Ca2+,Al3+, Si4+, Ti4+等。
有用的时间段包括数分钟至数小时至数天，例如5分钟或多至2-6小时或甚至1-6天或一周。
加热第二混合物的步骤包括施加热，直至反应达到需要的温度或温度范围，其可取决于选择的具体溶剂。有用的温度包括约30°C-约200°C, 约50°C-约150°C, 约75°C-约125°C。
进行步骤的顺序可能不是特别关键的，和在这样的情况下，步骤的顺序可改变。
所述方法可进一步包括纯化步骤。这样的纯化可基于大小或其它性质。纯化聚合物的方法是本领域已知的。
在另一实施方案中，本文所述的主题涉及制备具有货物的LPH-PolyMet的方法。在此实施方案中，所述方法包括加载货物至包含PolyMet的LPH纳米颗粒(“LPH-PolyMet”)。
为了制备LPH-PolyMet纳米颗粒，首先调整PolyMet/HA复合物的N/P比率(阳离子聚合物的胺基团与核酸或透明质酸的磷酸基团的摩尔比率)，和比较纳米颗粒的大小、多分散性和ξ-电位。以大约0.9的N/P比率观察到大的聚集体，其中形成中性复合物。为了形成更小的颗粒，使用约0.6的比率，因为复合物保持带负电荷(~-20 mV)与相对小的尺寸(~ 100nm)，以此比率，PEI-HA复合物具有与PolyMet-HA复合物类似的电荷和尺寸(图3)。
接着，将DOTAP/胆固醇(1:1 mol/mol)阳离子脂质体加入复合物，以通过电荷-电荷相互作用形成脂质包衣。DSPE-PEG和DSPE-PEG-茴香酰胺然后通过后插入方法(post-insertion method)加入至脂质体。由于σ受体在H460中过量表达的事实(Miao, L.G., S.;Zhang, J.; Kim, W.; Huang, L. Nanoparticles with Precise Ratiometric Co‐Loading and Co‐Delivery of Gemcitabine Monophosphate and Cisplatin forTreatment of Bladder Cancer. Advanced Functional Materials 24, 6601-6611(2014))，茴香酰胺用作靶向配体以特异性递送纳米颗粒至肿瘤。最终的纳米颗粒为70 -80 nm，具有大约20 mV的正电荷(图4)。
方案2
方案2描述胆甾醇基-二甲双胍的合成
方案3
方案3描述二甲双胍修饰的DOTAP (DOBP)阳离子脂质的合成。
药物制剂
如本文所用的，术语“递送”是指将物质或分子(例如，多核苷酸、生物活性化合物或药物)传递至生理部位、组织或细胞。这包括递送至细胞的细胞内部分或至细胞外空间。如本文所用的，术语“细胞内”或“细胞内地”具有本领域理解的其普通含义。一般而言，细胞内侧的空间，其被膜包围，定义为“细胞内”空间。类似地，如本文所用的，术语“细胞外”或“细胞外地”具有本领域理解的其普通含义。一般而言，细胞膜外侧的空间被定义为“细胞外”空间。
本文公开的方法提供递送治疗剂或所述试剂的衍生物或类似物。术语“衍生物”或“类似物”是指化学改良的治疗剂。例如，治疗剂的溶解性可通过本领域已知的方法增加或降低其疏水性被改良。
本文所述的纳米颗粒可用于哺乳动物组织培养系统、动物研究和治疗目的。包含当在细胞中表达或引入细胞时具有治疗活性的生物活性化合物的纳米颗粒可用于治疗应用。纳米颗粒可为治疗目的而给予，或包含纳米颗粒以及另外的药用载体的药物组合物可经配制以通过任何可用的途径递送，即给予受试者，所述途径包括但不限于胃肠外(例如静脉内)、皮内、皮下、口服、经鼻、支气管、眼、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道途径。在一些实施方案中，递送途径是静脉内、胃肠外、经粘膜、经鼻、支气管、阴道和口服。
如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与药物给予相容。补充的活性化合物也可掺入组合物中。
本领域普通技术人员将理解，本发明公开的药物组合物经配制以与其预期给药途径相容。用于胃肠外(例如静脉内)、肌内、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱来调整，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可装入安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶，其由玻璃或塑料制成。
适合注射使用的药物组合物通常包括无菌水性溶液或分散液，例如本文别处描述的那些，和无菌粉末，用于临时制备无菌注射溶液或分散液。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述组合物应该是无菌的，和应该流动至容易注射的程度。在一些实施方案中，药物组合物在制造和贮藏条件下是稳定的，和应该针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而防腐。一般而言，有关的载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在一些实施方案中，等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇或山梨醇，或氯化钠包括在制剂中。可注射制剂的延长吸收可通过在制剂中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶而实现。
无菌可注射溶液可以通过过滤除菌制备，如本文别处所述。在某些实施方案中，注射用溶液不含内毒素。通常，分散液通过将纳米颗粒掺入无菌溶媒中制备，所述溶媒包含基础分散介质和来自上文列举的那些的需要的其它成分。在其中无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的那些实施方案中，溶液可以通过真空干燥和冷冻干燥来制备，这得到来自其之前的无菌过滤溶液的活性成分加任何另外需要的成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。口服组合物可使用液体载体制备用作漱口剂。药学上相容的粘合剂和/或辅助材料可包括在内作为组合物的一部分。口服组合物可包括甜味剂例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷油、水杨酸甲酯或橙矫味剂。
对于通过吸入给予，本发明公开的组合物可以气溶胶喷雾剂的形式从包含合适的抛射剂例如气体例如二氧化碳的加压容器或分配器，或喷雾器递送。液体气溶胶、干燥粉末等也可使用。
本发明公开的组合物的系统给予也可通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮给予，适合于待穿透的屏障的渗透剂用于制剂。这样的渗透剂是本领域通常已知的，和对于经粘膜给予包括例如，去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给予可通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现。对于经皮给予，活性化合物被配制成软膏剂、油膏剂、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的。
有利的是，以易于给予和剂量均匀的单位剂型配制口服或胃肠外组合物。本文使用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理离散单位；每个单位包含经计算以产生需要的治疗效果的预定量的活性化合物与需要的药用或美容用载体的组合。本发明的单位剂型的规格受控于和直接取决于：(a) 活性化合物的独特性质和欲取得的特定治疗效果，和(b) 配制这样的活性化合物以治疗个体的技术中固有的限制。关于剂量的指导在本文别处提供。
在一个实施方案中，本发明的主题还包括提供本文所述的纳米颗粒的制品。制品可包括小瓶或其它容器，其包含适合于本发明的方法的组合物，以及干燥或呈液体形式的任何载体。制品进一步包括在容器上的标签形式和/或包装容器的盒中包括的插页形式的说明书，用于实施本发明的方法。说明书也可印刷在包装小瓶的盒上。说明书包含信息，例如足够的剂量和给药信息以允许受试者或本领域的工作者给予药物组合物。预期本领域的工作者包括任何医生、护士、技术员、配偶或可能给予组合物的其它护理提供者。药物组合物也可由受试者自我给予。
递送生物活性化合物至细胞可包括体外方法、其中递送生物活性化合物至细胞在受试者外部发生(转染的细胞可然后植入受试者)的离体方法和其中递送在受试者自身内发生的体内方法。
递送治疗有效量的纳米颗粒可通过给予包含治疗有效剂量的生物活性化合物或纳米颗粒的药物组合物获得。“治疗有效量”或“剂量”是指递送系统或其中包含的生物活性化合物的浓度足以引发需要的治疗效果。有效量可一次或多次给予。
测定功效和剂量的方法是本领域技术人员已知的。参见例如，Isselbacher等(1996) Harrison’s Principles of Internal Medicine 13 ed., 1814-1882, 通过引用并入本文。应理解，化合物的合适剂量取决于其效力，和可任选对特定的接受者定制，例如通过给予递增剂量，直至达到预选择的需要反应。应理解，任何特定动物受试者的特定剂量水平可取决于各种因素，包括使用的特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食，给予次数，给药途径，排泄速率，任何药物组合和待调节的表达或活性的程度。
这样的化合物的毒性和治疗功效可通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定LD50 (50%群体的致死剂量)和ED50 (50%群体的治疗有效剂量)。毒性(例如免疫毒性)和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，和其可表示为比率LD50/ED50。显示高治疗指数的化合物是优选的。尽管可使用显示毒性副作用的化合物，但应小心设计递送系统，其将这样的化合物寻靶至受影响的组织部位以使对不受感染的细胞的潜在破坏最小化，从而减少副作用。
从细胞培养测定法和动物研究获得的数据可用于配制人用的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地在循环浓度范围内，包括伴随很少或没有毒性的ED50。剂量可在该范围内改变，取决于使用的剂型，和使用的给药途径。对于用于本发明的方法的任何化合物，治疗有效剂量可初始从细胞培养测定法估算。剂量可在动物模型中配制，以达到包括IC50的循环血浆浓度范围(即，试验化合物的浓度，其实现症状的半-最大抑制)，如在细胞培养中所测定的。这样的信息可用于更准确地测定在人中的有用剂量。可测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱。
按需要，药物制剂可以各种间隔和在不同的时间内给予，例如每天多次，每天，每隔一天，每周一次持续约1-10周、2-8周、约3-7周、约4、5或6周等。技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需要的剂量和时间，包括但不限于疾病、病症或不需要的病况的严重性，之前的治疗，受试者的一般健康和/或年龄，和存在的其它疾病或不需要的病况。通常，受试者的治疗可包括单一治疗，或者在许多情况下，可包括一系列治疗。此外，受试者的治疗可包括单次美容施用，或在一些实施方案中可包括一系列美容施用。
本发明还包括提供本文所述的纳米颗粒的制品。制品可包括小瓶或其它容器，其包含适合于本发明的方法的组合物以及干燥或液体形式的任何载体。制品进一步包括在容器上的标签形式和/或包装容器的盒中包括的插页形式的说明书，用于实施本发明的方法。说明书也可印刷在包装小瓶的盒上。说明书包含信息，例如足够的剂量和给药信息以允许受试者或本领域的工作者给予药物组合物。预期本领域的工作者包括任何医生、护士、技术员、配偶或可能给予组合物的其它护理提供者。药物组合物也可由受试者自我给予。
本领域普通技术人员在查看本文公开的主题后将理解，本文公开的PolyMet化合物、其纳米颗粒和药物组合物，可直接给予至细胞、细胞培养物、细胞培养基、组织、组织培养物、组织培养基等。当涉及本发明的递送系统时，术语“给予”和其衍生语，包括允许化合物接触细胞的任何方法。本发明的化合物或其药物组合物可体外或离体给予至细胞或组织(或与其接触)。本文公开的PolyMet化合物、其纳米颗粒和药物组合物也可通过给予个体受试者，例如患者，例如通过系统给予(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内给予)或局部施用，体内给予至细胞或组织(或与其接触)，如本文别处所述。
通过举例说明的方式和不以限制的方式，提供以下实施例。
实施例
材料和方法
化学品
1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷盐酸盐(DOTAP)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇-2000)铵盐(DSPE-PEG2000)购自Avanti Polar Lipids,Inc. (Alabaster, AL)。DSPE-PEG-茴香酰胺(AA)在我们实验室内合成，如之前所述(Banerjee, R., Tyagi, P., Li, S. & Huang, L. Anisamide-targeted stealthliposomes: a potent carrier for targeting doxorubicin to human prostatecancer cells. International journal of cancer. Journal international du cancer 112, 693-700 (2004))。DeadEnd Fluorometric TUNEL测定试剂盒和萤光素酶测定系统测定底物获自Promega (Madison, WI)。其它化学品获自Sigma–Aldrich (St.Louis, MO)。BCL2 siRNA (靶序列: 5′-AAC AUC GCC CUG UGG AUG ACU-3′), VEGF siRNA(靶序列: 5′-ACC UCA CCA AGG CCA GCA C-3′)和对照siRNA (靶序列: 5′-AAU UCU CCGAAC GUG UCA CGU-3′)通过Sigma-Aldrich (St Louis, MO)合成。
细胞培养
H460、H460/Luc人NSCLC细胞、B16F10和B16F10/Luc小鼠黑素瘤癌细胞初始获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)和在补充有10%胎牛血清(Life Technologies, Carlsbad,California)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中培养。细胞在37 °C和5% CO2下在潮湿孵育箱中培养。
实验小鼠
6–8周龄的雌性裸鼠和雌性CD1小鼠用于研究。雌性裸鼠购自National CancerInstitute (Bethesda, MD)和由University of North Carolina, Chapel Hill的Division of Laboratory Animal Medicine (DLAM)饲养。CD1小鼠购自Charles RiverLaboratories (Morrisville, NC)。为了建立异种移植物模型，将5 × 106个细胞/100 μLPBS皮下注射至小鼠的右胁腹。
实施例1：PolyMet的制备
为制备PolyMet，将0.2 g的线性PEI和2 g的双氰胺在10 mL的水中混合。然后将2 mL的HCl加入溶液。化合物然后在100°C反应约4h。PolyMet然后通过截止为3000 Da的超滤管纯化和冻干。PolyMet的溶液以1 mg/mL, 1 mL等分试样保持用于实验。
实施例2：LPH纳米颗粒的制备
将DOTAP (20 mM, 1mL)和胆固醇(20 mM, 1mL)溶于(1:1 mol/mol)氯仿，和在减压下除去溶剂。脂质薄膜用2 mL的蒸馏水水合过夜以形成阳离子脂质体(10 mM)，其通过聚碳酸酯膜(200 nm × 20倍、100 nm × 20倍和50 nm × 20倍) (Millipore, Billerica, MA)序贯挤出。
制备具有不同比率的数种不同的复合物。为制备PolyMet-HA或PEI-HA复合物，将200 μL的HA (25 μg HA，在DI水中)和200 μL的PEI溶液(包含2 – 3.9 μg PEI，在DI水中)或200 μL的PolyMet溶液(包含5.8 – 11.6 μg PolyMet，在DI水中)在1.5 mL管中混合。复合物通过上下吸取10次混合，和允许在室温下静置10分钟，然后分析大小和ζ电位。复合物的比率通过来自粒度和ζ电位的结果确定，其通过动态光散射(DLS)，使用MalvernZetaSizer Nano series (Westborough, MA)测定。
在选择需要的复合物比率后，将复合物与60 μL阳离子DOTAP/胆固醇脂质体(10mM)混合，和孵育另外10分钟用于脂质包衣。脂质包被的纳米颗粒使用后插入方法通过加入45 μL DSPE-PEG和DSPE-PEG-AA (10 mg/mL 1:1 v/v)和在50°C孵育纳米颗粒15分钟来聚乙二醇化。得到的LPH纳米颗粒在20分钟内用于后续实验。
对于siRNA研究，代替使用200 μL的HA (25 μg HA，在DI水中)溶液而使用200 μL的HA / siRNA (12.5 μg HA, 12.5 μg siRNA，在DI水中)溶液和与不同量的PolyMet或PEI溶液在1.5 mL管中混合，然后选择需要比率的制剂。
实施例3：LPH NP的表征
LPH的透射电子显微镜(TEM)图像通过使用JEOL 100CX II TEM (Tokyo, Japan)获得。简言之，将新鲜制备的LPH纳米颗粒(5 μL)小心滴加到300-目的碳涂布铜网(Ted Pella,Inc., Redding, CA)上，和允许在室温下静置5分钟。然后将网用1%乙酸双氧铀(5 μL)染色，和允许短暂孵育(10秒)和快速干燥。所有图像以加速电压100 kV获得。
实施例4：动物肿瘤模型和抗肿瘤活性
按之前所述使用人NSCLC细胞异种移植物。H460人肺癌细胞(5.0 × 106)经皮下注射至雌性无胸腺nu/nu小鼠的右胁腹。当肿瘤达到约0.1 cm3大小(移植后10–15天)时，每隔一天，带H460肿瘤的小鼠在尾静脉经静脉内给予(IV)注射制剂。动物重量和肿瘤体积每隔一天测量。肿瘤长度(L)和宽度(W)用于通过方程：V = 1/2 × L × W2计算体积(V)。
实施例5：蛋白质印迹法分析
带H460肿瘤的小鼠每隔一天给予IV注射，和第三次注射后24小时处死小鼠。每泳道的蛋白通过4%–12% SDS-PAGE电泳分离(Invitrogen)，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)。该膜用5%脱脂奶粉(Bio-Rad)在室温下封闭1 h，然后用抗体在4°C孵育过夜。将膜洗涤3次，然后用第二抗体(1:4,000稀释；Cell signal Inc.)在室温下孵育1 h。最后，将膜洗涤4次，和使用增强化学发光系统，根据制造商的说明书(Thermo scientific)显色。
实施例6：免疫染色
系统给药后的体内肿瘤细胞凋亡通过TdT-介导的dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)测定法测定。带H460肿瘤的小鼠每隔一天给予IV注射制剂，总共三次。最后一次注射后24小时，处死小鼠和在10%福尔马林中固定肿瘤24 h，然后在石蜡中包埋和以厚度5 μm切片。
按制造商(Promega)的建议进行TUNEL染色。将DAPI固定介质(VectorLaboratories, Inc., Burlingame, CA)滴加到切片上用于核染色。TUNEL-染色的肿瘤切片的图像用荧光显微镜(Nikon Corp., Tokyo, Japan)捕获。凋亡细胞的百分比通过在每个显微镜视野中将凋亡细胞数除以总细胞数(蓝色核，通过DAPI染色，未显示)来获得。在各治疗组(n = 3)中10个代表性的显微镜视野被随机选择用于该分析。
实施例7：血清生物化学值分析和血液学测定
在三次注射后，收集全血和以4,000 rpm离心5分钟，获得血清。测定血尿素氮(BUN)、肌酸酐(Crea)、血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平作为肾和肝功能的指示。在三次重复治疗后从健康裸鼠收集全血。计算红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(HGB)和血细胞比容(HCT)以检测骨髓抑制。器官(心脏、肝、脾、肺和肾)经固定和切片用于H&E染色，以评价器官特异性毒性。
实施例8：体外萤光素酶基因沉默研究
在实验前一天将H460/Luc细胞(1× 104个细胞/0.2 mL/孔)接种到96-孔板(CorningInc., Corning, NY)。细胞用包含6、60或150 nM萤光素酶-siRNA的不同的制剂在100 μL无血清opti-MEM培养基中在37°C下处理4 h。细胞然后用PBS洗涤三次，接着用100 μL完全DMEM培养基孵育另外24 h。细胞然后用PBS洗涤和用60 μL裂解缓冲液(0.05% Triton X-100和2 mM EDTA/0.1 M Tris-HCl)孵育30分钟。然后将40 μL的裂解物转移至一个新的白色96板中并与100 μL底物(Luciferase Assay System, Promega Co., Madison, WI)混合，通过读板器(Plate Chameleon Multilabel Detection Platform, Bioscan Inc.,Washington DC)测量发光强度。蛋白浓度通过使用蛋白测定试剂盒(BCA protein assaykit, Thermo Science)测定。各样品的萤光素酶活性用蛋白水平标准化。
实施例9：胆甾醇基二甲双胍的合成
将固体胆甾醇基氯甲酸酯(1.0g, 2.2 mmol)溶于10 mL的二氯乙烷(DCM)。在单独的烧瓶中将0.22 mol乙二胺(13.2g)用10 mL的DCM稀释。在搅拌下，经30分钟时间在室温下(R.T.)将胆甾醇基氯甲酸酯溶液滴加至乙二胺溶液。在R.T.过夜搅拌后，蒸发有机溶剂，直到剩下最小样品体积。加入大约20 mL的乙腈以沉淀粗产物。然后收集固体，用乙腈漂洗数次，然后空气干燥。收率为92%。将等摩尔的胆固醇乙二胺(1.0 mmol)、双氰胺(1.0 mmol)和氯化铁(1.0 mmol)溶于10 mL的乙醇。将混合物升温至78oC和搅拌3小时。在乙醇蒸发后，将5mL稀盐酸(2 mol/L)加入以置换铁离子。然后分离产物和用乙腈漂洗数次，然后空气干燥。收率为71%。
统计学分析：治疗组之间的差异通过使用对于各对治疗组的Student's t-检验和对于多个组的单因素变量分析(ANOVA)进行分析。小于0.05的P值被认为是统计学显著的。所有统计学分析使用GraphPad Prism Software (Version 5.0, GrapPad Software, SanDiego, CA)进行。
本文使用的所有技术和科学术语具有相同含义。已尽力确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。
应注意，术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个实体；例如，“纳米颗粒”应理解为代表一个或多个纳米颗粒。因此，术语“一个” (或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换使用。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”、“包括”和“含有”以非排他性的含义使用，除非上下文另外要求。
如本文所用的，术语“约”当涉及值时，意指包括指定值在一些实施方案中± 20%、在一些实施方案中± 10%、在一些实施方案中± 5%、在一些实施方案中± 1%、在一些实施方案中± 0.5%和在一些实施方案中± 0.1%的变化，只要这样的变化适合于进行所公开的方法或使用所公开的组合物。
此外，当量、浓度或其它值或参数作为范围、优选范围或优选的上限值和有限的下限值的列表给出时，应理解为特别公开了从任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值的任何对形成的所有范围，不管范围是否单独公开。在本文列举数值的范围时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端点，和范围内的所有整数和分数。本文公开的主题的范围并非旨在限于定义范围时所列举的特定值。
说明书中提及的所有出版物和专利申请表明本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用结合到本文中，至如同每个单独的出版物或专利申请明确和单独指出通过引用结合到本文中的相同程度。
在具有前文描述和附图提供的教导益处时，本发明所属领域的技术人员将考虑本文阐明的本发明的许多修改和其它实施方案。因此，应理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，修改和其它实施方案意图包括在前述实施方案列表和随附权利要求的范围内。尽管本文使用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用，并且不用于限制目的。

Claims (64)

1.具有以下化学式I的聚合物：
其中，p是1或2，n是2-10,000的整数；
和
其中，X是氢或具有下式的二甲双胍残基：
其中在聚合物中至少5%的X是二甲双胍残基。
2.权利要求1的聚合物，其中X以至少50%的X出现率是二甲双胍残基。
3.权利要求1的聚合物，其中X以至少75%的X出现率是二甲双胍残基。
4.权利要求1的聚合物，其中X以至少95%的X出现率是二甲双胍残基。
5.权利要求1的聚合物，其中X以约100%的X出现率是二甲双胍残基。
6.权利要求1的聚合物，其中n是2-5,000的整数。
7.权利要求1的聚合物，其中n是2-4,000的整数。
8.权利要求1的聚合物，其中n是2-3,000的整数。
9.权利要求1的聚合物，其中n是2-2,000的整数。
10.权利要求1的聚合物，其中n是2-1,000的整数。
11.权利要求1的聚合物，其中n是2-500的整数。
12.权利要求1的聚合物，其中n是2-250的整数。
13.具有以下化学式I的聚合物：
其中n是2-10,000的整数；和
X是氢、具有下式的二甲双胍残基：
,
或具有以下化学式的乙基胺残基：
,
其中，在每种情况下，*N上的0、1或2个氢被以下取代：
a) 另外的乙基胺残基，其在每种情况下还可以相同的方式被进一步取代，和/或
b) 二甲双胍残基，
其中分支PEI中初始存在的至少5%的伯*N被二甲双胍残基取代。
14.权利要求13的聚合物，其中分支PEI中初始存在的至少50%的伯*N被二甲双胍残基取代。
15.权利要求13的聚合物，其中分支PEI中初始存在的至少75%的伯*N被二甲双胍残基取代。
16.权利要求13的聚合物，其中分支PEI中初始存在的至少95%的伯*N被二甲双胍残基取代。
17.权利要求13的聚合物，其中分支PEI中初始存在的约100%的伯*N被二甲双胍残基取代。
18.权利要求13的聚合物，其中n是2-5,000的整数。
19.权利要求13的聚合物，其中n是2-4,000的整数。
20.权利要求13的聚合物，其中n是2-3,000的整数。
21.权利要求13的聚合物，其中n是2-2,000的整数。
22.权利要求13的聚合物，其中n是2-1,000的整数。
23.权利要求13的聚合物，其中n是2-500的整数。
24.纳米颗粒，其包含：
i. 脂质外膜；和
ii. 被脂质外膜包裹的PolyMet。
25.纳米颗粒，进一步包含被脂质外膜包裹的透明质酸或核酸。
26.权利要求24的纳米颗粒，进一步包含与PolyMet复合的货物，其中所述货物是治疗剂。
27.权利要求26的纳米颗粒，其中所述货物是生物制剂。
28.权利要求27的纳米颗粒，其中所述货物是抗癌药。
29.权利要求27的纳米颗粒，其中所述货物是核苷酸。
30.权利要求27的纳米颗粒，其中所述货物是siRNA或pDNA。
31.权利要求24的纳米颗粒，其中脂质外膜包含阳离子脂质。
32.权利要求24的纳米颗粒，其中脂质外膜包含DOTAP和胆固醇。
33.权利要求24的纳米颗粒，其中脂质外膜包含靶向配体和/或被聚乙二醇化。
34.权利要求24的纳米颗粒，具有至少一个小于约1,000 nm的维度。
35.权利要求24的纳米颗粒，具有直径小于约100 nm的球形。
36.通过给予受试者PolyMet或LPH-PolyMet来治疗疾病的方法。
37.权利要求36的方法，其中所述疾病是癌症。
38.权利要求36的方法，其中所述疾病是糖尿病。
39.权利要求36的方法，其中PolyMet和the LPH-PolyMet包含货物。
40.权利要求39的方法，其中所述货物是治疗剂。
41.递送货物至靶标的方法，包括给予受试者与PolyMet或LPH-PolyMet缔合的货物，其中所述货物通过PolyMet或LPH-PolyMet递送至受试者体内的靶标。
42.权利要求41的方法，其中所述货物是治疗剂。
43.修饰细胞的遗传物质的方法，包括：使细胞和与外源遗传物质复合或缔合的PolyMet或LPH-PolyMet接触，其中细胞的遗传物质被修饰。
44.权利要求43的方法，其中所述细胞是真核细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或原核细胞。
45.权利要求43的方法，其中所述外源遗传物质是核酸。
46.试剂盒，包含PolyMet或LPH-PolyMet转染试剂和用于复合货物至PolyMet或LPH-PolyMet转染试剂的至少一种溶剂。
47.制备二甲双胍的聚合物的方法，包括
a. 使线性或分支的聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺与双氰胺在溶剂中接触，以制备第一混合物；
b. 使第一混合物与酸接触，以制备第二混合物；和
c. 加热第二混合物一段时间，
其中制备二甲双胍的聚合物。
48.权利要求47的方法，其中所述溶剂是水性溶剂。
49.权利要求47的方法，其中所述溶剂是水。
50.权利要求47的方法，其中所述酸是无机或有机酸。
51.权利要求47的方法，其中所述酸是HCl。
52.权利要求47的方法，其中所述一段时间是约2-约6小时。
53.权利要求47的方法，其中所述加热包括施加热，直至反应达到至少约100°C的温度。
54.具有以下化学式I的聚合物：
其中，p是1或2，n是2-10,000的整数；和
X是氢或具有下式的二甲双胍残基：
,
其中在聚合物中二甲双胍残基的wt %是至少0.001%。
55.具有以下化学式I的聚合物：
其中，p是1或2，n是2-10,000的整数；和
X是氢、具有下式的二甲双胍残基：
,
或具有以下化学式的乙基胺残基：
，或
具有以下化学式的丙基胺：
,
其中，在每种情况下，*N上的0、1或2个氢被以下取代：
a) 另外的乙基胺或丙基胺残基，其在每种情况下还可以相同的方式被进一步取代，和/或
b) 二甲双胍残基，
其中在聚合物中二甲双胍残基的wt %是至少0.001%。
56.具有下式的嵌段共聚物：
其中x是约0.1-约0.9，y是约0.1-约0.9，和其中x和y代表聚合物中每个单元的摩尔分数，和x和y的总和是1；G和G’二者可以相同或不同，和在每种情况下选自：
其中p在每种情况下是1或2，*N是可被二甲双胍残基或乙基胺或丙基胺衍生的氮，其任一将本身包含*N；和Y’和Y”独立地是氢、二甲双胍残基或乙基胺或丙基胺，其任一将本身包含*N，其中嵌段共聚物具有0.001 % wt/wt至大于90% wt/wt的共价结合的二甲双胍残基的% wt。
57.具有以下结构的树枝状聚合物：
,
其中至少0.0001出现率的树枝状聚合物的伯氮通过共价键合至至少一个二甲双胍残基而被衍生。
58.具有以下化学式III的聚合物：
其中每个p独立地是1或2，n是0.1-1.0；q是0.1-1.0；m是0.1-1.0，其中n、q和m表示聚合物中每个单元的摩尔分数和n、q和m的总和是1；z是0-1,000的整数；*N是可被二甲双胍残基或乙基胺或丙基胺衍生的氮，其任一将本身包含*N；X是氢或二甲双胍残基；和Y’和Y”独立地是氢、二甲双胍残基或乙基胺或丙基胺，其任一将本身包含*N。
59.权利要求58的聚合物，其中分子量是约200-约6,000,000。
60.式I的化合物：
,
其中R选自
和,
其中R1是甾醇。
61.权利要求60的化合物，其中R1是
。
62.纳米颗粒，包含脂质外膜和权利要求61的化合物。
63.权利要求62的纳米颗粒，进一步包含DOPE。
64.权利要求63的纳米颗粒，进一步包含被脂质外膜包裹的透明质酸或核酸。
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