CN112048002A - 一种靶向t细胞的酶敏感纳米体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种靶向T细胞的酶敏感的纳米体系及其制备方法和应用。本发明提供的靶向T细胞的酶敏感的纳米体系，以多肽载体为基础，可负载疏水性治疗药物，多肽末端有功能基团修饰，可连接靶向T细胞的功能抗体。所述多肽载体包含疏水段和亲水段，可自组装形成胶束，有良好的载药能力；多肽末端引入马来酰亚胺基团，可连接靶向T细胞表面蛋白的抗体等功能性物质。本发明为药物输送提供了一种新的纳米体系，可以靶向T细胞递送疏水性治疗药物和抗体药物，恢复免疫细胞功能，从而促进前腺癌细胞的凋亡，是前列腺癌免疫治疗的一种高效、低毒的纳米级递送系统。

Description

一种靶向T细胞的酶敏感纳米体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种靶向T细胞的酶敏感纳米体系及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是目前人类最常见的发病和死亡原因之一，目前肿瘤的治疗方法主要包括化学治疗、放射疗法等。近些年来随着对肿瘤免疫学研究的深入，免疫疗法逐渐成为肿瘤治疗的重要方法。在肿瘤微环境内，免疫细胞由于长期受到肿瘤抗原的刺激，多数T细胞处于衰竭状态而不能发挥抗肿瘤作用。T细胞和肿瘤细胞表面表达多种抑制性免疫检查点分子，如PD-1，CTLA-4等，介导免疫抑制并发生免疫逃逸。目前的免疫疗法主要为免疫检查点治疗，利用相关抗体阻断免疫检查点的免疫抑制作用，以增强机体的免疫反应达到抗肿瘤效果。目前的免疫检查点治疗多针对PD-1/PD-L1轴，且已有多种抗体投入使用。但是，anti-PD-1/PD-L1治疗仅有小部分患者受益，且常产生多种不良反应。
PD-1和PD-L1的结合介导免疫抑制作用。最新研究表明，PD-1与PD-L1结合后使CD28分子的胞质区域去磷酸化，导致直接靶向T细胞活化共刺激分子CD28的胞质区域，且具有比T细胞受体下游分子更高的亲和力，导致CD28分子信号的传递失败。且实验证实，CD28/B7共刺激途径的激活对有效的PD-1治疗和PD-1+CD8+T细胞的增殖是必需的(Hui E,CheungJ,Zhu J,et al.T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.Science.2017；355(6332):1428-1433；Kamphorst AO,WielandA,Nasti TR,et al.Rescue of exhausted CD8 T cells by PD-1-targeted therapiesis CD28-dependent.Science.2017；355(6332):1423-1427)。
另一方面，T细胞完全活化需要双信号刺激。TCR识别抗原并传递的为第一信号；抗原提呈细胞与T细胞表面的共刺激受体结合产生第二信号，CD28分子与CD80/86分子结合产生的是最主要的第二信号。然而T细胞表面表达免疫检查点CTLA-4，与CD28竞争性结合B7分子导致无法产生共刺激信号进而介导免疫抑制(Esensten JH,Helou YA,Chopra G,etal.CD28 Costimulation:From Mechanism to Therapy.Immunity.2016；44(5):973-88)。因此，增加有效的共刺激信号对T细胞活化有重要意义。因此PD-1及CD28双通路作用可能是解除免疫抑制的有效方法。
纳米体系由于其独特的粒径优势，在EPR效应的介导下，可被动靶向至肿瘤微环境；若对其进行修饰，可使其主动靶向至肿瘤部位，实现药物或抗体的精准递送，有效避免因全局作用引起的不良反应。目前尚无以T细胞为作用靶点的可降解多肽纳米体系，且尚无将CD28以及PD-1作为双靶点进行同时干预的药物递送体系，期望可以提供一种靶向T细胞并进行双通路作用以解除免疫抑制、恢复免疫细胞肿瘤杀伤作用的纳米体系。
发明内容
尽管免疫检查点治疗取得重大进步，但在传统的给药方式下，抗体与正常组织的脱靶效应、在体内不能有效地传递的原因等会带来一系列的副作用，所以本发明考虑引入纳米体系递送相关药物实现免疫功能改善。聚合物胶束作为纳米载体可以有效的封装药物，由于其粒径优势可利用EPR效应被动靶向至肿瘤微环境，实现精确递送。
肿瘤为环境中多高表达基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)。肿瘤细胞通过分泌MMP以帮助其完成侵袭和转移。其中，多肽序列-PLGLAG-是MMP的作用底物之一，可在MMP的酶解作用下断裂。根据有关研究报道，一些以酶敏感小分子肽片段为连接剂的抗体药物结合物在肿瘤组织中表现出有效的药物释放。
研究表明，芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是T细胞表面PD-1表达的重要靶点。当AhR被其内源性配体犬尿氨酸结合后可激活AhR，并促使其向细胞核转移并入核结合PD-1启动子，启动T细胞表面PD-1的表达。小分子化合物CH223191为AhR抑制剂，可与犬尿氨酸竞争性结合AhR，最终阻断PD-1的表达。
本发明通过构建一种靶向T细胞的纳米递送体系实现CD28及PD-1双靶点作用的目的。所述的纳米体系以多肽载体为基础，利用其包封并向T细胞递送疏水性药物CH223191，同时荷载CD28抗体提供共刺激信号，期望达到实现PD-1下调与T细胞激活的的效果，最终达到有效的肿瘤细胞杀伤效果。
本发明的第一目的在于为克服现有免疫治疗抗体无法精确输送至肿瘤部位的问题，提供一种以T细胞为靶点可靶向至T细胞的的药物递送体系。以多肽载体包封AhR抑制剂CH223191并荷载共刺激激动剂CD28抗体形成纳米递送体系，通过表面载体修饰及粒径优势，同时发挥主动靶向和被动靶向的作用，将纳米递送体系运输至肿瘤微环境并靶向T细胞，增强两种药物的协同作用，解除免疫抑制，使得T细胞有效活化进而进行肿瘤杀伤。
本发明的第二目的是提供该纳米递送体系的制备方法。
本发明的第三目的是提供上述纳米递送体系该在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的，具体技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种多肽载体，所述多肽载体的由多肽和硬脂酰组成，所述的多肽用硬脂酰修饰，并在多肽末端引入马来酰亚胺基团(-Mal)；所述的硬脂酰基修饰，是指多肽序列中的组氨酸的氨基与硬脂酸的羧基以酰胺键连接；所述的引入马来酰亚胺基团，是指赖氨酸的羧基与3-马来酰亚胺丙酸反应形成。
其中，所述多肽的氨基酸序列为HHHRRRRRPLGLAGK(SEQ ID NO.1)。
所述多肽载体的序列为stearyl-HHHRRRRRPLGLAGK-Mal，可缩写为sHRP，s为硬脂酰基，H为组氨酸，R为精氨酸，P为基质金属蛋白酶敏感段的起始氨基酸。
进一步的，所述的多肽载体的化学结构如式(I)所示：
Figure BDA0002622767800000031
此结构可自组装形成胶束聚合物，硬脂酰修饰后可包载疏水性药物，并使多肽载体亲脂性增加，增加与细胞膜的亲和力。肽段中包含一段基质金属蛋白酶(MMP)敏感肽段-PLGLAG-，可在MMP的作用下断裂，余下部分进入细胞释放药物发挥作用。多肽末端修饰马来酰亚胺基团(-Mal)，可与多种基团反应，用于连接抗体等功能物质。
本发明的第二方面，提供一种靶向T细胞的酶敏感纳米体系，所述的纳米体系是以上述的多肽载体为基础，多肽载体的功能基团连接靶向T细胞表面蛋白分子的功能抗体。
所述的功能抗体，通过化学键连接分布于所述纳米体系的表层；多肽载体可包载疏水性药物并分布于所述纳米体系内部。
所述多肽载体的功能基团通过连接靶向T细胞表面蛋白分子的功能抗体介导T细胞靶向作用的发挥。
所述抗体为靶向T细胞表面蛋白分子的抗体，即刻发挥靶向作用，在与相关分子结合后亦可发挥功能作用，如激活、阻断信号传递。所述抗体可为CD3抗体、CD28抗体、PD-1抗体等，优选为CD28抗体。
所述多肽载体可自组装形成胶束并利用其疏水段封装疏水性药物，可与连接的功能抗体对T细胞发挥协同治疗作用。所述疏水性药物为3’，4’-二甲氧基黄酮、BAY 2416964、CH223191等，优选为AhR拮抗剂CH223191。
本发明的第三方面，提供所述靶向T细胞的酶敏感纳米体系的制备方法，包括如下步骤：
(A)多肽载体的合成；可采用固相合成法合成；
(B)合成的多肽溶于水，加入5倍体积的溶解疏水性药物的二氯甲烷搅拌2h，后将二氯甲烷挥发完全即得载药胶束溶液；
(C)将巯基化后的抗体与步骤(B)中的载药胶束溶液混合反应即得双负载的靶向T细胞的酶敏感纳米体系。
进一步的，步骤C中巯基化抗体的具体操作包括：将抗体与Traut’s溶液在4℃避光反应2h，加入5mM EDTA，并去除空气。反应结束后将溶液置于3000D的透析袋中透析2h，除去多余的Traut’s，透析介质为含5mM EDTA的pH＝8的PBS溶液。透析结束后即得到巯基化的抗体。
进一步的，步骤C中混合反应的具体操作包括：将载药胶束溶液与巯基化的抗体在4℃避光反应24h，其反应质量摩尔比为1:20，并加入5mM EDTA，去除空气。反应结束后将溶液置于300kD的透析袋中透析12h，透析介质为含5mM EDTA的pH＝8的PBS溶液，透析介质应提前充氮气除氧，透析结束后即得抗体和药物双负载的纳米体系。
在本发明实施方式中，所述的纳米体系以上述多肽载体为基础，疏水性药物包封在胶束的疏水内核中，以AhR拮抗剂药物CH223191为一个实施例，功能抗体以CD28抗体为一个实施例，抗体通过化学键连接在纳米载体的表面；
其制备方法包括以下步骤：
(a)多肽载体的合成，采用固相合成法合成；
(b)将合成的多肽溶于水，加入5倍体积的溶解CH223191的二氯甲烷搅拌2h，后将二氯甲烷挥发完全即得载药胶束溶液(简写为CH-sHRP)。优选的，在投料质量比为CH22391：sHRP＝2:1时具有较好的载药能力和包封率。所述的载药胶束的包封率为70-80％。
(c)抗体的巯基化：将CD28抗体与Traut’s溶液在4℃避光反应2h，加入5mM EDTA，并去除空气；反应结束后将溶液置于3000D的透析袋中透析2h，透析介质为含5mM EDTA的pH＝8的PBS溶液；透析结束后即得到巯基化的CD28抗体。优选的，在CD28抗体与Traut’s溶液的反应质量摩尔比为1:20-1:50时抗体巯基化效果较好。
(d)将巯基化CD28抗体与步骤b中的载药胶束溶液在4℃避光反应24h，并加入5mMEDTA，去除空气；反应结束后将溶液置于300kD的透析袋中透析12h，透析介质为含5mM EDTA的pH＝8的PBS溶液，透析介质应提前充氮气除氧，透析结束后即得CD28抗体和CH223191双负载的纳米体系(简写为co-sHRP)。优选的，载药胶束溶液与CD28抗体反应的质量摩尔比为1:5-1:20时，抗体连接量较合适。
本发明的第四方面，提供一种如上所述的多肽载体在包载疏水性药物和/或荷载抗体的药物中的应用。
本发明的第五方面，提供一种如上所述的靶向T细胞的酶敏感纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤为前列腺癌。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的多肽载体由组氨酸、精氨酸、甘氨酸等组成的短肽和硬脂酰组成，多肽载体中包含氨基酸均为体内存在的氨基酸，对细胞及人体无毒副作用，所形成的多聚物对细胞及人体无毒副作用，可在细胞内迅速被降解。同时又有比较高的载药量，因此非常适用于体内外的药物递送研究和应用。此多肽包含疏水段和亲水段，可自组装形成胶束，有良好的载药能力；多肽序列中包含一段基质金属蛋白酶敏感肽段，多肽末端引入马来酰亚胺基团，可连接靶向T细胞表面蛋白的抗体等功能性物质，此肽段可在肿瘤微环境中基质金属酶的作用下断裂，使得纳米体系体积减小并释放敏感肽段连接的功能成分。
2、本发明提供的靶向T细胞的酶敏感的纳米体系，以多肽载体为基础，可负载疏水性治疗药物，多肽末端有功能基团修饰，可连接靶向T细胞的功能抗体。本发明提供的靶向T细胞的纳米递送体系适用于实验所需的化疗药物及抗体递送。本发明提供的纳米递送体系，在抗体的修饰及EPR效应的介导下可有效的靶向肿瘤微环境中的T细胞。共负载CD28抗体及CH223191的纳米体系对解除免疫抑制激活T细胞，进而进行肿瘤杀伤的作用效果强于单独的CD28抗体及CH223191的联合应用效果，大大提高了二者联和合应用的免疫治疗效果。
3、本发明为药物输送提供了一种新的纳米体系，可以靶向T细胞递送疏水性治疗药物和抗体药物，恢复免疫细胞功能，从而促进前腺癌细胞的凋亡，是前列腺癌免疫治疗的一种高效、低毒的纳米级递送系统。
附图说明
图1.sHRP的质谱图；
图2.sHRP合成纯度的HPLC图；
图3.co-sHPR纳米复合物的粒径；
图4.co-sHRP纳米复合物的电位；
图5.co-sHRP的透射电镜图；
图6.不同条件下CH223191的释放度考察；
图7.CD8+T细胞对Nil-sHRP摄取的流式结果；
图8.CD8+T细胞对Nil-sHRP摄取的共聚焦结果；
图9.sHRP的免疫原性考察；
图10.体外CD28-sHRP的抗体结合考察；
图11.不同浓度载体对细胞的细胞毒性考察；
图12.肿瘤细胞-CD8+T细胞共培养环境下纳米co-sHRP刺激肿瘤细胞的调亡情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：硬脂酰基修饰多肽的合成
硬脂酰基修饰的多肽：stearyl-HHHRRRRRPLGLAGK-Mal，由浙江鸿拓有限公司采用多肽固相合成法合成并命名为sHRP，利用制备高效液相色谱纯化合成的sHRP，使其纯度达到95％以上。其中HRP为多肽，氨基酸之间以肽键连接形成15肽(图1、图2)。
实施例2：sHRP胶束共载化学药物和抗体的方法
将sHPR溶于水，CH223191溶于二氯甲烷，水和二氯甲烷的体积比为1:5，混合密闭搅拌2h后，开盖保持搅拌将二氯甲烷挥发完全。制得CH-sHRP胶束。将得到的胶束溶液与巯基化后的CD28抗体溶液混合，胶束与抗体质量比为1:10，避光密闭反应24h，即得co-sHRP。平均粒径结果及电位见图3、4。粒径结果与透射电镜图相一致。
实施例3：CH223191体外释放特性考察
采用透析袋法进一步评价CH-sHRP分别在有无MMP条件下的释放度。选择相对分子质量为1000的透析袋，透析介质为pH＝7.4的PBS溶液。分别将MMP处理的CH-sHRP和未处理CH-SHRP放入透析袋，放于含有50mL的透析液，100r/min，分别于2，4，6，8，10，12，24，36，48h时间点取1mL外液，并补加1mL透析液，利用HPLC测定浓度，绘制体外释放曲线。如图6所示在MMP的存在下，CH223191的释放较快，这是因为载体的结构中MMP敏感的肽段断裂导致纳米结构粒径减小从而释放加快。
实施例4：sHRP胶束的细胞摄取考察
使用磁珠分离的方法分离小鼠脾脏CD8+T细胞，铺12孔板，每孔1×106细胞，加入不含血清的培养基1mL。以前述制备方法，采用Nile red代替CH223191，细胞培养板中分别给予游离尼罗红、Nile-sHRP、及MMP处理后的Nile-sHRP。4h后移除培养基并收集细胞，使用流式细胞仪检测T细胞对Nile-red的摄取情况。
另将CD8+T细胞以每孔5×104cells铺24孔板，加入无血清培养基。分别将游离尼罗红、Nile-sHRP、及MMP处理后的Nile-sHRP胶束加入培养板中，37℃、5％CO2条件下培养4h，吸去培养基PBS洗1次，用预冷的4％多聚甲醇固定30min，PBS洗3次。吸取8μL含有DAPI的封片液滴于载玻片上，将圆形盖玻片取出，使含有细胞的一面贴于含有DAPI液的载玻片上。利用激光共聚焦显微镜观察多肽胶束被细胞摄取的情况。
如图7所示，CD8+T细胞Nile-SHRP的摄取明显大于游离状态的Nile-red，说明在sHRP的介导下，Nile-red的摄取大量增加。MMP处理租的平均荧光强度稍大于未处理组，说明MMP敏感肽键断裂后更有利于Nile-red的摄取。
如图8所示，图中红色为Nile-red激发光，代表CH223191；蓝色为DAPI染色的细胞核。4h后CH-sHRP及MMP处理组的胞内红色荧光明显高于游离Nile-red组，说明胶束载体成功递送Nile-red进入胞内。
实施例5：sHRP的免疫原性考察
取小鼠脾脏分离脾脏淋巴细胞，以1×106cells每孔的密度铺24孔板，培养板中分别加入不同浓度的sHRP和免疫刺激物脂多糖(LPS)在37℃、5％CO2条件下培养48h。收集细胞培养液，离心取上清，采用ELISA法测定细胞培养液中的TNF-α和IL-6的浓度。
结果如图9所示，不同浓度的sHRP处理组的TNF-α和IL-6的浓度和对照组无明显差异，但是和阳性对照组LPS组有显著性差异，说明载体本身并无免疫原性，不会刺激免疫系统产生免疫反应。
实施例6：体外CD28-sHRP的抗体结合考察
以前述制备方法，用荧光标记的CD28抗体制备荷载CD28抗体的胶束。CD8+T细胞以每孔5×104cells铺24孔板，将CD28-sHRP加入培养板中，37℃、5％CO2条件下培养2h，吸去培养基PBS洗1次，用预冷的4％多聚甲醇固定30min，PBS洗3次。吸取8μL含有DAPI的封片液滴于载玻片上，将圆形盖玻片取出，使含有细胞的一面贴于含有DAPI液的载玻片上。利用激光共聚焦显微镜观察CD8+T细胞表面的胶束结合情况。
结果如图9所示，绿色为荧光标记的荷载抗体胶束，蓝色为DAPI染色的细胞核，明场图片展示了细胞膜结构。细胞膜一侧均匀分布绿色点状荧光，说明抗体可结合CD8+T细胞且结合效率很高。
实施例7：sHRP的细胞毒性研究
细胞毒性测定采用CCK-8法检测，分别测定不同浓度的sHRP及MMP处理后的sHRP对CD8+细胞的细胞毒性。
分离出的CD8+T细胞以5000个/孔的密度铺96孔板，细胞在含有10％胎牛血清的RMPI-1640培养基中生长6小时。在每孔中加入不同浓度sHRP进行处理，24h后，培养板移去旧的培养基，重新加入90μL培养基和10μL CCK8试剂，然后放入孵育箱中放置2h。取出需要检测的培养板，放于酶标仪震荡30s，然后测定在450nm波长处的各个孔的OD值。空白组为未接种细胞组的OD值，对照组为未加入药物的OD值，每个孔重复测量6次。细胞存活率依照如下方法进行：
存活率＝[1-(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]*100％
如图10所示，在MMP处理组和未处理组中，当载体浓度为200μg/mL时，细胞活力仍在90％以上；当浓度达到500μg/mL时，细胞活力仍保持在80％以上。说明载体SHRP本身的毒性较低，可以排除后续试验中因为载体毒性而引起的细胞活力的下降。
实施例8：co-sHRP的促凋亡研究
小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞培养至80％融合时，用胰酶消化后用PBS洗涤、离心。分离小鼠脾脏CD8+T细胞，按照肿瘤细胞：CD8+T细胞数量＝1:5的比例制成细胞混合悬液，将上述制得的细胞混悬液加入12孔板，并补充培养基至1mL。每孔加入CD3抗体，浓度为5μg/mL。而后分别加入CH-sHRP、CD28-sHRP、co-sHRP以及MMP处理后的co-sHRP刺激。48h后收集细胞，采用流式细胞术分析肿瘤细胞的调亡情况。
收集到的细胞先用CD8-APC抗体染色后，用细胞调亡试剂盒Annexin-PI染色，染色完成后进行流式细胞检测。统计并分析APC阴性部分细胞的调亡情况。
结果如图12所示，四组处理组的调亡细胞的比例均高于对照组；其中co-sHRP与MMP处理的共载组的调亡比例均高于CH-sHRP组与CD28-sHRP组，说明共载体系对激活T细胞的作用更强，对肿瘤细胞的杀伤能力更强。MMP处理组的凋亡率稍高于co-sHRP组，说明，抗体释放后纳米载体余下的部分更容易进入T细胞发挥作用，最终具有更高的T细胞激活作用。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 上海维洱生物医药科技有限公司
上海宝龙药业股份有限公司
宝龙药业有限公司
上海宝龙安庆药业有限公司
<120> 一种靶向T细胞的酶敏感纳米体系及其制备方法和应用
<130> /
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
His His His Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Lys
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种多肽载体，其特征在于，所述多肽载体的由多肽和硬脂酰组成，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的多肽用硬脂酰修饰，并在多肽末端引入马来酰亚胺基团；所述的硬脂酰基修饰，是指多肽序列中的组氨酸的氨基与硬脂酸的羧基以酰胺键连接；所述的引入马来酰亚胺基团，是指赖氨酸的羧基与3-马来酰亚胺丙酸反应形成。
2.根据权利要求1所述的多肽载体，其特征在于，所述的多肽载体的化学结构如式(I)所示：
Figure FDA0002622767790000011
3.一种靶向T细胞的酶敏感纳米体系，其特征在于，所述的纳米体系是以权利要求1或2所述的多肽载体为基础，多肽载体的功能基团连接靶向T细胞表面蛋白分子的功能抗体；所述的功能抗体，通过化学键连接分布于所述纳米体系的表层；多肽载体包载疏水性药物并分布于所述的纳米体系内部。
4.一种如权利要求3所述的靶向T细胞的酶敏感纳米体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)多肽载体的合成；
(B)合成的多肽溶于水，加入5倍体积的溶解疏水性药物的二氯甲烷搅拌2h，后将二氯甲烷挥发完全即得载药胶束溶液；
(C)将巯基化后的抗体与步骤(B)中的载药胶束溶液混合反应即得双负载的靶向T细胞的酶敏感纳米体系。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤C中巯基化抗体的操作包括：将抗体与Traut’s溶液在4℃避光反应2h，加入5mM EDTA，并去除空气；反应结束后将溶液置于3000D的透析袋中透析2h，除去多余的Traut’s，透析介质为含5mM EDTA的pH＝8的PBS溶液；透析结束后即得到巯基化的抗体。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤C中混合反应的操作包括：将载药胶束溶液与巯基化的抗体在4℃避光反应24h，其反应质量摩尔比为1:20，并加入5mM EDTA，去除空气；反应结束后将溶液置于300kD的透析袋中透析12h，透析介质为含5mM EDTA的pH＝8的PBS溶液，透析介质应提前充氮气除氧，透析结束后即得抗体和药物双负载的纳米体系。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，抗体与Traut’s溶液反应的质量摩尔比为1:20-1:50；载药胶束溶液与抗体反应的量摩尔比为1:5-1:20。
8.一种如权利要求1或2所述的多肽载体在包载疏水性药物和/或荷载抗体的药物中的应用。
9.一种如权利要求3所述的靶向T细胞的酶敏感纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为前列腺癌。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113648429A (zh) * 2021-07-06 2021-11-16 中山大学 靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用
CN114225047A (zh) * 2021-12-13 2022-03-25 安徽医科大学 一种免疫逃逸纳米制剂、制备方法及应用
CN114470238A (zh) * 2022-03-25 2022-05-13 华中科技大学同济医学院附属协和医院 AhR抑制剂CH223191在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞药物中的应用
CN115337268A (zh) * 2021-05-10 2022-11-15 四川大学华西医院 一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统及其制备方法和用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2810661A2 (en) * 2009-09-03 2014-12-10 Curevac GmbH Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
CN105727307A (zh) * 2016-04-01 2016-07-06 中国人民解放军第二军医大学 一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方法和应用
WO2019086627A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Universidade De Santiago De Compostela Drug delivery systems and methods comprising polysialic acid and/or other polymers
CN110804086A (zh) * 2019-10-10 2020-02-18 上海维洱生物医药科技有限公司 一种多肽纳米载体及其制备方法和应用
CN110903354A (zh) * 2019-10-15 2020-03-24 上海维洱生物医药科技有限公司 一种靶向前列腺癌骨转移的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2810661A2 (en) * 2009-09-03 2014-12-10 Curevac GmbH Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
CN105727307A (zh) * 2016-04-01 2016-07-06 中国人民解放军第二军医大学 一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方法和应用
WO2019086627A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Universidade De Santiago De Compostela Drug delivery systems and methods comprising polysialic acid and/or other polymers
CN110804086A (zh) * 2019-10-10 2020-02-18 上海维洱生物医药科技有限公司 一种多肽纳米载体及其制备方法和应用
CN110903354A (zh) * 2019-10-15 2020-03-24 上海维洱生物医药科技有限公司 一种靶向前列腺癌骨转移的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHONG YAO ET AL.: "Reduction-responsive cross-linked stearyl peptide for effective delivery of plasmid DNA", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》 *
韩治敏等: "纳米技术应用于肿瘤免疫治疗的研究进展", 《第二军医大学学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115337268A (zh) * 2021-05-10 2022-11-15 四川大学华西医院 一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统及其制备方法和用途
CN113648429A (zh) * 2021-07-06 2021-11-16 中山大学 靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用
CN113648429B (zh) * 2021-07-06 2023-11-10 中山大学 靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用
CN114225047A (zh) * 2021-12-13 2022-03-25 安徽医科大学 一种免疫逃逸纳米制剂、制备方法及应用
CN114225047B (zh) * 2021-12-13 2023-12-26 安徽医科大学 一种免疫逃逸纳米制剂、制备方法及应用
CN114470238A (zh) * 2022-03-25 2022-05-13 华中科技大学同济医学院附属协和医院 AhR抑制剂CH223191在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞药物中的应用

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