CN113004372A - 一种免疫多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域。本发明提供了一种免疫多肽及其应用，由封端基团和短肽连接得到，所述短肽为GFFY、G^DF^DF^DY和^DPPA‑1中的一种或多种。该免疫多肽可自组装形成超分子纳米药物。所述超分子纳米药物进入肿瘤微环境后可以同时逆转IDO途径因消耗过量色氨酸和犬尿氨酸等代谢产物积累所介导的免疫抑制作用；可以特异性的与癌细胞表面的PD‑L1结合阻断肿瘤细胞免疫逃逸；同时激活并增强机体免疫反应，三个部分并行发挥作用，使机体针对肿瘤产生强烈免疫反应从而在癌症的免疫治疗中达到最佳效果，为开发多功能肿瘤免疫治疗纳米药物提供了新思路。

Description

一种免疫多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种免疫多肽及其应用。

背景技术

肿瘤免疫疗法主要通过激发机体自身的免疫系统，恢复被抑制的免疫反应、阻断免疫逃逸或者增强自身抗肿瘤免疫力从而控制和杀伤肿瘤细胞。在众多免疫疗法中，免疫检查点疗法大放异彩。在针对PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂取得显著疗效的同时，小分子抑制剂如短肽拮抗剂的研究也随之增多。随着研究的不断深入，肿瘤免疫微环境中更多的免疫检查点被发现。研究表明，吲哚胺-2，3-双加氧酶1(IDO1)是人体催化必需氨基酸色氨酸经过犬尿氨酸途径代谢的关键限速酶，也是一种与机体外周免疫耐受现象和机体免疫抑制作用相关的免疫调节酶。该酶在多种恶性肿瘤中过表达造成的Trp耗竭和Kyn等代谢产物增加明显抑制T细胞的增殖，活化调节性T细胞，从而抑制抗肿瘤免疫应答。因此，IDO抑制剂成为肿瘤免疫治疗的又一热点领域，Indoximod作为IDO途径的有效抑制引发广泛关注。自组装多肽纳米材料具有疫苗佐剂、激活并增强免疫系统的功能。因此，以逆转IDO1途径介导的免疫抑制、阻断PD1/PD-L1造成的免疫逃逸和激活并增强免疫反应来进行癌症免疫治疗具有坚实的理论基础。目前尚未见到相关研究利用单一药物同时具备IDO1抑制剂、PD1/PD-L1拮抗剂以及激活并增强免疫反应三重功能的多肽，用于肿瘤的免疫治疗药物制备。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫多肽及其应用，用于肿瘤的免疫治疗药物制备。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种免疫多肽，由封端基团和短肽连接得到，所述短肽为GFFY、G^DF^DF^DY和^DPPA-1中的一种或多种。

作为优选，所述封端基团为indoximod或D-色氨酸。

作为优选，所述免疫多肽由indoximod和GFFY连接得到时的结构式为：

作为优选，所述免疫多肽由indoximod和G^DF^DF^DY连接得到时的结构式为：

作为优选，所述免疫多肽由indoximod、G^DF^DF^DY和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

作为优选，所述免疫多肽由D-色氨酸、G^DF^DF^DY和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

作为优选，所述免疫多肽由indoximod和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

本发明还提供了所述的免疫多肽在制备肿瘤免疫药物中的应用。

本发明提供了一种免疫多肽及其应用，由封端基团和短肽连接得到，所述短肽为GFFY、G^DF^DF^DY和^DPPA-1中的一种或多种。该免疫多肽可自组装形成超分子纳米药物。所述超分子纳米药物进入肿瘤微环境后可以同时逆转IDO途径因消耗过量色氨酸和犬尿氨酸等代谢产物积累所介导的免疫抑制作用；可以特异性的与癌细胞表面的PD-L1结合阻断肿瘤细胞免疫逃逸；同时激活并增强机体免疫反应，三个部分并行发挥作用，使机体针对肿瘤产生强烈免疫反应从而在癌症的免疫治疗中达到最佳效果，为开发多功能肿瘤免疫治疗纳米药物提供了新思路。

附图说明

图1为实施例1合成的免疫多肽高效液相色谱质谱图；

图2为实施例2合成的免疫多肽高效液相色谱质谱图；

图3为实施例3合成的免疫多肽高效液相色谱质谱图；

图4为实施例4合成的免疫多肽高效液相色谱质谱图；

图5为实施例5合成的免疫多肽高效液相色谱质谱图；

图6为对比例3合成的免疫多肽高效液相色谱质谱图；

图7为实施例1合成的免疫多肽经加热冷却自组装后的微观形貌图；

图8为实施例2合成的免疫多肽经加热冷却自组装后的微观形貌图；

图9为实施例3合成的免疫多肽经加热冷却自组装后的微观形貌图；

图10为实施例4合成的免疫多肽经加热冷却自组装后的微观形貌图；

图11为实验例2中所用的免疫多肽及自组装体纳米药物对肿瘤细胞产生犬尿氨酸的抑制率图；

图12为实验例3中所用的免疫多肽及自组装纳米药物与PD-L1蛋白的结合图；

图13为实验例4中所用的免疫多肽3和4的自组装纳米药物对小鼠肿瘤细胞生长的抑制作用图；

图14为ELISA检测实施例免疫多肽及自组装纳米药物促进细胞因子TNF-α的表达图；

图15为ELISA检测实施例免疫多肽及自组装纳米药物促进细胞因子IFN-γ的表达图；

图16为ELISA检测实施例免疫多肽及自组装纳米药物促进细胞因子IL-12的表达图；

图17为ELISA检测实施例免疫多肽及自组装纳米药物促进细胞因子IL-6的表达图；

图18为实验例6中小动物活体成像检测荧光标记的实施例3及对比例3所述免疫多肽的肿瘤靶向和保留能力图；

图19为实验例7中免疫组化检测免疫多肽及自组装纳米药物治疗的肿瘤组织中CD8⁺T细胞分布图；

图20为实验例7中免疫组化检测免疫多肽及自组装纳米药物治疗的肿瘤组织中CD8⁺T细胞统计图；

图21为实验例7中免疫组化检测免疫多肽及自组装纳米药物治疗的肿瘤组织中CD4⁺T细胞分布图；

图22为实验例7中免疫组化检测免疫多肽及自组装纳米药物治疗的肿瘤组织中CD4⁺T细胞统计图。

具体实施方式

本发明提供了一种免疫多肽，由封端基团和短肽连接得到，所述短肽为GFFY、G^DF^DF^DY和^DPPA-1中的一种或多种。

在本发明中，所述封端基团为indoximod或D-色氨酸。

在本发明中，所述免疫多肽由indoximod和GFFY连接得到时的结构式为：

在本发明中，所述免疫多肽由indoximod和G^DF^DF^DY连接得到时的结构式为：

在本发明中，所述免疫多肽由indoximod、G^DF^DF^DY和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

在本发明中，所述免疫多肽由D-色氨酸、G^DF^DF^DY和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

在本发明中，所述免疫多肽由indoximod和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

在本发明中，所述免疫多肽是由D构型的氨基酸序列构成。

在本发明中，所述封端基团indoximod为IDO1抑制剂。

在本发明中，所述免疫多肽的链接方法优选为Fmoc-短肽固相合成法。

在本发明中，所述免疫多肽可以自组装形成纳米结构。

本发明还提供了所述的免疫多肽在制备肿瘤免疫药物中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明实施例中涉及的制剂的来源如下：

2-Cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司，活性1.1mmol/mL；

氨基酸购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；

N，N-二异丙基乙胺(DIEPA)，购自阿达玛斯公司(Adamas)，纯度99％；

苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(以下用HBTU表示)，购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；

三氟乙酸(TFA)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；

三异丙基硅烷(TIS)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；

无水二氯甲烷(DCM)，购自天津化学试剂公司；

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津化学试剂公司；

甲醇，天津康科德科技公司；

哌啶，天津化学试剂公司；

氨基酸，购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；

细胞培养基，赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，无菌；

胎牛血清，赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，无菌；

ELISAKit购自北京达科为生物技术有限公司；

Balb/c小鼠，6周龄，雌性，购自维通利华生物科技有限公司。

在本发明实施例中涉及的设备为：

高效液相色谱仪为德国Lumtech，HPLC；

高效液相色谱质谱联用仪为日本岛津，型号为LC-MS 2020；

电子天平为德国arturious，型号为BS124S；

透射电子显微镜为Tecnai G2 F20系统；

冷冻干燥机为北京亚泰科隆，型号为LGJ-1-50；

激光共聚焦显微镜为日本OLYMPUS，型号为FV1000S-IX81或德国Leica，型号为TCSSP8；

液质联用仪为美国安捷伦，Agilent 6520Q-TOF LC/MS)。

实施例1多肽indoximod-GFFY的合成

采用Fmoc-短肽固相合成方法合成。具体步骤为：

1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烷(DCM)，放置在摇床上摇晃10min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；

2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；

3)将0.5mmol Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Tyr(tbu)-OH)溶解在10mL的无水DCM里，加入1mmol的DIEPA，然后转移到上述固相合成器中，在室温下反应1h；

4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗涤5次，加入配好的体积比为无水DCM：DIEPA：甲醇为17：1：2的溶液20mL，在室温下反应20min；

5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10mL，洗涤时间1min，共洗涤5次，再用DMF洗涤，每次DMF用量10mL，洗涤时间1min，共洗涤5次，加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应25min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗涤5次，进行下一步反应；

6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Phe-OH)1mmol、HBTU 1.5mmol、DIEPA 2mmol和10mL DMF，把溶解好的氨基酸溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；

7)重复步骤5)和6)的方法依次加入氨基酸和封端基团indoximod；然后用DMF洗涤5遍，二氯甲烷洗5遍，进行下一步反应；

8)将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H₂O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应0.5h，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，制得本实施例1的多肽。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例1得到的多肽，结果见图1，所述本实施例1多肽的结构式为

所述步骤8)中“将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H₂O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应0.5h”的步骤也可以通过将TFA与DCM的按照体积比1：99配制成TFA体积百分比浓度为1％的TFA溶液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为1min的操作来完成。

实施例2多肽indoximod-G^DF^DF^DY的合成

按照实施例1的Fmoc-短肽固相合成方法合成。得到多肽indoximod-G^DF^DF^DY。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例2得到的多肽，结果见图2，结构式为

实施例3多肽indoximod-G^DF^DF^DY-^DN^DY^DS^DK^DP^DT^DD^DR^DQ^DY^DH^DF的合成

按照实施例1的Fmoc-短肽固相合成方法合成。因特异性与癌细胞表面PD-L1蛋白结合的^DPPA-1序列为^DN^DY^DS^DK^DP^DT^DD^DR^DQ^DY^DH^DF，故将本申请的多肽简称为indoximod-G^DF^DF^DY-^DPPA-1。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例3得到的多肽，结果见图3，所述本实施例3多肽的结构式为

实施例4多肽^DW-G^DF^DF^DY-^DN^DY^DS^DK^DP^DT^DD^DR^DQ^DY^DH^DF的合成

按照实施例1的Fmoc-短肽固相合成方法合成。得到的多肽简称^DW-G^DF^DF^DY-^DPPA-1。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例4得到的多肽，结果见图4，所述本实施例4多肽的结构式为

实施例5多肽indoximod-^DN^DY^DS^DK^DP^DT^DD^DR^DQ^DY^DH^DF的合成

按照实施例1的Fmoc-短肽固相合成方法合成。得到的多肽简称indoximod-^DPPA-1。通过高效液相色谱质谱联用仪检测本实施例5得到的多肽，结果见图5，所述本实施例5多肽的结构式为

对比例1

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L得到PBS溶液。用高压灭菌锅灭菌后，保存于25℃或4℃冰箱中。

对比例2

称取1mg indoximod置于1.5mL的玻璃瓶中，加入1mL PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，超声助溶，得到无色透明的indoximod溶液。

对比例3多肽^DN^DY^DS^DK^DP^DT^DD^DR^DQ^DY^DH^DF的合成

按照实施例1提供的Fmoc-固相合成方法制备得到本对比例1多肽，简称^DPPA-1。本对比例的多肽较实施例1的多肽同时缺少了IDOI抑制剂indoximod和具有成胶和佐剂功能的4个氨基酸序列。通过高效液相色谱质谱联用仪检测^DPPA-1多肽，结果见图6，所述本对比例3多肽的结构式为

实验例1透射电镜实验

称取实施例1、2、制备得到的多肽5mg，加入1×PBS(pH＝7.4)溶液1mL，少量多次加入1M碳酸钠溶液调节pH值，酒精灯上加热使其完全溶解(终pH＝7.4)，待溶液微沸时停止加热放置在室温条件下冷却过夜。称取实施例3、4制备得到的多肽5mg，加入1ml超纯水，加热使其完全溶解，1M碳酸钠调节pH至6，加热至微沸时停止加热，室温冷却过夜。过夜稳定后得到多肽自组装纳米材料。用透射电镜观察上述多肽生物活性溶液的微观形貌，结果如图7～10所示。

图7和8表明indoximod-GFFY、indoximod-G^DF^DF^DY通过加热冷却可以自组装成多肽纳米纤维。不同的是，前者自组装成为直径约110nm的带状原纤维，而后者则形成更细的纳米纤维。indoximod-G^DF^DF^DY-^DPPA-1和^DW-G^DF^DF^DY-^DPPA-1的自组装微观形貌如图9和10所示，为大小不均匀的纳米颗粒状聚集体结构。以上结果也可说明，多肽的序列直接影响多肽分子的自组装形态，从而使其表现出不同的生物活性，行使不同的生物功能。

实验例2基于细胞的IDO分析

按照5×10³个细胞/孔的密度将小鼠乳腺癌细胞4T1接种在96孔板上，待细胞过夜贴壁后，更换200μL含有IFN-γ(50ng/mL)和不同浓度梯度的多肽药物的培养基，多肽药物分别为实施例3的多肽自组装纳米药物、实施例5的多肽和对比例2。二氧化碳培养箱中孵育48小时后，将孔板离心取150μL的上清转移至新的96孔板中，加入75μL 30％的三氯乙酸混匀后置于50℃恒温箱孵育30分钟，该过程允许从N-甲酰基kynurenien转化为犬尿氨酸。孵育完毕后离心96孔板，并再一次将上清液转移至新的孔板，加入等体积的Ehrlich试剂，充分混合并在室温下温育10分钟，使用酶标仪测量490nm的OD值。结果如图11所示，

从图11可以看出来，实施例3多肽自组装超分子纳米药物、实施例5多肽和对比例2都以浓度依赖性方式抑制犬尿氨酸产生的能力。其中，实施例3多肽自组装超分子纳米药物是最活跃的一种。在浓度为200μM时，其犬尿氨酸抑制率达到

而对比例1和实施例5所述多肽的相应抑制率分别为22.64％和33.67％。

实验例3蛋白结合实验

使用NT-647-NHS染料标记蛋白。使用Monolith NT.115TM蛋白标记试剂盒，该染料可与蛋白质的伯胺有效反应，形成高度稳定的蛋白质-染料偶联物。具体步骤为，将5μL溶剂为DMSO的“Dye NT-647NHS”添加到95μL PBS中，然后将其与100μL 9μM PD-L1(缓冲液：1×PBS pH 7.4，Tween-20(0.05％))混合均匀，然后将该混合物在黑暗中放置反应30分钟。多余的染料通过已经平衡的分子筛完全洗掉，并补加定量缓冲液使溶液在重力作用下流出后收集荧光标记的蛋白分子。为测试准备了不同浓度梯度的实施例3所述多肽的自组装纳米药物、实施例4中多肽的组装体、实施例5所述多肽以及对比例3所述多肽。将不同浓度梯度的多肽或组装体与等体积的已标记的PD-L1蛋白在室温下孵育5分钟，毛细管吸取溶液。最后，数据收集和最终分析在微热量泳动仪(Monolith NT.115)进行，结果如图12所示。

从图12可以看出，不同多肽以及多肽组装体对PD-L1蛋白具有不同的结合常数，其中实施例3制备的多肽的自组装纳米药物与PD-L1蛋白的结合能力最强，其K_D值为103.97μM，而对比例3的K_D值为422.94μM。实施例3制备多肽的自组装纳米药物提高了与PD-L1蛋白的亲和力近4倍，这与阻断癌细胞的免疫逃逸密切相关，具有成为PD1/PD-L1抑制剂的潜力。

实验例4动物肿瘤模型

使用小鼠乳腺癌细胞4T1构建小鼠乳腺癌皮下荷瘤模型，所使用小鼠为Balb/c雌性小白鼠(6～8周，16g～19g)。待小鼠肿瘤大小到100mm³时，进行随机分组，实验按照制备实施例3、4、5所合成的多肽的组装体和对比例1、2、3依次分组，每组至少5只鼠。肿瘤体积计算公式：长×宽²/2。采用尾静脉注射的方式给药，给药浓度按照^DPPA-1序列10mg/kg，分别在第0、3、6天给药一次，共给药三次，监控各组小鼠的肿瘤生长趋势和小鼠的体重变化，如图13所示。

从图13可以看出，在肿瘤生长初期，只有对比例1组中小鼠肿瘤体积以较快速度增长，而经过实施例3、4组装体纳米药物治疗的小鼠肿瘤体积增长缓慢。到检测后期时，对比例1组小鼠肿瘤体积呈指数变大，而经过对比例2、3、实施5多肽和实施例3、4多肽的组装体药物治疗的小鼠，肿瘤的增长都受到了不同程度的抑制，尤其是经过实施例3制备的多肽自组装超分子纳米药物治疗的小鼠，其肿瘤体积增长最缓慢。在治疗期结束时对肿瘤的抑制率高达80.79％，该抑制率分别是实施例4所述多肽组装体的1.27倍；是实施例5所述多肽的1.75倍；是对比例3治疗组的2.21倍；是对比例3组的2.21倍，是对比例1组的3.43倍。这充分展示了由实施例3所述多肽制备得到的集IDO抑制剂、PD1/PD-L1阻断剂和免疫系统激活并增强的三种功能于一体的超分子纳米药物在肿瘤微环境中，三方面并行发挥作用从而取得的显著的肿瘤免疫治疗效果。该结果充分表明所述多功能多肽在肿瘤免疫治理药物制备中的应用和巨大潜力。

实验例5 ELISA测定细胞因子实验

超净台中使用高压灭菌过的手术器械提取6～8周的Balb/c雌性小白鼠的脾组织，研磨得到脾细胞悬液。使用红细胞裂解液裂解细胞悬液中的红细胞后将脾细胞按照5×10⁶个细胞/孔的密度接种到24孔板中。在细胞培养基中加入相同浓度(150μM)的实施例3、4、5所述多肽的组装体以及对比例1。细胞培养箱中培养48小时后，收集细胞培养基上清，并使用ELISA试剂盒测定不同纳米药物刺激的脾细胞细胞培养基上清中细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12和IL-6的含量，结果如图14～17所示。

从图14～17可以看出，自组装纳米药物即实施例3、4所述多肽经加热冷却得到的组装体可以刺激免疫细胞分泌免疫相关细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12和IL-6，尤其是实施例3所述多肽的自组装超分子纳米药物可以显著提高免疫细胞分泌肿瘤免疫相关细胞因子的能力。缺少G^DF^DF^DY片段的实施例5所述多肽在上调细胞因子方面作用不明显，这说明凝胶因子序列G^DF^DF^DY的重要性。自组装多肽片段的存在可以刺激机体免疫系统分泌更多免疫相关的细胞因子，从而发挥更优异的肿瘤免疫治疗效果。

实验例6活体成像实验

使用小鼠乳腺癌细胞4T1构建小鼠乳腺癌皮下荷瘤模型，所使用小鼠为Balb/c雌性小白鼠(6～8周，16g～19g)。对实施例3和对比例3所述多肽进行荧光标记，所使用的荧光染料为Cy5.5 NHS ester。标记后的多肽采用尾静脉注射的方式进行给药，给药标准为每只小鼠0.15mg Cy5.5，给药一次。分别在给药后第0、12、24、48和72小时时使用小动物活体成像系统检测荧光标记的多肽在小鼠体内的分布情况，荧光的分布结果如图18所示。

从图18可以看出，荧光标记的实施例3和对比例3所述多肽在尾静脉注射后通过血液循环快速到达全身，即在给药0小时时荧光呈全身分布的特点。对比例3所述多肽序列^DPPA-1可以与肿瘤表面的PD-L1特异性结合，实施例3所述多肽包含靶向序列。因此随着给药时间的延长，荧光标记多肽的分布也随之变化，主要表现为肿瘤的靶向性。在给药12小时后，两条荧光标记的多肽均可以靶向肿瘤部位，小鼠身体其他部位的荧光减少或消失。随着给药时间的延长，肿瘤部位的荧光呈现衰减趋势，其中实施例3所述多肽的荧光衰减更慢。当给药后长达72小时，实施例3所述多肽在肿瘤部位仍然保留了较强的荧光信号，对比之下对比例3在肿瘤部位的荧光强度则较小。这充分展示了实施例3所述多肽的具有较强的肿瘤靶向性以及较好的肿瘤保留能力。实施例3的肿瘤靶向能力可以同时将IDO1抑制剂indoximod、PD1/PD-L1阻断剂输送到肿瘤部位发挥作用，同时较强的肿瘤保留能力可以使药物在肿瘤微环境中持续发挥作用，从而发挥最好的肿瘤免疫治疗能力。

实验例7免疫组化实验

将经过不同药物治疗的小鼠肿瘤进行石蜡包埋后切片。免疫组化实验被用来分析经过不同药物治疗后的肿瘤部位细胞毒性T细胞、调节性T细胞和穿孔素的浸润和含量。实验步骤按照SP试剂盒(SP-9001)提供进行，简要步骤如下：首先将载玻片脱蜡并用PBS洗涤5次；在3％甲醇-过氧化氢中孵育5-10分钟用PBS洗涤5次；然后在95℃的1mM柠檬酸钠溶液中浸泡20分钟，冷却至室温；将样品用PBS漂洗5次，在4℃条件下一抗孵育过夜或超过12小时；回收抗体，将组织切片用PBS洗涤5次，加二抗，在室温下孵育10-15分钟；再次用PBS冲洗样品，用DAB进行显影，显色后即用蒸馏水进行洗涤5次；使用苏木素对细胞核进行染色；最后，封片干燥后使用显微镜拍照并进行统计分析。光学与数据统计结果如图19～22所示。

从图19～22中可以看到，在所有被测药物中，实施例3制备的多功能多肽自组装超分子纳米药物发挥最大作用，其次依次是实施例4所述多肽组装体、实施例5所述多肽、对比例3所述多肽和对比例2、1。经过实施例3制备的多功能多肽自组装超分子纳米药物治疗小鼠，肿瘤部位CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的数量明显多于其他组，这是肿瘤免疫治疗中重要的指标，肿瘤浸润的细胞毒性T细胞增多，被杀伤的癌细胞数量就会随之增多，肿瘤生长被抑制的程度越深。调节性T细胞会抑制T细胞发挥作用，很显然我们看到了相反的趋势。由于调节性T细胞的减少可以减轻对CD8⁺和CD4⁺T细胞增殖和分化的相应抑制作用，并能够增加CTL来杀死肿瘤，因此这里的变化对于最终治疗结果是有益的。此外，我们也同时检测了肿瘤组织中穿孔素的局部表达，其中穿孔素的表达上升反映了释放穿孔素的CTL杀死肿瘤细胞的活性。发现实施例3制备的多肽的组装体具有比其他组更高的在肿瘤组织中提高穿孔素表达的能力。总的来说，所有这些变化都表明，本申请的超分子通过三部分并行发挥作用所诱导的强大的免疫反应为肿瘤的免疫治疗做出了重要贡献。

由以上实验例可知，本发明所提供的多肽，在加热冷却形成超分子纳米药物之后能够同时逆转IDO1途径因消耗过量色氨酸、产生大量犬尿氨酸等代谢产物所导致的免疫抑制；特异性的与癌细胞表面的PD-L1受体结合从而阻断PD1/PD-L1相互作用导致的癌细胞的免疫逃逸行为；激活并增强免疫系统的免疫反应。三部分并行发挥作用，分别表现为犬尿氨酸的抑制率达到约46.07％；将PD1/PD-L1的D-肽拮抗剂^DPPA-1与PD-L1蛋白的结合能力提高约4倍；自组装序列上调免疫相关细胞因子IFN-γ,IL-6,IL-12和TNF-α的表达量；同时上调了CD8⁺T细胞含量，增加细胞毒性T细胞穿孔素的分泌并降低了调节性T细胞的产生，综合上述多个方面，在小鼠的肿瘤实验中显著抑制了肿瘤的生长速度，阻止了肺转移性乳腺癌细胞的肺转移。因此本发明提供的多功能多肽自组装超分子纳米药物可以通过IDO1抑制剂、PD1/PD-L1阻断剂和免疫系统激活增强剂三部分并行发挥作用来解除机体的免疫抑制，阻止肿瘤细胞的免疫逃逸并增强免疫系统对癌细胞的免疫反应，识别并大量杀伤癌细胞从而取得较好的癌症免疫治疗效果。

由以上实施例可知，本发明提供了一种免疫多肽及其应用，由封端基团和短肽连接得到，所述短肽为GFFY、G^DF^DF^DY和^DPPA-1中的一种或多种。该免疫多肽可自组装形成超分子纳米药物。所述超分子纳米药物进入肿瘤微环境后可以同时逆转IDO途径因消耗过量色氨酸和犬尿氨酸等代谢产物积累所介导的免疫抑制作用；可以特异性的与癌细胞表面的PD-L1结合阻断肿瘤细胞免疫逃逸；同时激活并增强机体免疫反应，三个部分并行发挥作用，使机体针对肿瘤产生强烈免疫反应从而在癌症的免疫治疗中达到最佳效果，为开发多功能肿瘤免疫治疗纳米药物提供了新思路。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种免疫多肽，其特征在于，由封端基团和短肽连接得到，所述短肽为GFFY、G^DF^DF^DY和^DPPA-1中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的免疫多肽，其特征在于，所述封端基团为indoximod或D-色氨酸。

3.根据权利要求2所述的免疫多肽，其特征在于，所述免疫多肽由indoximod和GFFY连接得到时的结构式为：

4.根据权利要求2所述的免疫多肽，其特征在于，所述免疫多肽由indoximod和G^DF^DF^DY连接得到时的结构式为：

5.根据权利要求2所述的免疫多肽，其特征在于，所述免疫多肽由indoximod、G^DF^DF^DY和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

6.根据权利要求2所述的免疫多肽，其特征在于，所述免疫多肽由D-色氨酸、G^DF^DF^DY和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

7.根据权利要求2所述的免疫多肽，其特征在于，所述免疫多肽由indoximod和^DPPA-1连接得到时的结构式为：

8.权利要求1～7任意一项所述的免疫多肽在制备肿瘤免疫药物中的应用。

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