BR112019019658A2

BR112019019658A2 - conjugados, composições farmacêuticas, método para tratar uma indicação ocular e método para produzir um conjugado de fármaco de hidrogel

Info

Publication number: BR112019019658A2
Application number: BR112019019658A
Authority: BR
Inventors: Laufer Burkhardt; Vivian Lee Chingwei; Bumbaca Yadav Daniela; Fuh Germaine; Rau Harald; Bisek Nicola; KOENIG Patrick; Weisbrod Samuel; Stark Sebastian; Knappe Thomas; Voigt Tobias
Original assignee: Ascendis Pharma As; Genentech Inc
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2018-03-22
Publication date: 2020-04-22
Also published as: EP3600441A1; RU2019133326A3; CN110891611B; US11642415B2; SG10202107829YA; JP7216006B2; SG11201908547VA; AU2018240375B2; AU2018240375C1; CA3055985A1; JP2023058511A; AU2018240375A2; IL269506B1; WO2018175788A1; ZA201905930B; RU2019133326A; US20200222547A1; AR111190A1; JP2020515545A; KR20200007776A

Abstract

a presente invenção refere-se a composições de pró-fármacos de hidrogel compreendendo ácido hialurônico reticulado (ha), ou um derivado ou um sal do mesmo, em que o sistema de reticulação compreende um espaçador biodegradável, em que o ha reticulado compreende um fármaco-ligante conjugado, e em que o ligante é capaz de liberar o fármaco em condições fisiológicas. a presente invenção refere-se ainda a métodos para preparar as composições de pró-fármacos de hidrogel. a presente invenção refere-se ainda a métodos para o tratamento de uma condição ocular utilizando as composições de hidrogel.

Description

“CONJUGADOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, MÉTODO PARA TRATAR UMA INDICAÇÃO OCULAR E MÉTODO PARA PRODUZIR UM CONJUGADO DE FÁRMACO DE HIDROGEL” Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica prioridade para o pedido provisório US 62/475.094 depositado em 22 de março de 2017, cuja divulgação é incorporada aqui por referência.

Listagem de Sequências [002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada via EFS-Web e é incorporada por referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 21 de março de 2018, é denominada P34128_WO_Sequence Listing.txt e tem 38.048 bytes de tamanho.

Campo da Invenção [003] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas, métodos de preparação relacionados e métodos para uso das composições farmacêuticas para o tratamento de uma ou mais condições oculares.

Antecedentes da Invenção [004] Uma das principais causas de cegueira é a incapacidade de tratar suficientemente certas doenças oculares. Uma limitação importante é a falta de opções adequadas para introduzir fármacos ou agentes terapêuticos no olho e manter esses fármacos ou agentes em uma concentração terapeuticamente eficaz no mesmo durante a duração necessária. A administração sistêmica pode não ser uma solução ideal porque, frequentemente, são necessários níveis inaceitavelmente altos de dosagem sistêmica para atingir concentrações intra-oculares eficazes, com o aumento da incidência de efeitos colaterais inaceitáveis dos fármacos. A simples instilação ou aplicação ocular não é uma alternativa aceitável em muitos casos, porque o

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2/254 fármaco pode ser rapidamente lavado por ação lacrimal ou é exaurido de dentro do olho para a circulação geral. A terapia tópica de colírios é limitada por má absorção, necessidade de dosagens frequentes e/ ou crônicas por períodos de dias a anos, mudança rápida de humor aquoso, produção e movimento do filme lacrimal e outras causas, que podem remover efetivamente os agentes terapêuticos por muito tempo antes da conclusão da terapia ou da administração da dose adequada.

[005] As injeções intra-oculares têm a vantagem de poder fornecer biodisponibilidade aprimorada para um local alvo (por exemplo, a retina) do olho em relação a outros mecanismos de administração, tal como administração tópica. No entanto, eles também têm desvantagens e podem apresentar várias complicações diferentes. Por exemplo, injeções intravítreas podem resultar na administração de concentrações indesejavelmente altas de agente terapêutico em um local alvo ou em outro local, particularmente quando o agente terapêutico é relativamente solúvel. Além disso, as injeções intraoculares são altamente desagradáveis para o paciente. Além disso, como a própria injeção intraocular pode causar complicações, tais como endoftalmite e descolamento de retina, é altamente desejável ter a maior duração possível entre as injeções, mantendo, ao mesmo tempo, os níveis terapêuticos do fármaco no olho.

[006] Além do exposto, os agentes terapêuticos administrados por injeções intravítreas podem não ter duração de ação, uma vez que os agentes podem, frequentemente, se dispersar rapidamente no interior do olho após a injeção. Essa falta de duração é particularmente indesejável, pois pode exigir maior frequência de injeção. Ranibizumabe e pegaptanib, por exemplo, são administrados a um paciente por injeção intraocular a cada 4 e 6 semanas, respectivamente, o que é uma experiência altamente desagradável para o paciente.

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3/254 [007] Assim, existe um amplo reconhecimento de que o campo da oftalmologia se beneficiaria de formulações mais duradouras. Elas beneficiariam o atendimento ao paciente e a saúde ocular, fornecendo a entrega prolongada de agentes terapêuticos aos olhos, enquanto minimiza os problemas associados à adequação do paciente aos regimes médicos terapêuticos prescritos.

[008] A expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uma proteína sinalizadora produzida por células que estimula a vasculogênese e a angiogênese, desempenha um papel importante em várias condições oculares, tal como em certas formas de degeneração macular e retinopatias.

[009] Existem vários medicamentos para tratar essas condições oculares no mercado, tais como ranibizumabe, aflibercept e pegaptanib. A aplicação ao paciente ocorre através de injeções intra-oculares a cada 4 e 8 semanas.

[010] Em vista do acima exposto, existe a necessidade de proporcionar uma forma de administração que supere essas desvantagens pelo menos parcialmente.

Descrição Resumida da Invenção [011] A invenção fornece conjugados de fármaco de ácido hialurônico (HA) reticulado, composições farmacêuticas e métodos de utilização de tais conjugados para o tratamento de indicações oculares e métodos de produção dos conjugados.

[012] Em certas formas de realização, a invenção fornece um conjugado de fármaco de HA reticulado compreendendo uma pluralidade de polímeros de ácido hialurônico 2A e uma pluralidade de polímeros de ácido hialurônico 2B, em que:

cada 2A compreende uma pluralidade de unidades conectadas

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4/254 linearmente, as unidades consistindo essencialmente em:

cada 2B compreende uma pluralidade de unidades conectadas linearmente, as unidades consistindo essencialmente em:

em que uma linha tracejada não marcada indica um ponto de ligação a uma unidade adjacente em uma linha tracejada marcada com # ou a um hidrogênio, uma linha tracejada marcada com # indica um ponto de ligação a uma unidade adjacente em uma linha tracejada não marcada ou a uma hidroxila; e uma linha tracejada marcada com * indica um ponto de ligação de reticulação entre uma unidade Z³ de 2A e uma unidade Z⁴ de 2B, de modo que pelo menos um 2A seja reticulado a pelo menos um 2B;

o Fármaco é um agente terapêutico;

Ra¹ e Ra² são, cada um, independentemente, hidrogênio, alquila C1-4, um íon de metal alcalino, um íon de amônio, um íon de metal alcalino

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5/254 terroso, ou outro contra-íon adequado;

L² é um ligante de pró-fármaco reversível;

L⁴ é um espaçador opcionalmente biodegradável e pode ser igual ou diferente em Z² e Z⁴;

2A compreende um total de unidades s, em que s é de 25 a 2500, em que;

o número de unidades Z¹ em 2A é de cerca de 0,8s a cerca de 0,99s, e o número de unidades Z³ é de cerca de 0,2s a cerca de 0,01 s;

2B compreendendo um total de unidades t, em que t é de 25 a 2500, em que;

o número de unidades Z¹ em 2B é de cerca de 0,75t a cerca de 0,94t;

o número combinado de unidades Z² e Z⁴ é de cerca de 0,25t a cerca de 0,06t;

o número de unidades Z² é de pelo menos 0,011; e o número de unidades Z⁴ é de pelo menos 0,011.

[013] Em certas formas de realização, s é de 50 a 2000.

[014] Em certas formas de realização, s é de 75 a 1500.

[015] Em certas formas de realização, s é de 75 a 1000.

[016] Em certas formas de realização, s é de 80 a 500.

[017] Em certas formas de realização, s é de 100 a 250.

[018] Em certas formas de realização, s é de 100 a 200.

[019] Em certas formas de realização, s é de 200 a 800 ou de 300 a 600.

[020] Em certas formas de realização, t é de 50 a 2000.

[021] Em certas formas de realização, t é de 75 a 1500.

[022] Em certas formas de realização, t é de 75 a 1000.

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6/254 [023] Em certas formas de realização, t é de 80 a 500.

[024] Em certas formas de realização, t é de 100 a 250.

[025] Em certas formas de realização, t é de 100 a 200.

[026] Em certas formas de realização, t é de 200 a 800 ou de 300 a 600.

[027] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,91s a cerca de 0,98s.

[028] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,8s a cerca de 0,99s.

[029] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,82s a cerca de 0,99s.

[030] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,84s a cerca de 0,99s.

[031] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,86s a cerca de 0,99s.

[032] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,88s a cerca de 0,99s.

[033] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,9s a cerca de 0,99s. Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹ em 2A é de cerca de 0,92s a cerca de 0,97s.

[034] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,93s a cerca de 0,96s.

[035] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2A é de cerca de 0,94s a cerca de 0,95s.

[036] Em certas formas de realização, o número de unidades Z³em 2A é de cerca de 0,2s a cerca de 0,01s.

[037] Em certas formas de realização, o número de unidades Z³em 2A é de cerca de 0,18s a cerca de 0,01 s.

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7/254 [038] Em certas formas de realização, o número de unidades Z³ em 2A é de cerca de 0,16s a cerca de 0,01 s.

[039] Em certas formas de realização, o número de unidades Z³ em 2A é de cerca de 0,14s a cerca de 0,01 s. Em certas formas de realização, o número de unidades Z³ em 2A é de cerca de 0,12s a cerca de 0,01 s.

[040]

Em certas formas de realização, o número de unidades Z³ em 2A é de cerca de 0,10s a cerca de 0,01 s.

[041] Em certas formas de realização, número de unidades Z³ é de cerca de 0,09s a cerca de 0,02s.

[042]

Em certas formas de realização, o número de unidades Z³ é de cerca de 0,08s a cerca de 0,03s.

[043] Em certas formas de realização, o número de unidades Z³é de cerca de 0,07s a cerca de 0,04s.

[044] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2B é de cerca de 0,88s a cerca de 0,92s.

[045] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2B é de cerca de 0,86s a cerca de 0,94s.

[046] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹em 2B é de cerca de 0,89s a cerca de 0,91 s.

[047] Em certas formas de realização, o número de unidades Z¹ em 2B é de cerca de 0,86s a cerca de 0,94s.

[048] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ em 2B é de cerca de 0,25t a cerca de 0,05t.

[049] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ em 2B é de cerca de 0,23t a cerca de 0,05t.

[050] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ em 2B é de cerca de 0,211 a cerca de 0,05t.

[051] Em certas formas de realização, o número combinado de

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8/254 unidades Z² e Z⁴ em 2B é de cerca de 0,19t a cerca de 0,05t.

[052] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ em 2B é de cerca de 0,17t a cerca de 0,05t.

[053] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ em 2B é de cerca de 0,15t a cerca de 0,05t.

[054] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ em 2B é de cerca de 0,13t a cerca de 0,05t.

[055] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ é de cerca de 0,12t a cerca de 0,06t.

[056] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ é de cerca de 0,11t a cerca de 0,07t.

[057] Em certas formas de realização, o número combinado de unidades Z² e Z⁴ é de cerca de 0,25t a cerca de 0,06t.

[058] Em certas formas de realização, o número de unidades Z²éde 0,02ta0,12t.

[059] Em certas formas de realização, o número de unidades Z²é de 0,04t a 0,1 Ot.

[060] Em certas formas de realização, o número de unidades Z²é de 0,06t a 0,08t.

[061] Em certas formas de realização, o número de unidades Z²é de 0,07t a 0,08t.

[062] Em certas formas de realização, o número de unidades Z²é de 0,075t a 0,08t.

[063] Em certas formas de realização, o número de unidades Z²é 0,077t.

[064] Em certas formas de realização, o número de unidades Z⁴éde 0,01ta 0,12t.

[065] Em certas formas de realização, o número de unidades Z⁴

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9/254 éde 0,02ta0,12t.

[066] Em certas formas de realização, o número de unidades Z⁴é de 0,04t a 0,1 Ot.

[067] Em certas formas de realização, o número de unidades Z⁴é de 0,06t a 0,08t.

[068] Em certas formas de realização, o número de unidades Z⁴é de 0,011 a 0,04t.

[069] Em certas formas de realização, o número de unidades Z⁴é de 0,02t a 0,03t.

[070] Em certas formas de realização, o número de unidades Z⁴é de 0,02t a 0,025t.

[071] Em certas formas de realização, o número de unidades Z⁴é 0,0231 [072] Em certas formas de realização, o ligante de pró-fármaco reversível L² que acopla o fármaco ao espaçador L⁴ é de fórmula XIIa

em que:

a linha tracejada indica a ligação a um nitrogênio de um composto de fármaco (não mostrado) através da formação de uma ligação am ida;

-X- é -C(R⁴R^4a)-, -N(R⁴)-, -O-, -C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a)-, -C(R⁵R^5a)C(R⁴R^4a)-, -C(R⁴R^4a)-N(R⁶)-, -N(R⁶)-C(R⁴R^4a)-, -C(R⁴R^4a)-O-, -O-C(R⁴R^4a)-, ou -C(R⁷R^7a)-;

X¹ é C, ou S(O);

-X²- é -C(R⁸R^8a)-, ou -C(R⁸R^8a)-C(R⁹R^9a)-;

=X³ é =0, =S, ou =N-CN;

-R¹, -R^1a, -R², -R^2a, -R⁴, -R^4a, -R⁵, -R^5a, -R⁶, -R⁸, -R^8a, -R⁹, -R^9a são

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10/254 selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em -H, e alquila C1-6;

-R³, -R^3a são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em -H, e alquila C1-6, desde que no caso de um de -R³, -R^3a ou ambos serem diferentes de -H, eles estão conectados ao N ao qual estão ligados através de um átomo de carbono hibridizado em SP³;

-R⁷ é -N(R¹⁰R^10a), ou -NR¹⁰-(C=O)-R¹¹;

-R^7a, -R¹⁰, -R^10a, -R¹¹ são, independentemente um do outro, -H ou alquila C1-10;

opcionalmente, um	ou	mais	dos
pares -R^1a/-R^4a, -R^1a/-R^5a, -R^1a/-R^7a, -R^4a/-R^5a,	-R^8a/-R^9a	formam uma	ligação
química;
opcionalmente, um	ou	mais	dos
pares -R¹/-R^1a, -R²/-R^2a, -R⁴/-R^4a, -R⁵/-R^5a,	-R⁸/-R^8a,	-R⁹/-R^9a são	unidos

juntamente com o átomo ao qual estão ligados para formar uma cicloalquila C310 ou heterociclila de 3 a 10 membros;

opcionalmente, um ou mais dos pares -R¹/-R⁴, -R¹/-R⁵, -R¹/-R⁶, -R¹/-R^7a, -R⁴/-R⁵, -R⁴/-R⁶, -R⁸/-R⁹, -R²/-R³ são unidos juntamente com os átomos aos quais estão ligados para formar um anel A;

opcionalmente, R³/R^3a são unidos juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um heterociclo de 3 a 10 membros;

o anel A é selecionado a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 3 a 10 membros, e heterobiciclila de 8 a 11 membros; e em que o grupo de fórmula Xlla é substituído com -L⁴, desde que o hidrogênio marcado com o asterisco na fórmula (Xlla) não seja substituído

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11/254 por -L⁴ ou outro substituinte;

em que -L⁴- é uma ligação química simples ou uma porção espaçadora, conforme aqui definido.

[073] Em certas formas de realização, o ligante de pró-fármaco reversível L² é da fórmula Vila:

em que:

cada asterisco representa um sítio independente de ligação ao espaçador l_4.

[074] Em certas formas de realização, o ligante de pró-fármaco reversível L², juntamente com o espaçador L⁴, é da fórmula Vllc:

em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação ao átomo de nitrogênio do fármaco; e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z² do ácido hialurônico 2B.

[075] Em certas formas de realização, o espaçador L⁴ que conecta o polímero de ácido hialurônico 2A ao polímero de ácido hialurônico 2B (conectando a unidade Z³ do polímero 2A à unidade Z⁴ do polímero 2B) é da fórmula:

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12/254 ο

em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação a uma unidade Z³ no polímero de ácido hialurônico 2A; e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z⁴ no polímero de ácido hialurônico 2B.

[076] O espaçador L⁴ que conecta o polímero de ácido hialurônico 2A ao polímero de ácido hialurônico 2B pode, em certas formas de realização, ser invertido em orientação de modo que a linha ondulada mais à direita da fórmula acima represente o ponto de ligação a uma unidade Z⁴ no polímero de ácido hialurônico 2B; e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z³ no polímero de ácido hialurônico 2A.

[077] Em certas formas de realização, o espaçador l_4 que une o ligante de pró-fármaco reversível L² ao polímero de ácido hialurônico 2B é da fórmula:

o

o em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação ao L²; e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z² no polímero de ácido hialurônico 2B;

em que:

L¹ é um espaçador; e

L³ é um espaçador biodegradável.

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13/254 [078]

Em certas formas de realização, a unidade Z⁴ é

HN

em que L¹, L³ e Ra² são como aqui definidos.

[079] Em certas formas de realização, a unidade Z² é

em que L¹, L², L³ e Ra² são como aqui definidos.

[080] Em certas formas de realização, o espaçador l_4 que conecta o polímero de ácido hialurônico 2A ao polímero de ácido hialurônico 2B é da fórmula:

em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação a uma unidade Z³ no polímero de ácido hialurônico 2B; e

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14/254 a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z⁴ no polímero de ácido hialurônico 2A;

L^A é um espaçador;

L^B é um espaçador; e

L^c é um espaçador biodegradável.

[081] Em certas formas de realização, o espaçador L⁴ que conecta o polímero de ácido hialurônico 2A ao polímero de ácido hialurônico 2B é da fórmula:

em que:

[082] Em certas formas de realização, o espaçador L⁴ que une o ligante de pró-fármaco reversível L² ao polímero de ácido hialurônico 2A é da fórmula

em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação a L²;

e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z² no polímero de ácido hialurônico 2B;

em que:

L^A é um espaçador;

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15/254

L^B é um espaçador; e

L^c é um espaçador biodegradável.

[083] Em certas formas de realização, L^A é alquileno C1-10 opcionalmente substituído e/ ou opcionalmente interrompido.

[084] Em certas formas de realização, L^A é alquileno C2-4 linear.

[085] Em certas formas de realização, L^B é -(O)-alquileno C1-5 linear.

[086] Em certas formas de realização, L^c é:

em que m é de 0 a 10, n é de 1 a 4 e o é de 1 a 4.

[087] Em certas formas de realização, L^c é:

[088] Em certas formas de realização, o espaçador l_4 que une o ligante de pró-fármaco reversível L² ao polímero de ácido hialurônico 2B é da fórmula

em que:

[089] Em certas formas de realização, a unidade Z⁴ é:

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16/254

em que Ra² é como aqui definido.

[090] Em certas formas de realização, a unidade Z² é

em que L², Ra² e Fármaco são como aqui definidos.

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17/254 [091]

Em certas formas de realização, a unidade Z² é

Fármaco

em que Ra² e Fármaco são como aqui definidos.

[092] Em certas formas de realização, o ligante de pró-fármaco reversível combinado L² juntamente com o espaçador L⁴ é da fórmula Vlld

em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação ao átomo de nitrogênio do fármaco; e

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18/254 a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z² do ácido hialurônico 2B.

[093] Em certas formas de realização, o fármaco é um anticorpo.

[094] Em certas formas de realização, o anticorpo é um antagonista de VEGF.

[095] Em certas formas de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo anti-VEGF.

[096] Em certas formas de realização, o fragmento de anticorpo é um fragmento de anticorpo Fab.

[097] Em certas formas de realização, o fragmento de anticorpo Fab é ranibizumabe ou LUCENTIS ®.

[098] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende as seis regiões hipervariáveis (HVRs) a seguir:

(a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8 (SEQ ID NO: 2), em que X1 é lie ou His, X2 é Ala ou Arg, X3 é Tyr ou Lys, X4 é Thr ou Glu, X5 é Arg, Tyr, Gin ou Glu, Xe é Ala ou Glu, X7 é Lys ou Glu e Xe é Gly ou Glu;

(c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQX1VSTAVA (SEQ ID NO: 4), em que X1 é Asp ou Arg;

(e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de X1ASFLYS (SEQ ID NO: 5), em que X1 é Ser ou Met; e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de X1QGYGX2PFT (SEQ ID NO: 6), em que X1 é Gin, Asn ou Thr e X2 é Ala, Asn, Gin ou Arg.

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19/254 [099] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende as seis HVRs a seguir:

(b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21) ou GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22);

(d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10) ou QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).

[0100] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende as seis HVRs a seguir:

(b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7);

(e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de

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20/254

QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10).

[0101] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende ainda as seguintes regiões estruturais (FRs) de domínio variável da cadeia pesada (VH):

(a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13);

(b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14);

(c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); e (d) um FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16).

[0102] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve (VL):

(a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17);

(b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18);

(c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).

[0103] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende as seis HVRs a seguir:

(b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22);

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21/254 (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).

[0104] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs de domínio VL:

(c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).

[0105] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende as seis HVRs a seguir:

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22/254 (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10).

[0106] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs de domínio VL:

(a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17),

DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25) ou

DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26);

(b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) ou WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27);

(c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19) ou GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).

[0107] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs de domínio VH:

(a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) ou EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 51);

(b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30);

(c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) um FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de

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23/254

WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).

[0108] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs de domínio VH:

(e) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) ou EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52);

(f) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30);

(g) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (h) um FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).

[0109] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 40 ou 42; (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 41 ou 46; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).

[0110] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende (a) um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 40 ou 42; (b) um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 41 ou 46; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).

[0111] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

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24/254 [0112] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

[0113] Em certas formas de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

[0114] Em certas formas de realização, o conjugado de anticorpohidrogel possui uma meia-vida ocular eficaz que é aumentada em relação a um anticorpo de referência que não está covalentemente ligado ao hidrogel.

[0115] Em certas formas de realização, a meia-vida ocular eficaz é aumentada pelo menos cerca de 2 vezes em relação ao anticorpo de referência.

[0116] Em certas formas de realização, a meia-vida ocular eficaz é aumentada pelo menos cerca de 5 vezes em relação ao anticorpo de referência.

[0117] Em certas formas de realização, a meia-vida ocular eficaz é aumentada pelo menos cerca de 8 vezes em relação ao anticorpo de referência.

[0118] Em certas formas de realização, a meia-vida ocular eficaz é aumentada pelo menos cerca de 10 vezes em relação ao anticorpo de referência.

[0119] Em certas formas de realização, a meia-vida ocular eficaz é aumentada pelo menos cerca de 12 vezes em relação ao anticorpo de referência.

[0120] Em certas formas de realização, a meia-vida ocular eficaz é aumentada pelo menos cerca de 15 vezes em relação ao anticorpo de

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25/254 referência.

[0121] Em certas formas de realização, a meia-vida ocular eficaz é aumentada pelo menos cerca de 16 vezes em relação ao anticorpo de referência.

[0122] Em certas formas de realização, a meia-vida ocular eficaz é uma meia-vida vitreal.

[0123] Em certas formas de realização, o anticorpo de referência é idêntico ao anticorpo do conjugado de anticorpo.

[0124] Em certas formas de realização, a invenção fornece uma composição farmacêutica para uso como um medicamento, para uso na fabricação de um medicamento para tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica em um sujeito, para uso na redução ou inibição da angiogênese em um sujeito com um distúrbio associado à angiogênese patológica e/ ou para uso no tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica em um sujeito.

[0125] Em certas formas de realização, a composição farmacêutica compreende o conjugado de hidrogel e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0126] Em certas formas de realização, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente, em que o segundo agente é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um agente antiangiogênico, uma citocina, um antagonista de citocinas, um corticosteróide, um analgésico e um composto que se liga a uma segunda molécula biológica.

[0127] Em certas formas de realização, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente, em que o segundo agente é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um agente antiangiogênico, uma citocina, um antagonista de citocinas, um

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26/254 corticosteróide, um analgésico e um composto que se liga a uma segunda molécula biológica.

[0128] Em certas formas de realização, o agente antiangiogênico da composição farmacêutica é um antagonista de VEGF.

[0129] Em certas formas de realização, o antagonista de VEGF da composição farmacêutica é um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo anti-receptor de VEGF, uma proteína de fusão solúvel do receptor de VEGF, um aptâmero, um anti-VEGF DARPin® ou um inibidor de tirosina quinase de VEGFR.

[0130] Em certas formas de realização, o anticorpo anti-VEGF da composição farmacêutica é ranibizumabe (LUCENTIS®), RTH-258 ou um anticorpo anti-VEGF biespecífico.

[0131] Em certas formas de realização, o anticorpo anti-VEGF biespecífico é um anticorpo anti-VEGF/ anti-Ang2.

[0132] Em certas formas de realização, o anticorpo anti-VEGF/ anti-Ang2 é RG-7716.

[0133] Em certas formas de realização, a proteína de fusão solúvel do receptor de VEGF é aflibercept (EYLEA®).

[0134] Em certas formas de realização, o aptâmero é pegaptanib (MACUGEN®).

[0135] Em certas formas de realização, o anti-VEGF DARPin® é abicipar pegol.

[0136] Em certas formas de realização, o inibidor de tirosina quinase de VEGFR é selecionado a partir do grupo que consiste em 4-(4bromo-2-fluoroanilino)-6-metoxi-7-(1-metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474), 4-(4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-1-ilpropoxi) quinazolina (AZD2171), vatalanib (PTK787), semaxaminib (SLI5416), e SUTENT® (sunitinib).

[0137] Em certas formas de realização, a segunda molécula

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27/254 biológica é selecionada a partir do grupo que consiste em IL-1 β, IL-6, IL-6R, IL13, IL-13R, PDGF, angiopoietina, angiopoietina 2, Tie2, S1P, integrinas ανβ3, ανβ5 e α5β1, betacelulina, apelina/ APJ, eritropoietina, fator de complemento D, TNFa, HtrA1, um receptor de VEGF, receptor ST-2, e uma proteína geneticamente ligada ao risco de AMD.

[0138] Em certas formas de realização, o receptor de VEGF é VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR ou sVEGFR.

[0139] Em certas formas de realização, a proteína geneticamente ligada ao risco de AMD é selecionada a partir do grupo que consiste em componentes da via do complemento C2, fator B, fator H, CFHR3, C3b, C5, C5a e C3a, HtrA1, ARMS2, TIMP3, HLA, IL-8, CX3CR1, TLR3, TLR4, CETP, LIPC, COL10A1 eTNFRSFWA.

[0140] Em certas formas de realização, o composto que se liga a uma segunda molécula biológica é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0141] Em certas formas de realização, o fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv e (Fab')2.

[0142] Em certas formas de realização, o distúrbio associado à angiogênese patológica é um distúrbio ocular.

[0143] Em certas formas de realização, o distúrbio ocular é selecionado a partir do grupo que consiste em degeneração macular relacionada com a idade (AMD), degeneração macular, edema macular, edema macular diabético (DME) (incluindo DME focal, não central e DME difuso e envolvido no centro), retinopatia, retinopatia diabética (DR) (incluindo DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) e DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquem ia, retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão de veia da retina (RVO) (incluindo formas central (CRVO) e

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28/254 ramificada (BRVO)), CNV (incluindo a CNV míope), neovascularização da córnea, uma doença associada à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, uma doença associada à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, vitreorretinopatia exsudativa familiar (FEVR), doença de Coats, doença de Norrie, síndrome de Osteoporose-Pseudoglioma (OPPG), hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intra-ocular, degeneração da retina, edema macular cistoide (CME), vasculite, papiloedema, retinite, conjuntivite (incluindo conjuntivite infecciosa e conjuntivite não-infecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber, uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não-infecciosa), coroidite, histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática e doença de Sjogren.

[0144] Em certas formas de realização, o distúrbio ocular é AMD, DME, DRou RVO.

[0145] Em certas formas de realização, o distúrbio ocular é AMD. [0146] Em certas formas de realização, a AMD é AMD úmida.

[0147] Em certas formas de realização, a invenção fornece um método para tratar uma indicação ocular, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapêutica de uma solução das composições farmacêuticas aqui descritas.

[0148] Em certas formas de realização, a administração da composição farmacêutica é intraocular.

[0149] Em certas formas de realização, a composição farmacêutica é injetada no vítreo do sujeito.

[0150] Em certas formas de realização, a composição

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29/254 farmacêutica é injetada usando uma agulha com um calibre de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32.

[0151] Em certas formas de realização, a indicação ocular é selecionada a partir de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), degeneração macular, edema macular, edema macular diabético (DME) (incluindo DME focal, não central e DME difuso, envolvido no centro), retinopatia, retinopatia diabética (DR) (incluindo DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) e DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquemia, retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão de veia da retina (RVO) (incluindo formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), CNV (incluindo CNV míope), neovascularização da córnea, uma doença associada à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, uma doença associada à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, vitreorretinopatia exsudativa familiar (FEVR), doença de Coats, doença de Norrie, síndrome de Osteoporose-Pseudoglioma (OPPG), hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intraocular, degeneração da retina, edema macular cistoide (CME), vasculite, papiloedema, retinite, conjuntivite (incluindo conjuntivite infecciosa e conjuntivite nãoinfecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber, uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não infecciosa), coroidite, histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática e doença de Sjogren.

[0152] Em certas formas de realização, a invenção fornece um método para a produção de um conjugado de fármaco de hidrogel, em que o método compreende:

(a) fornecer um primeiro ácido hialurônico ou um sal de metal

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30/254 alcalino ou um derivado do mesmo, tendo pelo menos três primeiros grupos reativos no mesmo;

(b) fornecer um segundo ácido hialurônico ou um sal de metal alcalino ou um derivado do mesmo, tendo pelo menos dois segundos grupos reativos no mesmo, em que o primeiro e o segundo grupos reativos são capazes de reagir entre si para formar uma ligação covalente;

(c) acoplar pelo menos um fármaco a um dos primeiros grupos reativos; e (d) reticular o primeiro e o segundo ácidos hialurônicos por reação de um primeiro grupo reativo e um segundo grupo reativo para formar um agente de reticulação e formar o conjugado de hidrogel.

[0153] Em certas formas de realização, o fármaco é acoplado ao primeiro ácido hialurônico por meio de um ligante de pró-fármaco reversível.

[0154] Em certas formas de realização, o fármaco é acoplado ao ligante de pró-fármaco reversível e purificado para formar um conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível purificado antes do acoplamento com o primeiro ácido hialurônico, em que o conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível é purificado por:

(a) marcação do conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível com um marcador de purificação para formar uma mistura de conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível marcada;

(b) purificação de um monoconjugado de fármaco-ligante de prófármaco reversível marcado da mistura por separação cromatográfica; e (c) remoção do marcador de purificação do monoconjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível marcado para formar o conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível purificado.

[0155] Em certas formas de realização, o agente de reticulação compreende uma porção espaçadora biodegradável.

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31/254 [0156] Em certas formas de realização, o agente de reticulação compreende uma porção éster de ácido azelaico.

Breve Descrição das Figuras [0157] A Figura 1 é um conjugado de fármaco de ácido hialurônico reticulado de acordo com a invenção.

[0158] A Figura 2 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de ácido hialurônico (HA) funcionalizado com maleimida e ácido hialurônico funcionalizado com maleimida possuindo um fármaco conjugado.

[0159] A Figura 3 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de ácido hialurônico funcionalizado com tiol protegido, ácido hialurônico funcionalizado com tiol e uma composição de pró-fármaco de ácido hialurônico reticulado.

[0160] A Figura 4 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de ácido hialurônico funcionalizado com maleimida e ácido hialurônico funcionalizado com dissulfeto protegido.

[0161] A Figura 5 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de ácido hialurônico funcionalizado com tiol, ácido hialurônico funcionalizado com tiol possuindo um fármaco conjugado e uma composição de pró-fármaco de ácido hialurônico reticulado.

[0162] A Figura 6 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de ácido hialurônico funcionalizado com amina e para a preparação de ácido hialurônico funcionalizado com maleimida a partir daí.

[0163] A Figura 7 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção, que mostra o ácido hialurônico funcionalizado

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32/254 com maleimida e o ácido hialurônico funcionalizado com maleimida possuindo um fármaco conjugado.

[0164] A Figura 8 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de ácido hialurônico funcionalizado com amina, ácido hialurônico funcionalizado com dissulfeto protegido e ácido hialurônico funcionalizado com tiol.

[0165] A Figura 9 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de uma composição de prófármaco de ácido hialurônico reticulado.

[0166] A Figura 10 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de uma composição de prófármaco de ácido hialurônico reticulado.

[0167] A Figura 11 é um esquema de reação de acordo com um aspecto da presente invenção para a preparação de uma composição de prófármaco de ácido hialurônico reticulado.

[0168] A Figura 12 mostra a PK vitreal de RabFab após a liberação do HA RabFab reticulado nos coelhos NZW (pontos e linha vermelhos) em comparação com o RabFab livre (pontos e linha azuis).

[0169] As Figuras 13A e 13B são ilustrações que mostram fragmentação mínima e movimento de partículas do placebo de hidrogel de HA reticulado no olho de NHP.

[0170] A Figura 14 ilustra a tolerabilidade no olho de coelho de conjugado de Rabfab de hidrogel de HA reticulado.

[0171] A Figura 15 ilustra a tolerabilidade no olho de macaco cymolgus de conjugado G6.3.1 AAR de HA reticulado.

Descrição Detalhada da Invenção [0172] Em alguns aspectos, a presente invenção refere-se, de modo geral, a métodos para a preparação de composições de pró-fármacos de

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33/254 hidrogel que compreendem ácido hialurônico reticulado (HA), ou um derivado ou um sal do mesmo, em que o sistema de reticulação compreende um espaçador biodegradável, em que o HA reticulado compreende um fármacoligante conjugado, e em que o ligante é capaz de liberar o fármaco sob condições fisiológicas. Em alguns desses aspectos, as composições de prófármaco de hidrogel de HA da presente invenção são de fórmulas 1, 10, 16 e 26, como mostrado nas Figuras 1, 3, 5 e 9, respectivamente. Nas fórmulas, estruturas e esquemas de reação deste documento, qualquer valência aberta em um átomo de carbono, nitrogênio, oxigênio ou enxofre deve ser entendida como representando um átomo de hidrogênio.

[0173] Com referência à Figura 1, é mostrado um composto 1 do conjugado de fármaco de HA reticulado de acordo com a invenção. O composto 1 pode ser preparado como descrito mais abaixo. No composto 1, uma porção de fármaco é unida a uma porção de HA através de um ligante L², que é uma porção ligante de pró-fármaco reversível e um espaçador L⁴, como descrito mais adiante. A porção de fármaco pode compreender qualquer porção terapêutica ou biologicamente ativa, como também descrito aqui mais adiante. As porções de HA são unidas ou reticuladas em conjunto por um espaçador L⁴, e a porção L²-fármaco é unida a uma porção de HA pelo espaçador L⁴. Os espaçadores l_4 podem ser iguais ou diferentes em cada ocorrência e, em muitas formas de realização, podem ser biodegradáveis, como descrito aqui mais adiante.

[0174] Os espaçadores L⁴ podem variar de acordo com o tipo de química usada para reticular as porções de HA e ligar a porção L²-fármaco a uma porção de HA. Em muitas formas de realização deste documento, os conjugados de fármacos de HA reticulados da invenção são baseados na química de tiol-maleimida e, portanto, os espaçadores L⁴ compreendem grupos tiosuccinimida resultantes da reação de tióis e maleimidas. Deve ser entendido,

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34/254 no entanto, que vários tipos de química podem ser usados para reticular as porções de HA e ligar a porção L²-fármaco a uma porção de HA, de acordo com a invenção, também estão dentro do escopo desta invenção. Por exemplo, a química “clique” com base na reação de alquinas com azidas como divulgada nos documentos WO 2003101972, WO 2011136645, WO 2013036748 e WO 2013171485, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência, pode ser usada para reticular as porções de HA e ligar a porção L²-fármaco a uma porção de HA. A química de reticulação baseada em acrílico, a química de reticulação de amina-epóxido e outras químicas formadoras de ligação também podem ser usadas com a invenção.

[0175] Com referência também às Figuras 2 e 3, é mostrado um composto 10 de hidrogel de conjugado de fármaco de HA reticulado (Figura 3) de acordo com a invenção. No composto 10, o espaçador L⁴ do composto 1 que une as porções de HA é mostrado mais particularmente como

e o espaçador L⁴ que une a porção L²-fármaco a uma porção de HA é mostrado mais particularmente como

O

HN yj o⁷ em que L¹ e L³ são como aqui definidos. Em geral, o composto 10 pode ser preparado de acordo com o método representado nas Figuras 2 e 3. Em uma primeira etapa, um primeiro composto 2 de HA (ou um derivado ou um sal do mesmo) é conjugado com o composto 3 de maleimida para formar o composto 4 que compreende grupos reativos de maleimida conjugados a HA por um espaçador L¹.

[0176] Em uma segunda etapa, o composto 5 do conjugado tiol

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L²-fármaco é reagido com os grupos reativos de maleimida do composto 4 para formar o composto 6 que compreende porções conjugadas de conjugado -S-L²fármaco. Em alguns aspectos, L² é uma porção de ligante de pró-fármaco reversível, como descrito mais adiante em outros locais, que é capaz de liberação controlada do fármaco sob condições fisiológicas. O grupo tiol no composto 5 pode ser parte do ligante de pró-fármaco reversível L². Em alguns aspectos, o fármaco é um terapêutico, tal como uma molécula anti-VEGF, que é útil para o tratamento de doenças nos olhos. Os equivalentes dos grupos maleimida no composto 4 excedem os equivalentes do composto 5 do conjugado de fármaco, de modo que o composto 6 compreende grupos maleimida livres.

[0177] Em uma terceira etapa, um segundo composto 2 de HA (ou um derivado ou um sal do mesmo) é conjugado com o composto 7 de tiol protegido (mostrado com um grupo protetor PG) para formar o composto 8 que compreende grupos tiol protegidos conjugados a HA pelo espaçador L³. Em alguns aspectos, L³ é uma porção espaçadora biodegradável.

[0178] Em uma quarta etapa, os grupos protetores do composto 8 são removidos para gerar o composto 9 com grupos tiol. Em certas formas de realização, o grupo protetor pode formar um dissulfeto com os grupos tiol, de modo que a remoção do grupo protetor possa ser alcançada com um agente redutor.

[0179] Em uma quinta etapa, o composto 6 e o composto 9 são combinados e reagidos para formar o composto 10 de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado.

[0180] O grau de funcionalização da maleimida e tiol, como mostrado nas Figuras, é apenas ilustrativo e deve ser entendido que nem todos os grupos carboxilato no composto 2 de HA sofrem reação e, na maioria das formas de realização, a maioria dos grupos carboxilato não reagiu. O composto

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36/254 de HA funcionalizado com maleimida na Figura 2 terá um grau suficiente de funcionalização, de modo que uma porção dos grupos funcionais de maleimida no composto 4 esteja disponível para ligação do fármaco (como mostrado no composto 6) e os demais grupos de maleimida estejam disponíveis para sofrer reação de reticulação com grupos tiol do composto 9 para finalmente fornecer a composição 10 de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado de acordo com a invenção. Por exemplo, o grau de funcionalização da maleimida do composto 4 pode variar de cerca de 5% a cerca de 15%, enquanto o grau de funcionalização do composto 9 de tiol pode variar de cerca de 1% a cerca de 7%.

[0181] Em certas formas de realização, o grau de funcionalização do composto 4 de HA com maleimida pode variar de cerca de 6% a cerca de 14%, de cerca de 7% a cerca de 13%, de cerca de 8% a cerca de 12%, de cerca de 10% a cerca de 12 % e de cerca de 9% a cerca de 11%. O grau de funcionalização do composto 9 de HA com tiol, como mostrado na Figura 3, pode, por exemplo, variar de cerca de 1% a cerca de 7%, de cerca de 2% a cerca de 6% e de cerca de 3% a cerca de 5%.

[0182] Em certas formas de realização, o grau de funcionalização da maleimida no composto 4 de HA, como mostrado na Figura 2, pode ser de cerca de 10%, de modo que cerca de um em cada dez grupos carboxilato no primeiro composto 2 de HA sejam derivatizados com maleimida. Em outras palavras, se o composto 2 de HA tiver um número x de grupos carboxilato nele, o composto 4 inclui 0,1x grupos de maleimida. O grau de funcionalização do tiol no composto 9 de HA, como mostrado na Figura 3, pode ser de cerca de 4%, ou para x grupos carboxilato no composto 2 de HA, existem 0,04x grupos de tiol no composto 9 (e correspondentemente 0,04x grupos de tiol protegidos no composto 8) [0183] No composto 6, cerca de 77% das maleimidas, em média,

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37/254 serão substituídas com Fármaco, enquanto o restante, aproximadamente 23%, é usado para a reação de reticulação com o composto 9 para fornecer o gel reticulado 10. Assim, por exemplo, um HA de 116 kDa que é 10% funcionalizado com maleimida, haverá aproximadamente 28 grupos de maleimida nele, dos quais aproximadamente 22 grupos de maleimida serão abordados pelo Fármaco.

[0184] Com referência agora às Figuras 4 e 5, a preparação do composto 16 é mostrada.

[0185] Em uma primeira etapa, um primeiro composto 2 de HA (ou um derivado ou um sal do mesmo) é conjugado com o composto 3 de maleimida para formar o composto 11 que compreende grupos reativos de maleimida conjugados a HA pelo espaçador L³.

[0186] Em uma segunda etapa, um segundo composto 2 de HA (ou um derivado ou um sal do mesmo) é conjugado com o composto 7 de dissulfeto protegido (PG) para formar o composto 12 que compreende grupos dissulfeto protegidos conjugados com HA pelo espaçador L¹. Em alguns aspectos, L¹ é uma porção espaçadora biodegradável.

[0187] Em uma terceira etapa, os grupos protetores do composto 12 são removidos para gerar o composto 13 possuindo grupos tiol.

[0188] Em uma quarta etapa, o composto 14 de conjugado de maleimida-L²-fármaco é reagido com os grupos reativos de tiol do composto 13 para formar o composto 15 que compreende porções de fármaco conjugadas. Os equivalentes dos grupos tiol excedem os equivalentes do composto 14, de modo que o composto 15 compreende grupos tiol livres. Em alguns aspectos, L² é uma porção de ligante de pró-fármaco reversível que é capaz de liberação controlada do fármaco sob condições fisiológicas. Em alguns aspectos, o fármaco é uma molécula anti-VEGF.

[0189] Na etapa 5, o composto 11 e o composto 15 são

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38/254 combinados de modo que os grupos maleimida e tiol livres, respectivamente neles, são reagidos para formar o composto 16 de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado. No composto 16, o espaçador L⁴, como mostrado na Figura 1, que une as porções de HA é representado mais particularmente por o

o e o espaçador L⁴ que une a porção L²-fármaco a uma porção de

HA é representado mais particularmente como o

o em que L¹ e L³ são como aqui definidos.

[0190] Como descrito acima, o grau de funcionalização dos grupos carboxilato nos compostos 2 de HA, como mostrado nas Figuras, é arbitrário e é para fins ilustrativos. O composto 13 de HA funcionalizado com tiol (e o composto 12 funcionalizado com tiol protegido) terá um maior grau de funcionalização do que o composto 11 de HA funcionalizado com maleimida. Uma porção dos grupos funcionais de tiol no composto 13 será usada para ligação do fármaco e os demais grupos de tiol estão disponíveis para sofrer reação de reticulação com grupos maleimida do composto 11 para fornecer a composição 16 de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado. Por exemplo, o grau de funcionalização do tiol do composto 13 pode variar de cerca de 5% a cerca de 15%, enquanto o grau de funcionalização do composto 11 de maleimida pode variar de cerca de 1% a cerca de 7%. A variação do grau de funcionalização de tiol e maleimida permite diferentes densidades de reticulação e diferentes graus de carga do fármaco no bioconjugado da invenção, como descrito acima.

[0191] Em alguns aspectos, como representado nas Figuras 6 a 9,

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39/254 os pró-fármacos de hidrogel de HA reticulados podem ser preparados por (1) preparação de um primeiro HA funcionalizado com amina e preparação de um HA funcionalizado com maleimido a partir daí, (2) preparação de um segundo HA funcionalizado com amina e preparação de um HA funcionalizado com tiol a partir daí, (3) conjugação de um conjugado fármaco-ligante ao HA funcionalizado com maleimido, em que uma porção dos grupos maleimido não é conjugada com o conjugado fármaco-ligante e (4) formação de pró-fármacos de hidrogel de HA reticulados por reação dos grupos maleimido no primeiro HA funcionalizado com os grupos tiol no segundo HA funcionalizado.

[0192] Na Figura 6, etapa 1, um primeiro composto 2 de hialuronato de sódio (ou a forma ácida ou um derivado do mesmo) é reagido com o composto 17 de H2N-L^A-NH2 para formar o composto 18 de HA funcionalizado com amina, em que o grau de funcionalização amina do HA é de cerca de 5% a cerca de 15%, de cerca de 6% a cerca de 14%, de cerca de 7% a cerca de 13%, de cerca de 8% a cerca de 12%, de cerca de 9% a cerca de 11%, ou em algumas formas de realização, cerca de 10%; cerca de 11%; ou cerca de 12%. Em alguns aspectos, La é uma porção espaçadora conforme aqui definido.

[0193] Como representado na Figura 6, etapa 2, o composto 18 é reagido com o composto 19 de N-hidroxissuccinimida-LB-maleimida para formar o composto 20 de HA funcionalizado com maleimido representado na Figura 7. Em alguns aspectos, Lb é uma porção espaçadora que forma um éster ativado com a porção succinimida do reagente 19.

[0194] Como representado na Figura 7, etapa 3, o composto 20 é reagido com o composto 5 de conjugado de fármaco de tiol para formar um composto 21 de precursor de pró-fármaco. L2 é um ligante de pró-fármaco reversível, como aqui definido.

[0195] Como mostrado na Figura 8, etapa 4, um segundo

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40/254 composto 2 de hialuronato de sódio (ou a forma ácida ou um derivado do mesmo) é reagido com o composto 17 de H2H-L^A-NH2 para formar HA funcionalizado com amina (composto 22) em que o grau de funcionalização de amina do HA pode variar de cerca de 1% a cerca de 7%, de cerca de 2% a cerca de 6%, de cerca de 3% a cerca de 5% e, em certas formas de realização, 4%.

[0196] Como adicionalmente representado na Figura 8, etapa 5, o composto 22 é reagido com o composto 23 de grupo protetor de Nhidroxissuccinimida-L^c-S (Grupo protetor mostrado como “PG”) para formar o composto 24. O composto 24 é então desprotegido na etapa 6 para remover o grupo protetor e formar o composto 25 de HA de funcionalizado com tiol. Em alguns aspectos, L^c é uma porção espaçadora biodegradável que forma um éster ativado com a porção succinimida do reagente 23. Como representado na Figura 9, o composto 21 de precursor de pró-fármaco é reticulado com o composto 25 de HA funcionalizado com tiol para formar a composição 26 de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado. No composto 26, o espaçador L⁴, como mostrado na Figura 1 que une as porções de HA, é mais particularmente representado por o

~^Ahn^^lV^l'^s-\V^lY^lV^v e o espaçador L⁴ que une a porção L²-fármaco a uma porção de

HA é representado mais particularmente como ^hn h °y/^s/'· o

em que L^A, L^B e L^c são como aqui definidos.

[0197] Como na forma de realização das Figuras 2 a 3 descrita acima, na forma de realização das Figuras 6 a 9, o composto 20 de HA

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41/254 funcionalizado com maleimida na Figura 7 terá um maior grau de funcionalização do que o composto 25 de HA funcionalizado com tiol na Figura 8. Uma porção dos grupos funcionais de maleimida no composto 20 será usada para ligação do fármaco (como mostrado no composto 21) e os demais grupos de maleimida estão disponíveis para sofrer reação de reticulação com grupos tiol do composto 25 para fornecer a composição 26 de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado de acordo com a invenção. As faixas e os valores do grau de funcionalização dos grupos maleimida e tiol, as faixas e os valores para a densidade de reticulação e as faixas e os valores para carga de fármacos relacionados em outras partes deste documento também se aplicam à forma de realização das Figuras 6 a 9.

Definições [0198] Como aqui utilizado, ácido hialurônico (HA) refere-se a HA e quaisquer derivados e sais do mesmo. Em certas formas de realização, o HA pode ser da fórmula:

em que Ra¹ e Ra² representam independentemente, cada um, hidrogênio, alquila inferior ou outro grupo formador de éster, um contra-íon de metal ou amônio (incluindo mono-, di-, tri- e tetra-alquil amônio) ou outro tipo de contra-íon. Em certas formas de realização, Ra¹ é selecionado independentemente a partir de H, alquila C1-4 e um contra-íon de metal alcalino, e cada Ra² é selecionado independentemente a partir de H, alquila C1-4 e um contra-íon de metal alcalino. Em alguns aspectos, cada Ra¹ é Na⁺ e cada Ra² é H. Em alguns possíveis derivados de HA, como mostrado acima, os grupos hidroxila podem, cada um, ser substituídos independentemente com éteres de alquila C1-4 (não mostrados) ou com ésteres de alquila C1-4 (não mostrado) e o

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42/254 átomo de nitrogênio de cada uma das funcionalidades de amida pode opcionalmente ser substituído (alquilado) com alquila C1-4 (também não mostrado). O peso molecular numérico médio de HA é de cerca de 10 kDa, cerca de 25 kDa, cerca de 50 kDa, cerca de 75 kDa, cerca de 100 kDa, cerca de 125 kDa, cerca de 150 kDa, cerca de 175 kDa, cerca de 200 kDa, cerca de 225 kDa, cerca de 250 kDa, cerca de 275 kDa, cerca de 300 kDa, cerca de 325 kDa, cerca de 350 kDa, cerca de 375 kDa, cerca de 400 kDa, cerca de 425 kDa, cerca de 450 kDa, cerca de 475 kDa, cerca de 500 kDa, cerca de 550 kDa, cerca de 600 kDa, cerca de 650 kDa, cerca de 700 kDa, e faixas dos mesmos, tal como de cerca de 10 kDa a cerca de 1000 kDa, de cerca de 25 kDa a cerca de 750 kDa, de cerca de 50 kDa a cerca de 250 kDa, de cerca de 75 kDa a cerca de 200 kDa, de cerca de 75 kDa a cerca de 175 kDa, de cerca de 100 kDa a cerca de 150 kDa ou de cerca de 100 kDa a cerca de 125 kDa.

[0199] O termo “ligante de pró-fármaco reversível” ou simplesmente “ligante” refere-se a uma porção que, em uma extremidade sua, está ligada a um fármaco, por exemplo, um fármaco neutralizante de VEGF, por meio de uma ligação reversível e, em outra extremidade, está ligada por meio de uma ligação permanente a um veículo, tal como os hidrogéis de acordo com a invenção, ligando assim o fármaco ao veículo. Exemplos de ligantes de pró-fármacos reversíveis utilizáveis com a invenção são divulgados no documento WO 2009095479, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. Em tais formas de realização, o ligante de pró-fármaco resversível é um grupo de fórmula XIIa

em que:

a linha tracejada indica a ligação a um nitrogênio de um composto

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43/254 de fármaco (não mostrado) através da formação de uma ligação am ida;

X¹ é C, ou S(O);

-X²- é -C(R⁸R^8a)-, ou -C(R⁸R^8a)-C(R⁹R^9a)-;

=X³ é =0, =S, ou =N-CN;

-R¹, -R^1a, -R², -R^2a, -R⁴, -R^4a, -R⁵, -R^5a, -R⁶, -R⁸, -R^8a, -R⁹, -R^9a são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em -H, e alquila C1-6;

-R⁷ é -N(R¹⁰R^10a), ou -NR¹⁰-(C=O)-R¹¹;

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44/254 opcionalmente, R³/R^3a são unidos juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um heterociclo de 3 a 10 membros;

A é selecionado a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 3 a 10 membros, e heterobiciclila de 8 a 11 membros; e em que o grupo de fórmula Xlla é substituído com -L⁴, desde que o hidrogênio marcado com o asterisco na fórmula (Xlla) não seja substituído por -L⁴ ou outro substituinte;

em que -L⁴- é uma ligação química simples ou uma porção espaçadora, conforme aqui definido; e em que a alquila C1-10 pode ser opcionalmente interrompida e/ ou opcionalmente substituída como aqui definido.

[0200] Ligantes de pró-fármacos reversíveis adicionais utilizáveis em outras formas de realização da invenção são descritos em WO 05099768 A2, WO 06136586 A2, WO 2011/012722 A1, WO 2011/089214 A1, WO 2011/089216 A1, WO 2011/089215 A1, WO 2013/024053 A1, WO 2013/160340 A1, WO 2016/020373 A1, WO 2016/196124 A2, EP 1536334 B1, WO 2009/009712 A1, WO 2008/034122 A1, WO 2009/143412 A2, WO 2011/082368 A2, US 8618124 B2, US 8946405 B2, US 8754190 B2, WO 2013/036857 A1, US 7585837 B2 e WO 2002/089789 A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência.

[0201] Um espaçador ou porção espaçadora, em muitas formas de realização, pode ser selecionado a partir de -T-, -alquileno C1-10, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(Ry¹)-, -S(O)2N(Ry¹)-, -S(O)N(Ry¹)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N (Ry¹)S(O)2N(Ry^1a)-, -s-, -N(R^y1)-, -oc(ORy¹)(Ry^1a)-, -N(Ry¹)C(O)N(Ry^1a)-, -oc (O)N(Ry¹)-, alquila C 1-50, alquenila C2-so e alquinila C₂-so; em que -T-, alquila Ci50, alquenila C₂-so e alquinila C₂-so são opcionalmente substituídos com um ou

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45/254 mais -R^y2, que são iguais ou diferentes e em que alquila C1-50, alquenila C2-50 e alquinila C2-50 são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados a partir do grupo que consiste em -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O) N(R^y3)-, -S(O)2N(R^y3)-, -S(O) N(R^y3)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R^y3)S(O)₂N (R^y3a)-, -S -, -N(R^y3)-, -OC(OR^y3)(R^y3a)-, -N(R^y3)C(O)N(R^y3a)-, e -OC(O)N(R^y3)-;

em que:

-R^y1 e -R^y1a são independentemente um do outro selecionados a partir do grupo que consiste em -H, -T, alquila C1-50, alquenila C2-50 e alquinila C2-50; em que -T, alquila C1-50, alquenila C2-50 e alquinila C2-50 são opcionalmente substituídos com um ou mais -R^y2, que são iguais ou diferentes, e em que alquila C1-50, alquenila C2-50 e alquinila C2-50 são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados a partir do grupo que consiste em -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y4)-, -S(O)2N(R^y4)-, -S(O)N(R^y4), -S(O)2-, -S(O)-, -N(R^y4)S(O)₂N(R^y4a)-, -S-, -N(R^y4)-, -OC(OR^y4) (R^y4a)-, -N(R^y4)C(O)N(R^y4a)-, e -OC(O)N(R^y4)-;

cada T é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 3 a 10 membros, heterobiciclila de 8 a 11 membros, carbopoliciclila de 8 a 30 membros e heteropoliciclila de 8 a 30 membros; em que cada T é independentemente opcionalmente substituído com um ou mais R^y2, que são iguais ou diferentes;

cada -R^y2 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em halogênio, -CN, oxo (=0), -COOR^y5, -OR^y5, -C(O)R^y5, -C(O)N(R^y5R^y5a), -S(O)2N(R^y5R^y5a), -S(O)N(R^y5R^y5a), -S(O)2R^y5, -S(O)R^y5, -N(R^y5)S(O)2N(R^y5aR^y5b), -SR^y5, -N(R^y5R^y5a), -NO2, -O C(O)R^y5, -N(R^y5)C(O)R^y5a, -N(R^y5)S(O)2R^y5a, -N(R^y5)S(O)R^y5a, -N(R^y5)C(O) OR^y5a, -N(R^y5)C(O)N(R^y5aR^y5b), -OC(O)N(R^y5R^y5a) e alquila Ci-e; em que alquila C1-6 é opcionalmente substituída com um ou mais halogênios, que são iguais

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46/254 ou diferentes; e cada -R^y3, -R^y3a, -R^y4, -R^y4a, -R^y5, -R^y5a e -R^y5b é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em -H e alquila C1-6, em que alquila C1-6 é opcionalmente substituído com um ou mais halogênio, que são iguais ou diferentes.

[0202] Esse espaçador é um “espaçador biodegradável” se a porção espaçadora compreender pelo menos uma ligação biodegradável.

[0203] Em certas formas de realização, uma porção espaçadora pode ser selecionada a partir de -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y1)-, -S(O)2 N(R^y1)-, -S(O)N(R^y1)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R^y1)S(O)2N(R^y1a)-, -S-, -N(R^y1)-, -OC (OR^y1)(R^y1a)-, -N(R^y1)C(O)N(R^y1a)-, -OC(O)N(R^y1)-, alquila C1-50, alquenila C2-50 e alquinila C2-50; em que -T-, alquila C1-20, alquenila C2-20 e alquinila C2-20 são opcionalmente substituídos com um ou mais -R^y2, que são iguais ou diferentes e em que alquila C1-20, alquenila C2-20 e alquinila C2-20 são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados a partir do grupo que consiste em -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y3)-, -S(O)2N(R^y3)-, -S(O)N (R^y3)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R^y3)S(O)₂N(R^y3a)-, -S-, -N(R^y3)-, -OC(OR^y3) (R^y3a)-, -N(R^y3)C(O)N(R^y3a)-, e -OC(O)N(R^y3)-;

em que:

-R^y1 e -R^y1a são independentemente um do outro selecionados a partir do grupo que consiste em -H, -T, alquila C1-10, alquenila C2-10 e alquinila C2-10; em que -T, alquila C1-10, alquenila C2-10 e alquinila C2-10 são opcionalmente substituídos com um ou mais -R^y2, que são iguais ou diferentes, e em que alquila C1-10, alquenila C2-10 e alquinila C2-10 são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados a partir do grupo que consiste em -T-, -0(0)0-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y4)-, -S(O)2N(R^y4)-, -S(O)N (R^y4)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R^y4)S(O)₂N(R^y4a)-, -S-, -N(R^y4)-, -OC (OR^y4)(R^y4a)-, -N(R^y4)C(O)N(R^y4a)-, e -OC(O)N(R^y4)-;

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47/254 cada T é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 3 a 10 membros, heterobiciclila de 8 a 11 membros, carbopoliciclila de 8 a 30 membros e heteropoliciclila de 8 a 30 membros; em que cada T é independentemente opcionalmente substituído com um ou mais R^y2, que são iguais ou diferentes;

-R^y2 é selecionado a partir do grupo que consiste em halogênio, -CN, oxo (=0), -COOR^y5, -OR^y5, -C(O)R^y5, -C(O)N (Ry5Ry5a) -S(O)2N(R^y5R^y5a), -S(O)N(R^y5R^y5a), -S(O)2R^y5, -S(O)R^y5, -N(R^y5)S(O)2 N(Ry5aRy5b) _SRy5 _N(Ry5Ry5a) _NQ2 -OC(O)R^y5, -N(R^y5)C(O)R^y5a, -N(R^y5)S(O)2 R^y5a -N(R^y5)S(O)R^y5a, -N(R^y5)C(O)OR^y5a, -N(R^y5)C(O)N(R^y5aR^y5b), -OC(O)N(R^y5R^y5a) e alquila Οι-e; em que alquila C1-6 é opcionalmente substituída com um ou mais halogênio, que são iguais ou diferentes; e cada -R^y3, -R^y3a, -R^y4, -R^y4a, -R^y5, -R^y5a e -R^y5b é independentemente um do outro selecionado a partir do grupo que consiste em -H e alquila Ci-e; em que alquila C1-6 é opcionalmente substituída com um ou mais halogênio, que são iguais ou diferentes.

[0204] Esse espaçador é um “espaçador biodegradável” se a porção espaçadora compreender pelo menos uma ligação biodegradável.

[0205] Em ainda outras formas de realização, uma porção espaçadora pode ser selecionada a partir de -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O) N(R^y1)-, -S(O)2N(R^y1)-, -S(O)N(R^y1)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R^y1)S(O)2N (R^y1a)-, -S-, -N(R^y1)-, -OC(OR^y1)(R^y1a)-, -N(R^y1)C(O)N(R^y1a)-, -OC(O)N(R^y1)-, alquila C1-50, alquenila C2-so e alquinila C₂-so; em que -T-, alquila C1-50, alquenila C₂-so e alquinila C₂-so são opcionalmente substituídos com um ou mais -R^y2, que são iguais ou diferentes e em que alquila C1-50, alquenila C2-soe alquinila C2-so são interrompidas opcionalmente por um ou mais grupos selecionados a partir do grupo que consiste em -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y3)-, -S (O)2N(R^y3)

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48/254 , -S(O)N(Ry³)-, -S(0)2-, -S(0)-, -N(Ry³)S(O)2N(Ry^3a)-, -S-, -N(R^y3)-, -0 C(ORy³)(Ry^3a)-, -N(Ry³)C(O)N(Ry^3a)- e -0C(0)N(R^y3)-;

em que:

-R^y1 e -R^y1a são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em -H, -T, alquila C1-10, alquenila C2-10 e alquinila C2-10;

cada T é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 3 a 10 membros, heterobiciclila de 8 a 11 membros, carbopoliciclila de 8 a 30 membros e heteropoliciclila de 8 a 30 membros;

cada -R^y2 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em halogênio e alquila Ci-e; e cada -Ry³, -Ry^3a, -Ry⁴, -Ry^4a, -Ry⁵, -Ry^5a e -Ry^5b é independentemente um do outro selecionado a partir do grupo que consiste em -H e alquila C1-6; em que alquila C1-6 é opcionalmente substituída com um ou mais halogênio, que são iguais ou diferentes.

[0206] Esse espaçador é um “espaçador biodegradável” se a porção espaçadora compreender pelo menos uma ligação biodegradável. Em outras formas de realização, uma porção espaçadora pode ser uma cadeia alquila C1-20, que é opcionalmente interrompida por um ou mais grupos selecionados independentemente a partir de -O-, -T- e -C(O)N(R^y1)-; e cuja cadeia alquila C1-20 é opcionalmente substituída com um ou mais grupos selecionados independentemente a partir de -OH, -T e -C(O)N(R^y6R^y6a); em que -R^y1, -R^y6, -R^y6a são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em H e alquila C1-4 e em que T é selecionado a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 3 a 10 membros, heterobiciclila de 8 a 11 membros, carbopoliciclila de 8 a 30 membros e heteropoliciclila de 8 a 30 membros.

[0207] Esse espaçador é um “espaçador biodegradável” se a

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49/254 porção espaçadora compreender pelo menos uma ligação biodegradável.

[0208] Uma ligação biodegradável pode ser uma ligação éster ou carbonato, por exemplo.

[0209] Conforme usado neste documento, “MARCADOR” e “MARCADOR de purificação” se referem a uma porção que, quando conjugada a uma segunda porção, confere (a) propriedade/propriedades físicas e/ ou químicas não presentes na dita segunda porção sem a porção de marcador e cujas propriedade/propriedades físicas e/ ou químicas diferentes permitem a purificação de tal conjugado.

[0210] Como aqui utilizado, “grupo protetor” ou “PG” refere-se a uma porção que é usada para a proteção reversível de grupos funcionais durante processos de reação química para tornar esses grupos funcionais essencialmente não reativos nos referidos processos de reação química.

[0211] Como aqui utilizado, o termo “pró-fármaco” significa um conjugado no qual um fármaco é conjugado de forma covalente e reversível a uma porção de ligante reversível, cuja porção de ligante de pró-fármaco reversível é direta ou indiretamente através de uma porção espaçadora ligada a um veículo, tal como um hidrogel de acordo com a invenção. Um pró-fármaco libera o fármaco em condições fisiológicas (tampão aquoso, 37,4 °C, pH 7,4). Esse fármaco liberado pode ser não modificado, significando que nenhum resíduo da porção de ligante de pró-fármaco reversível permanece ligado ao fármaco liberado.

[0212] Como aqui utilizado, o termo “fármaco” refere-se a qualquer substância que possa afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um organismo biológico, incluindo, mas não se limitando a vírus, bactérias, fungos, plantas, animais e seres humanos. Em particular, como aqui utilizado, os termos incluem qualquer substância destinada ao diagnóstico, cura, alívio, tratamento ou prevenção de doenças em organismos, em particular seres

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50/254 humanos ou animais, ou para melhorar o bem-estar físico ou mental de organismos, em particular humanos ou animais. Em alguns aspectos, o fármaco é uma porção biologicamente ativa que modula a atividade de uma ou mais proteínas selecionadas a partir do grupo que compreende fatores básicos de crescimento de fibroblastos (bFGF), fatores ácidos de crescimento de fibroblastos (aFGF), fatores de crescimento transformadores alfa (TGFa)), fatores de crescimento transformadores beta (TGF3), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), angiogenina, fator de crescimento para células endoteliais derivado de plaquetas (PD-ECGF), interleucina-1 (IL-1), interleucina-8 (IL-8), interleucina-12, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiopoietina-l, Del-I, folistatina, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), leptina, midkine, fator de crescimento placentário, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina, fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), angioarrestina, fragmento de plasminogênio da angiostatina, anti-trombina III antiangiogênica, inibidor derivado da cartilagem (CDI), fragmento de complemento CDS9, fragmento de colágeno XVIII da endostatina, fragmento de fibronectina, gro-beta, heparinases, fragmento de hexassacarídeo heparina, gonadotropina coriônica humana (hCG), interferon alfa/ beta/ gama, proteína induzível por interferon (IPIO), fragmento de plasminogênio Kringle S, inibidores de metaloproteinase (TIMPs), 2-metoxiestradiol, inibidor de ribonuclease placentária, inibidor de ativador de plasminogênio, fator 4 plaquetário (PF4), fragmento de prolactina 16 kD, proteína relacionada à proliferina (PRP), retinóides, tetra-hidrocortisol-S, trombospondina-l (TSP-I), vasculostatina, fragmento de vasostatina calreticulina, receptor de prostaglandina, hormônio de crescimento, fator de crescimento I semelhante à insulina (IGF-I), esfingosina-1-fosfato, fator D, RTP801, inibidores do complemento, agonista a2 adrenérgico, mTOR, fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator

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51/254 neurotrófico derivado de células gliais (GDNF), fator de crescimento derivado do epitélio da lente (LEDGF), fator de viabilidade do cone derivado de bastonete (RdCVF), fator derivado do epitélio pigmentado (PEDF), proteína ativadora de neutrófilos, proteína quimioatraente para monócitos, proteína inflamatória de macrófagos, pequenas proteínas secretadas induzíveis (SIS), fator plaquetário, proteína básica plaquetária, atividade estimuladora do crescimento de melanoma, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento nervoso, proteínas ósseas morfogenéticas, fator indutor de cartilagem de crescimento ósseo, interleucinas, inibidores de interleucina, receptores de interleucina, fatores hematopoiéticos, fator estimulador de colônias de granulócitos, fator estimulador de colônias de macrófagos, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos, inibina e ativina. Em alguns aspectos, o fármaco é um antagonista de VEGF. O termo “fármaco” também é usado para o fármaco conjugado, que comparado ao fármaco livre, carece de hidrogênio.

[0213] O termo “antagonista de VEGF”, como aqui utilizado, refere-se a uma molécula capaz de se ligar ao VEGF, reduzir os níveis de expressão de VEGF ou neutralizar, bloquear, inibir, liquidar, reduzir ou interferir nas atividades biológicas de VEGF, incluindo, mas não limitado a, ligação de VEGF a um ou mais receptores de VEGF, sinalização de VEGF e angiogênese mediada por VEGF e sobrevivência ou proliferação de células endoteliais. Por exemplo, uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, liquidar, reduzir ou interferir nas atividades biológicas do VEGF pode exercer seus efeitos pela ligação a um ou mais receptores de VEGF (VEGFR) (por exemplo, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, receptor de VEGF ligado a membrana (mbVEGFR) ou receptor de VEGF solúvel (sVEGFR)). Incluídos como antagonistas de VEGF úteis nos métodos da invenção estão polipeptídeos que se ligam especificamente ao VEGF, anticorpos anti-VEGF e seus fragmentos de ligação

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52/254 ao antígeno, moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente ao VEGF, sequestrando assim sua ligação a um ou mais receptores, proteínas de fusão (por exemplo, VEGF-Trap (Regeneron)) e VEGF121-gelonina (Peregrine). Os antagonistas de VEGF também incluem variantes antagonistas de polipeptídeos VEGF, oligômeros de nucleobase antisenso complementares a pelo menos um fragmento de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo VEGF; pequenos RNAs complementares a pelo menos um fragmento de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo VEGF; ribozimas que têm como alvo o VEGF; peptibodies para VEGF; e aptâmeros VEGF. Os antagonistas de VEGF também incluem polipeptídeos que se ligam ao VEGFR, anticorpos anti-VEGFR e seus fragmentos de ligação ao antígeno, e derivados que se ligam ao VEGFR, bloqueando, inibindo, liquidando, reduzindo ou interferindo nas atividades biológicas do VEGF (por exemplo, sinalização de VEGF), ou proteínas de fusão. Os antagonistas de VEGF também incluem pequenas moléculas não peptídicas que se ligam ao VEGF ou VEGFR e são capazes de bloquear, inibir, liquidar, reduzir ou interferir nas atividades biológicas do VEGF. Assim, o termo “atividades de VEGF” inclui especificamente atividades biológicas de VEGF mediadas por VEGF. Em certas formas de realização, o antagonista de VEGF reduz ou inibe, em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais, o nível de expressão ou atividade biológica de VEGF. Em algumas formas de realização, o VEGF inibido pelo antagonista específico de VEGF é VEGF (8109), VEGF (1-109) ou VEGF165.

[0214] Como aqui utilizado, os antagonistas de VEGF podem incluir, mas não estão limitados a, anticorpos anti-VEGFR2 e moléculas relacionadas (por exemplo, ramucirumab, tanibirumab, aflibercept), anticorpos anti-VEGFR1 e moléculas relacionadas (por exemplo, icrucumab, aflibercept (VEGF Trap-Eye; EYLEA®) e ziv-aflibercept (VEGF Trap; ZALTRAP®)),

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53/254 anticorpos biespecíficos VEGF (por exemplo, MP-0250, vanucizumab (VEGFANG2) e anticorpos biespecíficos divulgados em US 2001/0236388), anticorpos biespecíficos incluindo combinações de dois dos braços anti-VEGF, antiVEGFR1 e anti-VEGFR2, anticorpos anti-VEGF (por exemplo, bevacizumabe, sevacizumabe e ranibizumabe) e antagonistas de VEGF de moléculas pequenas não peptídicos (por exemplo, pazopanib, axitinib, vandetanib, stivarga, cabozantinib, lenvatinib, nintedanib, orantinib, telatinib, dovitinig, cediranib, motesanib, sulfatinib, apatinib, foretinib, famitinib e tivozanib). Antagonistas adicionais de VEGF são descritos abaixo.

[0215] Um “distúrbio” é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com os conjugados de anticorpos aqui descritos. Por exemplo, mamíferos que sofrem ou precisam de profilaxia contra angiogênese anormal (angiogênese excessiva, inadequada ou não controlada) ou permeabilidade vascular. Isso inclui distúrbios ou doenças crônicas e agudas, incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitativos de distúrbios a serem tratados neste documento incluem distúrbios associados a angiogênese patológica (por exemplo, distúrbios oculares e distúrbios proliferativos celulares) e distúrbios associados a permeabilidade vascular indesejável.

[0216] Uma “quantidade eficaz” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.

[0217] Conforme usado neste documento, “tratamento” (e variações gramaticais do mesmo, como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado e pode ser realizada para profilaxia ou durante a curso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, entre outros, prevenção

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54/254 da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas formas de realização, conjugados de anticorpos da invenção ou outras composições que incluem um conjugado de anticorpo da invenção (por exemplo, uma formulação farmacêutica) são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou para reduzir a progressão de uma doença.

[0218] O termo “interrompido” significa que uma porção é inserida entre dois átomos de carbono ou - se a inserção estiver em uma das extremidades da porção - entre um carbono ou heteroátomo e um átomo de hidrogênio, preferencialmente entre um átomo de carbono e um hidrogênio. Exemplos não limitativos de tais átomos e porções incluem -O-, -S-, -N(H)-, N(substituído)-, -NC(O)- e -OC(O)-.

[0219] Como aqui utilizado, o termo “alquila C1-4”, sozinho ou em combinação, significa uma porção alquil de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono. Se presentes no final de uma molécula, exemplos de alquila C1-4 de cadeia linear ou ramificada são metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila e terc-butila. Quando duas porções de uma molécula são ligadas pela alquila C1-4, então os exemplos para esses grupos alquila C1-4 são -CH2-, -CH2-CH2-, -CH (CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-. Cada hidrogênio de um carbono alquila C1-4 pode, opcionalmente, ser substituído por um substituinte como definido acima. Opcionalmente, uma alquila C1-4 pode ser interrompida por uma ou mais porções, conforme definido abaixo.

[0220] Como aqui utilizado, o termo “alquila Ci-e”, sozinho ou em combinação, significa uma porção alquila de cadeia linear ou ramificada com 1 a 6 átomos de carbono. Se presentes no final de uma molécula, exemplos de

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55/254 grupos alquila C1-6 de cadeia linear e ramificada são metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, 2-metilbutila, 2,2dimetilpropila, n-hexila, 2-metilpentila, 3-metilpentila, 2,2-dimetilbutila, 2,3dimetilbutila e 3,3-dimetilpropila. Quando duas porções de uma molécula são ligadas pelo grupo alquila Ci-e, os exemplos para esses grupos alquila C1-6 são -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH₃)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C₂H₅)- e -C(CH₃)₂-. Cada átomo de hidrogênio de um carbono C1-6 pode, opcionalmente, ser substituído por um substituinte como definido acima. Opcionalmente, uma alquila C1-6 pode ser interrompida por uma ou mais porções, conforme definido abaixo. Por conseguinte, “alquila C1-10”, “alquila C1-20” ou “alquila C1-50” significa uma cadeia alquila com 1 a 10, 1 a 20 ou 1 a 50 átomos de carbono, respectivamente, em que cada átomo de hidrogênio do carbono C1-10, C1-20 ou C1-50 pode, opcionalmente, ser substituído por um substituinte como definido acima. Opcionalmente, uma alquila C1-10 ou C1-50 pode ser interrompida por uma ou mais porções, conforme definido abaixo.

[0221] Como aqui utilizado, o termo “alquileno” refere-se a um radical alifático saturado bivalente, tal como metileno, etileno, propileno e assim por diante.

[0222] Como aqui utilizado, o termo “alquenila C2-6”, sozinho ou em combinação, significa uma porção de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada que compreende pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono com 2 a 6 átomos de carbono. Se presente no final de uma molécula, exemplos são -CH=CH₂, -CH=CH-CH₃, -CH₂-CH=CH₂, -CH=CHCH₂-CH₃ e -CH=CHCH=CH₂. Quando duas porções de uma molécula são ligadas pelo grupo alquenila C2-6, então um exemplo para essa alquenila C2-6 é -CH=CH- Cada átomo de hidrogênio de uma porção alquenila C2-6 pode, opcionalmente, ser substituído por um substituinte como definido acima. Opcionalmente, uma alquenila C2-6 pode ser interrompida por uma ou mais porções, conforme

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56/254 definido abaixo. Por conseguinte, o termo “alquenila C2-10”, “alquenila C2-20” ou “alquenila C2-50”, sozinho ou em combinação, significa uma porção de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada que compreende pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono com 2 a 10, 2 a 20 ou 2 a 50 átomos de carbono. Cada átomo de hidrogênio de um grupo alquenila C2-10, alquenila C2-20 ou alquenila C2-50 pode, opcionalmente, ser substituído por um substituinte como definido acima. Opcionalmente, uma alquenila C2-10, alquenila C2-20 ou alquenila C2-50 pode ser interrompida por uma ou mais porções, conforme definido abaixo.

[0223] Como aqui utilizado, o termo “alquinila C2-6”, sozinho ou em combinação, significa uma porção de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada que compreende pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono com 2 a 6 átomos de carbono. Se presente no final de uma molécula, exemplos são -CeCH, -CH₂-CeCH, CH2-CH₂-CeCH e CH₂-CeC-CH3. Quando duas porções de uma molécula são ligadas pelo grupo alquinila, então um exemplo é -C=C-. Cada átomo de hidrogênio de um grupo alquinila C2-6 pode, opcionalmente, ser substituído por um substituinte como definido acima. Opcionalmente, uma ou mais ligações duplas podem ocorrer. Opcionalmente, uma alquinila C2-6 pode ser interrompida por uma ou mais porções, conforme definido abaixo. Por conseguinte, como aqui utilizado, o termo “alquinila C2-10”, “alquinila C2-20” e “alquinila C2-50”, sozinho ou em combinação, significa uma porção de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada que compreende pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono tendo 2 a 10, 2 a 20 ou 2 a 50 átomos de carbono, respectivamente. Cada átomo de hidrogênio de um grupo alquinila C2-10, alquinila C2-20 ou alquinila C2-50 pode, opcionalmente, ser substituído por um substituinte como definido acima. Opcionalmente, uma ou mais ligações duplas podem ocorrer. Opcionalmente, uma alquinila C2-10, alquinila C2-20 ou alquinila C2-50 pode ser interrompida por uma ou mais

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57/254 porções, conforme definido abaixo.

[0224] Como mencionado acima, uma alquila C1-4, alquila C1-6, alquila C1-10, alquila C1-20, alquila C1-50, alquenila C2-6, alquenila C2-10, alquenila C2-20, alquenila C2-50, alquinila C2-6, alquinila C2-10, alquenila C2-20 ou alquinila C2-50 pode opcionalmente ser interrompida por uma ou mais porções que são preferencialmente selecionadas a partir do grupo que consiste em

OR

em que as linhas tracejadas indicam ligação ao restante da porção ou reagente; e

-R e R^a são, independentemente um do outro, selecionados a partir do grupo que consiste em -H, metila, etila, propila, butila, pentila e hexila.

[0225] Como aqui utilizado, o termo “cicloalquila C3-10” significa uma cadeia de alquila cíclica com 3 a 10 átomos de carbono, que pode ser saturada ou insaturada, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, ciclo-hexenila, ciclo-heptila, ciclooctila, ciclononila ou ciclodecila. Cada átomo de hidrogênio de um carbono de cicloalquila C3-10 pode ser substituído por um substituinte como definido acima. O termo “cicloalquila C3-10” também inclui biciclos em ponte como norbornano ou norborneno.

[0226] O termo “carbopoliciclila de 8 a 30 membros” ou “carbopoliciclo de 8 a 30 membros” significa uma porção cíclica de dois ou mais

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58/254 anéis com 8 a 30 átomos de anel, em que dois anéis vizinhos compartilham pelo menos um átomo do anel e que podem conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não aromático que é totalmente, parcialmente ou insaturado). De preferência, uma carbopoliciclila de 8 a 30 membros significa uma porção cíclica de dois, três, quatro ou cinco anéis, mais preferencialmente de dois, três ou quatro anéis.

[0227] Como aqui utilizado, o termo “heterociclila de 3 a 10 membros” ou “heterociclo de 3 a 10 membros” significa um anel com 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 átomos de anel que podem conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não aromático que é totalmente, parcialmente ou insaturado) em que pelo menos um átomo do anel, até 4 átomos do anel, é substituído por um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em enxofre (incluindo - S(O)-, -S(O)2-), oxigênio e nitrogênio (incluindo =N(O)-) e em que o anel está ligado ao restante da molécula através de um átomo de carbono ou nitrogênio. Exemplos para heterociclos de 3 a 10 membros incluem, entre outros, aziridina, oxirano, tiirano, azirina, oxireno, tiireno, azetidina, oxetano, tietano, furano, tiofeno, pirrol, pirrolina, imidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazol, oxazolina, isoxazol, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, isotiazolina, tiadiazol, tiadiazolina, tetra-hidrofurano, tetra-hidrotiofeno, pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolano, pirano, di-hidropirano, tetra-hidropirano, imidazolidina, piridina, piridazina, pirazina, pirimidina, piperazina, piperidina, morfolina, tetrazol, triazol, triazolidina, tetrazolidina, diazepano, azepina e homopiperazina. Cada átomo de hidrogênio de um grupo heterociclila de 3 a 10 membros ou grupo heterocíclico de 3 a 10 membros pode ser substituído por um substituinte como definido abaixo.

[0228] Como aqui utilizado, o termo “heterobiciclila de 8 a 11

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59/254 membros” ou “heterobiciclo de 8 a 11 membros” significa uma porção heterocíclica de dois anéis com 8 a 11 átomos de anel, em que pelo menos um átomo do anel é compartilhado por ambos os anéis e que pode conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não aromático que é totalmente, parcialmente ou insaturado) em que pelo menos um átomo do anel, até 6 átomos do anel, é substituído por um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em enxofre (incluindo -S(O)-, -S(O)2-), oxigênio e nitrogênio (incluindo =N(O)-) e em que o anel está ligado ao restante da molécula por um átomo de carbono ou nitrogênio. Exemplos para um heterobiciclo de 8 a 11 membros são indol, indolina, benzofurano, benzotiofeno, benzoxazol, benzisoxazol, benzotiazol, benzisotiazol, benzimidazol, benzimidazolina, quinolina, quinazolina, di-hidroquinazolina, quinolina, di-hidroquinolina, tetrahidroquinolina, deca-hidroquinolina, isoquinolina, deca-hidroisoquinolina, tetrahidroisoquinolina, di-hidroisoquinolina, benzazepina, purina e pteridina. O termo heterobiciclo de 8 a 11 membros também inclui estruturas espiro de dois anéis como 1,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]decano ou heterociclos em ponte como 8-azabiciclo[3.2.1]octano. Cada átomo de hidrogênio de um carbono de heterobiciclila de 8 a 11 membros ou heterobiciclo de 8 a 11 membros pode ser substituído por um substituinte como definido abaixo.

[0229] Similariamente, o termo “heteropoliciclila de 8 a 30 membros” ou “heteropoliciclo de 8 a 30 membros” significa uma porção heterocíclica de mais de dois anéis com 8 a 30 átomos de anel, preferencialmente de três, quatro ou cinco anéis, em que dois anéis vizinhos compartilham pelo menos um átomo do anel e que pode conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não aromático que é totalmente, parcialmente ou insaturado), em que pelo menos um átomo do anel, até 10 átomos do anel, são substituídos por um heteroátomo selecionado a partir do grupo de enxofre (incluindo -S(O)-, S(O)2-), oxigênio e nitrogênio (incluindo

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60/254 =N(O)-) e em que o anel está ligado ao resto de uma molécula através de um átomo de carbono ou nitrogênio.

[0230] Como aqui utilizado, “halogênio” significa flúor, cloro, bromo ou iodo. É geralmente preferido que o halogênio seja flúor ou cloro.

[0231] Como aqui utilizado, o termo “parcialmente insaturado” refere-se a uma porção do anel que inclui pelo menos uma ligação dupla ou tripla entre átomos do anel, mas não é aromático. O termo “parcialmente insaturado” pretende abranger anéis com múltiplos sítios de insaturação, mas não se destina a incluir porções arila ou heteroarila, como aqui definido.

[0232] O termo “biodegradável” como aqui utilizado em relação a uma porção espaçadora ou outras espécies químicas significa que a porção espaçadora ou espécie química é capaz de sofrer degradação ou clivagens de ligação em condições biológicas ou fisiológicas. A biodegradação pode ocorrer por hidrólise, divagem enzimática ou outro mecanismo. As porções espaçadoras descritas neste documento geralmente sofrerão degradação no fluido vitreal por reação de divagem de ligação que ocorre com uma meia-vida não superior a 12 meses, em algumas formas de realização com uma meiavida não superior a seis meses, de injeção em ou exposição ao vítreo. A biodegradação das porções espaçadores pode ocorrer nas ligações químicas que ligam a porção espaçadora a outros grupos, bem como nas ligações químicas dentro da porção espaçadora.

[0233] Como aqui utilizado, o termo “opcionalmente substituído”, a menos que especificado de outra forma, significa que um grupo pode ser substituído por um ou mais (por exemplo, 1,2, 3 ou 4) dos substituintes listados pare o grupo em que os referidos substituintes podem ser iguais ou diferentes. Em alguns aspectos, um grupo opcionalmente substituído tem 1 substituinte. Em outro aspecto, um grupo opcionalmente substituído tem 2 substituintes. Em outro aspecto, um grupo opcionalmente substituído tem 3 substituintes.

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61/254 [0234] 0 termo “interrompido” como aqui utilizado com alquila, alquenila, alquinila ou alquileno, significa que um ou mais átomos de carbono são substituídos com grupos funcionais ou heteroátomos, de modo que na alquila, alquenila, alquinila ou alquileno são interrompidos. Grupos exemplificativos que podem interromper alquila, alquenila, alquinila ou alquileno, a menos que aqui especificado de outra forma, incluem T, -C(O)O-; O-; -0(0)-; -C(O)N(R¹⁷)-; -S(O)2N(R¹⁷)-; -S(O)N(R¹⁷)-; -S(O)2-; -S(O)-; N(R¹⁷)S(O)2N(R^17a)-; -S-; -N(R¹⁷)-; -OC(O)R¹⁷; -N(R¹⁷)C(O)-; -N(R¹⁷)S(O)2-; N(R¹⁷)S(O)-; -N(R¹⁷)C(O)O-; -N(R¹⁷)C(O)N(R^17a)-; e -OC(O)N(R¹⁷R^17a) em que R¹⁷ é, em cada ocorrência, independentemente H ou alquila C1-50.

[0235] O termo “substituído” significa que um ou mais átomos -H de uma molécula são substituídos por um átomo diferente ou um grupo de átomos, chamados de “substituinte” ou “substituintes”. Substituintes adequados são selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio; CN; COOR¹⁵; OR¹⁵; C(O)R¹⁵; C(O)N(R¹⁵R^15a); S(O)2N(R¹⁵R^15a); S(O)N(R¹⁵R^15a); S(O)2R¹⁵; S(O)R¹⁵; N(R¹⁵)S(O)2N(R^15aR^15b); SR¹⁵; N(R¹⁵R^15a); NO2; OC(O)R¹⁵;

N(R¹⁵)C(O)R^15a; N(R¹⁵)S(O)₂R^15a; N(R¹⁵)S(O)R^15a; N(R¹⁵)C(O)OR^15a;

N(R¹⁵)C(O)N(R^15aR^15b); OC(O)N(R¹⁵R^15a); T; alquila C1-50; alquenila C2-so; ou alquinila C2-so, em que T; alquila C1-50; alquenila C2-so; e alquinila C2-so são opcionalmente substituídos com um ou mais R¹⁶, que são iguais ou diferentes e em que alquila C1-50; alquenila C2-so; e alquinila C₂-so são opcionalmente interrompidos por um ou mais grupos selecionados a partir do grupo que consiste em T, -0(0)0-; -O-; -0(0)-; -C(O)N(R¹⁷)-; -S(O)2N(R¹⁷)-; -S(O)N(R¹⁷)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R¹⁷)S(O)2N(R^17a)-; -S-; -N(R¹⁷)-; -OC(O)R¹⁷; -N(R¹⁷)C(O)-; N(R¹⁷)S(O)2-; -N(R¹⁷)S(O)-; -N(R¹⁷)C(O)O-; -N(R¹⁷)C(O)N(R^17a)-; e OC(O)N(R¹⁷R^17a). Em alguns desses aspectos, R¹⁵, R^15a, R^15b são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em Η; T; e alquila C1-50; alquenila C₂-so; ou alquinila C₂-so, em que T; alquila C1-50; alquenila

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C₂-5o; e alquinila C₂-so são opcionalmente substituídos com um ou mais R¹⁶, que são iguais ou diferentes e em que alquila C1-50; alquenila C₂-so; e alquinila C₂-so são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados a partir do grupo que consiste em T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R¹⁷)-; -S(O)2N(R¹⁷)-; -S(O)N(R¹⁷)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R¹⁷)S(O)₂N(R^17a)-; -S-; -N(R¹⁷)-; -OC(O)R¹⁷; N(R¹⁷)C(O)-; -N(R¹⁷)S(O)2-; -N(R¹⁷)S(O)-; -N(R¹⁷)C(O)O-; -N(R¹⁷)C(O)N(R^17a)-; e -OC(O)N(R¹⁷R^17a). Em alguns desses aspectos, T é selecionado a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 4 a 7 membros, ou heterobiciclila de 8 a 11 membros, em que T é opcionalmente substituído com um ou mais R¹⁶, que são iguais ou diferentes. Em alguns desses aspectos, R¹⁶ é halogênio; CN; oxo (=0); COOR¹⁸; OR¹⁸; C(O)R¹⁸; C(O)N(R¹⁸R^18a); S(O)2N(R¹⁸R^18a); S(O)N(R¹⁸R^18a); S(O)2R¹⁸; S(O)R¹⁸; N(R¹⁸)S(O)2N(R^18aR^18b); SR¹⁸; N(R¹⁸R^18a); N02; OC(O)R¹⁸; N(R¹⁸)C(O)R^18a; N(R¹⁸)S(O)2R^18a; N(R¹⁸)S(O)R^18a; N(R¹⁸)C(O)OR^18a;

N(R¹⁸)C(O)N(R^18aR^18b); OC(O)N(R¹⁸R^18a); ou alquila C1-6, em que alquila C1-6 é opcionalmente substituída com um ou mais halogênios, que são iguais ou diferentes. Em alguns desses aspectos, R¹⁷, R^17a, R¹⁸, R^18a, R^18b são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em H; ou alquila C1-6, em que alquila C1-6 é opcionalmente substituída com um ou mais halogênios, que são iguais ou diferentes.

[0236] Conforme usado aqui, “contra-íon de metal alcalino” referese a Na⁺, K⁺ e Li⁺.

[0237] Como aqui utilizado, o termo “hidrogel” significa uma rede polimérica hidrofílica ou anfifílica composta de homopolímeros ou copolímeros, que é insolúvel devido à presença de reticulações químicas covalentes.

[0238] Como aqui utilizado, o termo “peso molecular numérico médio” significa a média aritmética comum dos pesos moleculares dos polímeros individuais. O técnico no assunto entende que os produtos de

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63/254 polimerização obtidos a partir de uma reação de polimerização não têm todos o mesmo peso molecular, mas sim exibem uma distribuição de peso molecular. Consequentemente, as faixas de peso molecular, pesos moleculares, faixas de número de monômeros em um polímero e número de monômeros em um polímero, conforme aqui utilizado, referem-se ao peso molecular numérico médio e média numérica de monômeros.

[0239] Como aqui utilizado, o termo “composição farmacêutica” refere-se a uma composição que compreende um ou mais ingrediente (s) ativo (s) e um ou mais ingrediente (s) inerte (s), bem como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, de combinação, complexação ou agregação de dois ou mais ingredientes, ou da dissociação de um ou mais ingredientes, ou de outros tipos de reações ou interações de um ou mais ingredientes.

[0240] Como aqui utilizado, o termo “excipiente” refere-se a um diluente, adjuvante ou veículo com o qual é administrado o agente terapêutico, isto é, o pró-fármaco neutralizante de VEGF, tal como um anticorpo anti-VEGF. Esse excipiente farmacêutico pode ser água; óleos e petróleo de origem animal, vegetal ou sintética, incluindo, entre outros, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares; amido; glicose; lactose; sacarose; manitol; trealose; gelatina; malte; arroz; farinha; giz; silica gel; estearato de sódio; monoestearato de glicerol; talco; cloreto de sódio; leite desnatado seco; glicerol; propileno; glicol; etanol; acetato; succinato; tris; carbonato; fosfato; HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico); MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico); Tween®; poloxâmeros; poloxaminas; CHAPS; Igepal®; aminoácidos como, por exemplo, glicina, lisina ou histidina; triglicerídeos; manitol; lactose; amido; estearato de magnésio; sacarina de sódio; celulose; e carbonato de magnésio. Exemplos de excipientes farmacêuticos adequados são descritos em “Remington's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin. A formulação deve se adequar ao

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64/254 modo de administração.

[0241] Conforme usado aqui, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa que uma molécula ou reagente é aprovado por uma agência reguladora, tal como a EMA (Europa) e/ ou a FDA (EUA) e/ ou qualquer outra agência reguladora nacional, para uso em animais, de preferência em humanos.

[0242] Uma “estrutura humana aceitadora” para os fins deste documento é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma estrutura de domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma estrutura de domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humano, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceitadora “derivada de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácidos, ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em algumas formas de realização, o número de alterações de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas formas de realização, a estrutura humana aceitadora de VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana de VL ou sequência de estrutura de consenso humano.

[0243] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, como aqui utilizado, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1: 1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos

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65/254 comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Formas de realização ilustrativas e exemplificativas específicas para medir a afinidade de ligação são descritas a seguir.

[0244] Um anticorpo de “afinidade maturada” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs) e/ ou regiões estruturais (FRs), em comparação com um anticorpo parental que não possui essas alterações, tais alterações resultando em uma melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno.

[0245] O termo “fator de crescimento endotelial vascular” ou “VEGF” refere-se à proteína A do fator de crescimento endotelial vascular, como exemplificado pela SEQ ID NO: 47 (ver também Número de Acesso Prot Suíço P15692, Gene ID (NCBI): 7422). O termo “VEGF” abrange a proteína que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, bem como seus homólogos e isoformas. O termo “VEGF” também abrange as isoformas conhecidas, por exemplo, isoformas de emenda (splice), de VEGF, por exemplo, VEGFm, VEGF121, VEGFus, VEGFws, VEGF189 e VEGF206, juntamente com as formas alélicas e processadas de ocorrência natural do mesmo, incluindo fator de crescimento de células endoteliais vasculares humanas de 110 aminoácidos gerado pela divagem de plasmina de VEGF165 como descrito em Ferrara Mol. Biol. Cell. 21: 687 (2010), Leung et al., Science, 246: 1306 (1989) e Houck et al., Md. Endocrin., 5: 1806 (1991). O termo “VEGF” também se refere a VEGFs de espécies não humanas, como camundongo, rato ou primata. Às vezes, o VEGF de uma espécie específica é indicado por termos como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino e assim por diante. O termo “VEGF” também é usado para se referir a formas truncadas do polipeptídeo que compreende os aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do fator de crescimento de células endoteliais vasculares humanas de 165 aminoácidos. A referência a qualquer uma dessas formas de VEGF pode

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66/254 ser identificada no presente pedido, por exemplo, por “VEGF109”, “VEGF (8109)”, “VEGF (1-109)” ou “VEGF165”. As posições de aminoácidos para um VEGF nativo “truncado” são numeradas conforme indicado na sequência VEGF nativa. Por exemplo, a posição 17 de aminoácido (metionina) no VEGF nativo truncado também é a posição 17 (metionina) no VEGF nativo. O VEGF nativo truncado tem afinidade de ligação para os receptores KDR e Flt-1 comparável ao VEGF nativo. O termo “variante de VEGF”, conforme aqui utilizado, referese a um polipeptídeo VEGF que inclui uma ou mais mutações de aminoácidos na sequência nativa de VEGF. Opcionalmente, as uma ou mais mutações de aminoácidos incluem substituição (ões) de aminoácidos. Para fins de designação abreviada de variantes de VEGF aqui descritas, note que os números se referem à posição do resíduo de aminoácido ao longo da sequência de aminoácidos do VEGF nativo putativo (fornecido em Leung et al., supra e Houck et al., supra). Salvo indicação em contrário, o termo “VEGF”, conforme usado aqui, indica VEGF-A.

[0246] Os termos “anticorpo anti-VEGF”, um “anticorpo que se liga ao VEGF” e “anticorpo que se liga especificamente ao VEGF” se referem a um anticorpo que é capaz de se ligar ao VEGF com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como agente de diagnóstico e/ ou terapêutico no direcionamento para VEGF. Em uma forma de realização, a extensão da ligação de um anticorpo anti-VEGF a uma proteína não relacionada não VEGF é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao VEGF conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas formas de realização, um anticorpo que se liga ao VEGF tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10’⁸M ou menos, por exemplo, de 10’⁸ M a 10’¹³ M, por exemplo, de 10’⁹ M a 10’¹³ M). Em certas formas de realização, um anticorpo anti-VEGF se liga a um epítopo de VEGF que é conservado entre VEGF de diferentes

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67/254 espécies.

[0247] 0 termo “anticorpo” aqui é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, entre outros, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.

[0248] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab', FabC, Fab'-SH, F(ab')2; diabodies; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em alguns casos, exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diabodies; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[0249] A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos “Fab” e um fragmento residual “Fc”, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar rapidamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia leve (L) inteira, juntamente com o domínio da região variável da cadeia pesada (H) (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). O tratamento com pepsina de um anticorpo produz um único fragmento F(ab')2 grande que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados a dissulfeto tendo atividade de ligação a antígeno bivalente e ainda é capaz de reticulação de antígeno. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por terem poucos resíduos adicionais no carboxi terminal do domínio CH1, incluindo uma ou mais

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68/254 cisteínas da região de dobradiça (hinge) do anticorpo. As moléculas de Fab-C são moléculas de Fab que são expressas de modo que a sequência seja truncada na primeira dobradiça de cisteína, resultando em um Fab com uma cisteína livre diretamente após a expressão (ver, por exemplo, Shatz et al. Mol. Pharmaceutics 2016; identificador PubMed (PMID) 27244474). Por exemplo, uma molécula Fab-C pode ter uma cisteína livre na posição Cys227 da cadeia pesada. Em outros casos, uma molécula Fab-C pode ter uma cisteína livre na posição Cys229 da cadeia pesada. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' na qual o (s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de dobradiça entre eles. Também são conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos.

[0250] O termo “região Fc” aqui é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma forma de realização, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, até a carboxila terminal da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma aqui, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado de índice EU, como descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[0251 ]“Fv” consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação estreita e não covalente. A partir da dobragem desses dois domínios, emanam seis alças

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69/254 hipervariáveis (3 alças cada uma das cadeias H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para a ligação ao antígeno e conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora frequentemente com uma afinidade menor do que todo o sítio de ligação.

[0252] “Fv de cadeia única” também abreviado como “sFv” ou “scFv” são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo VH e VL conectados a uma única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipeptídeo sFv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite ao sFv formar a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão do sFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore, Springer-Verlag, Nova Iorque, p. 269-315 (1994).

[0253] O termo “diabodies” refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo preparados pela construção de fragmentos de sFv (ver parágrafo anterior) com ligantes curtos (cerca de 5 a 10 resíduos) entre os domínios VH e VL, de modo que o emparelhamento inter-cadeia, mas não intra-cadeia, dos domínios V é alcançado, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento com dois sítios de ligação ao antígeno. Os diabodies biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv “cruzados” nos quais os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Os diabodies são descritos mais detalhadamente em, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993).

[0254] Um anticorpo “bloqueador” ou um anticorpo “antagonista” é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Certos anticorpos bloqueadores ou anticorpos antagonistas inibem

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70/254 substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.

[0255] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais e, inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Um ensaio de competição exemplificativo é fornecido aqui.

[0256] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ ou leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ ou leve é derivada de uma fonte ou espécie diferente.

[0257]A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGi, lgG2, IgGs, lgG4, IgAi, e lgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente.

[0258] Um “anticorpo parental” é um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos a partir da qual um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos por um ou mais resíduos. O anticorpo parental pode compreender uma sequência do tipo nativa ou selvagem. O anticorpo parental pode ter modificações pré-existentes na sequência de aminoácidos (tais como adições, deleções e/ ou substituições) em relação a outras formas nativas, do tipo selvagem ou modificadas de um anticorpo. Um anticorpo parental pode ser direcionado contra um antígeno alvo de interesse, por exemplo, um polipeptídeo biologicamente importante, tal como o VEGF. Qualquer um dos anticorpos aqui descritos (por exemplo, anticorpos antiPetição 870200029674, de 05/03/2020, pág. 81/313

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VEGF) pode ser um anticorpo parental.

[0259] “Funções efetoras” se referem às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.

[0260] “Estrutura” (‘‘Framework’) ou “região estrutural” ou “FR” refere-se a resíduos de domínio variável diferentes de resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4.

[0261] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são aqui utilizados de forma intercambiável para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa ou que possui cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme aqui definido.

[0262] Uma “estrutura de consenso humano” é uma estrutura que representa os resíduos de aminoácidos mais comuns em uma seleção de sequências estruturais de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-

3. Em uma forma de realização, para o VL, o subgrupo é o subgrupo kappa I, como em Kabat et al., supra. Em uma forma de realização, para o VH, o subgrupo é o subgrupo III, como em Kabat et al., supra.

[0263] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por

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72/254 exemplo, roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada do anticorpo não humano. Na maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primata não humano com a especificidade, afinidade e capacidade de anticorpos desejadas. Em alguns casos, os resíduos FR da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos os pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos as alças hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

[0264] O termo “variável” refere-se ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos. O domínio variável ou “V” medeia a ligação ao antígeno e define a especificidade de um anticorpo específico para seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída igualmente no intervalo dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes chamados regiões estruturais (FRs) de 15 a 30 aminoácidos

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73/254 separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas “regiões hipervariáveis” com 9 a 12 aminoácidos cada uma. O termo “região hipervariável” ou “HVR”, quando usado aqui, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de, por exemplo, em torno dos resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e em torno dos resíduos 26-35 (H1), 49-65 (H2) e 95-102 (H3) no VH (em uma forma de realização, H1 está em tomo dos resíduos 31-35); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) el ou os resíduos de uma “alça hipervariável” (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) o VL e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no VH; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987).Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem, cada um, quatro FRs, adotando amplamente uma configuração de folha beta, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam alças conectando e, em alguns casos, formando parte da estrutura da folha beta. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Por conseguinte, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1 (L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, como a participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

[0265] O termo “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat” ou “numeração de posição de aminoácidos como em Kabat” e suas

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74/254 variações refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al. supra. Usando este sistema de numeração, a sequência linear de aminoácidos real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondentes a um encurtamento ou inserção em um FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da cadeia pesada FR. A numeração de resíduos Kabat pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat “padrão”.

[0266] O sistema de numeração Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5^a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O “sistema de numeração EU” ou “índice EU” é geralmente usado quando se refere a um resíduo em uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al., supra). O “índice EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduos do anticorpo humano lgG1 de EU. Salvo indicação em contrário, referências a números de resíduos no domínio variável de anticorpos significam a numeração de resíduos pelo sistema de numeração Kabat. A menos que indicado de outra forma aqui, referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpos significam a numeração de resíduos pelo sistema de numeração EU (por exemplo, consulte o Pedido Provisório US 60/640.323, Figuras para numeração EU).

[0267] Salvo indicação em contrário, os resíduos HVR e outros

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75/254 resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados aqui de acordo com Kabat et al., supra.

[0268] O termo “anticorpo isolado”, quando usado para descrever os vários anticorpos aqui divulgados, significa um anticorpo que foi identificado e separado e/ ou recuperado de uma célula ou cultura de células a partir da qual foi expresso. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que normalmente interferem nos usos diagnósticos ou terapêuticos do polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em algumas formas de realização, um anticorpo é purificado para pureza superior a 95% ou 99%, conforme determinado por, por exemplo, eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, foco isoelétrico (IEF), eletroforese capilar) ou cromatografia (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para uma revisão dos métodos para avaliação da pureza do anticorpo, ver, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007). Em formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de um sequenador de copo giratório ou (2) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras usando azul de Coomassie ou, preferencialmente, mancha de prata. O anticorpo isolado inclui anticorpos in situ dentro de células recombinantes, porque pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. Normalmente, no entanto, o polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0269] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênios, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ ou se ligam ao mesmo epítopo,

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76/254 exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em pequenas quantidades. Em contraste às preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, entre outros, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fagos e métodos que utilizam animais transgênicos contendo todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana, esses métodos e outros métodos exemplificativoss para produzir anticorpos monoclonais sendo descritos aqui.

[0270] O termo “anticorpo multiespecífico” é usado no sentido mais amplo e abrange especificamente um anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) e um domínio variável da cadeia leve (VL), em que a unidade VH-VL possui especificidade poliepitópica (ou seja, é capaz de ligação a dois epítopos diferentes em uma molécula biológica ou a cada epítopo em uma molécula biológica diferente). Tais anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitados a anticorpos completos, anticorpos com dois ou mais domínios VL e VH, fragmentos de anticorpos como Fab, Fab', Fab-C. Fv, dsFv, scFv, diabodies, diabodies e triabodies biespecíficos, fragmentos de anticorpos que foram ligados covalentemente ou

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77/254 não covalentemente. “Especificidade poliepitópica” refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois ou mais epítopos diferentes no mesmo ou em diferente(s) alvo(s). “Especificidade dupla” ou “biespecificidade” refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois epítopos diferentes no (s) mesmo (s) alvo (s) ou diferentes. No entanto, em contraste com os anticorpos biespecíficos, os anticorpos duplamente específicos têm dois braços de ligação a antígenos que são idênticos na sequência de aminoácidos e cada braço Fab é capaz de reconhecer dois antígenos. A especificidade dupla permite que os anticorpos interajam com alta afinidade com dois antígenos diferentes como uma única molécula Fab ou IgG. De acordo com uma forma de realização, o anticorpo multiespecífico em uma forma de lgG1 se liga a cada epítopo com uma afinidade de 5 μΜ a 0,001 pM, 3 μΜ a 0,001 pM, 1 pM a 0,001 pM, 0,5 pM a 0,001 pM ou 0,1 pM a 0,001 pM. “Monoespecífico” refere-se à capacidade de se ligar apenas a um epítopo.

[0271] “Anticorpos nativos” se referem a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente com estruturas variadas. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que estão ligadas por dissulfeto. A partir do N- ao Cterminal, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também denominada domínio pesado variável ou domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Da mesma forma, a partir do N- ao C- terminal, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também denominada domínio leve variável ou domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dos dois tipos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante.

[0272] No que diz respeito à ligação de um anticorpo a uma

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78/254 molécula alvo, o termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo específico ou um epítopo em um alvo polipeptídico específico significa a ligação que é mensurável diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada pela competição com uma molécula de controle que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for inibida competitivamente pelo excesso de alvo não marcado. O termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo específico ou um epítopo em um alvo polipeptídico específico, conforme aqui utilizado, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com um Kd para o alvo de 10-4 M ou menos, alternativamente 10-5 M ou menos, alternativamente 10-6 M ou menos, alternativamente 10-7 M ou menos, alternativamente 10-8 M ou menos, alternativamente 10-9 M ou menos, alternativamente 10-10 M ou menos, alternativamente 10-11 M ou menos, alternativamente 10-12 M ou menos ou um Kd na faixa de 10-4 M a 10-6 M ou

106Ma1010Mou107Ma109M. Como será apreciado pelo técnico no assunto, os valores de afinidade e Kd estão inversamente relacionados. Uma alta afinidade para um antígeno é medida por um baixo valor de Kd. Em uma forma de realização, o termo “ligação específica” refere-se à ligação em que uma molécula se liga a um polipeptídeo ou epítopo específico em um polipeptídeo específico sem se ligar substancialmente a qualquer outro epítopo polipeptídico ou polipeptídeo.

[0273]“Identidade de sequência de aminoácidos em porcentagem (%)” em relação a uma sequência de polipeptídeo de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência

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79/254 candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de seqüências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Para os fins deste documento, no entanto, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequência ALIGN-2 foi de autoria da Genentech, Inc., e o código fonte foi depositado com documentação do usuário no Escritório de direitos autorais dos EUA, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob o n°. de registro de direitos autorais dos EUA TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente na Genentech, Inc., São Francisco do Sul, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[0274] Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade da sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode ser expressa

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80/254 alternativamente como uma determinada sequência de aminoácido A que possui ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma: 100 vezes a fração X/ Y, em que X é o número de resíduos de aminoácidos classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 no alinhamento de A e B desse programa e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que, onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A. A menos que seja especificado de outra forma, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos aqui utilizados são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior usando o programa de computador ALIGN-2.

[0275] Como aqui utilizado, “administração” significa um método para fornecer uma dosagem de um composto (por exemplo, conjugado de anticorpo-hidrogel da invenção) ou uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica, por exemplo, uma composição farmacêutica incluindo um conjugado de anticorpo-hidrogel da invenção) a um sujeito. As composições utilizadas nos métodos aqui descritos podem ser administradas, por exemplo, por via intravítrea (por exemplo, por injeção intravítrea), por colírio, por vias intramuscular, tópica, subconjuntival, intravesicular, intraocular, infraorbital, por injeção, por implantação, por infusão, por infusão contínua, em composições lipídicas.

[0276]“Angiogênese” refere-se ao processo pelo qual novos vasos sanguíneos se formam a partir de vasos sanguíneos pré-existentes. A angiogênese é distinta da vasculogênese, que é a formação de novo de células endoteliais a partir de precursores de células mesodérmicas. Os distúrbios

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81/254 associados à angiogênese patológica podem ser tratados por composições e métodos da invenção. Esses distúrbios incluem distúrbios não neoplásicos e distúrbios proliferativos celulares. Os distúrbios proliferativos celulares incluem, mas não estão limitados aos descritos abaixo. Os distúrbios não neoplásicos incluem, mas não estão limitados a condições oculares (condições oculares não limitantes incluem, por exemplo, retinopatia, incluindo retinopatia diabética proliferativa, neovascularização da coróide (CNV), degeneração macular relacionada com a idade (AMD), retinopatias diabética e outras relacionadas a isquemia, edema macular diabético (DME), miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, oclusão de veia da retina (incluindo as formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), neovascularização da córnea, neovascularização da retina, retinopatia da prematuridade (ROP), vitreorretinopatia exsudativa familiar (FEVR), doença de Coats, doença de Norrie, síndrome de Osteoporose-Pseudoglioma (OPPG), hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular e retinopatia hipertensiva), doenças auto-imunes (por exemplo, artrite reumatóide (RA), psoríase, espondilite anquilosante e doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa)), hipertrofia indesejada ou anormal, artrite, artrite psoriática, placas psoriáticas, sarcoidose, aterosclerose, placas ateroscleróticas, arteriosclerose arterial, reestenose vascular, malformações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tireóide (incluindo a doença de Grave), transplante de córnea e outros tecidos, inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda/ ARDS, sepse, hipertensão pulmonar primária, derrame pulmonar maligno, edema cerebral (por exemplo, associado a acidente vascular cerebral agudo/ traumatismo/ trauma craniano fechado), inflamação sinovial, formação de pannus na RA, miosite ossificante, formação óssea hipertrófica, osteoartrite (OA), ascites refratárias, doença ovariana policística, endometriose, terceiro espaçamento de

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82/254 doenças fluidas (pancreatite, síndrome do compartimento, queimaduras, doença intestinal), asma crônica, fibróides uterinos, trabalho de parto prematuro, inflamação crônica tal como IBD (doença de Crohn e colite ulcerativa), doenças renais inflamatórias (incluindo glomerulonefrite, especialmente glomerulonefrite mesangioproliferativa, síndrome hemolítica urêmica, nefropatia diabética e nefrosclerose hipertensiva), doenças que ocorrem após transplantes, rejeição de aloenxerto renal, doenças inflamatórias, síndrome nefrótica, crescimento indesejável ou anormal de massa de tecido (não-câncer), articulações hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição do crescimento capilar, síndrome de Osler-Weber, fibroplasias retrolentais de granuloma piogênico, escleroderma, tracoma, aderências vasculares, sinovite, dermatite, pré-eclâmpsia, ascite, derrame pericárdico (tal como o associado à pericardite) e derrame pleural. Distúrbios oculares adicionais são descritos abaixo.

[0277] Outros distúrbios que podem estar associados à angiogênese patológica incluem fraturas sem união (fraturas que não cicatrizam), granuloma piogênico, tracoma, articulações hemofílicas, aderências vasculares e cicatrizes hipertróficas, rejeição a enxerto, tecido fibrovascular, acne rosácea, síndrome da imunodeficiência adquirida, oclusão da artéria, ceratite atópica, úlceras bacterianas, doença de Bechet, doença obstrutiva carotídea, inflamação crônica, descolamento de retina crônico, uveíte crônica, vitrite crônica, excesso de lentes de contato, rejeição a enxerto de córnea, neovascularização de enxerto de córnea, doença de Eales, ceratoconjuntivite epidêmica, úlceras fúngicas, infecções por Herpes simplex, infecções por Herpes zoster, síndromes de hiperviscosidade, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneração lipídica, doença de Lyme, ceratólise marginal, úlcera de Mooren, infecções por micobactérias que não sejam lepra, miopia, fossas ópticas, osteoartrite, doença de Paget, pars planite, penfigóide,

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83/254 filectenulose, poliarterite, complicações pós-laser, infecções por protozoários, pseudoxantoma elástico, ceratite sicca do pterígio, ceratotomia radial, fibroplasias retrolentais, sarcoide, esclerite, anemia falciforme, síndrome de Sjogren, doença de Stargarts, doença de Steven Johnson, ceratite límbica superior, sífilis, lúpus sistêmico, degeneração marginal de Terrien, toxoplasmose, trauma, oclusão de veias, deficiência de vitamina A e sarcoidose de Wegeners, angiogênese indesejada associada a diabetes, doenças parasitárias, cicatrização anormal de feridas, hipertrofia após cirurgia, lesão ou trauma, inibição de crescimento capilar, inibição de ovulação e formação de corpo lúteo, inibição de implantação e inibição do desenvolvimento embrionário no útero.

[0278] O termo “distúrbio ocular”, como aqui utilizado, inclui qualquer distúrbio ocular (também referido aqui de forma intercambiável como “condição ocular”) associado à angiogênese patológica. Um distúrbio ocular pode ser caracterizado por proliferação alterada ou não regulada e/ ou invasão de novos vasos sanguíneos nas estruturas dos tecidos oculares, tais como retina ou córnea. Os distúrbios oculares não limitantes incluem, por exemplo, AMD (por exemplo, AMD úmida, AMD seca, AMD intermediária, AMD avançada e atrofia geográfica (GA)), degeneração macular, edema macular, DME (por exemplo, DME focal, não central e DME difuso e envolvido no centro), retinopatia, retinopatia diabética (DR) (por exemplo, DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) e DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquemia, ROP, oclusão de veia da retina (RVO) (por exemplo, formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), CNV (por exemplo, CNV míope), neovascularização da córnea, doenças associadas à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, doenças associadas à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, FEVR, doença de Coats, doença

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84/254 de Norrie, OPPG, hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intraocular, degeneração da retina, edema macular cistoide (CME), vasculite, papiloedema, retinite, conjuntivite (por exemplo, conjuntivite infecciosa e conjuntivite não infecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber (também conhecida como amaurose congênita de Leber ou LCA), uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não infecciosa), coroidite (por exemplo, coroidite multifocal), histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática, doença de Sjogren e outras doenças oftálmicas em que a doença ou distúrbio está associado à neovascularização ocular, vazamento vascular e/ ou edema da retina. Distúrbios oculares exemplificativos adicionais incluem doenças associadas à rubeose (neovascularização do ângulo) e doenças causadas pela proliferação anormal de tecido fibrovascular ou fibroso, incluindo todas as formas de vitreorretinopatia proliferativa.

[0279] As doenças exemplificativas associadas à neovascularização da córnea incluem, mas não estão limitadas a ceratoconjuntivite epidêmica, deficiência de vitamina A, excesso de lentes de contato, ceratite atópica, ceratite límbica superior, ceratite sicca do pterígio, síndrome de Sjogren, acne rosácea, filectenulose, sífilis, infecções por micobactérias, degeneração lipídica, queimaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecções por Herpes simplex, infecções por Herpes zoster, infecções por protozoários, sarcoma de Kaposi, úlcera Mooren, degeneração marginal de Terrien, ceratólise marginal, artrite reumatóide, lúpus sistêmico, poliarterite, trauma, sarcoidose de Wegener, esclerite, Síndrome de Stevens-Johnson, ceratotomia radial perifigóide e rejeição do gráfico da córnea.

[0280] As doenças exemplificativas associadas à

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85/254 neovascularização da retina/ coróide incluem, entre outras, retinopatia diabética, degeneração macular, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, doença de Paget, oclusão de veias, oclusão da artéria, doença obstrutiva carotídea, uveíte/ vitrite crônicas, infecções por micobacterias, doença de Lyme, lúpus eritematoso sistêmico, retinopatia da prematuridade, retinite pigmentosa, edema da retina (incluindo edema macular), doença de Eales, doença de Behcet, infecções causadoras de retinite ou coroidite (por exemplo, coroidite multifocal), histoplasmose ocular presumida, doença de Best (degeneração macular viteliforme), miopia, fossas ópticas, doença de Stargart, pars planite, descolamento de retina (por exemplo, descolamento crônico de retina), síndromes de hiperviscosidade, toxoplasmose, trauma e complicações pós-laser.

[0281] “Distúrbios associados a permeabilidade vascular indesejável”, como aqui utilizado, incluem, por exemplo, edema associado a tumores cerebrais, ascites associadas a doenças malignas, síndrome de Meigs, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica, derrame pericárdico, derrame pleural, permeabilidade associada a doenças cardiovasculares tais como condição após infartos e derrames do miocárdio e afins.

[0282]Uma “variante” ou “mutante” de um polipeptídeo de partida ou de referência (por exemplo, um anticorpo de referência ou seu (s) domínio (s) variável (is)/ HVR (s)) é um polipeptídeo que (1) possui uma sequência de aminoácidos diferente daquela do polipeptídeo de partida ou de referência e (2) foi derivado do polipeptídeo de partida ou de referência através de mutagênese natural ou artificial (sintética). Tais variantes incluem, por exemplo, deleções e/ ou inserções e/ ou substituições de resíduos na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse, aqui referidos como “alterações de resíduos de aminoácidos”. Assim, uma variante HVR refere-se a a uma HVR que compreende uma sequência

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86/254 variante em relação a uma sequência polipeptídica de partida ou de referência (como a de um anticorpo fonte ou fragmento de ligação ao antígeno). Uma alteração de resíduo de aminoácido, neste contexto, refere-se a um aminoácido diferente do aminoácido na posição correspondente em uma sequência polipeptídica de partida ou de referência (como a de um anticorpo de referência ou seu fragmento). Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à variante final ou construto mutante, desde que o construto final possua as características funcionais desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar os processos pós-traducionais do polipeptídeo, como a alteração do número ou posição dos sítios de glicosilação.

[0283] Uma sequência “tipo selvagem (WT)” ou “referência” ou a sequência de uma proteína/ polipeptídeo “tipo selvagem” ou “referência”, tal como uma HVR ou um domínio variável de um anticorpo de referência, pode ser a sequência de referência a partir do qual polipeptídeos variantes são derivados através da introdução de mutações. Em geral, a sequência “tipo selvagem” para uma dada proteína é a sequência mais comum na natureza. Da mesma forma, uma sequência de gene do “tipo selvagem” é a sequência desse gene que é mais comumente encontrada na natureza. Mutações podem ser introduzidas em um gene do “tipo selvagem” (e, portanto, na proteína que ele codifica) por processos naturais ou por meios induzidos pelo homem. Os produtos de tais processos são formas “variantes” ou “mutantes” da proteína ou gene “tipo selvagem” original.

[0284] O termo “depuração” (“clearance), conforme usado aqui, refere-se ao volume de uma substância (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF, um conjugado de anticorpo, uma proteína de fusão (por exemplo, uma proteína de fusão Fab) ou uma formulação polimérica) depurada de um compartimento

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87/254 (por exemplo, o olho (por exemplo, o vítreo)) por unidade de tempo.

[0285]O termo “meia-vida” refere-se ao tempo necessário para a concentração de uma substância (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF, um conjugado de anticorpo, uma proteína de fusão (por exemplo, uma proteína de fusão Fab) ou uma formulação polimérica) diminuir pela metade, in vivo (por exemplo, no olho (por exemplo, o vítreo)) ou in vitro.

[0286]O termo “meia-vida efetiva” refere-se ao tempo necessário para a concentração de um conjugado, por exemplo, um conjugado hidrogel-ligante-anticorpo, diminuir pela metade, in vivo (por exemplo, no olho, por exemplo, no vítreo) ou in vitro. Entende-se que cada um dos componentes do conjugado, por exemplo, o hidrogel, o ligante e o anticorpo, pode contribuir para a meia-vida efetiva do conjugado.

Purificação de HA [0287]O HA pode, opcionalmente, ser purificado antes da derivação de acordo com os métodos da presente invenção. Em alguns desses aspectos, é formada uma solução aquosa que compreende HA e de cerca de 0,5 a cerca de 1 mol/L de acetato de sódio. O HA é precipitado da solução por adição de etanol a cerca de 80% de etanol v/ v. O HA precipitado é coletado e lavado com cerca de 80% v/ v de etanol seguido por etanol absoluto. O procedimento de dissolução/ precipitação/ lavagem pode ser repetido conforme necessário até que a pureza desejada seja alcançada.

Preparação de Ácido Hialurônico Funcionalizado com Amina [0288]Em alguns aspectos, o ácido hialurônico é funcionalizado com uma amina reagindo uma mistura reacional que compreende HA de fórmula I, uma amina primária (H2N-LA-NH2) e um reagente de acoplamento ativador de carboxila para formar amina-HA de fórmula II e amina-HA parcialmente reticulada de fórmula III, de acordo

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88/254 com o esquema de reação 1 abaixo.

Esquema de Reação 1

I

H₂N-L_a-NH₂

Reagente de acoplamento Tampão

II

[0289] O grau de funcionalização de HA II e III com o reagente amina H2N-LA-NH2, como mostrado no Esquema de Reação 1, é como aqui descrito em outra parte.

[0290] No Esquema de Reação 1, cada Ra¹ é selecionado independentemente a partir de H, alquila C1-4, um contra-íon de metal alcalino, um contra-íon de amônio ou um contra-íon de metal alcalino-terroso. Cada Ra²é selecionado independentemente a partir de H, alquila C1-4 e um contra-íon de metal alcalino. A ligação éster de reticulação na fórmula III pode subsequentemente ser hidrolisada, como descrito mais abaixo, para fornecer

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89/254 material adicional da fórmula II e tornar o produto da reação do Esquema 1 sensível a filtração estéril.

[0291] Em alguns desses aspectos, L^A é um espaçador. Em alguns outros aspectos, La é alquileno C1-10 opcionalmente substituído e/ ou opcionalmente interrompido. Em alguns desses aspectos, La é alquileno C2-4 linear ou é n-propileno. Em outros aspectos, La pode compreender um oligômero de oxialquileno ou polímero, tal como polietileno glicol (PEG).

[0292] A formação de am ida no Esquema de Reação 1 utiliza um reagente de acoplamento que, em certas formas de realização, pode ser selecionado a partir de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), cloreto de 4-(4,6dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMM) e 2-cloro-4,6-dimetoxi-

1,3,5-triazina) (CDMT). Em alguns aspectos particulares, o reagente de acoplamento é EDC.

[0293] Em alguns aspectos, a mistura reacional pode ainda compreender um aditivo de acoplamento. Em alguns desses aspectos, o aditivo de acoplamento pode ser selecionado a partir de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 1-hidroxi-7-aza-1 H-benzotriazol (HOAt), N-hidroxissuccinimida (HOSu) e etil 2ciano-2-(hidroximino) acetato (Oxyma pure®). Em alguns aspectos particulares, o aditivo de acoplamento é HOBt. Em outras formas de realização, o reagente de acoplamento pode ser hexafluorofosfato de 1-ciano-2-etoxi-2oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morfolino-carbenio (COMU). Um tampão com um pH de cerca de 5 a cerca de 6 a uma concentração de cerca de 50 mM a 150 mM é geralmente adequado para a mistura reacional para formar ácido hialurônico funcionalizado com amina. Em alguns desses aspectos, o tampão é o ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES).

[0294]A mistura reacional pode, em algumas formas de realização, compreender ainda um solvente aprótico polar para melhorar a

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90/254 solubilidade dos reagentes. Em tais aspectos, as razões adequadas de tampão para solvente aprótico polar são de cerca de 1: 3 v/ v, cerca de 1: 2 v/ v, cerca de 1: 1,5 v/ v, cerca de 1: 1 v/ v, cerca de 1,5: 1 v/ v, cerca de 2: 1 v/ v, cerca de 3: 1 v/ v, cerca de 5: 1 v/ v ou cerca de 10: 1 v/ v. Em alguns desses aspectos, o solvente aprótico polar pode ser selecionado a partir de acetona, Ν,Ν-dimetil formamida (DMF), acetonitrila (ACN), dimetilsulfóxido (DMSO) e combinações dos mesmos. Em um aspecto, o solvente é acetonitrila.

[0295]A funcionalização da amina pode ser feita a uma temperatura de cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C ou cerca de 40 °C, durante um tempo adequado para obter acoplamento essencialmente completo, tal como cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 10 horas, cerca de 12 horas ou mais.

[0296] Em qualquer um dos vários aspectos da invenção, os equivalentes de grupos carboxila excedem os equivalentes de amina primária no HA formado e funcionalizado, como descrito acima, de modo que nem todos os grupos carboxila do HA são funcionalizados, como representado no esquema de reação I. Mais particularmente, são introduzidas funcionalidades de amina para fornecer um grau de funcionalização do HA (ou um derivado do mesmo ou um sal de metal alcalino do mesmo) de cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14% ou cerca de 15%, e faixas dos mesmos, ou como descrito em outras partes deste documento. A concentração de hialuronato, amina primária e aditivo de acoplamento pode ser mantida constante e as referidas concentrações são independentes da carga de amina desejada do ácido hialurônico funcionalizado com amina formado.

[0297] Exemplos de concentrações adequadas de hialuronato

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91/254 podem variar, por exemplo, de 2 g/ L a 16 g/ L. O número de equivalentes de reagente amina e aditivos de acoplamento de am ida em relação aos equivalentes de grupos carboxilato em HA I pode ser variado conforme necessário para fornecer o grau desejado de funcionalização. O grau de funcionalização, em algumas formas de realização, pode ser controlado com base nos equivalentes de reagente de acoplamento de am ida na presença de excesso de reagente de amina.

[0298] Como representado no Esquema de Reação 1, uma porção do HA pode ser reticulada por ligações éster para formar amina-HA parcialmente reticulado. Esse HA parcialmente reticulado é solúvel em sistemas aquosos, mas na maioria dos casos não é filtrável estéril. O HA reticulado pode ser incubado na presença de uma base para hidrolisar as ligações éster e fornecer amina-HA linear. Bases adequadas incluem bases de metais alcalinos, como NaOH, KOH e LiOH. A hidrólise pode ser feita em uma concentração de base, tal como cerca de 0,1 M, cerca de 0,5 M, cerca de 1 M, cerca de 1,5 M ou cerca de 2 M, a um pH de cerca de 12 a cerca de 14, cerca de 13 a cerca de 14 ou cerca de 14, a uma temperatura de cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C ou cerca de 40 °C, durante um tempo adequado para obter uma hidrólise essencialmente completa, tal como cerca de 0,5 horas, cerca de 1 hora, cerca de 1,5 horas, cerca de 2 horas ou mais. Essa amina-HA hidrolisada tem um peso molecular numérico médio essencialmente igual ao do material de partida de HA nativo, é solúvel em sistemas aquosos e é filtrável estéril. Após a hidrólise, o pH pode ser ajustado para de cerca de 6 a cerca de 8,5, de cerca de 6,5 a cerca de 8 ou para cerca de 7,5 com um ácido mineral ou um ácido orgânico. Em alguns aspectos, o ácido é ácido acético.

Preparação de HA Funcionalizado com Maleimido [0299] Em alguns aspectos da invenção, o HA funcionalizado com

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92/254 amina, aqui descrito em outras partes, é reagido com -N-hidroxissuccinimida (NHS)-La-maleimida ou NHS-Lc-maleimida para formar o HA funcionalizado com maleimida. Em alguns desses aspectos, o derivado de HA da fórmula II é reagido com NHS-l_B-maleimida ou NHS-Lc-maleimida (onde NHS é Nhidroxissuccinimida e está na forma de um éster ativado com Lb ou Lc) para formar HA funcionalizado com maleimida de fórmula IV de acordo com o esquema de reação 2 abaixo.

Esquema de Reação 2

II

IV em que Ra¹, Ra² e L^A são como aqui descritos em outros lugares.

Em alguns aspectos particulares, o espaçador de maleimida é L^B. Em outros aspectos, o espaçador de maleimida é L^c. O grau de funcionalização de HA II e IV com reagente amina H2N-L^A-NH2 e L^B-maleimida ou L^c-maleimida respectivamente, como mostrado no Esquema de Reação 2, é arbitrário, e deve-se entender que o grau de funcionalização pode variar conforme desejado para diferentes formas de realização da invenção, e o grau de funcionalização da maleimida pode ser como aqui descrito em outro lugar. Em muitas formas de realização, a maioria ou todos os grupos funcionais de amina no HA II são reagidos com LB-maleimida ou L^c-maleimida, mas em certas

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93/254 formas de realização, os grupos funcionais de amina residuais podem estar presentes.

[0300] Em alguns aspectos, L^B é uma porção espaçadora como descrito aqui. Em alguns aspectos, L^B é um alquileno C1-10 opcionalmente substituído e/ ou opcionalmente interrompido. Em alguns aspectos, L^B é -C(O)alquileno C1-5. Em alguns desses aspectos, Lb é linear -(O)-alquileno C2-3 ou é C(O)-etileno.

[0301] Em alguns aspectos, L^c é uma porção espaçadora biodegradável, conforme descrito aqui. Em alguns aspectos, L^c pode compreender pelo menos uma porção éster, pelo menos uma ligação de carbonato ou combinações das mesmas.

[0302] Em alguns aspectos, o L^c é da estrutura:

o

em que m é selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10, e intervalos construídos a partir deles, tais como de 1 a 10, de 2 a 8 ou de 5 a 8. n é selecionado a partir de 1, 2, 3 e 4 e intervalos construídos a partir deles, tais como de 1 a 4 ou de 1 a 3. o é selecionado a partir de 1, 2, 3 e 4 e intervalos construídos a partir deles, tal como de 1 a 4, ou de 1 a 3. Em tais formas de realização, o reagente Lc-maleimida tem a estrutura

' / η θ [0303] Em alguns aspectos, em que m é 7, L^c compreende uma porção derivada do ácido azelaico, tal como uma porção éster do ácido azelaico. Em um desses aspectos, Lc é da estrutura:

OOO

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94/254 [0304] Em tais formas de realização, o reagente Lc-maleimida tern a estrutura

[0305]0 pH da reação para os eventos do Esquema de Reação 2 é adequadamente de cerca de 6,5 a cerca de 9, de cerca de 7 a cerca de 8 ou cerca de 7,4. Uma concentração de tampão de cerca de 50 mM a cerca de 150 mM é geralmente adequada para a mistura reacional para formar ácido hialurônico funcionalizado com maleimida. Em alguns desses aspectos, o tampão é selecionado a partir de ácido (4-(2hidroxietil)-1-piperazina etanossulfônico) (HEPES), maleato, citrato, BISTris, fosfato, ácido N-(2-acetamido) iminodiacético (ADA), carbonato, ácido piperazina-N,N'-bis(2-etanossulfônico) (PIPES), ácido 3-morfolino-2hidroxipropanossulfônico (MOPSO), imidazol, BIS-Tris-Propano, ácido N,Nbis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico (BES), ácido 3-(Nmorfolino)propanossulfônico) (MOPS), ácido 2-[(2-hidroxi-1,1-bis (hidroximetil) etil) amino] etanossulfônico (TES), ácido 3- (bis (2-hidroxietil) amino)-2-hidroxipropano-1 -sulfônico (DIPSO), ácido 2-hidroxi-3- [tris (hidroximetil) metilamino] -1-propanossulfônico (TAPSO), ácido 4-(2hidroxietil)piperazina-1 -(2-hidroxipropanossulfônico) (HEPPSO), ácido piperazina-1,4-bis (2-hidroxipropanossulfônico) desidratado (POPSO), triceno, glicilglicina e Tris. Em alguns aspectos particulares, o tampão é HEPES. A mistura reacional pode ainda compreender um solvente aprótico polar para melhorar a solubilidade dos reagentes. Em tais aspectos, as razões adequadas de tampão para solvente aprótico polar são de cerca de 1: 3 v/ v, cerca de 1: 2 v/ v, cerca de 1: 1,5 v/ v, cerca de 1: 1 v/ v, cerca de 1,5: 1 v/ v, cerca de 2: 1 v/ v, cerca de 3: 1 v/ v, cerca de 5: 1 v/ v ou cerca

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95/254 de 10: 1 v/ v. Em alguns desses aspectos, o solvente aprótico polar pode ser selecionado a partir de acetona, DMF, ACN, DMSO e combinações dos mesmos. Em um aspecto, o solvente é ACN. A temperatura da reação é de cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C ou cerca de 40 °C, e o tempo de reação é de cerca de 0,5 horas, cerca de 1 hora, cerca de 1,5 horas, cerca de 2 horas ou mais.

[0306] Em alguns aspectos do esquema de reação 2, o HA funcionalizado com maleimida é obtido pela reação da amina primária do HA funcionalizado com amina com um reagente NHS-l_B-maleimida, de acordo com o esquema de reação 3 abaixo.

Esquema de Reação 3

NHS-L^b- maleimida [0307] Em alguns aspectos particulares, L^A é n-propileno e L^B é C(O)-(CH₂)2-. Em alguns aspectos, o tampão é HEPES, o pH da reação é de cerca de 7 a cerca de 8 ou cerca de 7,4, o tampão compreende ACN em uma razão de volume de tampão para ACN de cerca de 2: 1, a temperatura da reação é de cerca de 20 °C a cerca de 30 °C, e o tempo de reação é de cerca de 0,5 horas a cerca de 2 horas.

[0308] Em alguns outros aspectos do esquema de reação 2, o HA funcionalizado com maleimido é obtido pela reação da amina primária do HA funcionalizado com amina com um reagente NHS-Lc-maleimida de acordo com o esquema de reação 4 abaixo.

Esquema de reação 4

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HA-NH-L^a-NH₂

NHS-L^C- reagente maleimida

HA-NH-L^a-NH^

[0309] Em alguns aspectos particulares, L^A é n-propileno e L^c é da

estrutura o

n ° A VNH (^ch2)o onde m é 7, p é 2 e o é 2. Em alguns aspectos, o tampão é HEPES, o pH da reação é de cerca de 8 a cerca de 9 ou cerca de 7,4, o tampão compreende ACN em uma razão volumétrica de tampão para ACN de cerca de 2: 1, a temperatura da reação é de cerca de 20 °C a cerca de 30 °C, e o tempo de reação é de cerca de 1 hora a cerca de 3 horas.

Preparação Direta de HA Funcionalizado com Maleimido [0310] Em alguns aspectos, como representado na Figura 2, os grupos maleimida podem ser diretamente conjugados ao HA ao reagir uma mistura reacional que compreende HA (ou um derivado ou sal do mesmo), composto 2 de maleimida da estrutura o h₂n-l¹—iZj] o e um reagente de acoplamento de ativação de carboxila para formar o composto 4 com grupos conjugados de maleimida.

[0311]L¹ é uma porção espaçadora como aqui descrita. Em alguns aspectos, Li é alquila C1-12, alquila C2-10 ou alquila C3-8. L1 pode ser opcionalmente substituído e/ ou opcionalmente interrompido, como descrito em outras partes aqui. Por exemplo, L¹ pode, opcionalmente, ser interrompido por uma ou mais dentre uma amida ou uma amina.

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Preparação de HA Funcionalizado com Tiol [0312] Em alguns aspectos da invenção, o HA funcionalizado com amina aqui descrito em outra parte é reagido com o grupo protetor NHS-L^B-S ou o grupo protetor NHS-L^C-S seguido de desproteção para formar o HA funcionalizado com tiol. Em alguns desses aspectos, a fórmula II ou a fórmula Ha é reagida com o grupo protetor NHS-L^B-S ou grupo protetor NHS-L^C-S para formar a fórmula V seguida de desproteção para formar HA funcionalizado com tiol da fórmula VI, de acordo com o esquema de reação 5 abaixo.

Esquema de Reação 5

II

NHS-L_b-S-PG ou

NHS-L_C-S-PG

Tampão ^PG s^^PG

Agente redutor

VI em que Ra¹, Ra², L^A, L^B e L^c são como aqui descritos em outra parte. Em alguns aspectos particulares, o espaçador que se conecta a S-PG no composto V de, e a -SH no composto VI do Esquema 5 é L^c.

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98/254 [0313] Como no Esquema de Reação 5 acima, o grau de funcionalização de HA V e VI com o grupo protetor NHS-L^B-S ou grupo protetor NHS-L^C-S, mostrado no Esquema de Reação 5, é arbitrário e deve ser entendido que o grau da funcionalização pode ser variado conforme desejado para diferentes formas de realização da invenção. O grau de funcionalização de tiol protegido (e, finalmente, do tiol) é como descrito em outra parte deste documento. Em muitas formas de realização, a maioria ou todos os grupos funcionais de amina no HA II são reagidos com o grupo protetor de NHS-L^B-S ou grupo protetor de NHS-L^C-S, mas em certas formas de realização grupos funcionais de amina residuais podem estar presentes.

[0314] O pH da reação de conjugação para o Esquema de Reação 5 é adequadamente de cerca de 7,5 a cerca de 9,5, ou de cerca de 8 a cerca de 9, tal como cerca de 8,5. Tampões adequados a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 150 mM são descritos em outra parte aqui. Em alguns aspectos, o tampão é HEPES. A mistura reacional pode ainda compreender um solvente aprótico polar como aqui descrito em outro lugar para melhorar a solubilidade dos reagentes. Em alguns aspectos, o solvente é ACN. A razão de tampão para solvente aprótico polar é adequadamente de cerca de 1: 2 v/ v a cerca de 4: 1 ou de cerca de 3: 1 a cerca de 1: 1, tal como cerca de 2: 1. A temperatura da reação é de cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C ou cerca de 40 °C, e o tempo de reação é de cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas ou mais.

[0315] O derivado de HA da Fórmula V é colocado em contato com um agente redutor para clivar o grupo protetor na ligação dissulfeto, gerando assim Lb ou Lc terminados com um tiol (Fórmula VI). Grupos protetores cliváveis são conhecidos na técnica e exemplos não limitativos incluem piridil-tiol e fenil-tiol, que podem ser opcionalmente substituídos com

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99/254 pelo menos um substituinte selecionado independentemente a partir de NO2, Cl, F, CN, CO2H e Br. Em um desses aspectos, o grupo de partida é 2mercaptopiridila. Os agentes redutores são conhecidos na técnica e incluem sal (tris (2-carboxietil) fosfina) HCI (TCEP), 2-mercaptoetanol e ditiotreitol.

Preparação Direta de HA Funcionalizado com Tiol [0316] Em alguns aspectos, como representado na Figura 3, os grupos dissulfeto protegidos podem ser diretamente conjugados ao HA por reação de uma mistura reacional que compreende HA (ou um derivado ou sal do mesmo), composto 6 de dissulfeto protegido da estrutura H2N-L3-S-PG e um reagente de acoplamento de ativação de carboxila para formar o composto 8 com grupos dissulfeto protegidos conjugados. O grupo protetor pode ser clivado como aqui descrito em outro lugar para gerar HA funcionalizado com tiol.

Conjugados Fármaco-Ligante [0317] Os conjugados de fármaco-ligante, tais como o reagente 5 na Figura 2, 0 reagente 14 na Figura 5 e o reagente 5 na Figura 7, são utilizados na preparação de conjugados de fármacos de HA reticulados de acordo com a invenção. Em muitas formas de realização, o conjugado de fármaco-ligante pode utilizar um ligante de pró-fármaco reversível L2 de fórmula II como descrito acima. Em alguns outros aspectos, a porção de ligante de prófármaco reversível L2 usada em tais monoconjugados de fármacos pode ser representada pela fórmula XIIa:

em que:

a linha tracejada indica a ligação a um nitrogênio de um composto de fármaco (não mostrado) através da formação de uma ligação am ida; e

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X, X¹, X², X³, R¹, R^1a, R², R^2a, R³ e R^3a são definidos como acima.

[0318] Em muitas formas de realização, o ligante de pró-fármaco reversível L2 pode, por conveniência sintética, ser preparado em conjunto com um espaçador l_4 ou uma porção de um espaçador l_4.

[0319] Em algumas formas de realização, a porção de ligante de pró-fármaco reversível L2, juntamente com uma porção de um espaçador l_4, pode ser representada por um composto espaçador-ligante que compreende a fórmula XIIc

o Xllc em que a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação ao átomo de nitrogênio de um fármaco por meio de uma ligação amida e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação ao hidrogel de HA reticulado ou precursor do mesmo, conforme divulgado no presente relatório descritivo através de uma ligação sulfeto (não mostrado). A porção espaçadora ligante Xllcd representa uma combinação particular de uma porção de ligante de pró-fármaco reversível L2 com uma porção de um espaçador l_4 que pode ser convenientemente sintetizado em conjunto, como descrito abaixo, para uso em formas de realização particulares da invenção.

[0320] Em alguns aspectos, a porção L² de ligação de pró-fármaco reversível pode ser selecionada a partir do seguinte, em que a linha ondulada indica o sítio de ligação ao nitrogênio do fármaco e em que cada L² é substituído com uma porção L⁴, desde que o hidrogênio marcado com o asterisco não seja substituído:

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Preparação e Purificação de Conjugados Fármaco-Espaçador-Ligante [0321] Em qualquer um dos vários aspectos da invenção, um conjugado fármaco-ligante usando um ligante de pró-fármaco reversível L2 pode ser preparado como a seguir. Como observado acima, em muitas formas de realização, o ligante de pró-fármaco reversível L2 pode, por conveniência sintética, ser preparado em conjunto com um espaçador l_4 ou uma porção de um espaçador l_4. A porção da fórmula Xllb é usada para fins exemplificativos, mas aos técnicos no assunto reconhecerão que variações do procedimento

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105/254 abaixo podem ser usadas para outras formas de realização do ligante L2 e do espaçador l_4, de acordo com a invenção.

[0322] O composto de fórmula Villa

representa uma porção que compreende o ligante de pró-fármaco reversível L² com um grupo protetor de amina Pg¹, uma porção de um espaçador L⁴ com um grupo protetor de tiol Pg² no mesmo e um grupo ativador AG. O grupo protetor de tiol representa o ponto de ligação aos conjugados de

HA reticulados 10, 16 e 26, ou as porções de HA precursoras correspondentes 5, 14 e 19, como mostrado nas Figuras 2 a 9. O grupo ativador AG é um grupo que é deslocado durante a reação com um grupo de fármaco como ranibizumabe ou outro agente terapêutico peptídico com um grupo amino livre, para formar uma ligação amida. O grupo amina protegido pelo grupo Pg¹ é um grupo catalítico que participa na divagem da ligação amida que conecta o fármaco ao ligante L2.

[0323] O ligante combinado L² e a porção do composto espaçador L⁴ de fórmula Villa podem ser usados para preparar um composto de fórmula

Vlllb

por deslocamento do grupo de ativação AG para formar uma

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106/254 ligação amida com o fármaco. O fármaco pode ser, por exemplo, uma proteína terapêutica, anticorpo ou fragmento de anticorpo, como aqui descrito, tendo um ou mais grupos amino livres disponíveis que estão disponíveis para reagir com o ligante para formar o conjugado de fármaco ligante via ligação amida.

[0324] Grupos protetores (PG) são conhecidos na técnica. Por exemplo, alguns grupos protetores dentro do escopo da presente invenção são descritos na Publicação Internacional WO 2015/052155, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Os técnicos no assunto reconhecerão que vários esquemas diferentes de proteção e desproteção, tais como os descritos em “Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Quinta Edição, 2014 por John Wiley & Sons, Inc., também incorporado por referência, podem ser usados com a invenção como alternativas aos exemplos específicos mostrados aqui.

[0325] Em alguns aspectos, o grupo protetor de amina Pg¹ é um grupo protetor autoimolativo que pode compreender uma das porções

em que R¹⁸ é alquila C1-10 opcionalmente substituída e/ ou opcionalmente interrompida. Em alguns aspectos, R¹⁸ é uma amina C1-6. Em outros aspectos, R¹⁸ é uma diamina C1-6.

[0326] Um exemplo de um grupo Pg¹ do grupo protetor de amina é o seguinte:

I onde a linha ondulada indica o ponto de ligação a um grupo amina no ligante L².

[0327] Um exemplo de um grupo protetor de tiol é o metanossulfonila da fórmula -SO2CH3, de modo a formar um tiossulfonato de

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107/254 metano MTS.

[0328] Grupos de ativação também são bem conhecidos na técnica. Em certas formas de realização, o grupo ativador AG pode ser N hidroxissuccinimida (NHS) na forma de um éster. Outros desses grupos éster ativados incluem ésteres de 4-nitrofenol e pentafluorofenol.

[0329] Em um aspecto particular, a porção da fórmula Villa acima pode ser um composto éster de tiossulfonato de metano de N-

[0330] O composto Vlllc representa o composto Vlllb, mais particularmente com um grupo metanossulfonila como Pg², um éster de N hidroxissuccinimida (NHS) como AG e o grupo protetor de amina acima como Pg¹. A reação do composto Vlllc com o fármaco fornece então um composto conjugado de espaçador-ligante-fármaco da fórmula VII Id

[0331] O bisconjugado e o trisconjugado de ligante espaçador fármaco (não mostrado) também podem se formar em algumas formas de realização juntamente com o monoconjugado VIIId e o monoconjugado pode ser isolado dos conjugados superiores por separação em coluna, conforme descrito nos exemplos experimentais abaixo. O grupo tiol desprotegido do mono conjugado Vllld é reagido com um grupo maleimida em uma porção de

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HA, como descrito acima, e o grupo amino desprotegido participa na divagem catalítica da ligação fármaco-amida para fornecer liberação controlada pelo tempo do Fármaco.

[0332] O Fármaco (por exemplo, ranibizumabe ou outro agente terapêutico) que desloca o grupo NHS pode ser adequadamente solubilizado em um tampão a um pH de cerca de 6 a cerca de 9, ou de cerca de 7 a cerca de 8, tal como cerca de 7,4, em uma concentração de de cerca de 20 mg/ mL a cerca de 100 mg/ mL, de cerca de 30 mg/ mL a cerca de 50 mg/ mL, ou cerca de 40 mg/ mL. Em alguns aspectos, o tampão compreende cerca de 30 mM de fosfato de sódio. O ligante éster N-hidroxissuccinimida pode adequadamente ser solubilizado em um solvente aprótico polar, como DMSO.

[0333]As soluções do ligante éster N-hidroxissuccinimida e o fármaco são combinadas a cerca de 5 °C a um pH de cerca de 7 a cerca de 8, tal como cerca de 7,4, e reagidas por até cerca de 10 minutos, tal como cerca de 5 minutos, para formar uma solução do conjugado ligante-fármaco. A razão de equivalentes de ligante éster de N-hidroxissuccinimida para fármaco é de cerca de 1: 1, cerca de 5: 1, cerca de 10: 1, cerca de 15: 1 ou cerca de 20: 1, tal como cerca de 5: 1, cerca de 10: 1 ou cerca de 15: 1. O conjugado ligantefármaco compreende tipicamente uma mistura de fármaco não conjugado, monoconjugados de fármaco, bisconjugados de fármaco, trisconjugados de fármaco e conjugados superiores. Tempos de reação mais longos e quantidades maiores de equivalentes são usados conforme necessário, bem como temperaturas de reação mais altas.

[0334] O pH da solução do conjugado de fármaco pode ser ajustado conforme necessário para o uso de grupos protetores particulares. Para utilização com o composto éster de tiossulfonato de metano de Nhidroxissuccinimida (NHS) mostrado acima, o pH pode ser ajustado para cerca de 4. Em alguns aspectos, o pH é ajustado com um tampão com um pH de

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109/254 cerca de 2 a cerca de 3,5. Em alguns desses aspectos, o tampão é ácido succínico de pH 3 (por exemplo, cerca de 3 M de ácido succínico). Em alguns aspectos, após o ajuste do pH, a troca de tampão da solução do conjugado ligante-fármaco com um tampão com um pH de cerca de 4 pode ser realizada. Em alguns desses aspectos, a troca de tampão pode ser feita com cerca de 5 mM, pH 4,0, ácido succínico.

[0335] Uma porção de MARCADOR de purificação pode ser utilizada na preparação e purificação de monoconjugados de fármaco ligante de acordo com a invenção. Em uma etapa de MARCAção (TAGylation), é introduzido um MARCADOR de purificação deslocando o grupo metanossulfonila, de modo a que o MARCADOR de purificação se junte ao conjugado através de uma ligação dissulfeto. Os marcadores de purificação dentro do escopo da presente invenção são descritos na Publicação Internacional WO 2015/052155. Em alguns aspectos, o MARCADOR de purificação compreende uma porção de fórmula IX abaixo:

em que:

SP é uma porção espaçadora;

a linha tracejada indica ligação ao restante do MARCADOR ou, alternativamente, o ponto de ligação do MARCADOR ao conjugado de fármaco ligante (através, por exemplo, da formação de uma ligação dissulfeto em que o ácido 4-mercapto-3-nicotínico é o espaçador;

R²¹, R^21a, R^21b, R²², R^22a, R^22b, R²³, R^23a, R^23b, R²⁴, R^24a e R^24b são, cada um, independentemente H ou metila;

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110/254 cada s é, independentemente um do outro, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8; cada t é, independentemente um do outro, 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8; cada u é, independentemente um do outro, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8; e cada v é, independentemente um do outro, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0336]Em alguns aspectos, R²¹, R^21ae R^21b, são, cada um, metila. Em alguns outros aspectos, R²¹ é H e R^21a e R^21b são metila. Em alguns aspectos, R²², R^22a e R^22b, são, cada um, metila. Em alguns outros aspectos, R²² é H e R^22a e R^22b são metila. Em alguns aspectos, R²³, R^23a e R^23b, são, cada um, metila. Em alguns outros aspectos, R²³ é H e R^23a e R^23b são metila. Em alguns aspectos, R²⁴, R^24a e R^24b, são, cada um, metila. Em alguns outros aspectos, R²⁴ é H e R^24a e R^24b são metila.

[0337] Em alguns aspectos, s é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; 2, 3, 4 ou 5; 3, 4 ou 5; ou 4. Em alguns aspectos, t é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; 2, 3, 4 ou 5; 2, 3 ou 4; ou

3. Em alguns aspectos, u é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; 1, 2, 3 ou 4; 1, 2 ou 3; ou 1. Em alguns aspectos, v é 1,2, 3, 4, 5 ou 6; 1,2, 3 ou 4; 1,2 ou 3; ou 1.

[0338] Em alguns aspectos, R²¹, R^21a, R^21b, R²², R^22a, R^22b, R²³, R^23a, R23b r24 R24a e R24b saOj cac|a um metila; s é 4, t é 3, u é 1 e v é 1. Em alguns outros aspectos, R²¹, R²², R²³e R²⁴ são, cada um, H; R^21a, R^21b, R^22a, R^22bi R23a R23b R24a _e R24b _{saOj cac}|_{a um} metila; s é 4, t é 3, u é 1 e vé 1.

[0339] Os contra-íons para a fórmula IX dentro do escopo da presente invenção incluem Cl·, TFA; HSO4’ e SO4²·.

[0340] Entende-se que a linha tracejada na fórmula IX indica ligação ao restante do marcador se o composto de fórmula IX é um reagente e é preferencialmente um hidrogênio e, alternativamente, indica ligação ao conjugado fármaco-ligante após a conjugação com o referido conjugado fármaco-ligante.

[0341] Em alguns aspectos particulares, o marcador de purificação

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X, em que a linha tracejada indica ligação à porção de tiol de fórmula

X.

[0342] Em alguns aspectos particulares, o reagente de marcador

[0343] Em

Xa.

alguns aspectos particulares, o monoconjugado desprotegido MARCADOR-espaçador-ligante-fármaco é da fórmula VIHe:

N

[0344] O monoconjugado

Vllle

Vllle de MARCADOR-espaçador ligante-fármaco desprotegido representa o conjugado VIIId juntamente com o

MARCADOR de purificação Xa no lugar do grupo protetor de metanossulfonila.

O monoconjugado Vllle de MARCADOR-espaçador-ligante-fármaco desprotegido pode estar presente com conjugados superiores (não mostrados)

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112/254 como descrito acima.

[0345] Entende-se que a porção Vllle e outros compostos mencionados nas seções seguintes também compreendem partes de l_4. Por conveniência e nomeação mais fácil, as porções espaçadoras são omitidas dos nomes dos compostos descritos abaixo.

[0346] A MARCAção e desproteção de amina podem ser realizadas como a seguir. A introdução do marcador de purificação é feita combinando uma solução contendo um excesso estequiométrico de um marcador de purificação, tal como cerca de 1,5, 2, 2,5 ou 3 ou ainda mais equivalentes de marcador de purificação para o conjugado ligante-fármaco, para uma solução de conjugado ligante-fármaco. A concentração do conjugado ligante-fármaco na sua solução é adequadamente cerca de 5 mg/ mL, cerca de 10 mg/ mL, cerca de 15 mg/ mL, cerca de 20 mg/ mL, cerca de 25 mg/ mL, cerca de 30 mg/ mL, cerca de 35 mg/ mL ou cerca de 40 mg/ mL, tal como cerca de 10 mg/ mL a cerca de 20 mg/ mL ou cerca de 10 mg/ mL a cerca de 40 mg/ mL. A concentração do MARCADOR na solução usada para a reação com o conjugado fármaco ligante é adequadamente de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM, de cerca de 0,2 mM a cerca de 0,8 mM, de cerca de 0,3 mM a cerca de 0,7 mM, de cerca de 0,4 mM a cerca de 0,6 mM. Em certas formas de realização, a concentração de MARCADOR é de cerca de 0,5 mM. Em alguns aspectos, a solução de marcador é uma solução aquosa. O pH da reação é adequadamente de cerca de 3 a cerca de 5, de cerca de 3,5 a cerca de 4,5 ou cerca de 4. A temperatura da reação é adequadamente de cerca de 10 °C a cerca de 40 °C, tal como cerca de 25 °C. O tempo de reação é adequadamente pelo menos 5 minutos, ou pelo menos 10 minutos, ou pelo menos 30 minutos, tal como cerca de 15 minutos ou cerca de 35 minutos.

[0347] A desproteção pode ser realizada por incubação a um pH de cerca de 7 a cerca de 8, tal como cerca de 7,4. Em alguns aspectos, o pH é

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113/254 ajustado para de cerca de 7 a cerca de 8 com tampão fosfato contendo Ν,Ν,Ν'trimetiletileno-1,3-diamina (TriMED). A incubação pode ser adequadamente realizada a uma temperatura de cerca de 10 °C a cerca de 40 °C, tal como cerca de 25 °C, e por um tempo de pelo menos 8 horas, tal como cerca de 16 horas.

[0348] Após desproteção, o pH da solução do conjugado desprotegido MARCADOR-ligante-fármaco é ajustado para cerca de 3,5 a cerca de 4,5, ou cerca de 4,0 para purificação subsequente. Em alguns aspectos, o ajuste do pH pode ser feito com um tampão com um pH de cerca de 2,5 a cerca de 3,5, tal como o tampão de ácido succínico a pH 3,0. A solução ajustada ao pH pode ser opcionalmente diluída com tampão antes da purificação subsequente. Em alguns aspectos, a diluição pode ser realizada com tampão de ácido succínico a pH 4,0, por exemplo, tampão de ácido succínico 20 mM.

[0349] Após a desproteção, as espécies monoconjugadas do conjugado desprotegido MARCADOR-ligante-fármaco são isoladas. Em alguns aspectos, o monoconjugado pode ser isolado por cromatografia de troca catiônica (CIEC). Em alguns outros aspectos, o monoconjugado pode ser isolado por cromatografia de exclusão por tamanho. Em alguns outros aspectos, o monoconjugado pode ser isolado por cromatografia de afinidade. Nos aspectos CIEC, as resinas adequadas são conhecidas na técnica e estão disponíveis comercialmente, por exemplo, a partir da Bio-Rad Laboratories e GE Healthcare e incluem, por exemplo e sem limitação, AG® 50W, AG® MP50, Bio-Rex 70, Chelex® 100, AG® 50W, séries Macro-Prep®, séries UNOsphere™, Source 15S, Source 30S e Nuvia™ S. O mesmo tampão usado para diluição na segunda etapa pode ser usado para os tampões CIEC. Por exemplo, o tampão A pode ser ácido succínico 20 mM (pH 4,0) e o tampão B (para eluição) pode ser ácido succínico 20 mM, NaCI 1 M (pH 4,0). O fármaco

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114/254 não conjugado elui primeiro na separação do CIEC, seguido pelo monoconjugado do fármaco e, em seguida, seguido pelos conjugados superiores (bis- e tris-), etc.

[0350] Após o isolamento do monoconjugado desprotegido MARCADOR-ligante-fármaco, o monoconjugado pode ser concentrado por métodos conhecidos na técnica, tais como por filtração com fluxo tangencial (TFF) ou por centrifugação através de uma membrana. O monoconjugado concentrado pode ser opcionalmente filtrado. Após a concentração, a concentração final pode adequadamente ser de cerca de 0,2 mg/ mL a cerca de 20 mg/ mL, de cerca de 0,2 mg/ mL a cerca de 10 mg/ mL ou cerca de 5 mg/ mL.

[0351] Em seguida, o marcador de purificação é clivado do monoconjugado desprotegido isolado e potencialmente concentrado de MARCADOR-ligante-fármaco por divagem da ligação dissulfeto na presença de agente redutor para formar uma mistura que compreende MARCADOR clivado e um monoconjugado de ligante-fármaco.

[0352] O agente redutor é tipicamente uma molécula pequena e pode ser selecionado a partir de, por exemplo, β-mercaptoetanol, glutationa, ditiotreitol (DTT) e TCEP. Em alguns aspectos, o agente redutor é DTT. A divagem de MARCADOR pode ser adequadamente realizada a um pH de cerca de 3,5 a cerca de 5,5, tal como cerca de 4 ou cerca de 4,5. Em alguns aspectos, o DTT é adicionado à solução do monoconjugado desprotegido MARCADOR-ligantefármaco a uma concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM, tal como cerca de 1 mM a uma temperatura inferior a cerca de 15 °C, tal como de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C. A incubação pode ser realizada adequadamente por pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 8 horas.

[0353] Em alguns aspectos, o monoconjugado ligante-fármaco, após a desproteção e remoção do MARCADOR de purificação, é da fórmula

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Vlllf:

[0354] O monoconjugado ligante-fármaco pode ser isolado a partir da mistura contendo MARCADOR clivado por cromatografia, tal como aqui descrito em outra parte. Nos aspectos do CIEC, resinas adequadas são descritas em outras partes deste documento. Geralmente, o CIEC para o isolamento do monoconjugado ligante-fármaco é feito com um sistema tampão com um pH de cerca de 4 a cerca de 7, tal como cerca de 5,5. Por exemplo, o tampão A pode ser 10 mM de histidina (pH 5,5) e o tampão B (para eluição) pode ser 10 mM de histidina, 500 mM de NaCI (pH 5,5). O monoconjugado ligante-fármaco elui primeiro na separação CIEC, seguido pelo dímero potencial ligado ao dissulfeto e o MARCADOR clivado.

[0355] Opcionalmente, pode ser adicionado tampão B adicional para ajustar a osmolalidade da solução proteica. O monoconjugado isolado de ligante-fármaco pode ser opcionalmente concentrado a uma concentração superior a 50 mg/ mL ou superior a 60 mg/ mL para uso subsequente na preparação das composições de pró-fármacos que compreendem HA reticulado da presente invenção. A concentração pode ser feita por TFF ou por centrifugação através de uma membrana.

Conjugação do Monoconjugado Fármaco-Ligante com HA Funcionalizado com Maleimido [0356] Referindo-se novamente às Figuras 2 e 3 e Figura 6 à Figura 9, o monoconjugado ligante-fármaco Vlllf pode ser usado como reagente 5 conjugado de fármaco ligante. Os grupos maleimido estão em excesso equivalente em relação ao reagente 5, de modo que alguma proporção dos grupos maleimido

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116/254 não estão conjugados com o monoconjugado fármaco-ligante e, portanto, estão disponíveis para reticulação com HA funcionalizado com tiol, como descrito em outro local neste documento. Em alguns aspectos, a razão equivalente de HA funcionalizado com maleimido para monoconjugado de fármaco-ligante é de 1,1: 1 a cerca de 2: 1, tal como cerca de 1,2: 1, cerca de 1,3: 1, cerca de 1,4: 1, cerca de

1,5: 1, cerca de 1,6: 1, cerca de 1,7: 1 ou cerca de 1,8: 1. Em alguns aspectos, a mistura reacional compreende uma concentração de monoconjugado de fármacoligante de cerca de 25 mg/ mL a cerca de 100 mg/ mL (em uma base de proteína), de cerca de 35 mg/ mL a cerca de 55 mg/ mL, ou cerca de 55 mg/ mL. A conjugação é feita em um sistema tampão com um pH de cerca de 4,5 a cerca de

6,5 ou de cerca de 5 a cerca de 6, tal como cerca de 5,5. Em alguns aspectos, o tampão é 10 mM de histidina, 150 mM de NaCI e 0,01% de Tween 20. A temperatura da reação é de cerca de 0 °C, cerca de 5 °C, 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C ou cerca de 40 °C, e a mistura reacional é incubada por um tempo adequado para alcançar uma conjugação substancialmente completa, tal como de cerca de 1 hora a cerca de 12 horas ou mais, tal como cerca de 2 horas, cerca de 4 horas ou cerca de 6 horas.

[0357] Em alguns aspectos, o HA funcionalizado com fármacoligante-maleimido é da estrutura XII:

Fármaco XII.

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117/254 [0358] 0 grau de funcionalização do composto XII de HA pode variar conforme descrito acima, e o grau relativo de funcionalização na estrutura XII é apenas ilustrativo. Em algumas formas de realização, cerca de 0,5% a cerca de 6%, cerca de 1% a cerca de 5%, cerca de 1,5% a cerca de 4%, cerca de 2% a 3% ou cerca de 2% a cerca de 2,5% dos sítios de carboxilato na cadeia de HA de XII são ocupados por maleimida não reagida (e, portanto, disponível para reação de reticulação subsequente), enquanto cerca de 3% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 9%, cerca de 6% a cerca de 8% ou cerca de 7% a cerca de 8% dos sítios de carboxilato são ocupados pelo conjugado de fármaco ligante. Em certas formas de realização, cerca de 4% dos sítios de carboxilato na cadeia HA de XII são ocupados por maleimida não reagida e cerca de 6% dos sítios de carboxilato são ocupados por conjugado de fármaco ligante. Em certas formas de realização, cerca de 2,3% dos sítios de carboxilato na cadeia HA de XII são ocupados por maleimida não reagida e cerca de 7,7% dos sítios de carboxilato são ocupados por conjugado de fármaco ligante. O conjugado fármaco ligante liga-se à cadeia HA através da reação do grupo tiol do conjugado fármaco ligante reagindo com grupos maleimida na cadeia HA, conforme descrito aqui. A percentagem de sítios ocupados por maleimida não reagida e por conjugado de fármaco ligante pode variar para controlar o grau de reticulação e carga de fármaco do conjugado de hidrogel final.

Preparação de Composições de Pró-fármacos que compreendem HA Reticulado [0359] Em alguns aspectos, as composições de pró-fármacos da presente invenção podem ser preparadas através da formação de uma mistura reacional que compreende uma solução de HA funcionalizado com fármacoligante-maleimido, como descrito em outras partes deste documento, e uma solução de HA funcionalizado com tiol, conforme descrito em outras partes

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118/254 aqui, e incubando a mistura reacional a um pH e por um tempo e temperatura suficientes para obter a reticulação de HA. A reação geralmente prossegue de acordo com a etapa 7 do esquema de reação representado na Figura 9, onde L^A, L^B, L^c, L² e o fármaco são como aqui descritos em outras partes. Em alguns aspectos, o pH é de cerca de 4,5 a cerca de 6,5 ou de cerca de 5 a cerca de 6, tal como cerca de 5,5. A temperatura da reação é de cerca de 0 °C, cerca de 5 °C, cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C ou cerca de 40 °C.

[0360] Em alguns aspectos, a mistura reacional é completamente misturada e preenchida em seringas logo em seguida. As seringas previamente preenchidas podem então ser incubadas à temperatura ambiente por de cerca de 8 horas a cerca de 4 semanas, para completar a reticulação e a formação das composições de pró-fármaco de HA reticulado da presente invenção. As seringas previamente preenchidas também podem ser armazenadas diretamente a 2-8 °C, sem armazenamento adicional à temperatura ambiente. Em uma forma de realização, soluções separadas de HA funcionalizado com fármaco-ligante-maleimido e HA funcionalizado com tiol são, cada uma, introduzida diretamente em um dispositivo de seringa de preenchimento prévio e misturadas no mesmo, e a reticulação é deixada ocorrer no dispositivo de seringa de preenchimento prévio e deixada sofrer reação de reticulação para formar a composição de pró-fármaco de HA reticulado in situ dentro do dispositivo de seringa de preenchimento prévio. Após um tempo adequado (que pode variar dependendo da temperatura e de outras condições) ser deixado para a reação de reticulação, a composição de pró-fármaco de HA reticulado está pronta para injeção em um paciente sem mistura ou transferência adicional.

[0361] Em outras formas de realização, uma polimerização em lote pode ser realizada para realizar a reação de reticulação. O gel resultante é

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119/254 então rasgado passando-o através de uma rede para torná-lo injetável (syringeable) e é posteriormente transferido para um dispositivo de seringa.

[0362] Em alguns aspectos, as composições de pró-fármaco da presente invenção são de fórmula 10:

em que L¹, L², L³, o grau de funcionalização e o fármaco são como aqui definidos em outra parte. Em alguns outros aspectos, o HA pode ser substituído com Ra¹ e/ ou Ra² como descrito em outro local neste documento.

[0363] Em alguns outros aspectos, as composições de prófármaco da presente invenção têm a fórmula 16:

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120/254 em que L¹, L², L³, o grau de funcionalização e o fármaco são como aqui definidos em outra parte. Em alguns outros aspectos, o HA pode ser substituído com Ra¹ e/ ou Ra² como descrito em outro local neste documento.

[0364] Em alguns outros aspectos, as composições de prófármacos da presente invenção têm a fórmula 26:

Fármaco

em que L^A, L^B, L^c, L², o grau de funcionalização e o fármaco são como aqui definidos em outra parte. Em alguns outros aspectos, o HA pode ser substituído com Ra¹ e/ ou a como descrito em outra parte deste documento.

Processos Gerais para a Preparação de Composições de Pró-fármacos QUE COMPREENDEM HA RETICULADO [0365] Os processos gerais para a preparação de composições de pró-fármacos que compreendem HA reticulado estão representados nas Figuras 10 e 11.

[0366] Um processo para preparar composições de pró-fármacos que compreendem HA reticulado é representado na Figura 10. Na etapa 1, a amina-HA 1 é preparada de acordo com métodos para a preparação de HA

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121/254 funcionalizado com amina, como descrito aqui em outra parte. Na etapa 2, maleimida-HA com um espaçador permanente é preparada a partir de aminaHA 1 de acordo com métodos para a preparação de HA funcionalizado com maleimido, como descrito em outro lugar neste documento. Na etapa 3, a amina-HA 2 é preparada de acordo com métodos para a preparação de HA funcionalizado com amina, como descrito em outro lugar aqui. Na etapa 4, o tiol-HA 2, que compreende um grupo tiol ligado de forma degradável, é preparado de acordo com um método para preparar o HA funcionalizado com tiol, como descrito aqui em outro lugar. Na etapa 5, um monoconjugado de fármaco-ligante-tiol é preparado de acordo com métodos aqui descritos em outro lugar. Na etapa 6, o monoconjugado de fármaco-ligante-tiol é conjugado ao maleimida-HA com um espaçador, como aqui descrito em outro lugar. Na etapa 7, as composições de pró-fármacos que compreendem HA reticulado são preparadas a partir de fármaco-ligante-maleimida-HA e tiol-HA degradável, como descrito em outro local neste documento. A etapa 7 pode compreender a filtração estéril do fármaco-maleimida-HA da etapa 6 e do tiol HA degradável da etapa 4 diretamente em um dispositivo de seringa de preenchimento prévio no qual a reticulação é realizada.

[0367] Outro processo para preparar composições de prófármacos que compreendem HA reticulado é representado na Figura 11. Na etapa 1, a amina-HA 1 é preparada de acordo com métodos para a preparação de HA funcionalizado com amina, como descrito em outro local neste documento. Na etapa 2, maleimida-HA com um espaçador é preparada a partir de amina-HA 1 de acordo com métodos para a preparação de HA funcionalizado com maleimido, como descrito aqui em outro lugar. Na etapa 3, a amina-HA 2 é preparada de acordo com métodos para a preparação de HA funcionalizado com amina, como descrito em outro local neste documento. Na etapa 4, o tiol-HA 2 que compreende um grupo tiol ligado de forma degradável

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122/254 é preparado de acordo com o método para a preparação de HA funcionalizado com tiol, como descrito em outra parte aqui. Na etapa 5, um monoconjugado de fármaco-ligante-tiol é preparado de acordo com métodos aqui descritos em outro lugar. Na etapa 6, o monoconjugado de fármaco-ligante-tiol, o maleimidaHA com um ligante permanente e tiol-HA com um ligante degradável são combinados e conjugados para formar composições de pró-fármacos que compreendem HA reticulado. O maleimida HA, o monoconjugado de fármacoligante tiol e o tiol HA podem ser, cada um, filtrados esterilmente e transferidos para um dispositivo de seringa preenchimento prévio em que sofrem reação para formar o pró-fármaco de HA reticulado final. As condições de reação para a Figura 11, etapa 6, são geralmente consistentes com as condições de reação para as condições para a preparação de composições de pró-fármacos que compreendem HA reticulado de fármaco-ligante-maleimida-HA e tiol degradável-HA, como aqui descrito em outro lugar.

Composições Farmacêuticas [0368] A composição farmacêutica da presente invenção compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo agentes tamponantes, modificadores de isotonicidade, conservantes/ antimicrobianos, estabilizadores, agentes anti-adsorção, anti-oxidantes, viscosificantes/ agentes melhoradores de viscosidade e/ ou outros agentes auxiliares.

[0369] Os agentes tamponantes podem ser utilizados para manter o pH da composição na faixa desejada. Exemplos não limitativos de agentes tamponantes incluem fosfato de sódio, bicarbonate, succinato, histidina, citrato e acetato, sulfato, nitrato, cloreto e piruvato.

[0370] Modificadores de isotonicidade podem ser usados para minimizar a dor que pode resultar de dano celular devido a diferenças de pressão osmótica no lado da injeção. Exemplos não limitativos de agentes de

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123/254 isotonicidade incluem glicerina e cloreto de sódio.

[0371] Conservantes/ antimicrobianos podem ser usados para minimizar o risco de infecção. Exemplos não limitativos de conservantes incluem m-cresol, fenol, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, clorobutanol, álcool benzílico, nitrato fenilmercúrico, timerosol, ácido sórbico, sorbato de potássio, ácido benzóico, clorocresol e cloreto de benzalcônio.

[0372] Os estabilizadores podem ser utilizados para inibir a degradação do hidrogel e do fármaco. Exemplos não limitativos de estabilizadores incluem: aminoácidos tais como alanina, arginina, ácido aspártico, glicina, histidina, lisina, prolina; açúcares tais como glicose, sacarose, trealose; polióis tais como glicerol, manitol, sorbitol; sais tais como fosfato de potássio, sulfato de sódio; agentes quelantes tais como EDTA, hexafosfato; ligantes tais como íons metálicos divalentes (zinco, cálcio etc.); oligômeros ou polímeros tais como ciclodextrinas, dextrano, dendrímeros, PEG ou PVP ou protamina ou HAS; e/ ou outros sais ou moléculas orgânicas tais como derivados fenólicos.

[0373] Os agentes anti-adsorção podem ser utilizados para revestir ou adsorver competitivamente, por exemplo, a superfície do recipiente, tal como uma seringa, no qual a composição farmacêutica está contida. Os agentes anti-absorção podem ser tensoativos iônicos ou não iônicos, proteínas ou polímeros solúveis. Exemplos não limitativos de tensoativos incluem: alquil sulfatos, tais como lauril sulfato de amônio e lauril sulfato de sódio; éter sulfatos de alquila, tais como lauril éter sulfato de sódio e miril éter sulfato de sódio; sulfonatos, tais como dioctil sulfossuccinatos de sódio, perfluorooctanossulfonatos, perfluorobutanossulfonatos, alquilbenzeno sulfonatos; fosfatos, tais como fosfatos de éter alquil arílico e fosfatos de éter alquílico; carboxilatos, tais como sais de ácidos graxos (sabões) ou estearato

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124/254 de sódio, lauroil sarcosinato de sódio, perfluorononanoato, perfluorooctanoato; dicloridrato de octenidina; cátions de amônio quaternário, tais como brometo de cetil trimetilamônio, cloreto de cetil trimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio, amina de sebo polietoxilada, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, 5bromo-5-nitor-1,3-dioxano, cloreto de dimetildioctadecilamônio, brometo de dioctadecildimetilamônio; zwitteriônicos, tais como 3-[(3-colamidopropil) dimetilamônio]-1 -propanossulfonato, cocam idopropil hidroxisultaína, aminoácidos, iminoácidos, cocamidopropil betaína, lecitina; álcoois graxos, tais como álcool cetílico, álcool estearílico, álcool cetostearílico, álcool oleílico; éteres alquílicos de polioxietilenoglicol, tais como éter monododecílico de octaetilenoglicol, éter monododecílico de pentaetilenoglicol; éteres alquílicos de polioxipropileno glicol; éteres alquílicos de glicosídeo, tais como decil glicosídeo, laurel glicosídeo, octil glicosídeo; éteres de polioxietileno glicol octilfenol, tais como Triton X-100; éteres de polioxietileno glicol alquilfenol tais como nonoxinol-9; ésteres alquílicos de glicerol, tais como laurato de glicerila; ésteres alquílicos de polioxietileno glicol sorbitano, tais como polissorbatos; ésteres alquílicos de sorbitano; cocamida MEA e cocamida DEA; óxido de dodecil-dimetilamina; copolímeros em bloco de polietileno glicol e polipropileno glicol, tais como poloxâmeros (Plutonic F-68), éter dodecílico PEG (Brij 35), polissorbato 20 e 80; outros agentes anti-absorção são dextrano, polietilenoglicol, PEG-poli-histidina, BSA e HSA e gelatinas.

[0374] Exemplos não limitativos de anti-oxidantes incluem ácido ascórbico, ectoína, metionina, glutationa, monotioglicol, morina, polietilenimina (PEI), gaiato de propila, vitamina E, agentes quelantes tais como ácido cítrico, EDTA, hexafosfato e ácido tioglicólico.

[0375] As composições farmacêuticas de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado podem ser fornecidas em um recipiente que compreende doses múltiplas da composição farmacêutica. Essa composição farmacêutica

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125/254 de dose múltipla pode ser usada para diferentes pacientes em necessidade da mesma ou pode ser usada para um paciente, em que as doses restantes são armazenadas após a aplicação da primeira dose até serem necessárias. Em alguns desses aspectos, o recipiente é uma seringa previamente preenchida.

[0376] As composições farmacêuticas de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado podem ser fornecidas como uma composição farmacêutica de dose única ou múltipla em uma seringa previamente preenchida.

[0377] As composições farmacêuticas de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado da presente invenção podem ser adequadamente armazenadas em seringas a uma temperatura inferior a cerca de 10 °C.

[0378] Quantidades terapêuticas das composições farmacêuticas de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado podem ser administradas por injeção intra-ocular. Por exemplo, a composição pode ser injetada no vítreo de um indivíduo em necessidade da mesma usando uma agulha com um calibre de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32.

[0379] Em alguns aspectos, as composições farmacêuticas de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado podem ser fornecidas em um kit. Em tais aspectos, o kit pode compreender uma seringa previamente preenchida com a composição farmacêutica de pró-fármaco de hidrogel de HA reticulado, uma agulha hipodérmica e instruções de uso.

[0380] A invenção fornece conjugados de anticorpos que incluem anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-VEGF) ligados covalentemente a composições de hidrogel de HA reticulado, como aqui descrito.

Anticorpos Exemplificativos para Uso em Composições de Conjugado de Hidrogel de HA Reticulado da Invenção [0381] Qualquer anticorpo adequado (por exemplo, anticorpo antiVEGF) pode ser usado. Por exemplo, o anticorpo pode se ligar especificamente a um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em VEGF;

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126/254 interleucina-1 beta (IL-1 β); interleucina-6 (IL-6); receptor de interleucina-6 (IL6R); interleucina-13 (IL-13); receptor de IL-13 (IL-13R); PDGF (por exemplo, PDGF-BB); angiopoietina; angiopoietina 2 (Ang2); Tie2; S1P; integrinas ανβ3, ανβ5 e α5β1; betacelulina; apelina/ APJ; eritropoietina; fator de complemento D; TNFa; HtrA1; urn receptor de VEGF (por exemplo, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, receptor de VEGF ligado à membrana (mbVEGFR) ou receptor de VEGF solúvel (sVEGFR)); receptor ST-2; e uma proteína geneticamente ligada ao risco de degeneração macular relacionada com a idade (AMD) (por exemplo, componentes da via do complemento C2, fator B, fator H, CFHR3, C3b, 05, C5a e C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; interleucina-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; e TNFRSF10A). Tais anticorpos podem ser úteis, por exemplo, para reduzir a angiogênese e/ ou para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio associado à angiogênese patológica (por exemplo, distúrbios oculares ou distúrbios proliferativos celulares). Anticorpos anti-VEGF não limitativos e exemplificativos que podem ser utilizados nos conjugados de anticorpos da invenção são descritos mais adiante.

[0382] Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF pode incluir pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8 (SEQ ID NO: 2), em que X1 é lie ou His, X2 é Ala ou Arg, X3 é Tyr ou Lys, X4 é Thr ou Glu, X5 é Arg, Tyr, Gin ou Glu, Xe é Ala ou Glu, X7 é Lys ou Glu eXs é Gly ou Glu; (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQX1VSTAVA (SEQ ID NO: 4), em que X1 é Asp ou Arg; (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de X1ASFLYS (SEQ ID NO: 5),

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127/254 em que Xi é Ser ou Met; e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de X1QGYGX2PFT (SEQ ID NO: 6), em que X1 é Gin, Asn ou Thr e X2 é Ala, Asn, Gin ou Arg, ou uma combinação de uma ou mais das HVRs acima e uma ou mais variantes das mesmas com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade) com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-6.

[0383] Por exemplo, o anticorpo anti-VEGF pode incluir pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21) ou GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10) ou QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23) ou uma combinação de uma ou mais das HVRs acima e uma ou mais variantes das mesmas tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade) com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3, 7-10 ou 21-23.

[0384] Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF pode incluir pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a

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128/254 sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO:

9) ; e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10) ou uma combinação de uma ou mais das HVRs acima e uma ou mais variantes das mesmas com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade) com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 ou 7-10. Em um exemplo particular, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO:

10) .

[0385] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões estruturais de domínio variável da cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de

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RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16).

[0386] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).

[0387] Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia pesada a seguir: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); e (d) uma

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FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia leve a seguir: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:

17); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0388] Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF pode incluir pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23) ou uma combinação de uma ou mais das HVRs acima e uma ou mais variantes das mesmas com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade) com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 8, 9, 22 ou 23. Em um exemplo específico, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as

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131/254 seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).

[0389] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões estruturais de domínio variável da cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) ou EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 51); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).

[0390] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ

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ID NO: 20).

[0391] Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seguintes quatro FRs de domínio variável da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia leve a seguir: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (b) um domínio VL que compreende uma

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133/254 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0392] Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia pesada a seguir: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 51); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia leve a seguir: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e (b) um domínio VL que compreende uma

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134/254 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0393] Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF pode incluir pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO:

9) ; e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10) ou uma combinação de uma ou mais das HVRs acima e uma ou mais variantes das mesmas com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade) com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 8-10 ou 22. Em um exemplo específico, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO:

10) .

[0394] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões

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135/254 estruturais de domínio variável da cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) ou EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 51); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).

[0395] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25) ou

DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) ou WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19) ou GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).

[0396] Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a

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136/254 sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia leve a seguir: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[0397] Por exemplo, em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a

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137/254 sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

[0398] Por exemplo, em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a

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138/254 sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia pesada a seguir: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 51); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seguintes quatro FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

[0399] Por exemplo, ainda em outros casos, o anticorpo antiVEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a

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139/254 sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia leve a seguir: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[0400] Por exemplo, em ainda outros casos, o anticorpo antiVEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a

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140/254 sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

[0401] Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de

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RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 51); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

[0402] Por exemplo, em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a

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142/254 sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro seguintes FRs de domínio variável da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia leve a seguir: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0403] Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seis HVRs a seguir: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de

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RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia pesada a seguir: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 51); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). Em outros casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as quatro FRs de domínio variável da cadeia leve a seguir: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0404] Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF compreende (a) um domínio variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, qualquer uma das SEQ ID NOs: 11, 40 ou 42; (b) um domínio variável de cadeia leve (VL) que

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144/254 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, qualquer uma das SEQ ID NOs: 12, 41 ou 46; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.

[0405] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões estruturais de domínio variável da cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14) ou WVRQEPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 39); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de

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145/254 aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16).

[0406] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17) ou DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC (SEQ ID NO: 45); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC (SEQ ID NO: 44) ou GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (SEQ ID NO: 54); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20) ou FGQGTKVEVK (SEQ ID NO: 55).

[0407] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 59).

[0408] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 59).

[0409] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de

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DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 59).

[0410] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 59).

[0411] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 59).

[0412] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 60).

[0413] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 60).

[0414] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH

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147/254 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 60).

[0415] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEI K(SEQ ID NO: 60).

[0416] Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEI K (SEQ ID NO: 60). Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF compreende (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, SEQ ID NO: 11; (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, SEQ ID NO: 11; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF pode incluir (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de

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GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) uma HVRL1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seguintes regiões estruturais da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui as seguintes regiões estruturais da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF inclui um domínio de ligação que compreende (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em alguns casos, o exemplo de anti-VEGF é N94A.F83A.N82aR.Y58R (também conhecido como G6.31.AARR).

[0417] Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF compreende (a) domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos

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90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, SEQ ID NO: 33 ou 51; (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, qualquer uma das SEQ ID NOs: 12, 34, 35, 36, 37 ou 38; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de

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SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0418] Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF compreende (a) domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, SEQ ID NO: 33 ou 51; (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, qualquer uma das SEQ ID NOs: 12, 34, 35, 36, 37 ou 38; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH

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151/254 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0419] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões estruturais de domínio variável da cadeia pesada (FRs): uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) ou EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30) ou WVRQEPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 39); (c) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (d) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).

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152/254 [0420] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-VEGF anteriores pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve: (a) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25) ou

DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) ou WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (c) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24) ou GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); e (d) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).

[0421] Em alguns casos, a invenção fornece um anticorpo que compreende (a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e/ ou (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Em certas formas de realização, o anticorpo é G6.31 AARR expresso no formato Fab.

[0422] Em alguns casos, a invenção fornece um anticorpo que compreende (a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e/ ou (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Em certas formas de realização, o anticorpo é uma versão variante do G6.31 AARR que carece de reatividade ao IgG anti-humano.

[0423] Em um aspecto adicional, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF), de acordo com qualquer uma das formas de realização acima, pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em

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153/254 combinação, como descrito nas Seções 1-7 abaixo:

Seção 1: Afinidade a Anticorpos [0424] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Por exemplo, em alguns casos, um anticorpo aqui fornecido se liga a um antígeno (por exemplo, VEGF humano (hVEGF)) com um Kd de cerca de 10 nM ou menos. Em alguns casos, um anticorpo aqui fornecido se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd de cerca de 5 nM ou menos. Em alguns casos, um anticorpo aqui fornecido se liga ao hVEGF com um Kd de cerca de 2 nM ou menos. Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 25 pM e cerca de 2 nM (por exemplo, cerca de 25 pM, cerca de 50 pM, cerca de 75 pM, cerca de 100 pM, cerca de 125 pM, cerca de 150 pM, cerca de 175 pM, cerca de 200 pM, cerca de 225 pM, cerca de 250 pM, cerca de 275 pM, cerca de 300 pM, cerca de 325 pM, cerca de 350 pM, cerca de 375 pM, cerca de 400 pM, cerca de 425 pM, cerca de 450 pM, cerca de 475 pM, cerca de 500 pM, cerca de 525 pM, cerca de 550 pM, cerca de 575 pM, cerca de 600 pM, cerca de 625 pM, cerca de 650 pM, cerca de 675 pM, cerca de 700 pM, cerca de 725 pM, cerca de 750 pM, cerca de 775 pM, cerca de 800 pM, cerca de 825 pM, cerca de 850 pM, cerca de 875 pM, cerca de 900 pM, cerca de 925 pM, cerca de 950 pM, cerca de 975 pM, cerca de 1 nM, cerca de 1,1 nM, cerca de 1,2 nM, cerca de 1,3 nM, cerca de 1,4 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1,6 nM, cerca de 1,7 nM, cerca de 1,8 nM, cerca de 1,9 nM, ou cerca de 2 nM). Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 75 pM e cerca de 600 pM (por exemplo, cerca de 75 pM, cerca de 100 pM, cerca de 125 pM, cerca de 150 pM, cerca de 175 pM, cerca de 200 pM, cerca

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154/254 de 225 pM, cerca de 250 pM, cerca de 275 pM, cerca de 300 pM, cerca de 325 pM, cerca de 350 pM, cerca de 375 pM, cerca de 400 pM, cerca de 425 pM, cerca de 450 pM, cerca de 475 pM, cerca de 500 pM, cerca de 525 pM, cerca de 550 pM, cerca de 575 pM, cerca de 600 pM). Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 75 pM e cerca de 500 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 75 pM e cerca de 400 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 75 pM e cerca de 300 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 75 pM e cerca de 200 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 75 pM e cerca de 150 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 75 pM e cerca de 125 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd entre cerca de 75 pM e cerca de 100 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd de cerca de 80 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd de cerca de 60 pM. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, hVEGF) com um Kd de cerca de 40 pM.

[0425] Em uma forma de realização, o Kd é medido por um ensaio de ligação a antígeno radiomarcado (RIA). Em uma forma de realização, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno. Por exemplo, a afinidade de ligação da solução de Fabs para antígeno é medida equilibrando Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (1251) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado e, em seguida, capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (ver, por exemplo, Chen et al., J. Mol.

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Biol. 293: 865-881 (1999)). Para estabelecer condições para o ensaio, as placas de múltiplos poços MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas de um dia para outro com 5 pg/ ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9,6) e subsequentemente bloqueadas com albumina de soro bovino (BSA) a 2% (p/ v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc # 269620), 100 pM ou 26 pM de [125l]-antígeno são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Ο Fab de interesse é então incubado de um dia para outro; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Depois disso, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com 0,1% de polissorbato 20 (TWEEN20®) em PBS. Quando as placas estão secas, são adicionados 150 pl/ poço de cintilante (MICROSCINT-20™; Packard) e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT™ (Packard) por dez minutos. As concentraes de cada Fab que produzem menos ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitivos.

[0426] De acordo com outra forma de realização, Kd é medido usando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. Por exemplo, um ensaio usando um BIACORE®-2000 ou um BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25 °C com chips de antígeno CM5 imobilizados a ~ 10 unidades de resposta (RU). Em uma forma de realização, os chips de biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDO) e

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N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. 0 antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8 a 5 pg/ ml (~ 0,2 pM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 pl/ minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, a etanolamina 1M é injetada para bloquear os grupos que não reagiram. Para medições de cinética, diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com tensoativo de polissorbato 20 a 0,05% (TWEEN-20™) (PBST) a 25 °C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 pl/ min. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo simples de ligação Langmuir individual (BIACORE® Evaluation Software versão 3.2), ajustando simultaneamente os sensores de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a razão koff/ kon. Ver, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Se a taxa de associação (on) exceder 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada usando uma técnica de atenuação fluorescente que mede o aumento ou diminuição da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de banda de 16 nm) a 25 °C de um anticorpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno, conforme medido em um espectrômetro, como um espectrofômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-AMINCO™ da série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

Seção 2: Estabilidade de Anticorpos [0427] Em alguns casos, o anticorpo usado nos conjugados de anticorpo da invenção ou em suas composições possui estabilidade aprimorada, por exemplo, em comparação com um anticorpo anti-VEGF, por exemplo, G6.31 (ver, por exemplo, Patente US No. 7.758.859 e Publicação de

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Pedido Internacional No. WO 2005/012359, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade). A estabilidade de um anticorpo pode ser determinada usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, fluorimetria diferencial de varredura (DSF), dicroísmo circular (CD), fluorescência intrínseca de proteínas, calorímetria diferencial de varredura, espectroscopia, espalhamento de luz (por exemplo, espalhamento dinâmico de luz (DLS) e espalhamento estático de luz (SLS), cromatografia de autointeração (SIC).O anticorpo anti-VEGF pode ter, por exemplo, uma temperatura de fusão aprimorada (Tm), temperatura de agregação (Tagg) ou outras métricas de estabilidade em comparação com um anticorpo anti-VEGF, por exemplo, G6.31.

[0428] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido tem uma Tm que é maior ou igual a cerca de 80 °C (por exemplo, cerca de 81 °C, cerca de 82 °C, cerca de 83 °C, cerca de 84 °C, cerca de 85 °C, cerca de 86 °C, cerca de 87 °C, cerca de 88 °C, cerca de 89 °C, cerca de 90 °C, cerca de 91 °C, cerca de 92 °C ou cerca de 93 °C). Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF tem uma Tm maior ou igual a cerca de

83,5 °C (por exemplo, cerca de 83,5 °C, cerca de 84 °C, cerca de 85 °C, cerca de 86 °C, cerca de 87 °C, cerca de 88 °C, cerca de 89 °C, cerca de 90 °C, cerca de 91 °C, cerca de 92 °C ou cerca de 93 °C). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF tem uma Tm de cerca de 82 °C a cerca de 92 °C (por exemplo, cerca de 82 °C, cerca de 83 °C, cerca de 84 °C, cerca de 85 °C, cerca de 86 °C, cerca de 87 °C, cerca de 88 °C, cerca de 89 °C, cerca de 90 °C, cerca de 91 °C ou cerca de 92 °C). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF tem uma Tm de cerca de 82 °C. Em alguns casos, qualquer um dos valores de Tm anteriores de um anticorpo anti-VEGF é determinado usando DSF. Em algumas formas de realização, o valor de Tm de um anticorpo anti-VEGF é determinado como descrito, por exemplo, no Exemplo 1 do Pedido de Patente

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Internacional No. PCT/ US2016/ 053454, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Seção 3: Fragmentos de Anticorpo [0429] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpo incluem, entre outros, fragmentos Fab, Fab', Fab-C, Fab'-SH, F(ab')2, Fv e scFv e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, ver por exemplo Plückthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, Nova Iorque), pp. 269-315 (1994); ver também WO 93/16185; e as patentes US 5,571,894 e 5,587,458. Para discussão sobre fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento e que possuem meia-vida in vivo aumentada, ver Patente US 5,869,046.

[0430] Os diabodies são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Ver, por exemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc Natl Acad Sei USA 90, 6444-6448 (1993). Triabodies e tetrabodies também são descritos em Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003).

[0431]Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreendem a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas formas de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por exemplo, Patente US 6,248,516 B1).

[0432] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando a digestão proteolítica de um

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159/254 anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), como aqui descrito.

Seção 4: Anticorpos Quiméricos e Humanizados [0433] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, um domínio variável derivado de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e um domínio constante humano. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe comutada”, no qual a classe ou subclasse foi alterada daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem seus fragmentos de ligação ao antígeno.

[0434] Em certas formas de realização, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, por exemplo, CDRs (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado, opcionalmente, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas formas de realização, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos com resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

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160/254 [0435] Anticorpos humanizados e métodos para fabricá-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), e são ainda descritos, por exemplo, em Riechmann et aí, Nature 332: 323-329 (1988); Queen et aí, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 86: 10029-10033 (1989); Patentes US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 e US 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (descrevendo o enxerto da região determinante de especificidade (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (descrevendo “renovação da superfície” (“resurfacing)); DalIAcqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (descrevendo “embaralhamento de FR” (“FR shuffling)); e Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) e Klimka et ai., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de “seleção guiada” ao embaralhamento de FR).

[0436] As regiões estruturais humanas que podem ser usadas para humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estruturais selecionadas usando o método “melhor ajuste” (ver, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (ver, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); e Presta et. al. J. Immunol. 151: 2623 (1993)); regiões estruturais humanas matures (somaticamente mutadas) ou regiões estrutureis de linha germinal humana (ver, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); e regiões estrutureis derivadas da triagem de bibliotecas FR (ver, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 1067810684 (1997) e Rosokef al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).

Seção 5: Anticorpos Derivados de Bibliotecas [0437] Os anticorpos da invenção podem ser isolados por triagem de bibliotecas combinatórias quanto a anticorpos com a (s) atividade (s) desejada (s). Por exemplo, são conhecidos na técnica uma variedade de

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161/254 métodos para gerar bibliotecas de exibição de fagos e fazer a triagem dessas bibliotecas quanto a anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Tais métodos são revistos, por exemplo, em Hoogenboom etal., em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e mais detalhadamente descritos, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks etal., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks e Bradbury, em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004).

[0438] Em certos métodos de exibição de fagos, os repertórios dos genes VH e VL são clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem então ser tríadas quanto a fagos de ligação a antígenos, conforme descrito em Winter et at, Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994). Os fagos apresentam tipicamente fragmentos de anticorpo, como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade ao imunogênio sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, o repertório simples pode ser clonado (por exemplo, do ser humano) para fornecer uma única fonte de anticorpos para uma ampla gama de antígenos não próprios e também próprios sem nenhuma imunização, como descrito por Griffiths et al. em EMBO J, 12: 725734 (1993). Finalmente, as bibliotecas simples também podem ser feitas sinteticamente, clonando segmentos do gene V não rearranjados de célulastronco e usando iniciadores de PCR contendo sequência aleatória para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e realizar rearranjo in vitro,

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162/254 conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992). As publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patentes US 5.750.373; bem como as publicações de patentes US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 e US 2009/0002360.

[0439] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser derivados de bibliotecas de fagos como descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2016/053454.

[0440] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos aqui.

Seção 6: Anticorpos Multiesrecíficos [0441] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes. Em certas formas de realização, uma das especificidades de ligação é para VEGF e a outra é para qualquer outro antígeno (por exemplo, uma segunda molécula biológica, por exemplo, interleucina-1 beta (IL-Ιβ); interleucina-6 (IL-6); receptor de interleucina-6 (IL-6R); interleucina-13 (IL-13); receptor de IL-13 (IL13R); PDGF (por exemplo, PDGF-BB); angiopoietina; angiopoietina 2 (Ang2); Tie2; S1P; integrinas ανβ3, ανβ5 e α5β1; betacelulina; apelina/ APJ; eritropoietina; fator de complemento D; TNFa; HtrA1; um receptor de VEGF (por exemplo, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, receptor de VEGF ligado à membrana (mbVEGFR) ou receptor de VEGF solúvel (sVEGFR)); receptor ST2; e proteínas geneticamente ligadas ao risco de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), tais como componentes da via do

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163/254 complemento C2, fator B, fator H, CFHR3, C3b, C5, C5a e C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; interleucina-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; e TNFRSF10A. Consequentemente, o anticorpo biespecífico pode ter especificidade de ligação para VEGF e IL-1 β; VEGF e IL- 6, VEGF e IL-6R; VEGF e IL-13; VEGF e IL-13R; VEGF e PDGF (por exemplo, PDGF-BB); VEGF e angiopoietina; VEGF e Ang2; VEGF e Tie2; VEGF e S1P; VEGF e integrina ανβ3; VEGF e integrina ανβ5; VEGF e integrina α5β1; VEGF e betacelulina; VEGF e apelina/ APJ; VEGF e eritropoietina; VEGF e fator de complemento D; VEGF e TNFa; VEGF e HtrA1; VEGF e um receptor de VEGF (por exemplo, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR ou sVEGFR); VEGF e receptor de ST-2; VEGF e C2; VEGF e fator B; VEGF e fator H; VEGF e CFHR3; VEGF e C3b; VEGF e C5; VEGF e C5a; VEGF e C3a; VEGF e ARMS2; VEGF e TIMP3; VEGF e HLA; VEGF e IL-8; VEGF e CX3CR1; VEGF e TLR3; VEGF e TLR4; VEGF e CETP; VEGF e LIPC; VEGF e COL10A1; ou VEGF e TNFRSF10A. Em certas formas de realização, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes de VEGF. Anticorpos biespecíficos também podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicos em células que expressam VEGF. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab' ou fragmentos Fab-C).

[0442] Em alguns casos, o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti- angiopoietina 2 (Ang2) divulgado no Pedido de Patente US 2014/0017244, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Por exemplo, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-Ang2 pode incluir um primeiro domínio de ligação que se liga ao VEGF (como qualquer um dos anticorpos anti-VEGF aqui descritos) e um segundo domínio de ligação que se liga a Ang2 que inclui (a) uma HVR -H1 que compreende a sequência de aminoácidos de GYYMH (SEQ ID NO: 61); (b) uma HVR-H2 que

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164/254 compreende a sequência de aminoácidos de WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 62); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SPNPYYYDSSGYYYPGAFDI (SEQ ID NO: 63); (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO: 64); (e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de DDSDRPS (SEQ ID NO: 65); e (f) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QVWDSSSDHWV (SEQ ID NO: 66) ou uma combinação de uma ou mais das HVRs acima e uma ou mais variantes das mesmas com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade) com qualquer uma das SEQ ID NOs: 61-66.

[0443] Em alguns casos, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/ antiAng2 pode incluir um primeiro domínio de ligação que se liga ao VEGF (como qualquer um dos anticorpos anti-VEGF aqui descritos) e um segundo domínio de ligação que se liga a Ang2. Em alguns casos, o anticorpo biespecífico antiVEGF/ anti-Ang2 pode incluir um primeiro domínio de ligação que se liga ao VEGF (tal como qualquer um dos anticorpos anti-VEGF aqui descritos) e um segundo domínio de ligação que se liga especificamente a Ang2, em que o segundo domínio de ligação é qualquer domínio de ligação de anticorpo descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2010/069532, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade, ou uma variante do mesmo.

[0444] Em outros casos, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/ antiAng2 é qualquer anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-Ang2 descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2016/073157.

[0445] Em alguns casos, o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-IL-6. Em alguns casos, um anticorpo biespecífico

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165/254 anti-VEGF/ anti-IL-6 pode incluir um primeiro domínio de ligação que se liga ao VEGF (tal como qualquer um dos anticorpos anti-VEGF aqui descritos) e um segundo domínio de ligação que se liga à IL-6. O segundo domínio de ligação pode ser um domínio de ligação de qualquer anticorpo anti-IL-6 conhecido na técnica, por exemplo, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; ver, por exemplo, WO 2016/073890, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), siltuximab (SYLVANT®), olokizumab, clazakizumab, sirukumab, elsilimomab, gerilimzumab, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921 ou uma variante dos mesmos.

[0446] Em alguns casos, o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-IL-6R. Em alguns casos, um anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-IL-6R pode incluir um primeiro domínio de ligação que se liga ao VEGF (tal como qualquer um dos anticorpos anti-VEGF aqui descritos) e um segundo domínio de ligação que se liga a IL-6R. O segundo domínio de ligação pode ser um domínio de ligação a qualquer anticorpo anti-IL-6R conhecido na técnica, por exemplo, tocilizumab (ACTEMRA®) (ver, por exemplo, WO 1992/019579, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), sarilumab, vobarilizumab (ALX-0061), SA-237 ou uma variante dos mesmos.

[0447] As técnicas para produzir anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitadas a co-expressão recombinante de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina com especificidades diferentes (ver Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e engenharia “protuberância-emorifício” (“knob-in-hole) (ver, por exemplo, Patente US 5.731.168). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por efeitos de direção eletrostática de engenharia para produzir moléculas heterodiméricas de anticorpo FC (ver, por exemplo, WO 2009/089004 A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (ver, por exemplo, Patente US No. 4.676.980, e

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Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizando zipper leucina para produzir anticorpos bi-específicos (ver, por exemplo, Kostelny et aí, J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)); utilizando a tecnologia “diabody” para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (ver, por exemplo, Hollinger et aí, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993)); e utilizando dímeros de cadeia simples de Fv (sFv) (ver, por exemplo, Gruber et aí, J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparando anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[0448] Anticorpos projetados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais, incluindo “anticorpos de octópode” também estão incluídos neste documento (ver, por exemplo, US 2006/ 0025576 A1).

[0449] O anticorpo ou fragmento aqui também inclui um “FAb de ação dupla” ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao VEGF, bem como outro antígeno diferente (ver, por exemplo, US 2008/0069820).

Seção 7: Variantes de Anticorpos [0450] Em certas formas de realização, variantes de sequência de aminoácidos (por exemplo, variantes de anticorpo incluindo uma ou mais alterações de resíduos de aminoácidos) dos anticorpos aqui fornecidos são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas através da introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica o anticorpo ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ ou inserções e/ ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao

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167/254 antígeno.

(a) Variantes de Substituição, Inserção e Deleção [0451] Em certas formas de realização, variantes de anticorpo com uma ou mais substituições de aminoácidos são fornecidas. Os sítios de interesse para a mutagênese substitucional incluem as HVRs e FRs. As substituições conservadoras são mostradas na Tabela 1, sob o título de “substituições preferidas”. Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 1, sob o título de “substituições exemplificativas”, e conforme descrito abaixo em referência às classes de cadeias laterais de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/ aprimorada, imunogenicidade reduzida ou outras características funcionais, por exemplo, estabilidade ou função efetora.

Tabela 1

Resíduo Original	Substituições exemplificativas	Substituições preferidas
Ala (A)	Vai; Leu; He	Vai
Arg (R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn (N)	Gin; His; Asp, Lys; Arg	Gin
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gin (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gin	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg
He (1)	Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina	Leu
Leu (L)	Norleucina; He; Vai; Met; Ala; Phe	lie
Lys (K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; lie	Leu

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Resíduo Original	Substituições exemplificativas	Substituições preferidas
Phe (F)	Trp; Leu; Vai; He; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
Thr (T)	Vai; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Vai (V)	He; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina	Leu

[0452] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie; (2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) ácida: Asp, Glu; (4) básica: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromática: Trp, Tyr, Phe; Substituições não conservadoras implicarão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[0453] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável e/ ou resíduos de FR de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado). Geralmente, a (s) variante (s) resultante (s) selecionada (s) para estudo adicional terá (ão) modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, estabilidade aumentada, expressão aumentada, pl alterado e/ ou imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ ou terá (ão) certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parental. Uma variante de substituição exemplificativa é um anticorpo de afinidade madura, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação de afinidade baseadas em exibição de fagos, tais como aquelas aqui descritas. Resumidamente, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos variantes exibidos no fago e selecionados quanto a uma atividade biológica

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169/254 específica (por exemplo, afinidade de ligação).

[0454] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade de anticorpos. Tais alterações podem ser feitas nos “pontos críticos” da HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (ver, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)), el ou resíduos que contatam o antígeno, com a variante resultante VH ou VL sendo testada quanto à afinidade de ligação. A maturação de afinidade através da construção e nova seleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al., em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Em algumas formas de realização de maturação de afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erros, embaralhamento de cadeia ou mutagênese dirigida por oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então selecionada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, nas quais vários resíduos de HVR (por exemplo, 4-6 resíduos de cada vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser identificados especificamente, por exemplo, usando mutagênese por varredura de alanina ou modelagem. CDR-H3 e CDR-L3, em particular, são frequentemente direcionadas.

[0455] Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, desde que essas alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras como aqui fornecidas) que não reduzem

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170/254 substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos de contato com o antígeno nas HVRs. Em certas formas de realização das sequências variantes de VH e VL fornecidas acima, cada HVR é inalterada ou contém não mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[0456] Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais FRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno. Tais alterações podem, por exemplo, melhorar a afinidade e/ ou a estabilidade do anticorpo (por exemplo, como avaliado por um aumento da temperatura de fusão).

[0457] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado “mutagênese por varredura de alanina”, como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente, ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos à substituição. As variantes podem ser selecionadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[0458] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ ou carboxil-terminais com comprimento variando de um resíduo a

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171/254 polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequencias de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao Nou C-terminal do anticorpo com uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.

(b) Variantes de Pontos Isoelétricos [0459] A invenção fornece variantes de anticorpos com pontos isoelétricos alterados. Por exemplo, a invenção fornece variantes de anticorpos com um ponto isoelétrico reduzido (pl), por exemplo, em comparação com um anticorpo anti-VEGF, por exemplo, G6.31. Em alguns casos, a carga superficial é reduzida em pH fisiológico. Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF tem um pl igual ou inferior a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5 ou cerca de 4). Em alguns casos, o anticorpo tem um pl de cerca de 4 a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7 ou cerca de 8). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF tem um pl de cerca de 5 a cerca de 7 (por exemplo, cerca de 5, cerca de 6 ou cerca de 7). Em alguns casos, o anticorpo anti-VEGF tem um pl de cerca de 5 a cerca de 6 (por exemplo, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9 ou cerca de 6) [0460] Os anticorpos da invenção podem ser projetados por engenharia para ter um pl reduzido, por exemplo, substituindo resíduos de aminoácidos do tipo selvagem em uma determinada posição com um aminoácido com um pl mais baixo. O pl de um aminoácido pode ser determinado com base nos valores de pKa da amina (-NH2), ácido carboxílico (-COOH) e cadeia lateral do aminoácido, que são conhecidos na técnica. Em algumas formas de realização, os resíduos de aminoácidos expostos à superfície podem ser substituídos para reduzir o pl de um anticorpo. Em uma

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172/254 forma de realização, os resíduos de aminoácidos expostos à superfície podem ser substituídos com glutamato (E). Em uma forma de realização, os resíduos de aminoácidos expostos à superfície podem ser substituídos com aspartato (D).

Métodos e Composições Recombinantes [0461] Qualquer um dos anticorpos (por exemplo, anticorpos antiVEGF) aqui descritos pode ser produzido usando métodos e composições recombinantes, por exemplo, como descrito na Patente U.S. 4.816.567. Em uma forma de realização, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-VEGF aqui descrito. Tal ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a VL e/ ou uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leve e/ ou pesada do anticorpo). Em uma forma de realização adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreende tal ácido nucleico são fornecidos. Em uma forma de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Em uma dessas formas de realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula linfóide (por exemplo, célula Y0, NSO, Sp20). Em uma forma de realização, é fornecido um método de produção de um anticorpo anti-VEGF, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira

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173/254 compreendedo um ácido nucleico que codifica o anticorpo, como fornecido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[0462] Para a produção recombinante de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF), o ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, como descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ ou expressão em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo).

[0463] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores codificadores de anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas aqui descritas. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, as patentes US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. Ver também Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), p. 245254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli. Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser ainda mais purificado.

[0464]Além dos procariontes, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificadores de anticorpos, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou

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174/254 totalmente humano. Ver Gemgross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), e Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006).

[0465] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas baculovirais que podem ser usadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[0466] As culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros. Ver, por exemplo, as patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES™ para a produção de anticorpos em plantas transgênicas).

[0467]As células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, linhagens celulares de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293T, conforme descrito, por exemplo, em Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células renais de hamster bebê (BHK), células de sertoli de camundongo (células TM4, como descrito, por exemplo, em Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células renais de macaco (CV1), células renais de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células renais caninas (MDCK), células de fígado de rato búfalo (BRL 3A), células pulmonares humanas (W138), células hepáticas humanas (Hep G2), células tumorais mamárias de camundongos (MMT 060562), células TRI, como descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals NY Acad Sci 383, 44-68 (1982), células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens

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175/254 celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (llrlaub et al., Proc Natl Acad Sei USA 77, 4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma tais como YO, NSO e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para produção de anticorpos, ver, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), p. 255-268 (2003).

Ensaios [0468]Anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-VEGF aqui descritos), bem como conjugados de anticorpos (por exemplo, conjugados de anticorpos que incluem anticorpos anti-VEGF (por exemplo, qualquer anticorpo anti-VEGF aqui fornecido)) podem ser identificados, selecionados ou caracterizados pelas suas propriedades físicas/ químicas e/ ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.

(a) Ensaios de Ligação e outros Ensaios [0469] Em um aspecto, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF), ou um conjugado de anticorpo do mesmo, é testado quanto à sua atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos tais como ELISA, Western blot, etc.

[0470] Em outro aspecto, ensaios de competição podem ser utilizados para identificar um anticorpo que compete com um anticorpo como aqui descrito, ou um conjugado de anticorpo do mesmo, para ligação a um antígeno (por exemplo, VEGF). Em certas formas de realização, tal anticorpo competidor se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou um conformacional) que é ligado por um anticorpo como aqui descrito. Métodos exemplificativos detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols, em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

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176/254 [0471] Em um ensaio de competição exemplificativo, o VEGF imobilizado é incubado em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga ao VEGF e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo para se ligar ao VEGF. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o VEGF imobilizado é incubado em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo ao VEGF, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associada ao VEGF imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associado ao VEGF imobilizado for substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo pela ligação ao VEGF. Ensaios semelhantes podem ser realizados para outros antígenos. Ver Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

(b) Ensaios de Atividade [0472] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-VEGF) ou seus conjugados de anticorpos, com atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, ligação a um antígeno (por exemplo, VEGF (por exemplo, VEGF na corrente sanguínea)) ou um fragmento peptídico do mesmo, in vivo, in vitro ou ex vivo. Em certas formas de realização, a atividade biológica pode incluir bloquear ou neutralizar um antígeno. Por exemplo, em certas formas de realização, a atividade biológica pode incluir bloquear ou neutralizar o VEGF ou impedir que o VEGF se ligue a um ligante, por exemplo, um receptor tal como KDR ou Flt-1. Anticorpos, ou seus conjugados de anticorpos, com essa atividade biológica in vivo e/ ou in vitro também são fornecidos. Em certas

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177/254 formas de realização, um anticorpo da invenção, ou um conjugado de anticorpo do mesmo, é testado para essa atividade biológica.

(c) Ensaios de Estabilidade [0473] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para determinar a estabilidade (por exemplo, termoestabilidade) de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF) ou um conjugado de anticorpo do mesmo. Por exemplo, a estabilidade de um anticorpo, ou de um conjugado de anticorpo do mesmo, pode ser determinada usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, fluorimetria diferencial de varredura (DSF), dicroísmo circular (CD), fluorescência intrínseca de proteínas, calorimetria diferencial de varredura, espectroscopia, espalhamento de luz (por exemplo, espalhamento dinâmico de luz (DLS) e espalhamento estático de luz (SLS), cromatografia de auto-interação (SIC). A estabilidade de um anticorpo, ou de um conjugado de anticorpo do mesmo, pode ser determinada como descrito aqui, por exemplo, usando DSF como descrito, por exemplo, nos Exemplos 1 e 2 do Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2016/053454. Em alguns casos, a estabilidade de um conjugado de anticorpo pode ser determinada por cromatografia de exclusão por tamanho alinhada com o índice de refração e detectores de espalhamento de luz de vários ângulos (SEC-RI-MALS).

Métodos e Composições Terapêuticos [0474] Qualquer um dos anticorpos (por exemplo, anticorpos antiVEGF) ou seus conjugados de anticorpos (por exemplo, conjugados de hidrogel de HA reticulado), aqui fornecidos, podem ser utilizados em métodos terapêuticos.

[0475] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-VEGF para uso como medicamento. Em outro aspecto, um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) para uso como medicamento é fornecido. Em aspectos adicionais, a invenção fornece um

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178/254 anticorpo anti-VEGF para uso no tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica. Em outro aspecto, a invenção fornece um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) para uso no tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica. Em algumas formas de realização, o distúrbio associado à angiogênese patológica é um distúrbio ocular ou um distúrbio proliferativo celular. Em alguns casos, o distúrbio ocular é AMD (por exemplo, AMD úmida, AMD seca, AMD intermediária, AMD avançada ou atrofia geográfica (GA)), degeneração macular, edema macular, DME (por exemplo, DME focal, não central ou DME difuso e envolvido no centro), retinopatia, retinopatia diabética (DR) (por exemplo, DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) ou DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquemia, ROP, oclusão de veia da retina (RVO) (por exemplo, formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), CNV (por exemplo, CNV míope), neovascularização da córnea, doenças associadas à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, doenças associadas à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, FEVR, doença de Coats, doença de Norrie, OPPG, hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intra-ocular, degeneração da retina, edema macular cistoide (CME), vasculite, papiloedema, retinite, conjuntivite (por exemplo, conjuntivite infecciosa e conjuntivite não-infecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber, uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não-infecciosa), coroidite (por exemplo, coroidite multifocal), histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática ou doença de Sjogren. Em alguns casos, o distúrbio proliferativo celular é câncer. Em alguns casos, o câncer é câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão

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179/254 de células não pequenas, linfoma não-Hodgkins (NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma ou mieloma múltiplo. Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-VEGF para uso no tratamento de um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável. Em alguns casos, o distúrbio associado à permeabilidade vascular indesejável é edema associado a tumores cerebrais, ascites associadas a doenças malignas, síndrome de Meigs, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica, derrame pericárdico, derrame pleural ou permeabilidade associada a doenças cardiovasculares.

[0476] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-VEGF para uso em um método de tratamento. Em outro aspecto, é fornecido um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) para uso em um método de tratamento. Em certos casos, a invenção fornece um anticorpo anti-VEGF (por exemplo, um anticorpo antiVEGF) para uso em um método de tratamento de um sujeito com um distúrbio associado à angiogênese patológica, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo anti-VEGF. A invenção também fornece um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) para uso em um método de tratamento de um sujeito com um distúrbio associado à angiogênese patológica compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do conjugado de anticorpo. Em alguns casos, o distúrbio associado à angiogênese patológica é um distúrbio ocular. Em alguns casos, o distúrbio ocular é AMD (por exemplo, AMD úmida, AMD seca, AMD intermediária, AMD avançada ou atrofia geográfica (GA)), degeneração macular, edema macular, DME (por exemplo, DME focal, não central ou DME difuso e envolvido no centro), retinopatia, retinopatia diabética (DR) (por exemplo, DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) ou DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquemia, ROP, oclusão de veia da

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180/254 retina (RVO) (por exemplo, formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), CNV (por exemplo, CNV míope), neovascularização da córnea, doenças associadas à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, doenças associadas à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, FEVR, doença de Coats, doença de Norrie, OPPG, hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intraocular, degeneração da retina, edema macular cistoide (CME), vasculite, papiloedema, retinite, conjuntivite (por exemplo, conjuntivite infecciosa e conjuntivite não-infecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber, uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não-infecciosa), coroidite (por exemplo, coroidite multifocal), histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática ou doença de Sjogren. Em alguns casos, o distúrbio proliferative celular é câncer. Em alguns casos, o câncer é câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, linfoma não-Hodgkins (NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma ou mieloma múltiplo.

[0477] Em outros casos, a invenção fornece um anticorpo antiVEGF para uso em um método de tratamento de um indivíduo com um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável. Em outros casos, a invenção fornece um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) para uso em um método de tratamento de um indivíduo com um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável. Em alguns casos, o distúrbio associado à permeabilidade vascular indesejável é edema associado a tumores cerebrais, ascites associadas a doenças malignas, síndrome de Meigs, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica,

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181/254 derrame pericárdico, derrame pleural ou permeabilidade associada a doenças cardiovasculares. Qualquer um dos usos anteriores pode ainda incluir a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo.

[0478] Em alguns casos, a invenção fornece um anti-VEGF para uso na redução ou inibição da angiogênese em um sujeito. Em outro aspecto, um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) para uso na redução ou inibição da angiogênese em um sujeito é fornecido. Em certas formas de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-VEGF para uso em um método de redução ou inibição da angiogênese em um sujeito que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo anti-VEGF para reduzir ou inibir a angiogênese. A invenção também fornece um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) para uso em um método de redução ou inibição da angiogênese em um sujeito que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do conjugado de anticorpo. Em outros casos, a invenção fornece um anticorpo anti-VEGF, ou um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) do mesmo, para uso na redução ou inibição da permeabilidade vascular em um sujeito. Em certas formas de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-VEGF, ou um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) do mesmo, para uso em uma redução ou inibição da permeabilidade vascular em um sujeito que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo antiVEGF ou conjugado de anticorpo para reduzir ou inibir a permeabilidade vascular. Um “sujeito” de acordo com qualquer um dos usos acima pode ser humano.

[0479] A invenção prevê a utilização de um anticorpo anti-VEGF na fabricação ou preparação de um medicamento. A invenção também prevê a

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182/254 utilização de um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) na fabricação ou preparação de um medicamento. Por exemplo, em um exemplo, o medicamento é para o tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica. Em um outro exemplo, o medicamento é para uso em um método de tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica, compreendendo a administração a um sujeito com um distúrbio associado à angiogênese patológica, de uma quantidade eficaz do medicamento. Em alguns casos, o distúrbio associado à angiogênese patológica é um distúrbio ocular. Em alguns casos, o distúrbio ocular é AMD (por exemplo, AMD úmida, AMD seca, AMD intermediária, AMD avançada ou atrofia geográfica (GA)), degeneração macular, edema macular, DME (por exemplo, DME focal, não central ou DME difuso e envolvido no centro), retinopatia, retinopatia diabética (DR) (por exemplo, DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) ou DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquemia, ROP, oclusão de veia da retina (RVO) (por exemplo, formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), CNV (por exemplo, CNV míope), neovascularização da córnea, doenças associadas à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, doenças associadas à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, FEVR, doença de Coats, doença de Norrie, OPPG, hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intraocular, degeneração da retina, edema macular cistoide (CME), vasculite, papiloedema, retinite, conjuntivite (por exemplo, conjuntivite infecciosa e conjuntivite não-infecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber, uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não-infecciosa), coroidite (por exemplo, coroidite multifocal),

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183/254 histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática ou doença de Sjogren. Em alguns casos, o distúrbio proliferativo celular é câncer. Em alguns casos, o câncer é câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, linfoma não-Hodgkins (NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma ou mieloma múltiplo. Em um outro exemplo, o medicamento é para reduzir ou inibir a angiogênese em um sujeito. Em um exemplo adicional, o medicamento é para uso em um método de redução ou inibição da angiogênese em um sujeito que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do medicamento para reduzir ou inibir a angiogênese. Em qualquer um dos usos anteriores de medicamentos, o método pode incluir a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo.

[0480] Em outro exemplo, o medicamento é para o tratamento de um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável. Em alguns casos, o distúrbio associado à permeabilidade vascular indesejável é edema associado a tumores cerebrais, ascites associadas a doenças malignas, síndrome de Meigs, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica, derrame pericárdico, derrame pleural ou permeabilidade associada a doenças cardiovasculares. Em um outro exemplo, o medicamento é para uso em um método de tratamento de um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável, compreendendo administrar a um sujeito com um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável, uma quantidade eficaz do medicamento. Em outro exemplo, o medicamento é para reduzir ou inibir a permeabilidade vascular em um sujeito. Em um outro exemplo, o medicamento é para uso em um método de redução ou inibição da permeabilidade vascular em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do medicamento para reduzir ou inibir a angiogênese. Em qualquer um dos usos

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184/254 anteriores de medicamentos, o método pode incluir a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Um “sujeito” de acordo com qualquer um dos usos acima pode ser humano.

[0481] A invenção fornece um método para o tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica. Em uma forma de realização, o método compreende a administração a um indivíduo com um distúrbio associado à angiogênese patológica, de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-VEGF. Em outro exemplo, o método compreende a administração a um indivíduo com um distúrbio associado à angiogênese patológica, de uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado). Em alguns casos, o distúrbio associado à angiogênese patológica é um distúrbio ocular. Em alguns casos, o distúrbio ocular é AMD (por exemplo, AMD úmida, AMD seca, AMD intermediária, AMD avançada ou atrofia geográfica (GA)), degeneração macular, edema macular, DME (por exemplo, DME focal, não central ou DME difuso e envolvido no centro), retinopatia, retinopatia diabética (DR) (por exemplo, DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) ou DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquemia, ROP, oclusão de veia da retina (RVO) (por exemplo, formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), CNV (por exemplo, CNV míope), neovascularização da córnea, doenças associadas à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, doenças associadas à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, FEVR, doença de Coats, doença de Norrie, OPPG, hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intraocular, degeneração da

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185/254 retina, edema macular cistoide (CME), vasculite, papiloedema, retinite, conjuntivite (por exemplo, conjuntivite infecciosa e conjuntivite não-infecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber, uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não-infecciosa), coroidite (por exemplo, coroidite multifocal), histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática ou doença de Sjogren. Em alguns casos, o distúrbio proliferative celular é câncer. Em alguns casos, o câncer é câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, linfoma não-Hodgkins (NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma ou mieloma múltiplo. Em um outro exemplo, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, como descrito abaixo. Um “sujeito” de acordo com qualquer um dos métodos acima pode ser humano.

[0482] A invenção fornece um método para o tratamento de um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável. Em uma forma de realização, o método compreende a administração a um indivíduo com um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-VEGF. Em outra forma de realização, o método compreende administrar a um indivíduo com um distúrbio associado a permeabilidade vascular indesejável uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado). Em alguns casos, o distúrbio associado à permeabilidade vascular indesejável é edema associado a tumores cerebrais, ascites associadas a doenças malignas, síndrome de Meigs, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica, derrame pericárdico, derrame pleural ou permeabilidade associada a doenças cardiovasculares. Em outros casos, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, como descrito abaixo. Um “sujeito” de acordo com qualquer um dos

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186/254 métodos acima pode ser humano.

[0483] Está contemplado que o anticorpo ou conjugado de anticorpo (por exemplo, conjugado de hidrogel de HA reticulado) da presente invenção pode ser utilizado para tratar um mamífero. Em uma forma de realização, o anticorpo ou conjugado de anticorpo (por exemplo, conjugado de hidrogel de HA reticulado) é administrado a um mamífero não humano com a finalidade de obter dados pré-clínicos, por exemplo. Mamíferos não humanos exemplificativos a serem tratados incluem primatas não humanos, cães, gatos, roedores (por exemplo, camundongos e ratos) e outros mamíferos nos quais são realizados estudos pré-clínicos. Tais mamíferos podem ser modelos animais estabelecidos para uma doença a ser tratada com o anticorpo ou podem ser usados para estudar a toxicidade ou farmacocinética do anticorpo de interesse. Em cada uma dessas formas de realização, os estudos de escalonamento de dose podem ser realizados no mamífero. O anticorpo ou conjugado de anticorpo (por exemplo, conjugado de hidrogel de HA reticulado) pode ser administrado a um roedor hospedeiro em um modelo de tumor sólido, por exemplo. O anticorpo ou conjugado de anticorpo pode ser administrado a um hospedeiro (por exemplo, um roedor, por exemplo, um coelho) para estudos farmacocinéticos oculares, por exemplo, por administração intravítrea (por exemplo, injeção intravítrea).

[0484] Em um aspecto adicional, a invenção fornece formulações farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-VEGF) ou conjugados de anticorpos (por exemplo, conjugados de hidrogel de HA reticulado) aqui fornecidos, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma forma de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-VEGF) ou conjugados de anticorpos (por exemplo, conjugados de hidrogel de HA reticulado) fornecidos aqui e um veículo

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187/254 farmaceuticamente aceitável. Em outra forma de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-VEGF) ou conjugados de anticorpos (por exemplo, conjugados de hidrogel de HA reticulado) fornecidos aqui e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Em certas formas de realização, a formulação farmacêutica compreende um ou mais compostos adicionais. Em certas formas de realização, o composto adicional se liga a uma segunda molécula biológica selecionada a partir do grupo que consiste em IL1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; angiopoietina; Ang2; Tie2; S1P; integrinas ανβ3, ανβ5 e α5β1; betacelulina; apelina/ APJ; eritropoietina; fator de complemento D; TNFa; HtrA1; um receptor de VEGF; receptor ST-2; e proteínas geneticamente ligadas ao risco de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), tais como componentes da via do complemento 02, fator B, fator H, CFHR3, C3b, 05, C5a e C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; interleucina-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC, COL10A1; e TNFRSF10A. Em certas formas de realização, o composto adicional é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por exemplo, em alguns casos, o composto adicional é um anticorpo biespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-Ang2, tal como RG-7716 ou qualquer anticorpo biespecífico biespecífico anti-VEGF/ anti-Ang2 revelado em WO 2010/069532 ou WO 2016/073157 ou uma variante do mesmo. Em outro exemplo, em alguns casos, o composto adicional é um anticorpo anti-IL-6, por exemplo, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; ver, por exemplo, WO 2016/073890), siltuximab (SYLVANT®), olokizumab, clazakizumab, sirukumab, elsilimomab, gerilimzumab, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921 ou uma variante do mesmo. Em um outro exemplo, em alguns casos, o composto adicional é um anticorpo anti-IL-6R, por exemplo, tocilizumab (ACTEMRA®) (ver, por exemplo, WO 1992/019579), sarilumab, vobarilizumab (ALX-0061),

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SA-237 ou uma variante do mesmo.

[0485] Anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-VEGF) ou conjugados de anticorpos (por exemplo, conjugados de hidrogel de HA reticulado) podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo (por exemplo, anticorpo antiVEGF) ou conjugado de anticorpo (por exemplo, conjugado de hidrogel de HA reticulado) pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas formas de realização, um agente terapêutico adicional é outro anticorpo, um agente quimioterapêutico, um agente citotóxico, um agente antiangiogênico, um agente imunossupressor, um pró-fármaco, uma citocina, um antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, um corticosteróide, um antiemético, uma vacina contra o câncer, um analgésico, um agente inibidor do crescimento ou combinações dos mesmos.

[0486] Por exemplo, em certas formas de realização, qualquer um dos métodos anteriores compreende ainda a administração de um ou mais compostos adicionais. Em certas formas de realização, o anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-VEGF) ou o conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) é administrado simultaneamente com o (s) composto (s) adicional (ais). Em certas formas de realização, o anticorpo ou conjugado de anticorpo é administrado antes ou depois do (s) composto (s) adicional (ais). Em certas formas de realização, o composto adicional se liga a uma segunda molécula biológica selecionada a partir do grupo que consiste em IL-Ιβ; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; angiopoietina; Ang2; Tie2; S1P; integrinas ανβ3, ανβ5 e α5β1; betacelulina; apelina/ APJ; eritropoietina; fator de complemento D; TNFa; HtrA1; um receptor de VEGF; receptor ST-2; e proteínas geneticamente ligadas ao risco de AMD, tais como componentes da via do complemento C2, fator B, fator H, CFHR3, C3b, C5, C5a e C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; interleucina-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP;

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LIPC; COL10A1; e TNFRSF10A. Em certas formas de realização, o composto adicional é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas formas de realização de acordo com (ou como aplicado a) qualquer uma das formas de realização acima, o distúrbio ocular é uma doença neovascular intraocular selecionada a partir do grupo que consiste em retinopatias proliferativas, neovascularização da coróide (CNV), degeneração macular relacionada com a idade (AMD), retinopatias diabéticaa e outras relacionadas à isquemia, edema macular diabético, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, oclusão de veia da retina (RVO), incluindo CRVO e BRVO, neovascularização da córnea, neovascularização da retina e retinopatia da prematuridade (ROP). Por exemplo, em alguns casos, o composto adicional é um anticorpo biespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-Ang2, tal como RG-7716 ou qualquer anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-Ang2 revelado em WO 2010/069532 ou WO 2016/073157 ou uma variante do mesmo. Em outro exemplo, em alguns casos, o composto adicional é um anticorpo anti-IL-6, por exemplo, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; ver, por exemplo, WO 2016/073890), siltuximab (SYLVANT®), olokizumab, clazakizumab, sirukumab, elsilimomab, gerilimzumab, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921 ou uma variante do mesmo. Em um outro exemplo, em alguns casos, o composto adicional é um anticorpo anti-IL-6R, por exemplo, tocilizumabe (ACTEMRA®) (ver, por exemplo, WO 1992/019579), sahlumab, vobarilizumab (ALX-0061), SA-237 ou uma variante dos mesmos.

[0487] Em alguns casos, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF) ou um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) da invenção pode ser administrado em combinação com pelo menos um agente terapêutico adicional para o tratamento de um distúrbio ocular, por exemplo, um distúrbio ocular aqui descrito (por exemplo, AMD (por exemplo, AMD úmida), DME, DR ou RVO). Agentes terapêuticos

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190/254 adicionais exemplificativos para terapia combinada para tratamento de distúrbios oculares incluem, sem limitação, agentes antiangiogênicos, tais como antagonistas de VEGF, incluindo, por exemplo, anticorpos anti-VEGF (por exemplo, o anti-VEGF Fab LUCENTIS® (ranibizumabe)), proteínas de fusão de receptores solúveis (por exemplo, a proteína de fusão de receptor solúvel recombinante EYLEA® (aflibercept, também conhecida como VEGF Trap Eye; Regeneron/ Aventis)), aptâmeros (por exemplo, o aptâmero peguilado anti-VEGF MACUGEN® (pegaptanib sódio; NeXstar Pharmaceuticals/ OSI Pharmaceuticals)) e inibidores da tirosina quinase de VEGFR (por exemplo, 4- (4-bromo-2-fluoroanilino)-6-metoxi-7-(1-metilpiperidin4-ilmetoxi) quinazolina (ZD6474), 4-(4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7- (3pirrolidin-1 -ilpropoxi) quinazolina (AZD2171), vatalanib (PTK787), semaxaminib (SU5416; SUGEN) e SUTENT® (sunitinib)); Triptofanil-tRNA sintetase (TrpRS); esqualamina; RETAANE® (acetato de anecortave para suspensão de depósito; Alcon, Inc.); Pró-fármaco A4 de combretastatina (CA4P); MIFEPREX® (mifepristona-ru486); triancinolona acetonida subteniana; triancinolona acetonida cristalina intravítrea; inibidores de metaloproteinase da matriz (por exemplo, Prinomastat (AG3340; Pfizer)); acetonida de fluocinolona (incluindo implante intraocular de fluocinolona; Bausch & Lomb/ Control Delivery Systems); linomida; inibidores da função integrina β3; angiostatina e combinações dos mesmos. Estes e outros agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com um conjugado de anticorpos da invenção são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente US 2014/0017244, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0488] Outros exemplos de agentes terapêuticos adicionais que podem ser utilizados em combinação com um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-VEGF) ou um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) da invenção para o tratamento de um

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191/254 distúrbio ocular (por exemplo, AMD, DME, DR ou RVO) incluem, mas não estão limitados a, VISUDYNE® (verteporfina; um fármaco ativado por luz que é normalmente usado em conjunto com terapia fotodinâmica com laser não térmico), PKC412, Endovion (NS 3728; NeuroSearch A/S), fatores neurotróficos (por exemplo, fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF) e fator neurotrófico ciliar (CNTF)), diltiazem, dorzolamida, PHOTOTROP®, 9cis-retinal, medicamentos para os olhos (por exemplo, iodeto de fosfolina, ecotiofato ou inibidores da anidrase carbônica), veovastat (AE-941; AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027 (AGF-745; Sima Therapeutics, Inc.), neurotrofinas (incluindo, apenas a título de exemplo, NT-4/ 5, Genentech), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), antagonistas da integrina (incluindo os de Jerini AG e Abbott Laboratories), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), talidomida (como usada, por exemplo, por EntreMed, Inc.), cardiotrofina-1 (Genentech), 2-metoxiestradiol (Allergan/ Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), tetratiomolibdato (Universidade de Michigan), LYN-002 (Lynkeus Biotech), composto microalgáceo (Aquasearch/ Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group pic), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), TGF-beta 2 (Genzyme/ Celtrix), inibidores de tirosina quinase (por exemplo, aqueles da Allergan, SUGEN ou Pfizer), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/ Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), neuroprotetores de células de gânglios da retina (Cogent Neurosciences), derivados de N-nitropirazol (Texas A&M University System), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals), ciclosporina A, agentes terapêuticos utilizados na terapia fotodinâmica (por exemplo, VISUDYNE®; PDT direcionada a receptores, Bristol-Myers Squibb, Co.; porfímero sódico para injeção com PDT; verteporfina, QLT Inc.; rostaporfina com PDT, Miravent Medicai Technologies; talaporfina sódica com PDT, Nippon Petroleum; e motexafina lutécio, Pharmacyclics, Inc.), oligonucleotídeos antisenso (incluindo,

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192/254 a título de exemplo, produtos testados por Novagali Pharma SA e ISIS-13650, Isis Pharmaceuticals) e combinações dos mesmos.

[0489] Um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-VEGF) ou conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) da invenção pode ser administrado em combinação com uma terapia ou procedimento cirúrgico para o tratamento de um distúrbio ocular (por exemplo, AMD, DME, DR ou RVO), incluindo, por exemplo, fotocoagulação a laser (por exemplo, fotocoagulação panretiniana (PRP)), lasers de drusen, cirurgia do buraco macular, cirurgia de translocação macular, telescópios em miniatura implantáveis, angiografia de movimento por PHI (também conhecido como terapia micro-laser e tratamento de vasos alimentadores), terapia de feixe de prótons, terapia de microestimulação, descolamento de retina e cirurgia vítrea, saliência escleral, cirurgia submacular, termoterapia transpupilar, terapia com fotossistema I, uso de RNA de interferência (RNAi), reoferese extracorpórea (também conhecida como filtração diferencial de membrana e reoterapia), implantação de microchips, terapia com célulastronco, terapia de reposição gênica, terapia gênica com ribozimas (incluindo terapia gênica para o elemento de resposta à hipóxia, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; e terapia genética PDEF, GenVec), transplante de fotorreceptores/ células da retina (incluindo células epiteliais da retina transplantáveis, Diacrin, Inc.; transplante de células da retina, Cell Genesys, Inc.), acupuntura e combinações dos mesmos.

[0490] Em alguns casos, um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-VEGF) ou conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) da invenção pode ser administrado em combinação com um agente antiangiogênico para o tratamento de um distúrbio ocular (por exemplo, AMD, DME, DR ou RVO). Qualquer agente antiangiogênico adequado pode ser utilizado em combinação com um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti

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VEGF) ou um conjugado de anticorpos da invenção, incluindo, mas não se limitando aos listados por Carmeliet et al. Nature 407: 249-257, 2000. Em algumas formas de realização, o agente antiangiogênico é um antagonista de VEGF, incluindo, mas não limitado a, um anticorpo anti-VEGF (por exemplo, o anti-VEGF Fab LUCENTIS® (ranibizumabe), RTH-258 (anteriormente ESBA1008, um fragmento de anticorpo anti-VEGF de cadeia única; Novartis) ou um anticorpo biespecífico anti-VEGF (por exemplo, um anticorpo biespecífico antiVEGF/ anti-angiopoietina 2, como RG-7716; Roche)), uma proteína de fusão de receptor recombinante solúvel (por exemplo, EYLEA® (aflibercept)), uma variante de VEGF, um fragmento solúvel de VEGFR, um aptâmero capaz de bloquear o VEGF (por exemplo, pegaptanib) ou VEGFR, um anticorpo neutralizador anti-VEGFR, um inibidor de molécula pequena de tirosina quinases do VEGFR, um anti-VEGF DARPin® (por exemplo, abicipar pegol), um pequeno RNA interferente que inibe a expressão de VEGF ou VEGFR, um inibidor de tirosina quinase de VEGFR (por exemplo, 4-(4-bromo-2fluoroanilino)-6-metoxi-7- (1 -metilpiperidin-4-ilmetoxi) quinazolina (ZD6474), 4(4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7- (3-pirrol idin-1 -i Ipropoxi) quinazolina (AZD2171), vatalanib (PTK787), semaxaminib (SU5416; SUGEN) e SUTENT® (sunitinib)) e combinações dos mesmos. Em alguns casos, o anticorpo antiVEGF biespecífico se liga a uma segunda molécula biológica, incluindo mas não se limitando a ΙΙ_-1β; IL-6; IL-6R; PDGF (por exemplo, PDGF-BB); angiopoietina; angiopoietina 2; Tie2; S1P; integrinas ανβ3, ανβ5 e α5β1; betacelulina; apelina/ APJ; eritropoietina; fator de complemento D; TNFa; HtrA1; um receptor de VEGF (por exemplo, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR ou sVEGFR); receptor ST-2; e proteínas geneticamente ligadas ao risco de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), tal como componentes da via do complemento C2, fator B, fator H, CFHR3, C3b, C5, C5a e C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP;

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LIPC; COL10A1; e TNFRSF10A. Por exemplo, em alguns casos, o composto adicional é um anticorpo biespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-Ang2, tal como RG-7716 ou qualquer anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-Ang2 revelado em WO 2010/069532 ou WO 2016/073157 ou uma variante do mesmo.

[0491] Outros agentes antiangiogênicos adequados que podem ser administrados em combinação com um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-VEGF) ou um conjugado de anticorpo (por exemplo, conjugado de hidrogel de HA reticulado) da invenção para o tratamento de um distúrbio ocular (por exemplo, AMD, DME, DR ou RVO) incluem corticosteróides, esteróides angiostáticos, acetato de anecortave, angiostatina, endostatina, inibidores de tirosina quinase, inibidores de metaloproteinase da matriz (MMP), proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 3 (IGFBP3), antagonistas (por exemplo, anticorpos anti-SDF-1) do fator derivado do estroma (SDF-1), fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), gama-secretase, ligante tipo Delta 4, antagonistas da integrina, antagonistas do fator induzível por hipóxia (HIF)1a, antagonistas da proteína quinase CK2, agentes que inibem o alojamento das células-tronco (por exemplo, células progenitoras endoteliais) no sítio da neovascularização (por exemplo, um anticorpo anti-vascular da caderina endotelial (CD-144) e/ ou um anticorpo anti-SDF-1) e combinações dos mesmos.

[0492] Em um exemplo adicional, em alguns casos, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF) ou um conjugado de anticorpo (por exemplo, conjugado de hidrogel de HA reticulado) da invenção pode ser administrado em combinação com um agente que possui atividade contra neovascularização para tratamento de um distúrbio ocular (por exemplo, AMD, DME, DR ou RVO), tal como um fármaco anti-inflamatório, um alvo de mamífero do inibidor da rapamicina (mTOR) (por exemplo, rapamicina,

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AFINITOR® (everolimus) e TORISEL® (temsirolimus)), ciclosporina, um antagonista do fator de necrose tumoral (TNF) (por exemplo, um anticorpo antiTNFa ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, infliximab, adalimumab, certolizumab pegol e golimumab) ou uma proteína de fusão de receptor solúvel (por exemplo, etanercept)), um agente anticomplemento, um agente anti-inflamatório não esteróide (NSAID) ou combinações dos mesmos.

[0493] Em um outro exemplo, em alguns casos, um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-VEGF) ou um conjugado de anticorpo (por exemplo, conjugado de hidrogel de HA reticulado) da invenção pode ser administrado em combinação com um agente que é neuroprotetor e pode reduzir potencialmente a progressão da AMD seca para a AMD úmida, como a classe de fármacos chamados “neuroesteróides”, que inclui fármacos tais como dehidroepiandrosterona (DHEA) (nomes de marca: PRASTERA™ e FIDELIN®), sulfato de dehidroepiandrosterona e sulfato de pregnenolona.

[0494] Qualquer agente terapêutico AMD adequado pode ser administrado como um agente terapêutico adicional em combinação com um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF) ou um conjugado de anticorpo (por exemplo, um conjugado de hidrogel de HA reticulado) da invenção para tratamento de um distúrbio ocular (por exemplo, AMD, DME, DR ou RVO), incluindo, entre outros, um antagonista de VEGF, por exemplo, um anticorpo anti-VEGF (por exemplo, LUCENTIS® (ranibizumabe), RTH-258 (anteriormente ESBA-1008, um fragmento de anticorpo anti-VEGF de cadeia única; Novartis) ou um anticorpo biespecífico anti-VEGF (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-VEGF/ anti-angiopoietina 2, tal como RG-7716; Roche)), uma proteína de fusão de receptor VEGF solúvel (por exemplo, EYLEA® (aflibercept)), um anti-VEGF DARPin® (por exemplo, abicipar pegol; Molecular Partners AG/ Allergan) ou um aptâmero anti-VEGF (por exemplo,

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MACUGEN® (pegaptanib sódio)); um antagonista do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), por exemplo, um anticorpo anti-PDGF, um anticorpo anti-PDGFR (por exemplo, REGN2176-3), um aptâmero peguilado anti-PDGF-BB (por exemplo, FOVISTA®; Ophthotech/ Novartis), uma proteína de fusão de receptor PDGFR solúvel ou um antagonista duplo de PDGF/ VEGF (por exemplo, um inibidor de molécula pequena (por exemplo, DE-120 (Santen) ou X-82 (TyrogeneX)) ou um anticorpo biespecífico anti-PDGF/ anti-VEGF)); VISUDYNE® (verteporfina) em combinação com terapia fotodinâmica; um antioxidante; um antagonista do sistema de complemento, por exemplo, um antagonista do fator C5 do complemento (por exemplo, um inibidor de molécula pequena (por exemplo, ARC-1905; Opthotech) ou um anticorpo anti-C5 (por exemplo, LFG-316; Novartis), um antagonista da properdina (por exemplo, um anticorpo anti-properdina, por exemplo, CLG-561; Alcon) ou um antagonista do fator D do complemento (por exemplo, um anticorpo anti-fator D do complemento, por exemplo, lampalizumab; Roche)); um modificador do ciclo visual (por exemplo, cloridrato de emixustat); esqualamina (por exemplo, OHR102; Ohr Pharmaceutical); suplementos vitamínicos e minerais (por exemplo, aqueles descritos no Estudo sobre doenças oculares relacionadas à idade 1 (AREDS1; zinco e/ ou antioxidantes) e no Estudo 2 (AREDS2; zinco, antioxidantes, luteína, zeaxantina e/ ou ácidos graxos ômega-3)); uma terapia baseada em células, por exemplo, NT-501 (Renexus); PH-05206388 (Pfizer), transplante de células huCNS-SC (StemCells), CNTO-2476 (Janssen), OpRegen (Cell Cure Neurosciences) ou transplante de células MA09-hRPE (Ocata Therapeutics); um antagonista do fator tecidual (por exemplo, hl-con1; Iconic Therapeutics); um agonista do receptor alfa-adrenérgico (por exemplo, tartarato de brimonidina); uma vacina peptídica (por exemplo, S-646240; Shionogi); um antagonista beta amilóide (por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-beta amilóide, por exemplo, GSK-933776); um antagonista de

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S1P (por exemplo, um anticorpo anti-S1P, por exemplo, iSONEP™; Lpath Inc); um antagonista de ROBO4 (por exemplo, um anticorpo anti-ROBO4, por exemplo, DS-7080a; Daiichi Sankyo); um vetor lentiviral que expressa endostatina e angiostatina (por exemplo, RetinoStat); e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns casos, os agentes terapêuticos da AMD (incluindo qualquer um dos agentes terapêuticos da AMD anteriores) podem ser coformulados. Por exemplo, o anticorpo anti-PDGFR REGN2176-3 pode ser coformulado com aflibercept (EYLEA®). Em alguns casos, essa co-formulação pode ser administrada em combinação com um anticorpo da invenção. Em alguns casos, o distúrbio ocular é a AMD (por exemplo, AMD úmida).

[0495] Essas terapias de combinação observadas acima abrangem administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma ou em formulações separadas) e a administração separada, nesse caso, a administração do anticorpo ou conjugado de anticorpo da invenção, pode ocorrer antes, simultaneamente, e/ ou após administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma forma de realização, a administração do anticorpo ou do conjugado de anticorpo e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um, dois, três, quatro ou cinco meses, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias um do outro.

Exemplos [0496] As abreviações a seguir podem ser usadas nos exemplos abaixo e em outras partes deste documento.

Abreviação	Expressão e/ ou definição completas
CIEC	Cromatografia de troca catiônica
CV	Volumes da coluna
BHT	3,5-Di-ferc-butil-4-hidroxitoluol
DBU	1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
DCC	Diciclohexilcarbodiimida
DCM	Diclorometano
DIPEA	/V,/V-Diisopropiletilamina

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Abreviação	Expressão e/ ou definição completas
DMAP	4-(Dimetilamino)-piridina
DTT	Ditiotreitol
EDC	1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

Fab	Fragmento de ligação ao antígeno
Fmoc-Ado-OH	Ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanóico
HA	Ácido hialurônico
HEPES	Ácido 4-(2-hidroxietiI)-1 -piperazinaetanossulfônico
HOBt	Hidroxibenzotriazol
HOSu	Hidroxisuccinimida
HPLC	Cromatografia líquida de alta eficiência
IPC	Controle em processo
LCMS	Cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas
LPLC	Cromatografia líquida de baixa pressão
MES	Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico
MS	Espectrometria de massas
MTBE	Éter metil terc-butílico
MTS	Metanotiosulfonila
NHS	/V-hidroxisuccinimida
PFP	Pentafluorofenol
PTSA	Ácido para-tolueno sulfônico
PyBOP	Hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-oxitripirrolidinofosfônio
QC	Controle de qualidade
Rbz	Ranibizumabe
RP-HPLC	Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa
RP-LPLC	Cromatografia líquida de baixa pressão de fase reversa
SEC	Cromatografia de exclusão por tamanho
Su	Succinimida
TCEP	Cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina
TFA	Ácido trifluoroacético
TFF	Filtração com fluxo tangencial
TLC	Cromatografia em camada delgada
Ír	Tempo de retenção
TransCon	Conjugado transitoriamente
TriMED	Ν,Ν,Ν’-trimetil etilenodiamina
UPLC	Cromatografia líquida de ultra eficiência
wt%	Por cento em peso

Exemplo 1A - Síntese do Grupo Protetor Auto-Imolativo 4-(((perfluoro

FENOXI)CARBONILOXI)METIL) FENIL 2- (DIMETILAMINO) ETIL (METIL) CARBAMATO (a3)

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cloroformiato de 4-nitrofenila, DIPEA. THF depois, Ν,Ν,Ν’-trimetiletilenodiamina

Esquema1A [0497]A síntese do 4-(((perfluorofenoxi)carboniloxi)metil)fenil 2(dimetilamino)etil(metil)carbamato (a3) é ilustrada no Esquema 1A.

[0498] Etapa 1 - Preparação do 4-(hidroximetil)fenil 2-(dimetil amino)etil(metil)carbamato (a2):

[0499]Dissolveu-se álcool 4-hidroxibenzílico (a1) (1,70 g; 13,69 mmol; 1,00 eq.) em THF (20,5 ml), e DIPEA (4,8 ml; 27,39 mmol; 2,00 eq.) foi adicionado com agitação. Adicionou-se, gota a gota, cloroformiato de 4-nitrofenila (2,90 g; 14,38 mmol; 1,05 eq.) em THF (5 ml) ao longo de 25 minutos. A reação foi agitada por 20 minutos adicionais à temperatura ambiente. Um IPC por LCMS confirmou a formação do intermediário desejado. Adicionou-se lentamente Ν,Ν,Ν'trimetiletilenodiamina (2,21 ml; 17,12 mmol; 1,25 eq.) à solução e a mistura reacional foi agitada por mais 20 minutos. Um IPC por LCMS confirmou a conversão completa do carbonato. A reação foi resfriada em um banho de gelo, atenuada com TFA (3,17 ml; 41,08 mmol; 3,00 eq.) e diluída com água. O pH deveria estar abaixo de 2, conforme indicado pelo papel de pH. A fase aquosa foi lavada com acetato de etila (3 x 100 ml), após o que o pH da fase aquosa subiu para cerca de pH 4,5. A fase aquosa foi liofilizada para produzir um resíduo oleoso. O resíduo foi co-evaporado com acetato de etila (3x), dissolvido em DCM e seco (NazSCU). Após filtração, o

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200/254 solvente foi evaporado e o resíduo oleoso foi seco sob alto vácuo (2 h). Um QC por LCMS revelou uma pureza de 93%. O 4-(hidroximetil) fenil 2(dimetilamino) etil(metil)carbamato (a2) bruto resultante foi utilizado na etapa seguinte sem purificação.

[0500] Etapa 2 - Preparação do 4-((perfluorofenoxi) carboniloxi) metil)fenil 2-(dimetilamino)etil(metil) carbamato (a3):

[0501 ]O 4-(hidroximetil)fenil 2-(dimetilamino) etil(metil)carbamato (a2) bruto da etapa 1 (11,76 g; máx. 13,69 mmol; 1,00 eq; pureza máxima de 40% em peso) foi dissolvido em acetonitrila (24 ml) e a solução foi arrefecida em um banho de gelo. Adicionou-se, com agitação, carbonato de bis(pentafluorofenila) (10,15 g; 25,75 mmol; 1,88 eq.), DMAP (315 mg; 2,58 mmol; 0,19 eq.) e DIPEA (9,0 ml; 51,53 mmol; 3,76 eq.). A solução passou de laranja para verde e depois cinza. A mistura reacional foi agitada por 15 minutos. A formação do produto foi confirmada por LCMS. A mistura reacional foi arrefecida a -15 °C e atenuada com uma mistura de água com 0,1% de TFA (12,38 ml) e TFA puro (3,9 ml; 51,48 mmol; 3,76 eq.). A solução amarela foi purificada por RP-LPLC em 4 corridas. As frações puras foram combinadas, congeladas e liofilizadas para produzir 4-(((perfluorofenoxi) carboniloxi) metil) fenil 2(dimetilamino) etil (metil) carbamato (a3) como óleo amarelo, 4,73 g de sal TFA (8,21 mmol, 60% sobre 2 etapas).

Exemplo 1B - Síntese do Ligante Protegido (b5)

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PyBOP, DIPEA

DMF, 90%

ácido 6-(metilsulfoniltio)hexanóico c3

PyBOP, DIPEA

DMF, 83%

Esquema1B [0502] A síntese do ligante (b5) é mostrada no esquema 1B.

[0503] Etapa 1 - Preparação do composto amida (b3):

[0504] Dissolveu-se Fmoc-A/-Me-Asp(/Bu)-OH (b1) (6,96 g; 16,36 mmol; 1,00 eq.) em DMF (139 ml). Adicionaram-se PyBOP (12,77 g; 24,54 mmol; 1,50 eq.) e DIPEA (14,25 ml; 81,79 mmol; 5,00 eq.) e agitou-se até dissolver completamente. Adicionou-se cloridrato de A/-Boc-A/-meti 1-1,3 diaminopropano (b2) (4,04 g; 17,99 mmol; 1,10 eq.) e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 15 minutos. A conversão completa no produto foi observada por LCMS. A mistura reacional foi diluída com 400 ml de diclorometano e foi lavada três vezes com 400 ml de HCI 0,1 N. A camada orgânica foi lavada três vezes com 400 ml de solução saturada de NaHCOs e uma vez com 200 ml de solução salina. A camada orgânica foi seca sobre MgSCM, filtrada e concentrada. O material bruto foi dissolvido em 14 ml de diclorometano e purificado por cromatografia flash em fase normal. As frações contendo o produto foram reunidas e o solvente foi evaporado. O material final foi seco sob alto vácuo para produzir o composto amida (b3) como uma espuma branca. Rendimento: 8,81 g (14,79 mmol, 90%).

[0505] Etapa 2 - Preparação do composto amida (b4):

[0506] O composto amida (b3) (8,81 g; 14,79 mmol; 1,00 eq.) foi dissolvido em THF (130 ml). Foi adicionado DBU (2,56 ml; 17,15 mmol; 1,16

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202/254 eq.) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5 minutos. Um cromatograma de LCMS mostrou a conversão completa do material de partida. Além disso, foi preparada uma TLC (acetato de etiIa/ metanol 9: 1, coloração com KMnO4), Rf(Pdt) = 0,48). O solvente da mistura reacional bruta foi evaporado. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila para atingir um volume final de 20 ml e a solução foi purificada por cromatografia flash. As frações contendo o produto foram reunidas e o solvente foi evaporado. O material final foi seco sob alto vácuo de um dia para outro para produzir o composto am ida (b4) como óleo amarelado. Rendimento: 5,13 g (13,74 mmol, 87% de rendimento, 94% de pureza a 215 nm).

[0507] Etapa 3 - Preparação do composto ligante (b5):

[0508] Foi adicionado DIPEA (7,19 ml; 41,21 mmol; 3,00 eq.) a uma solução de ácido carboxílico (c3) do exemplo 1E (3,42 g; 15,11 mmol; 1,10 eq.) e PyBOP (7,86 g; 15,11 mmol; 1,10 eq.) em diclorometano (35 ml), após o que a mistura aqueceu significativamente e passou de amarelado para amarelo escuro. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5 minutos para pré-ativar o ácido. À solução de ácido ativado, uma solução recém-preparada do composto amida (b4) (5,13 g; 13,74 mmol; 1,00 eq.) em diclorometano (35 ml) foi adicionada de uma só vez, após o que a mistura ficou castanho claro. A solução de acoplamento foi agitada à temperatura ambiente durante 100 minutos. Um IPC por LCMS mostrou uma conversão quase completa do material de partida. A mistura reacional foi diluída com 500 ml de acetato de etila e foi lavada com HCI 0,2 N (4 x 300 ml), solução salina (1 x 100 ml), NaHCOs saturado (50, 25, 160 ml), ácido cítrico a 5% (1 x 100 ml) e solução salina (1 x 100 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi seco sob alto vácuo no fim de semana (13,59 g de material bruto). O resíduo foi dissolvido em acetato de etila para atingir um volume final de cerca de 22 ml. O material bruto foi purificado por cromatografia

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203/254 flash. As frações contendo o produto (TLC: acetato de etila, coloração com KMnCM, Rf(Pdt) = 0,54) foram reunidas e o solvente foi evaporado para produzir um resíduo pegajoso, castanho, semelhante a goma. O material final foi seco sob alto vácuo de um dia para outro para produzir o composto ligante (b5) como uma espuma. Rendimento: 6,61 g (11,36 mmol, 83% de rendimento, 96% de pureza).

Exemplo 1C - Síntese do Ligante Ácido (S)-4-(3-(((4-((2-(dimetilamino) etil)(metil)carbamoiloxi)benziloxi)carbonil)(metil)amino)propilamino)-3-(Nmetil-6-(metilsulfoniltio)hexanamido)-4-oxobutanóico (b7)

DIPEA, MeCN OH

Esquema1C [0509]A síntese de ácido (S)-4-(3-(((4-((2(dimetilamino)etil)(metil) carbamoiloxi)benziloxi)carbonil)(metil)amino)propilamino)-3-(N-metil-6(metil sulfoniltio)hexanamido)-4-oxobutanóico (b7) é ilustrada no Esquema

1C.

[0510]Etapa 1 - Preparação do ácido (S)-3-(N-metil-6-(metil sulfoniltio) hexanamido)-4- (3- (metilamino) propilamino)-4-oxobutanóico (b6):

[0511 ]O composto amida (b5) (3,40 g; 5,84 mmol; 1,00 eq.) foi dissolvido em diclorometano (19 ml), e TFA (19 ml) foi adicionado. A mistura reacional foi agitada por 75 minutos à temperatura ambiente em

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204/254 um balão aberto. Um IPC por LCMS mostrou boa conversão para o produto. A remoção dos voláteis foi realizada de maneira controlada (evaporador rotativo a 25 °C e 12 mbar, depois alto vácuo à temperatura ambiente por 60 min). O ácido (S)-4-(3-(((4-((2-dimetilamino)etil)(metil) carbamoiloxi) benziloxi) carbonil) (metil) amino) propilamino)-3- (N-metil- 6(metilsulfoniltio) hexanamido)-4-oxobutanóico (b6) foi imediatamente utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional.

[0512]Etapa 2 - Preparação de ácido (S)-4-(3-(((4-((2-(dimetil amino)etil) (metil) carbamoiloxi) benziloxi) carbonil) (metil) amino) propilamino)-3- (N-metil-6- (metilsulfoniltio) hexanamido)-4-oxobutanóico (b7):

[0513]Uma solução de 4-(((perfluorofenoxi) carboniloxi) metil) fenil 2-(dimetilamino)etil(metil) carbamato (a3) do Exemplo 1 (4,38 g; 7,60 mmol; 1,30 eq.) em acetonitrila (35,00 ml) foi resfriada a 0 °C em banho de gelo. Foi adicionado DIPEA (10,19 ml; 58,44 mmol; 10,00 eq.) e a mistura foi agitada a esta temperatura durante 1 minuto antes de uma solução do composto bruto (b6) em acetonitrila (35,00 ml) ser adicionada gota a gota dentro de 10 minutos. Após adição completa, a mistura foi agitada a 0 °C por mais 5 minutos, depois a mistura reacional foi analisada. Foi observada a conversão completa da zwitterion (b6). A reação foi atenuada por adição de TFA (4,00 ml; 51,92 mmol; 8,88 eq.) a 0 °C. Todos os voláteis foram removidos e o resíduo foi seco a <10 mbar e 40 °C por 10 minutos no evaporador rotativo. O resíduo bruto foi dissolvido em uma mistura de 6 ml de H₂O/ MeCN/ TFA 1:1: 0,002 e 12 ml de TFA a 0,1%. A solução castanha clara foi purificada por cromatografia RP-f/as/?. A solução foi mantida em gelo até a injeção. As frações contendo o produto foram combinadas, congeladas e liofilizadas para dar o ácido (S)-4- (3 - (((4-(2(dimetilamino)etil)(metil) carbamoiloxi) benziloxi) carbonil) (metil) amino)

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205/254 propilamino) -3- (N-metil-6-(metilsulfoniltio) hexanamido)-4-oxobutanóico (b7). Rendimento: 3,25 g como sal de TFA (68% de rendimento).

Exemplo 1D - Síntese de Ligante Ativado por NHS (S)-2,5-dioxopirrolidin-1 il 4-(3-(((4-((2-(dimetilamino)etil))(metil)carbamoiloxi)benzilqxi) carbonil) (metil)amino)propilamino)-3-(N-metil-6-(metilsulfoniltio)hexanamido)-4OXOBUTANOATO(b8)

[0514] Preparação de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1 -il 4-(3-(((4-((2(dimetilamino) etil) (metil) carbamoiloxi) benziloxi) carbonil) (metil)amino) propil amino)-3-(N-metil-6-(metilsulfoniltio)hexanamido)-4-oxobutanoato (b8) é mostrado no Esquema 1D.

[0515] O ligante (b7) do Exemplo 1C (2,02 g; 2,47 mmol; 1,00 eq.) foi dissolvido em diclorometano (20 ml). Foram adicionados HOSu (852,72 mg; 7,41 mmol; 3,00 eq.) e EDC (1,42 g; 7,41 mmol; 3,00 eq.) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio. Após dissolução dos reagentes adicionados, a mistura ficou ligeiramente amarela. Após 1 hora, um IPC por LCMS mostrou boa conversão para o produto. Após 75 minutos, a mistura reacional foi diluída com DCM (75 ml) e lavada uma vez

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206/254 com 75 ml de solução salina ácida (250 ml de solução salina foram misturados com 2,5 ml de HCI 1 M e a solução resultante foi saturada com NaCI adicional). A camada aquosa (pH cerca de 6,5) foi extraída com 50 ml de DCM. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4 e filtradas. Após adição de TFA (190 pl_; 2,47 mmol; 1,00 eq.), os voláteis foram evaporados. O resíduo oleoso foi seco sob alto vácuo por 30 minutos para produzir (S)-2,5dioxopirrolidin-1 -il 4-(3-((((4-((2-(dimetilamino)etil)(metil)carbamoiloxi))benziloxi) carbonil)(metil)amino) propilamino)-3- (N-metil-6- (metilsulfoniltio) hexanamido)-

4-oxobutanoato (b8) bruto (cerca de 2,4 g) como uma espuma branca. O produto bruto foi dissolvido em 5 ml de acetonitrila anidro (volume total ~ 6 ml) e purificado por RP-LPLC. Os eluentes para a cromatografia foram arrefecidos, depois congelados e liofilizados. O material seco liofilizado foi combinado com acetonitrila anidro (cerca de 20 ml no total). O solvente foi removido (evaporador rotativo, 40 °C) e seco sob alto vácuo para produzir 2,05 g (91% de rendimento) de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1 -il 4-(3-(((4-((2-(dimetilamino)etil) (metil) carbamoiloxi) benziloxi) carbonil) (metil) amino) propilamino)-3- (N-metil-

6- (metilsulfoniltio) hexanamido)-4-oxobutanoato (b8) como espuma incolor. O material foi dissolvido em 22,37 ml de DMSO anidro. A solução límpida e incolor foi filtrada estéril (filtros de seringa de PTFE estéril, Millipore Millex-LG, 25 mm, 0,2 pm) para produzir cerca de 23,5 ml de uma solução límpida e incolor. O material foi armazenado em alíquotas sob argônio a -80 °C. Pela análise por LCMS, foi determinada uma atividade do NHS de 79%.

Exemplo 1E - Síntese do Ácido 6-(metilsulfoniltio)hexanóico (c3) o NaS-S— o ^c2 ° ^Br^H^X^0H -----* — S-sJU^^OH ^{1 J}4 Π DMF, 80°C 6 T

O ^{c1 U} o c3

Esquema 1E [0516] A preparação do ácido 6-(metilsulfoniltio)hexanóico (c3) é

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207/254 mostrada no Esquema 1E.

[0517] Dissolveram-se ácido 6-bromohexanóico (5,89 g; 30,19 mmol; 1,00 eq.) e metanotiosulfonato de sódio (4,05 g; 30,19 mmol; 1,00 eq.) em Ν,Ν-dimetilformamida anidra (47,10 ml). A mistura reacional foi agitada a 80 °C durante 3 horas e depois deixada arrefecer até à temperatura ambiente. A análise por LCMS confirmou a formação do produto (c3). A mistura reacional foi diluída com 116 ml de água e foi lavada três vezes com 233 ml de éter dietílico. A fase orgânica foi lavada com solução salina (350 ml), seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida até um volume de 40 ml. A solução resultante foi precipitada em 2 x 1000 ml de n-heptano frio a -18 °C de um dia para outro. O sobrenadante foi decantado e o precipitado foi dissolvido em 80 ml de éter dietílico (40 °C). A solução resultante foi precipitada em 2 x 1000 ml de n-heptano frio a -18 °C durante 3 horas. O precipitado foi removido por filtração e o sólido branco foi seco sob alto vácuo de um dia para outro para dar o ácido 6- (metilsulfoniltio) hexanóico (c3). Rendimento: 5,72 g; 84%

Exemplo 1F - Síntese de 1 - (2,5-dioxopirrolidin-1 -il) 9- (2- (2- (3- (piridin-2 ildisulfanil) propanamido) etoxi) etil) nonanodioato (d9)

Esquema1F [0518] A preparação de 1 -(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) 9-(2-(2-(3

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208/254 (piridin-2-ildisulfanil)propanamido)etoxi)etil)nonanodioato (d9) é mostrada no Esquema 1F.

[0519] Etapa 1 - Síntese do ácido 9-(benziloxi)-9-oxononanóico (d2):

[0520] Uma mistura de ácido azelaico (d1) (103,00 g; 547,23 mmol; 1,10 eq.), álcool benzílico (51,73 ml; 497,48 mmol; 1,00 eq.) e monohidrato de ácido p-toluenossulfônico (1,99 g; 10,45 mmol; 0,02 eq.) em tolueno (561,82 ml) foi submetida a refluxo durante 5 horas em um aparelho Dean-Stark. A mistura reacional foi então deixada arrefecer até à temperatura ambiente e armazenada durante 1 hora a esta temperatura. Em seguida, o sólido foi separado por filtração e lavado com 50 ml de tolueno. O resíduo foi tratado com aproximadamente 800 ml de uma solução de NaOH 0,4 M e o pH foi ajustado para pH = 9 usando aproximadamente 30 ml de NaOH 4 Μ. A fase aquosa foi separada, para a fase orgânica foram adicionados 100 ml de água e 80 ml de NaOH 0,4 M, ajustando o pH para 9. As fases aquosas combinadas foram acidificadas com 50 ml de ácido sulfúrico 1 M para pH = 5 e extraídas duas vezes com 200 ml de MTBE. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com 200 ml de solução salina, secas sobre MgSÜ4 e o solvente foi evaporado sob vácuo. O produto bruto (62 g) foi dissolvido em 40 ml de heptano e 20 ml de THF (volume total de 120 ml) e purificado em duas corridas por cromatografia flash automatizada. O eluente foi evaporado e o resíduo foi obtido como um óleo (55,00 g; 39,72%). O resíduo foi dissolvido em 80 ml de MTBE e foram adicionados 2000 ml de heptano aquecido a 30 °C. Para cristalização, a solução foi armazenada a -20 °C de um dia para outro. O produto foi coletado por filtração através de um filtro de vidro (Por. 3) e lavado com 500 ml de heptano. Os cristais brancos foram secos durante 4 horas a <1 mbar para dar o ácido 9-(benziloxi)-9-oxononanóico (d2). Rendimento: 48,02 g; 35%.

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209/254 [0521] Etapa 2 - Síntese de nonanodioato de 1-(2-(2-aminoetoxi) etil) 9-benzila protegido com Boc (d4):

[0522] Foi adicionado DCC (3,32 g; 16,08 mmol; 1,10 eq.) a uma solução de Boc-2-(2-aminoetoxi)etanol (d3) (3,00 g; 14,62 mmol; 1,00 eq.), composto (d2) (4,07 g; 14,62 mmol; 1,00 eq.) e DMAP (446,41 mg; 3,65 mmol; 0,25 eq.) em DCM (50,00 ml). A suspensão de formação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para outro. A suspensão branca foi filtrada através de uma frita de seringa de 20 ml e o bolo do filtro foi lavado com cerca de 50 ml de DCM. O produto foi detectado por LCMS. Todos os voláteis foram removidos. E o resíduo foi dissolvido em DCM (volume total de 20 ml). A suspensão ligeiramente turva resultante foi purificada por cromatografia flash. As frações contendo o produto foram combinadas e todos os voláteis foram evaporados para produzir nonanodioato de 1-(2- (2-aminoetoxi)etil) 9-benzila protegido com Boc (d4) como um óleo incolor. Rendimento: 6,11 g; 90%.

[0523] Etapa 3 - Síntese do ácido 9-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)-9oxononanóico protegido com Boc (d5):

[0524] Foi adicionado Pd/ C a 10% (348,58 mg; 0,33 mmol; 0,03 eq.) a uma solução de nonanodioato de 1-(2-(2-aminoetoxi)etil) 9-benzila protegido com Boc (d4) (6,10 g; 13,10 mmol; 1,00 eq.) em THF (75,00 ml) e a camada de ar no balão foi trocada contra nitrogênio. Em seguida, o balão foi colocado em banho-maria a 50 °C e uma corrente de hidrogênio foi passada através da suspensão preta usando um balão e uma cânula 20G. Após 5 minutos, a corrente de hidrogênio foi parada e a mistura foi agitada vigorosamente sob atmosfera de hidrogênio a 50 °C até a conclusão da reação de desproteção. A suspensão resultante foi filtrada através de um chumaço de Celite. O bolo do filtro foi lavado com EtOAc adicional (25 ml). Os voláteis dos filtrados combinados foram evaporados e o material bruto foi dissolvido em EtOAC (30 ml). A solução foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,22 pm

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210/254

RC e os voláteis foram removidos para produzir o ácido 9-(2-(2aminoetoxi)etoxi)-9-oxononanóico protegido com Boc (d5) como um óleo ligeiramente amarelo. Rendimento: 5,09 g, quantitativo.

[0525] Etapa 4 - Síntese do ácido 9-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)-9oxononanóico (d6):

[0526] Foi adicionado TFA (5,00 ml; 64,90 mmol; 4,79 eq.) a uma solução de ácido 9-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)-9-oxononanóico protegido com Boc (d5) (5,09 g; 13,55 mmol; 1,00 eq.) em diclorometano (10,00 ml). Após 40 minutos, uma alíquota adicional de TFA (5,00 ml; 64,90 mmol; 4,79 eq.) foi adicionada à mistura e uma corrente de nitrogênio foi passada através da mistura reacional. Uma LCMS após 70 minutos revelou a conversão completa do material de partida. Os voláteis foram removidos e o resíduo oleoso castanho foi diluído com éter dietílico (50 ml), após o que, foi formado um sistema de duas fases. A emulsão foi novamente libertada de todos os voláteis no rotavapor e o resíduo oleoso castanho foi seco em alto vácuo de um dia para outro. Foi adicionado tolueno (30 ml) ao resíduo e a mistura foi novamente libertada de todos os voláteis no rotavapor (banho maria a 60 °C). O material foi seco no rotavapor a <9 mbar e a temperatura do banho maria a 60 °C para produzir o ácido 9-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)-9-oxononanóico (d6) como um óleo castanho. Rendimento: 6,04 g; 97%.

[0527] Etapa 5 - Síntese do ácido 9-oxo-9-(2-(2-(3-(piridin-2ildisulfanil)propanamido)etoxi)etóxi)nonanóico (d8):

[0528] Foi adicionado DIPEA (951,90 pl_; 5,46 mmol; 5,00 eq.) a uma solução de ácido 9-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)-9-oxononanóico (d6) (500,00 mg; 1,09 mmol; 1,00 eq.) e 3-[[(2-piridil)tio]tio]propionato de succinimidila (d7) (375,05 mg; 1,20 mmol; 1,10 eq.) em acetonitrila (5,00 ml). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 45 minutos. A reação foi atenuada por adição de ácido acético (1,00 ml; 17,48 mmol; 16,02 eq.). A mistura foi diluída

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211/254 com 6,5 ml de acetonitrila e 14,5 ml de água e a solução resultante foi purificada por HPLC preparativa. As frações contendo o produto foram combinadas, congeladas em nitrogênio líquido e liofilizadas de um dia para outro. Os lotes do produto foram combinados com o DCM. Os voláteis foram removidos e o resíduo oleoso foi seco sob alto vácuo para produzir o ácido 9oxo-9-(2-(2-(3-(piridin-2-ildisulfanil)propanamido)etoxi)etóxi)nonanóico (d8) como um óleo ligeiramente amarelo; 392,00 mg; 61%.

[0529] Etapa 6 - Síntese de 1 -(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) 9-(2-(2-(3(piridin-2 -ildisulfanil)propanamido)etoxi)etil) nonanedioato (d9):

[0530] A uma solução de ácido 9-oxo-9-(2-(2-(3-(piridin-2ildisulfanil)propanamido)etoxi)etóxi)nonanóico (d8) (392,00 mg; 0,67 mmol; 1,00 eq.) em diclorometano (5,00 ml), HOSu (153,81 mg; 1,34 mmol; 2,00 eq.) e EDC*HCI (256,19 mg; 1,34 mmol; 2,00 eq.) foram adicionados sucessivamente. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente, após o que, o conteúdo sólido dissolveu-se lentamente ao longo do tempo e formou-se uma solução límpida amarela clara. Após 80 minutos, foram adicionados HOSu adicional (50,00 mg; 0,43 mmol; 0,65 eq.) e EDC*HCI (50,00 mg; 0,26 mmol; 0,39 eq.). Após 120 minutos, a análise por LCMS revelou a conclusão da reação. Os voláteis foram removidos e o resíduo foi dissolvido em acetonitrila (5 ml). Foram adicionados água (5 ml) e H2O/ MeCN/ TFA 1:1: 0,002 (4 ml). Foi adicionado acetonitrila à emulsão turva até se obter uma solução clara. A solução resultante foi purificada por HPLC preparativa. Todos as frações que continham produtos foram mantidas em gelo até serem combinadas, congeladas e liofilizadas. Os lotes do produto foram combinados com diclorometano e todos os voláteis foram removidos. O produto foi seco sob alto vácuo para produzir 1 -(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) 9-(2-(2-(3- (piridin-2 -ildisulfanil) propanamido)etoxi)etil) nonanedioato (d9) como um óleo incolor; 455,00 mg; rendimento quantitativo.

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Exemplo 1G - Síntese do MARCADOR de Purificação N,N'-((10S,22S)-10-(2(dimetilamino)acetamido)-16-(4-mercaptonicotinoil)-2-metil-4,11,21-trioxo2,5,12,16,20-pentaazahexacosano-22,26-diil)bis(2-(dimetilamino)acetamida) e8

H N H H Boc e1

1) Fmoc-OSu,

K₂CO₃,

THF/H₂O, 96%

2) TFA, CH₂CI₂, * quant.

Fmoc

1) Boc-Lys(Boc)-NHS, DIPEA, DMF, 77%

2) TFA, CH₂CI₂, quant.

NaBH₄, H₂O, 79%

Esquema1G

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213/254 [0531] Preparação do MARCADOR de Purificação Ν,Ν'((10S,22S)-10-(2-(dimetilamino)acetamido)-16-(4-mercaptonicotinoil)-2-metil-4, 11,21-tnoxo-2,5,12,16,20-pentaazahexacosano-22,26-diil)bis(2-(dimetilamino) acetamida) (e8) é mostrado no Esquema 1G.

[0532] Etapa 1 - Síntese de (9H-fluoren-9-il)metil bis(3aminopropil)carbamato (e2):

[0533] Fmoc-OSu (9,77 g; 28,96 mmol; 1,20 eq.) foi adicionado a uma solução de 1,9-bis-Boc-1,5,9-triazanonano (e1) (8,00 g; 24,14 mmol; 1,00 eq.) em THF (80,00 ml). A esta mistura, foi adicionada gota a gota durante 10 minutos à temperatura ambiente uma solução de K2CO3 (5,00 g; 36,20 mmol; 1,50 eq.) em água (80,00 ml). Uma emulsão branca se formou durante a adição. Após 50 minutos de agitação à temperatura ambiente, diluiu-se a mistura reacional com acetato de etila (600 ml). A camada orgânica foi lavada com ácido clorídrico (0,1 M, 3 x 200 ml), solução saturada de NaHCOs (200 ml) e solução salina (100 ml). Após secagem sobre MgSCM e filtração, todos os voláteis foram removidos. O resíduo bruto foi seco em alto vácuo por 20 minutos para dar uma espuma branca. Esta espuma foi dissolvida em diclorometano e purificada por cromatografia flash. As frações contendo o produto foram combinadas e concentradas para produzir o intermediário N,Nbis[3-(terc-butoxicarbonilamino) propil] carbamato de 9H-fluoreno-9-ilmetila (não mostrado no Esquema 1G) como um sólido vítreo incolor; 12,81 g; 96%.

[0534] Este produto intermediário (12,78 g; 23,08 mmol; 1,00 eq.) foi dissolvido em TFA (30,00 ml; 389,39 mmol; 16,87 eq.) à temperatura ambiente. Após dissolução completa, a solução amarela foi agitada à temperatura ambiente durante 35 minutos. O produto foi precipitado por adição gota a gota da mistura reacional em éter dietílico (2 ml de solução de reação em 40 ml de éter dietílico) em tubos Falcon de 50 ml. Os tubos Falcon foram centrifugados a 7000xG e 0 °C por 3 minutos. O sobrenadante éter foi

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214/254 descartado e os resíduos foram dissolvidos em metanol (1 ml cada tubo). As soluções metanólicas combinadas foram adicionadas, gota a gota, a éter dietílico (200 ml) em um balão de fundo redondo de 500 ml. Todos os tubos foram lavados com metanol (total ~ 150 ml) e as soluções de lavagem foram adicionadas à mistura éter/ precipitado, após o que se formou uma solução límpida e incolor. Esta solução foi concentrada e o resíduo oleoso foi seco em alto vácuo de um dia para outro para dar (9H-fluoren-9-il)metil bis(3aminopropil)carbamato (e2) como uma espuma branca: 13,68 g; rendimento quantitativo.

[0535] Etapa 2 - Síntese de (9H-fluoren-9-il)metil bis(3-((S)-2,6diaminohexanamido)propil)carbamato (e3):

[0536] Foi adicionado DIPEA (20,44 ml; 117,20 mmol; 5,00 eq.) a uma solução do composto (e2) (13,63 g; 23,44 mmol; 1,00 eq.) e Boc-Lys (Boc)-OSu (24,95 g; 56,25 mmol; 2,40 eq.) em DMF (250,00 ml) e a mistura amarela clara foi agitada à temperatura ambiente durante 45 minutos. A mistura reacional foi diluída com acetato de etila (1200 ml) e a camada orgânica foi lavada com ácido clorídrico (0,1 M, 4 x 500 ml), solução saturada de NaHCOs (3 x 250 ml) e solução salina (200 ml). Após secagem sobre MgSO4 e filtração, todos os voláteis foram removidos para produzir o intermediário protegido com BoC (não mostrado no Esquema 1G) como uma espuma branca. O resíduo bruto foi dissolvido em diclorometano (30 ml) e purificado por cromatografia em coluna flash. As frações contendo o produto foram combinadas e todos os voláteis foram removidos sob vácuo. O produto puro precipitou a partir de soluções frias de acetato de etila. Foi adicionado metanol para dissolver completamente o produto. A evaporação das frações combinadas levou a um óleo incolor, que foi seco em alto vácuo de um dia para outro para dar o intermediário protegido com Boc: 18,27 g; 77%.

[0537] Este intermediário (18,12 g; 17,94 mmol; 1,00 eq.) foi

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215/254 dissolvido em TFA (40,00 ml; 519,19 mmol; 28,95 eq.). Durante a dissolução, muito gás evoluiu e a mistura aqueceu até cerca de 45 °C e ficou amarela. A solução clara e viscosa foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura reacional foi adicionada ao éter dietílico (2 ml de solução de reação em 40 ml de éter em um tubo Falcon de 50 ml). Após agitação vigorosa, o sistema bifásico se transformou em uma suspensão de um precipitado em pó branco em éter dietílico ácido. A mistura foi transferida para tubos Falcon e todos os Falcons foram centrifugados a 0 °C e 7000xG por 3 minutos e o sobrenadante foi descartado. Todos os precipitados foram lavados com 40 ml de éter dietílico cada e a centrifugação foi repetida. Após o descarte dos sobrenadantes novamente, todos os precipitados foram pré-secados no rotavapor para formar pós secos. Todas as alíquotas foram combinadas e secas em alto vácuo de um dia para outro para dar (9H-fluoren-9-il)metil bis(3-((S)-2,6diaminohexanamido)propil)carbamato (e3): 19,52 g; rendimento quantitativo.

Etapa 3 - Síntese do Composto (e5) [0538] Foi adicionado DIPEA (18,02 ml; 103,29 mmol; 6,00 eq.) a uma suspensão de N,N-dimetilglicina (e4) (8,88 g; 86,08 mmol; 5,00 eq.) e PyBOP (44,79 g; 86,08 mmol; 5,00 eq.) em DMF (180,00 ml). A mistura foi agitada durante 15 minutos à temperatura ambiente, após o que se formou uma solução clara. Esta solução foi adicionada em uma porção a uma solução de (9H-fluoren-9-il)metil bis(3-((S)-2,6-diaminohexanamido)propil)carbamato (e3) (18,35 g; 17,22 mmol; 1,00 eq.) e DIPEA (15,01 ml; 86,08 mmol; 5,00 eq.) em DMF (180,00 ml). A mistura reacional amarela foi agitada à temperatura ambiente. Após 35 min, a mistura reacional foi atenuada pela adição de TFA (22,02 ml; 285,82 mmol; 16,60 eq.). A solução foi concentrada para produzir um óleo amarelo, o qual foi subsequentemente dissolvido em metanol (450 ml) para produzir 600 ml de uma solução amarela escura. Este produto intermediário (não mostrado no Esquema 1G) foi precipitado duas vezes a

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216/254 partir de éter dietílico. Após lavagem do precipitado com éter dietílico, a pasta do produto foi concentrada e o produto foi seco sob vácuo por 72 horas: 23,17 g; 96%. Adicionou-se piperidina (17,50 ml; 0,18 mol; 10,83 eq.), em uma porção, a uma solução do produto intermediário (23,00 g; 0,02 mol; 1,00 eq.) em DMF (69,00 ml) e a solução cor de laranja foi agitada à temperatura ambiente por 35 minutos. A mistura reacional foi concentrada e TFA (200 ml) foi adicionado ao resíduo. A pasta foi filtrada através de uma frita de PE. O produto foi precipitado a partir de éter dietílico e após o produto ter sido lavado com éter dietílico, foi seco sob vácuo para produzir o composto (e5) como um pó esbranquiçado: 19,82 g; 93%.

Etapa 4 - Síntese de N,N'-((10S,22S)-10-(2-(dimetilamino) acetamido)-2-metil16-(4-(metildisulfanil) nicotinoil)-4,1 1,21-trioxo-2,5,12,16,20PENTAAZAHEXACOSANO-22.26-DIIL) BIS(2-(DIMETILAMINO)ACETAMIDA) (e7) [0539] O PyBOP (528,17 mg; 1,01 mmol; 1,00 eq.) e o ácido 4(metildisulfanil)nicotínico (e6) (320,00 mg; 1,01 mmol; 1,00 eq., preparado por reação do ácido 4-mercaptonicotínico com S-metilmetanotiolsulfonato, foram suspensos em acetonitrila (10,00 ml). Foi adicionado DIPEA (1,59 ml; 9,13 mmol; 9,00 eq.), após o que se formou uma solução amarela escura e límpida. Após 2 minutos à temperatura ambiente, a mistura foi adicionada a uma solução do composto (e5) (1 317,49 mg; 1,01 mmol; 1,00 eq.) em acetonitrila (10,00 ml). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. Foi adicionado TFA (1,59 ml; 20,64 mmol; 20,33 eq.), e o produto foi precipitado a partir de éter dietílico (140 ml). O precipitado foi lavado com éter dietílico (100 ml). O precipitado foi dissolvido em metanol (8 ml) e precipitado a partir de éter dietílico (140 ml) uma segunda vez. O produto foi seco em alto vácuo de um dia para outro para produzir N,N'-((10S,22S)-10-(2-(dimetilamino) acetam ido)-2-meti 1-16-(4(meti Id isu Ifan i l)nicotinoi I )-4,11,21 -trioxo-2,5,12,16,20-pentaazahexacosano-22,26diil) bis(2-(dimetilamino)acetamida) (e7) como um pó: 1,231 g; 82%.

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Etapa 5 - Síntese de N,N'-((10S,22S)-10-(2-(dimetilamino) acetamido)-16-(4mercaptonicotinoil)-2-metil-4,1 1,21-trioxo-2,5,12,16,20-penta AZAHEXACOSANO-22.26-DHL) bis (2-(dimetilamino)acetamida) (e8) [0540] Adicionou-se NaBhk (220,07 mg; 5,82 mmol; 7,00 eq.) em quatro porções a uma solução de N,N’-((10S,22S)-10-(2-(dimetilamino) acetamido)2-m eti 1-16-(4-(m eti Idisu Ifani I )n icotinoi I )-4,11,21 -trioxo-2,5,12,16,20pentaazahexacosano-22,26-diil) bis(2-(dimetilamino) acetamida) (e7) (1,231 g; 0,83 mmol; 1,00 eq.) em água (15,00 ml). Após a última adição, a mistura foi agitada durante 60 minutos à temperatura ambiente. Foi adicionado TFA (1,00 ml; 12,98 mmol; 15,62 eq.) à mistura reacional. A mistura reacional foi diluída com água até um volume final de 25 ml. A solução foi purificada por HPLC preparativa. As frações contendo o produto foram combinadas, congeladas e liofilizadas para dar o sal TFA de N, N'-((10S,22S)-10-(2-(dimetilam ino) acetamido)-16-(4-mercaptonicotinoil)-2metil-4,11,21 -trioxo-2,5,12,16,20-penta azahexacosano-22,26-diil) bis(2(dimetilamino)acetamida) (e8); 942,00 mg; 79%.

Exemplo 2A: Preparação de Ácido Hialurônico (HA) Funcionalizado com Amina [0541] As funcionalidades de amina foram introduzidas no HA. Em alguns aspectos, um grau de funcionalização de até cerca de 11 % foi introduzido para o HA funcionalizado com maleimida subsequente e a ligação do fármaco à maleimida, e até cerca de 5% para o HA funcionalizado com tiol subsequente.

^Na+ Na⁺

Funcionalizar com 1,3diaminopropano °=\ ^0H 0=^ f1

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Esquema 2A [0542]A funcionalização da amina do HA prossegue de acordo com o esquema de reação 2A:

[0543] Dissolveram-se 200 mg de sal de sódio de ácido hialurônico de 116 kDa (f1) em 25 mL de uma solução tamponada (MES 100 mM, 1,3diaminopropano 0,4 M, pH 5,5) sob agitação vigorosa. Foram adicionados 3,00 eq. de HOBt (229,14 mg; 1,50 mmol) em relação às funcionalidades do ácido carboxílico no HA. Foram adicionados 0,93 eq (88,92 mg; 0,46 mmol) de EDOHCI, após o que a suspensão se transformou lentamente em uma solução. A solução foi agitada à temperatura ambiente de um dia para outro e subsequentemente formou uma suspensão. À suspensão, 50,00 eq. (3,39 g; 24,94 mmol) de acetato de sódio foram adicionados para formar uma solução. O HA modificado (f2) foi precipitado por adição de etanol absoluto, lavado com etanol e seco sob alto vácuo de um dia para outro. Os péletes foram dissolvidos em 16 mL de água para formar uma solução transparente. Foram adicionados 5,40 mL de NaOH 4 M e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante duas horas. Foram adicionados 1,24 mL de ácido acético. O HA funcionalizado com amino (f3) foi precipitado por adição de etanol absoluto, lavado com etanol a 80% v/v e etanol absoluto e seco sob alto vácuo para dar péletes brancos. Os 0,93 equivalentes de EDC resultaram na

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219/254 funcionalização da amina de aproximadamente 11% dos grupos carboxilato no HA. Para a preparação de HA funcionalizado com amina com aproximadamente 5% de funcionalização com amina, foram utilizados 0,40 eq (38,63 mg; 0,20 mmol) de EDOHCI.

Exemplo 2B - Preparação de HA funcionalizado com maleimida [0544] O HA funcionalizado com maleimida foi obtido pela reação do HA funcionalizado com amina (f3) com o éster NHS do ácido maleimidopropiônico (f4), de acordo com o seguinte esquema de reação:

Esquema 2B [0545] Dissolveram-se 176,1 mg de HA funcionalizado com amina (f3) (0,252 mmol/ g de amina) em 17,6 mL de tampão HEPES 100 mM, pH 7,4. Adicionaram-se 150,48 mg (0,57 mmol; 10,00 eq.) de éster de Nhidroxissuccinimida do ácido 3-maleimidopropiônico (f4) em 9,50 mL de acetonitrila. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por exatamente 60 minutos.

27,1 mL de solução de acetato de sódio 1 M, pH 5,5, foram adicionados à solução sob agitação. Foi adicionado etanol absoluto para precipitar o HA. Os péletes obtidos foram lavados sucessivamente com etanol a 80% v/ v e etanol absoluto. Os péletes foram combinados e o material foi seco em alto vácuo por três horas com armazenamento subsequente a -20 °C. Os péletes obtidos foram dissolvidos em

17,6 mL de ácido acético a 1%. 17,6 mL de solução de acetato de sódio 1 M, pH 5,5, foram adicionados à solução. A mistura resultante foi filtrada através de um filtro de seringa PES de 33 mm de diâmetro e 0,22 pm e o HA funcionalizado com maleimida (f5) foi precipitado por adição de EtOH absoluto. Os péletes foram

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220/254 lavados sucessivamente com etanol a 80% v/ v e etanol absoluto. Os péletes foram combinados e secos sob alto vácuo por três horas para dar 159,50 mg como péletes brancos. A determinação do conteúdo de maleimida foi realizada através do ensaio inverso de Ellman por adição de 2-mercaptoetanol e detecção de 2mercaptoetanol residual não reagido. Um grau de funcionalização da maleimida de aproximadamente 10% em relação aos grupos carboxilatos inicialmente disponíveis no HA nativo foi detectado.

Exemplo 2C - Preparação de HA Funcionalizado com Tiol [0546] O HA funcionalizado com tiol foi projetado para permitir a degradação do gel de HA após a incubação do gel de HA reticulado em condições fisiológicas. Neste exemplo, uma ligação éster usando ácido azelaico foi introduzida.

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221/254

Esquema 2C [0547]Dissolveram-se 166,90 mg de HA funcionalizado com amina (f3) (0,104 mmol/ g de funcionalidade de amina) em 13,9 mL de tampão HEPES 100 mM, pH 8,40. Adicionou-se à mistura uma solução recentemente preparada de 75,3 mg (0,11 mmol; 5,00 eq.) de éster NHS (d9) (ver Esquema 1F) em 7,5 mL de acetonitrila. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 120 minutos para preparar HA funcionalizado com dissulfeto (não mostrada). Uma solução recémpreparada de 63,2 mg de sal HCI de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (0,22 mmol; 10,00 eq.) em 2,1 mL de água foi adicionada à mistura reacional. A solução foi agitada durante uma hora à temperatura ambiente. 22,9 mL de solução de acetato de sódio 1 M, pH 5,5, foram adicionados à mistura reacional. A solução resultante foi particionada entre tubos Falcon. Para precipitar o conteúdo de HA, foi adicionado etanol absoluto. Os tubos foram fechados, agitados e centrifugados. Os péletes obtidos foram lavados sucessivamente com etanol a 80% v/ v e etanol absoluto. Os péletes foram combinados e secos em alto vácuo por três horas e subsequentemente armazenados a -20 °C sob uma atmosfera de argônio até uso posterior. Os péletes foram dissolvidos em 16,7 mL de ácido acético a 1% por agitação vigorosa sob uma atmosfera de argônio. 16,7 mL de solução de acetato de sódio 1 M, pH 5,5, foram adicionados à solução. A mistura resultante foi filtrada através de um filtro de seringa PES de 0,22 pm e 33 mm de diâmetro para tubos Falcon e precipitada por adição de etanol absoluto. Os tubos foram fechados, agitados e centrifugados. Os péletes foram lavados sucessivamente com etanol a 80% v/ v e etanol absoluto. Os péletes foram combinados e secos sob alto vácuo por três horas para dar 150,10 mg de HA funcionalizado com tiol (f6) como péletes brancos. A determinação do conteúdo de tiol foi realizada através do

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222/254 ensaio Ellman. Um grau de funcionalização de tiol de aproximadamente 4% em relação aos grupos carboxilato inicialmente disponíveis no HA nativo foi detectado.

Exemplo 3A - Preparação do Conjugado Ligante-Ranibizumabe

pH 7,4, 4C minutos

Rbz 9¹

Esquema 3A [0548]A conjugação de Rbz ao ligante (b8) do exemplo 1D foi feita de acordo com o Esquema 3A.

[0549]A troca e a concentração de tampão podem ser realizadas com uma coluna HiPrep seguida de concentração por meio de filtros centrífugos (pequena escala) ou usando um sistema de filtração com fluxo tangencial (TFF) (maior escala).

[0550]Utilizou-se neste exemplo 62 mL de Rbz a 40 mg/ mL formulado em histidina 10 mM, 10% em peso de α,α-D-trealose, 0,01% de Tween 20, pH 5,5. Após troca do tampão para 30 mM de fosfato pH 7,4 e concentração, a solução Rbz foi filtrada usando filtros Millex GV 33 mm com um tamanho de poro de 0,22 pm. Cerca de 50 g da solução proteica foram recuperados. Após determinação da concentração, a amostra foi

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223/254 diluída para 40 mg/ mL por adição de tampão fosfato para dar um volume final de 53,1493 g. 2118,5 mg (85%) de Rbz foram recuperados a uma concentração de 39,8 mg/ mL e um volume total de cerca de 53 mL de volume.

[0551 ]1990 mg Rbz (50 mL a 39,8 mg/ mL) em fosfato de sódio 30 mM, pH 7,4 foi arrefecido em gelo. 15 eq. (8,0 mL) do composto (b8) (exemplo 1D) (corrigido em relação ao conteúdo de NHS, soluçãoestoque 100 mM em DMSO) foram adicionados e a solução foi agitada com cuidado (não foi utilizado agitador).

[0552]A solução foi incubada por 5 minutos em gelo imediatamente seguida por uma mudança de pH, e uma troca de tampão foi feita para remover o excesso de espécies ligantes da solução de conjugado de Rbz ligante. A mudança do tampão foi feita adicionando 0,12 vol. eq. (6 mL) de ácido succínico 0,5 M, pH 3,0, e a solução foi agitada cuidadosamente. O pH da solução foi deslocado para cerca de pH 4,0. A troca de tampão foi realizada usando um Ãkta P-900 equipado com uma coluna GE HiPrep. O tampão era ácido succínico 5 mM, pH 4,0, introduzido a uma taxa de fluxo de 8,0 mL/ min com 13 corridas com 5 mL de volume de injeção por corrida. Foram coletados 134 mL de solução do produto com uma concentração de 14,5 mg/ mL (cálculo com base no coeficiente de extinção do fármaco nativo).

[0553]As amostras antes e após a conjugação foram analisadas por espectrometria de massas. O espectro de MS deconvoluído antes da conjugação indicou um pico único de Rbz em 48381. O espectro após a conjugação indicou um pico de Rbz em 48382, um pico de monoconjugado (g1) em 49066, um bisconjugado em 497543 e um trisconjugado em 50437. Somente o produto majoritário monoconjugado (g1) é mostrado no Esquema 3A para maior clareza, e o monoconjugado

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224/254 foi isolado dos conjugados superiores como descrito abaixo.

Exemplo 3B - Introdução do Marcador de Purificação ao Conjugado de

Rbz Ligante

hn g1

Rbz

Esquema 3B [0554] A introdução do marcador de purificação (e8) no conjugado de Rbz ligante (g1) foi feita de acordo com o Esquema 3B.

[0555] A uma solução de 125 mL de mistura conjugada de ligante, incluindo monoconjugado (g1) (e conjugados superiores não mostrados) (14,53 mg/ mL, 1824 mg de proteína, 37,7 pmol), 2,5 equivalentes molares de marcador de purificação (e8) (Esquema 1G), em relação ao conteúdo de proteína, foi adicionado à temperatura ambiente (1886 pL de (e8) 50 mM, 94,3

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225/254 pmol, em água) e a solução foi agitada cuidadosamente para proporcionar monoconjugado (g2) de Rbz ligante MARCAdo e conjugados superiores (não mostrado). Após 35 minutos, foi realizada uma mudança de pH para pH 7,4 e a desproteção de amina por adição de 0,170 vol. eq. (21,4 mL) de fosfato 0,5 M, TriMED 200 mM, pH 7,8 (o volume da solução de MARCAção não foi levado em consideração), durante a qual, o grupo protetor foi clivado para proporcionar o monoconjugado (g3) de Rbz ligante MARCAdo e conjugados superiores (não mostrados). A solução foi armazenada a uma temperatura controlada de 25 °C de um dia para outro em uma incubadora.

[0556] Cerca de 148 mL de solução de proteína foram removidos da incubadora a 25 °C e 0,419 vol. eq. (52,4 mL, com base no volume inicial de 125 mL de proteína, 52,7 mL realmente adicionado) de ácido succínico 0,5 M, pH 3,0 foi adicionado à solução de (g3) e conjugados superiores para obter um pH de aproximadamente pH 4,0.

Exemplo 3C - Isolamento do Monoconjugado de Rbz Ligante [0557] Para a purificação de CIEC, a solução de proteína, contendo uma mistura de Rbz não conjugado e uma mistura de monoconjugado (g3) de Rbz ligante MARCAdo e conjugados superiores, foi diluída 3,3 vezes com ácido succínico 20 mM, pH 4,0, para um volume final de cerca de 660 mL. Utilizou-se uma coluna GE Healthcare Source 15S (coluna XK26, 5,2 cm de altura) com os seguintes tampões: ácido succínico 20 mM, pH 4,0 (tampão A); e ácido succínico 20 mM, NaCI 1 M, pH 4,0 (tampão B). O gradiente foi linear, 10% -50% B, 32 CV (taxa de fluxo de 20 mL/ min). A carga foi de aproximadamente 300 mg. A mistura do conjugado foi analisada por MS antes do CIEC e no espectro de MS deconvoluído, um pico de 48380 m/ z (Rbz nativo), um pico 49573 (monoconjugado (g3)), um pico 50766 (bisconjugado) e um pico 51958 (triconjugado) foram indicados. A fração CIEC 1 predominantemente continha Rbz nativo (pico m/ z de 48380), a fração CIEC 2

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226/254 predominantemente continha o monoconjugado (g3) (pico m/ z de 49573) e a fração CIEC 3 predominantemente continha o bisconjugado (pico m/ z de 50766).

[0558] Após o isolamento do monoconjugado Rbz-lingante (g3), a solução proteica foi concentrada até cerca de 5 mg/ mL usando filtração com fluxo tangencial. O material de partida continha cerca de 450 mL de monoconjugado Rbz- ligante (g3) a cerca de 0,85 mg/ mL formulado em tampão succinato pH 4,0. A amostra foi filtrada usando um filtro Millex GV 33 mm, com um tamanho de poro de 0,22 pm. Foram obtidos 68 mL da solução de monoconjugado Rbz-lingante na concentração de 4,82 mg/ mL.

Exemplo 3D - Clivagem de Marcador de Purificação

Esquema 3D [0559] O marcador de purificação (e8) foi removido pelo procedimento mostrado no Esquema 3C.

[0560] A clivagem do marcador de purificação (e8) (desmarcação (detagylation)) foi obtida por incubação de monoconjugado Rbz-ligante (g3) (68 ml, 4,82 mg/ ml) com DTT de um dia para outro a 2-8 °C com uma

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227/254 concentração de DTT de 1 mM. Uma solução-estoque de DTT 25 mM em ácido succínico 20 mM, pH 4,0 foi preparada dissolvendo 0,0161 g de DTT em 4,175 mL de tampão succinato. A solução foi filtrada através de um filtro Millex-GV 13 mm (tamanho de poro 0,22 pm). A solução de monoconjugado Rbz-ligante e a solução estoque de 25 mM de DTT foram resfriadas a 4 °C em gelo. Adicionaram-se 2,838 mL da solução DTT 25 mM à solução proteica para dar uma concentração final de DTT de 1 mM. A incubação foi realizada de um dia para outro a 2-8 °C. A remoção do marcador de purificação foi monitorada por MS. O Rbz-espaçador-ligante-marcador de purificação antes da divagem tinha um pico em 49573 indicando o monoconjugado de marcador de purificação (g3). O conjugado Rbz-ligante (g4), após a divagem, teve um pico em 48709 indicando o monoconjugado Rbz-ligante após a divagem do marcador de purificação.

[0561] O conjugado Rbz-ligante (g4) foi purificado por CIEC. 70,9 mL de monoconjugado Rbz-ligante, após desproteção mediada por DTT, foram diluídos 12 vezes com histidina 10 mM, pH 5,5, para um volume final de cerca de 850 mL. A coluna era uma coluna GE Healthcare Source 15S XK26 (5,2 cm de altura). O sistema tampão era: histidina 10 mM, pH 5,5 (tampão A); e histidina 10 mM, NaCI 500 mM, pH 5,5 (tampão B). O gradiente foi: linear, 0% 50% B, 25 CV (taxa de fluxo de 17,5 mL/ min). A carga era de cerca de 300 mg.

[0562] Após a etapa de CIEC, a osmolalidade da solução proteica foi ajustada por diluição adicional usando tampão B (histidina 10 mM, NaCI 500 mM, pH 5,5) para dar uma concentração de NaCI de cerca de 150 mM. 63 mL de monoconjugado Rbz-ligante foram coletados durante a execução do CIEC. Foram adicionados à amostra 15,6 mL de histidina 10 mM, NaCI 500 mM, pH

5,5 para dar um volume total de 78,6 mL de monoconjugado Rbz-espaçadorligante (g4).

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228/254

Exemplo 3E - Concentração de Rbz-ligante [0563] Para a preparação de HA-ligante-Rbz (h1) com uma carga de proteína de 40 mg/ mL, o monoconjugado Rbz- ligante (g4) foi concentrado acima de 60 mg/ mL. Foram utilizadas duas membranas Amicon Ultra 15 PLCG Ultracel MWCO 10 kDa para concentração da solução de proteína por centrifugação a 3000 g. Foram obtidos cerca de 4,5 g de solução de monoconjugado Rbz-ligante (g4) com um conteúdo de proteína de 64,6 mg/ mL (293,8 mg). O monoconjugado Rbz-ligante (g4) foi analisado por MS e um pico em 48710 foi encontrado indicando o monoconjugado Rbz-ligante.

Exemplo 4A - Conjugação de conjugado ligante-Rbz a HA funcionalizado

COM MALEIMIDA

HN r -N

HO

I íi

---------ff^NX^N £ H g4 Rbz pH 5.5 ^O

HO

HO' f5

HO ^H\ y ukT ^h1 \ HN γ-Ν

HO HN

HN

Γ o. / 'γ-N S^/^O ^O ~ HO

OH

HO ^HN^

HN _vr γ-N

Ύ⁵⁰ ι 8 s'*' '''''‘‘-''''Tf^N V^N**” ^NH ο Ξ ^H ι

Rbz

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229/254

Esquema 4A [0564]A conjugação do monoconjugado Rbz ligante (g4) ao HA funcionalizado com maleimida (f5) foi realizada como mostrado no Esquema 4A.

[0565]A conjugação do monoconjugado Rbz-ligante (g4) ao HA funcionalizado com maleimida (f5) foi realizada por adição de solução concentrada de monoconjugado Rbz-ligante (g4) a 1,3 eq. de HA funcionalizado com maleimida (f5) em relação ao conteúdo de tiol, resultando em uma concentração de proteína (Rbz) de 44 mg/ mL (com base no conteúdo de tiol) e em um conteúdo de HA de cerca de 0,49%. As amostras de monoconjugado Rbz-ligante (solução proteica de 64,6 mg/ mL formulada em histidina 10 mM, NaCI 150 mM, pH 5,5) preparadas de acordo com o Exemplo 3C foram deixadas aquecer até a temperatura ambiente. As amostras foram filtradas através de um filtro GV Millex de 33 mm com um tamanho de poro de 0,22 pm. O conteúdo de tiol da solução de monoconjugado de Rbz ligante (g4) foi determinado como sendo 69,0 mg/ mL. 1300 pL da solução de monoconjugado de Rbz ligante (g4) foram transferidos para um tubo Eppendorf de 5 mL. Foram adicionados 336 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, tampão Tween 20 a 0,01%, pH 5,5. Foram adicionados 68 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, Tween 20 a 0,2%, pH 5,5. Foram adicionados 335 pL de solução de HÁ-maleimida (f5) (conteúdo de 30 mg/ mL de um HA de 116 kDa com conteúdo de maleimida de 0,24 mmol/ g). A solução resultante foi bem misturada e deixada incubar por 4 horas à temperatura ambiente. Após 4 horas de tempo de reação, uma amostra de 25 pL foi retirada e analisada via SEC. 92% do monoconjugado de Rbz ligante já haviam se ligado ao HA funcionalizado com maleimida .

Exemplo 4B - Reticulação de Tiol-Maleimida para formar Géis de HA

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Reticulados com Ligante-Fármaco [0566] A reticulação foi feita de acordo com o Esquema 4Β:

pH 5.5

Esquema 4B [0567] Após 2014 μΙ_ do conjugado ligante-Rbz HÁ- (h1) foi incubado por 4 horas. Foram adicionados 201 μΙ_ de solução de HA-tiol (f6) (conteúdo de 27,8 mg/ mL de um HA de 116 kDa com um conteúdo de tiol de 0,098 mmol/ g),

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231/254 resultando em um conteúdo final de proteína de 40 mg/ mL (com base no conteúdo de tiol) e um conteúdo final de HA de 7,01 mg/ mL na solução resultante. A solução foi bem misturada e retirada para uma seringa de 2 mL equipada com uma cânula cega de 18 G. A solução foi rapidamente preenchida em oito seringas Luer Lock de 1 mL, usando a ponta da seringa para preenchimento. Uma tampa de rosca foi montada nas seringas e elas foram incubadas por cerca de 24 horas na posição vertical, à temperatura ambiente. As seringas foram subsequentemente incubadas a 5 °C por três semanas. A reação de reticulação foi completada nas seringas para produzir o conjugado de Rbz em gel de HA reticulado (h2).

Exemplo 4C - Liberação de Rbz a partir de Gel de Rbz HA Reticuladq [0568] A liberação de Rbz do a partir gel de Rbz HA reticulado foi analisada in vitro utilizando um material que foi preparado de acordo com o exemplo 4B com pequenos ajustes. 13-17 mg de gel de Rbz HA (h2) foram transferidos para um tubo Eppendorf estéril, livre de pirogênio. Foi adicionado tampão de liberação (fosfato de sódio 60 mM, EDTA 3 mM, Tween 0,01%, pH 7,4) de acordo com uma proporção de 975 pL de tampão para 25 mg de HA. Os tubos não foram invertidos ou agitados. Todos os tubos foram armazenados a uma temperatura controlada de 37 °C em uma incubadora. Em diferentes momentos, um tubo foi removido da incubadora e centrifugado (9300 rcf, 3 min). O sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf e a concentração de proteína do sobrenadante foi determinada por medição de absorbância a 280 nm com um comprimento de onda de referência de 338 nm, utilizando o coeficiente de extinção de Rbz de 1,9 mL/ cm.mg. Para cada amostra, a liberação em % foi calculada usando a massa transferida e o conteúdo de proteínas do gel (Tabela 4c).

Tabela 4C - Liberação de Ranibizumabe

Tempo/d	% da liberação (executada em duplicata)
7	27,0; 27,0
21	41,0; 42,5
41	54,3; 57,7
63	68,7; 70,9

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Exemplo 5A - Preparação do Conjugado Ligante-G6.31 AARR

pH 7,4, em gelo 5 minutos

G6.31 ^j1

Esquema 5A [0569] A conjugação de G6.31 AARR ao ligante (b8) do exemplo 1D foi feita de acordo com o esquema: 5A.

[0570] A troca e a concentração de tampão podem ser realizadas com uma coluna HiPrep seguida de concentração por meio de filtros centrífugos (pequena escala) ou usando um sistema de filtração com fluxo tangencial (TFF) (maior escala).

[0571] 31 mL de G6.31 AARR (mostrado como “G6.31” no Esquema 5A e nos Esquemas de reação abaixo) a 40 mg/ mL formulados em histidina 20 mM, sacarose 240 mM, Tween 20 a 0,01%, pH 5,5, foram usados neste exemplo. Após troca de tampão para fosfato 30 mM, pH 7,4, e concentração, foram recuperados cerca de 23 g da solução de proteína e a concentração foi determinada. A amostra foi diluída para 40 mg/ mL por adição de tampão fosfato. Foi obtido um volume total de 32,0 g de solução de proteína contendo 1277 mg de G6.31 a uma concentração de 39,9 mg/ mL.

[0572] 1277 mg de G6.31 AARR (32,0 mL a 39,9 mg/ mL) em fosfato

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233/254 de sódio 30 mM, pH 7,4 foram arrefecidos em gelo. 15 eq. (4,6 mL) do composto (b8) (exemplo 1 D) (corrigido em relação ao conteúdo de NHS, solução-estoque 100 mM em DMSO) foram adicionados e a solução foi invertida várias vezes.

[0573] A solução foi imediatamente incubada em gelo. Após 5 minutos, a reação de conjugação foi parada mudando o pH para cerca de pH 4,0. Portanto, 0,12 vol. eq. (3,8 mL) de ácido succínico 0,5 M, pH 3,0, foram adicionados e a solução foi invertida várias vezes. A troca de tampão para ácido succínico 5 mM, pH 4,0, foi realizada em 10 corridas a uma taxa de fluxo de 8 mL/ min usando um Ãkta Basic 10 equipado com uma coluna GE HiPrep. 4 mL da solução foram injetados por corrida. No total, foram coletados 93,1 g de solução do produto com uma concentração de 12,9 mg/ mL.

[0574] As amostras antes e após a conjugação foram analisadas por espectrometria de massas. O espectro de MS deconvoluído antes da conjugação indicou um pico único de G6.31 em 47390. O espectro após a conjugação indicou um pico de G6.31 AARR em 47392, um pico de monoconjugado (j1) em 48077, um bisconjugado em 48766, um trisconjugado em 49452 e um tetraconjugado em 50147. Apenas o principal produto monoconjugado (j1) é mostrado no Esquema 3A para maior clareza, e o monoconjugado foi isolado a partir dos conjugados superiores como descrito abaixo.

Exemplo 5B - Introdução do Marcador de Purificação ao Conjugado de

Ligante G6.31 AARR

HN \

G6.31

e8 I

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Esquema 5B [0575] A introdução do marcador de purificação (e8) ao G6.31 AARR ligante conjugado (j1) foi feita de acordo com o Esquema 5B.

[0576]A uma solução de 93,1 mL de mistura conjugado ligante incluindo monoconjugado (j1) (G6.31 AARR nativo e conjugados superiores não mostrados) (12,9 mg/ mL, 1203 mg de proteína, 25,4 pmol (coeficiente de extinção e peso molecular de G6,31 AARR foram usados para simplicidade)),

2,5 equivalentes de mol de marcador de purificação (e8) (Esquema 1G), em relação ao conteúdo de proteína, foram adicionados à temperatura ambiente (1270 pL de (e8) 50 mM em ácido succínico 20 mM, pH 4,0, 63,5 pmol) e a solução foi agitada cuidadosamente para proporcionar o monoconjugado (j2) ligante G6.31 MARCAdo e conjugados superiores (não mostrados). Após 50 minutos, foi realizada uma mudança de pH para pH 7,4 e a desproteção de amina por adição de 0,170 vol. eq. (15,8 mL) de fosfato 0,5 M, TriMED 200 mM, pH 7,8 (o volume da solução de marcador de purificação adicionada não foi levado em consideração). Como o bis-conjugado mono-marcado ainda foi detectado na mistura após a mudança de pH, 0,2 eq adicional. (100 pL de (e8)

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235/254 mM em ácido succínico 20 mM, pH 4,0, 5 pmol) do marcador de purificação (e8) (Esquema 1G), em relação ao conteúdo de proteína, foram adicionados à mistura. A solução foi armazenada em uma incubadora a uma temperatura controlada de 25 °C de um dia para outro durante o qual o grupo protetor do ligante do monoconjugado (j2) ligante MARCAdo (e os conjugados superiores) foi separado por clivagem, gerando (j3).

[0577] Cerca de 110 mL de solução de proteína foram removidos da incubadora a 25 °C e 0,419 vol. eq. (39,0 mL, com base no volume inicial de

93,1 mL de proteína) de ácido succínico 0,5 M, pH 3,0, foi adicionado à solução de (j3) e conjugados superiores para obter um pH de aproximadamente pH 4,0.

Exemplo 5C - Isolamento do Monoconjugado G6.31 AARR Ligante [0578]Para purificação por CIEC (cromatografia de troca catiônica), a solução de proteína, contendo uma mistura de G6.31 não conjugado e uma mistura de monoconjugado de G6.31 AARR MARCAdo ligante (j3) e conjugados superiores, foi diluída 3,3 vezes com ácido succínico 20 mM, pH 4,0, para um volume final de cerca de 500 mL. Uma coluna GE Healthcare Source 15S (coluna HiScale26, 9,8 cm de altura) foi usada com os seguintes tampões: ácido succínico 20 mM, pH 4,0 (tampão A); e ácido succínico 20 mM, NaCI 1 M, pH 4,0 (tampão B). O gradiente foi linear, 0% -50% B em 40 CV ou 10% -50% B em 32 CV a uma taxa de fluxo de 20 mL/ min. A carga foi de aproximadamente 600 mg por corrida. A mistura de conjugados foi analisada por MS antes do CIEC e no espectro de MS deconvoluído, foram observados um pico em 47395 (G6.31 AARR nativo), um pico em 48584 (monoconjugado 03)), um pico em 49782 (bisconjugado), um pico em 50986 (trisconjugado) e um pico em 52174 (tetraconjugado). Todos os picos de CIEC foram coletados. As frações contendo predominantemente monoconjugado (j3) foram reunidas (534,2 mL; 0,67 mg/ mL) e utilizadas na etapa seguinte.

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Exemplo 5D - Clivagem de Marcador de Purificação

Esquema 5D [0579] O marcador de purificação (e8) foi removido pelo procedimento mostrado no Esquema 5D.

[0580] A clivagem do marcador de purificação (e8) (desmarcação) foi obtida por incubação do monoconjugado isolado G6.31 AARR MARCAdo ligante (j3) (534,2 ml, 0,67 mg/ ml) na presença de DTT. Uma solução-estoque de DTT 25 mM foi preparada dissolvendo 0,1364 g de DTT em 35,4 mL de ácido succínico 20 mM, pH 4,0. A solução de monoconjugado G6.31- ligante e a solução-estoque de DTT 25 mM foram resfriadas a 4 °C. Adicionaram-se 22,3 mL da solução-estoque de DTT 25 mM à solução proteica para dar uma concentração final de DTT de 1 mM. A solução resultante foi armazenada de um dia para outro a uma temperatura controlada de 5 °C em uma incubadora. A remoção do marcador de purificação foi monitorada por MS. Antes da clivagem, um pico em 48585 foi detectado indicando o monoconjugado MARCAdo (j3). Após a clivagem, foi detectado um pico em 47720, confirmando a desMARCAção e geração do monoconjugado G6.31 AARR- ligante (j4).

[0581] O monoconjugado G4.3 AARR- ligante (j4) foi purificado

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237/254 por CIEC. 556,5 mL de monoconjugado G6.31-ligante, após desproteção mediada por DTT, foram diluídos 3 vezes com ácido succínico 20 mM, pH 4,0, a um volume final de cerca de 1660 mL. Foi utilizada uma coluna GE Healthcare Source 15S HiScale26 (9,8 cm de altura). O sistema tampão era: histidina 10 mM, pH 5,5 (tampão A); Ácido succínico 20 mM, pH 4,0 (A2); e histidina 10 mM, NaCI 500 mM, pH 5,5 (tampão B). Após o carregamento da coluna, a coluna foi lavada com 2 CV do tampão A2 seguido de uma lavagem da coluna com 2 CV A1. Posteriormente, um gradiente linear foi aplicado: 0% 50% B, 25 CV (taxa de fluxo de 20 mL/ min). A carga era de cerca de 300 mg.

[0582] Após a etapa de CIEC, a osmolalidade da solução proteica foi ajustada por diluição adicional usando tampão B (histidina 10 mM, NaCI 500 mM, pH 5,5) para dar uma concentração de NaCI de cerca de 150 mM. 130 mL de monoconjugado G6.31-ligante foram coletados durante a execução do CIEC. 28 mL de histidina 10 mM, NaCI 500 mM, pH 5,5 foram adicionados à amostra para dar um volume total de 158 mL de monoconjugado G6.31 AARRligante (j4).

Exemplo 5E - Concentração de G6.31 AARR-Ligante [0583]Para a preparação de HA-ligante-G6.31 AARR (k1) (Exemplo 6A abaixo) com uma carga de proteína de 40 mg/ mL, o monoconjugado G6.31 AARR- ligante (j4) foi concentrado acima de 60 mg/ mL. Foram utilizadas quatro membranas Amicon Ultra 15 PLCG Ultracel MWCO 10 kDa para concentração da solução de proteína por centrifugação a 3000 g. Foram obtidos cerca de 3,9 g da solução de monoconjugado G6.31 AARR- ligante (j4) com um conteúdo de proteína de

76,5 mg/ mL (298 mg). A solução concentrada foi analisada por MS e um pico em 47723 foi detectado correspondendo ao monoconjugado G6.31ligante (j4). A amostra foi diluída para 65 mg/ mL adicionando 689 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, pH 5,5.

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Exemplo 6A - Conjugação de Monoconjugado G6.31 AARR- Ligante (j4) a

HA Funcionalizado com Maleimida

Esquema 6A [0584] A conjugação do monoconjugado de G6.31-ligante (j4) a HA funcionalizado com maleimida (f5) para produzir o conjugado de ligante-G6.31 AARR-HA (k1) foi realizada como mostrado no Esquema 6A.

[0585] A conjugação do monoconjugado de G6.31-ligante (j4) a HA funcionalizado com maleimida (f5) (Exemplo 2B) foi realizada por adição de solução concentrada de monoconjugado de G6.31-ligante (j4) a 1,3 eq. de HA funcionalizado com maleimida (f5) em relação ao conteúdo de tiol, resultando em uma concentração de proteína (G6.31 AARR) de 44 mg/ mL (com base no conteúdo de tiol) e um conteúdo de HA de cerca de 0,49%. G6.31 As amostras de monoconjugado G6.31 AARR-ligante (j4) (solução proteica de 64,7 mg/ mL formulada em histidina 10 mM, NaC1150 mM, pH 5,5) preparadas de acordo com o

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Exemplo 5D foram deixadas aquecer até a temperatura ambiente. As amostras foram filtradas através de um filtro GV Millex de 33 mm com um tamanho de poro de 0,22 pm. O conteúdo de tiol da solução de monoconjugado de G6.31-ligante (j4) foi determinado como sendo 73,4 mg/ mL. 2190 pL da solução de monoconjugado de G6.31-ligante (j4) foram transferidos para um tubo Falcon de 50 mL. Foram adicionados 735,5 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, tampão Tween 20 a 0,01%, pH 5,5. Foram adicionados 115,3 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, Tween 20 a 0,2%, pH 5,5. Foram adicionados 612,5 pL de uma solução estéril filtrada (Millex GP, 25 mm de diâmetro, 0,22 pm) de HA-maleimida (f5) (conteúdo de 30 mg/ mL de um HA de 116 kDa com um conteúdo de maleimida de 0,24 mmol/ g). A solução resultante foi bem misturada e deixada incubar por 4 horas à temperatura ambiente. Após 4 horas de tempo de reação, uma amostra de 25 pL foi retirada e analisada via SEC. 95% do monoconjugado de G6.31 AARR-ligante (j4) foram conjugados com o HA funcionalizado com maleimida (f5) para fornecer o conjugado ligante-G6.31 AARR-HA (k1).

Exemplo 6B: Reticulação de Tiol-Maleimida para Formar Géis de HA Reticulado de Ligante- G6.31 AARR [0586] A reticulação do tiol HA (f6) e do conjugado ligante-G6.31 AARR-HA (k1) para fornecer o hidrogel de HA reticulado de ligante-G6.31 AARR (k2) foi realizada de acordo com o Esquema 6B: SH 0=) NH i °X + Conjugado Ligante-G6.31 AARR-HA (k1) > pH 5,5

NH

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Esquema 6B [0587] Após 3628 pl_ do conjugado ligante-G6.31 HA- (k1) foram incubados por 4 horas. 363 μΙ_ de uma solução estéril filtrada (Millex GP, 25 mm de diâmetro, 0,22 pm) de HA-tiol (f6) (Exemplo 2C) (conteúdo de 28,4 mg/ mL de uma HA de 116 kDa com um conteúdo de tiol de 0,098 mmol/ g) foram adicionados, resultando em um conteúdo final de proteína de 40 mg/ mL (com base no conteúdo de tiol) e em um conteúdo final de HA de 7,16 mg/ mL na solução resultante. A solução foi bem misturada e colocada em uma seringa de 5 mL equipada com uma cânula cega de 18 G. A solução foi rapidamente preenchida em dezoito seringas Luer Lock de 1 mL usando a ponta da seringa para preenchimento. Uma tampa de rosca foi montada nas seringas e elas

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241/254 foram incubadas por cerca de 24 horas na posição vertical, à temperatura ambiente. As seringas foram subsequentemente incubadas a 5 °C por três semanas. A reação de reticulação foi completada nas seringas para produzir o conjugado (k2) de gel de HA reticulado G6.31.

Exemplo 6C - Liberação de G6.31 AARR do Gel de HA Reticulado G6.31 [0588] A liberação de G6.31 AARR a partir de gel de HA reticulado G6.31 AARR (k2) foi analisada in vitro utilizando o material do exemplo 6B. 11 a 16 mg de gel G6.31 HA foram transferidos para um tubo Eppendorf estéril, livre de pirogênio. Foi adicionado tampão de liberação (fosfato de sódio 60 mM, EDTA 3 mM, Tween 0,01%, pH 7,4) de acordo com uma proporção de 975 pL de tampão para 25 mg de HA. Os tubos não foram invertidos ou agitados. Todos os tubos foram armazenados a uma temperatura controlada de 37 °C em uma incubadora. Em diferentes momentos, um tubo foi removido da incubadora e centrifugado (9300 rcf, 3 min). O sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf e a concentração de proteína do sobrenadante foi determinada por medição de absorbância a 280 nm com um comprimento de onda de referência de 338 nm, utilizando o coeficiente de extinção de G6.31 de 1,38 mL/ cm.mg. Para cada amostra, a liberação em % foi calculada usando a massa transferida e o conteúdo de proteínas do gel (Tabela 6C).

Tabela 6C - Liberação de G6.31

Tempo /d	Liberação /%
7	14,67
14	21,08
21	27,58
33	35,79
62	53,98
70	58,42
125	75,87
186	93,18

Exemplo 7A - Preparação de Gel de RabFab HA Reticulado [0589]A preparação do conjugado RabFab-ligante foi realizada

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242/254 de acordo com os procedimentos descritos nos exemplos 3A, 3B, 3C e 3D. A concentração do monoconjugado RabFab-ligante foi realizada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 3E, exceto que o conjugado foi concentrado a uma concentração de 46 mg/ mL, devido à qual o conteúdo de proteína no gel final é de aproximadamente 30 mg/ mL.

[0590]A conjugação do conjugado RabFab-ligante com HA funcionalizado com maleimida foi realizada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 4A. 5502 pL do conjugado RabFab-ligante foram misturados com 1804 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, tampão Tween 20 a 0,01%, pH 5,5. Foram adicionados 289 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, Tween 20 a 0,2%, pH 5,5. Foram adicionados 1124 pL de solução de HA-maleimida (f5) (conteúdo de 30 mg/ mL de um HA de 116 kDa com conteúdo de maleimida de 0,24 mmol/ g). A solução resultante foi bem misturada e deixada incubar por 4 horas à temperatura ambiente.

[0591 ]A preparação do gel de RabFab HA reticulado foi obtida de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 4B. A 8691 pL do conjugado RabFab- ligante -HA, 869 pL de solução de HA-tiol (f6) (conteúdo de 22,6 mg/ mL de um HA de 116 kDa com um conteúdo de tiol de 0,096 mmol/ g) foram adicionados. A solução foi bem misturada e retirada para uma seringa de 10 mL equipada com uma cânula cega de 18 G. A solução foi rapidamente preenchida em 48 seringas Luer Lock de 1 mL, usando a ponta da seringa para preenchimento. Uma tampa de rosca foi montada nas seringas e elas foram incubadas por cerca de 24 horas na posição vertical, à temperatura ambiente. As seringas foram subsequentemente incubadas a 5 °C por três semanas. A reação de reticulação foi completada nas seringas para produzir o conjugado de RabFab de gel HA reticulado (m1).

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Exemplo 7B - Preparação de gel de placebo HA marcado com CARBOXIFLUORESCEÍNA [0592] A preparação de HA funcionalizado com amina foi obtida de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2A. Para obter a variante de HA com um maior grau de funcionalização da amina, 1,00 g de HA de 116 kDa foram dissolvidos em 125 mL de 100 MES, tampão 1,3-diaminopropano 0,4 M, pH 5,5 e 1,15 g (7,48 mmol) de HOBt e 444,6 mg (2,32 mmol) de EDC foram usados. A marcação subsequente de carboxifluoresceína e maleimida foi obtida dissolvendo 463 mg do HA funcionalizado em amina acima mencionado em 46 mL de tampão HEPES 100 mM pH 7,4, seguido pela adição de 1,5 mL

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244/254 de uma solução de éster de N-succinimidil 5(6)-carboxifluoresceína (5,28 mg/ mL em acetonitrila). Após uma hora de incubação sob agitação à temperatura ambiente, foi adicionada à solução uma solução recém-preparada de 396 mg de éster de NHS do ácido 3-maleimidopropiônico em 24 mL de acetonitrila. Após uma hora adicional de incubação sob agitação à temperatura ambiente, a preparação da mistura reacional foi realizada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2B.

[0593] A preparação do gel de HA marcado com carboxifluoresceína foi obtida de acordo com o seguinte procedimento: 140,6 mg do HA funcionalizado com maleimida marcado com carboxifluoresceína foram dissolvidos em 6580 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, tampão Tween 20 a 0,01%, pH 5,5. 82,8 mg de HA funcionalizado com tiol foram dissolvidos em 2946 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, tampão Tween 20 a 0,01%, pH 5,5. Dissolveram-se 57,6 mg de 2-mercaptoetanol em 6216 pL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, tampão Tween 20 a 0,01%, pH 5,5. 500 pL desta solução de 2-mercaptoetanol foram transferidos para um novo frasco e diluídos com 49,5 mL de histidina 10 mM, NaCI 150 mM, tampão Tween 20 a 0,01%, pH 5,5. Dissolveram-se 121,5 mg de HA nativo de 116 kDa em 8433 pL da solução diluída de 2-mercaptoetanol. 8433 pL desta solução foram transferidos para um novo frasco e 2568 pL da solução de HA maleimida foram adicionados. A solução resultante foi brevemente agitada, centrifugada e deixada incubar por 2 horas à temperatura ambiente. 10 mL desta solução foram transferidos para um novo frasco e 1 mL da solução de tiol HA foi adicionado. A solução foi bem misturada e retirada para uma seringa de 10 mL equipada com uma cânula cega de 18 G. A solução foi rapidamente preenchida em 34 seringas Luer Lock de 1 mL usando a ponta da seringa para encher e aplicar um volume de preenchimento de aproximadamente 300 pL por seringa. Uma tampa de rosca foi montada nas seringas e elas foram incubadas por

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245/254 cerca de 24 horas na posição vertical, à temperatura ambiente. As seringas foram subsequentemente incubadas a 5 °C por três semanas. A reação de reticulação foi completada nas seringas para produzir gel de placebo de HA reticulado e marcado com carboxifluoresceína (m2).

NH

Exemplo 7C - Cinética de Liberação In Vivo a partir de Géis RabFab HA Reticulado [0594] O gel RabFab HA reticulado foi administrado a coelhos naturais Nova Zelândia Branco (NZW) por meio de uma única injeção intravítrea bilateral nos coelhos, seguida de até 60 dias de observação. O antibiótico tópico (pomada oftálmica de tobramicina) foi aplicado a ambos os olhos duas vezes no dia antes do tratamento, imediatamente após a injeção e duas vezes no dia após a injeção, com exceção dos animais enviados à necropsia nos dias 1 e 2. Antes da administração, gotas midriáticas (tropicamida a 1%) foram aplicadas a cada olho para dilatação total da pupila. Os animais foram sedados com isoflurano/ gás oxigênio antes e durante o procedimento. Alcaína (0,5%) também foi aplicada a cada olho antes da injeção. As conjuntivas foram lavadas com cloreto de benzalcônio (Zephiran™)

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246/254 diluído em água estéril, U.S.P. para 1: 10.000 (v/ v).

[0595] O gel RabFab HA reticulado foi administrado por uma única injeção intravítrea de 30 μΙ_ (dose de 0,3 mg) em ambos os olhos em todos os animais. As doses foram administradas por um oftalmologista veterinário certificado, utilizando seringas Luer Lock de 1 mL com uma agulha de calibre 25 x 1/2. Para imitar a dosagem clínica, os olhos foram dosados nos quadrantes inferotemporais, ou seja, nas posições de 5 e 7 horas para os olhos esquerdo e direito, respectivamente (quando voltado para o animal). Os olhos foram examinados por biomicroscopia com lâmpada de fenda e/ ou oftalmoscopia indireta imediatamente após o tratamento.

[0596] Todos os animais foram submetidos a exsanguinação por incisão das artérias axilar ou femoral após anestesia por injeção intravenosa de pentobarbital de sódio. O humor aquoso, o humor vítreo e o tecido da retina foram coletados, congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C. A determinação das concentrações vítreas do artigo de teste foi realizada por ELISA de ligação ao antígeno. Valores abaixo do LLOQ não foram utilizados na análise farmacocinética ou para fins gráficos ou resumidos.

[0597] A análise ELISA foi realizada utilizando um método de revestimento alvo. Neste ensaio, o revestimento alvo foi o peptídeo cMet fosforilado conjugado com KLH (peptídeo P-cMet, de Yenzym, São Francisco do Sul, CA). Para a preparação das placas de ensaio, o péptido P-cMet liofilizado foi reconstituído com 300 μΙ de tampão e posteriormente diluído para 1: 200 em tampão de bicarbonate de sódio 0,05M. O peptídeo P-cMet diluído (100 pL/ poço) foi adicionado a uma placa de microtitulação de 96 poços (Nunc, Thermo Scientific, Rockford, IL) e incubado de um dia para outro a 2-8 °C. Após a incubação, a placa foi lavada três vezes com 400 μΙ de tampão de lavagem (BA029), seguida de bloqueio, com diluente de ensaio (tampão de lavagem contendo 0,5% de albumina de soro bovino e 0,05% de Proclin). A

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247/254 curva padrão foi preparada diluindo Rabbit Fab (Genentech, São Francisco do Sul, CA) a 200 ng/ ml e depois diluição em série 1: 2 em diluente de ensaio. Os controlos foram diluídos 1: 100 no diluente de ensaio. Cada amostra foi diluída na faixa quantitativa de ensaio utilizando diluente de ensaio. Todas as amostras, controles e padrões foram adicionados à placa a 100 μΙ e incubados à temperatura ambiente por 2 horas, com agitação suave. Após incubação e lavagem, foram adicionados 100 μΙ do anticorpo de detecção (cadeia leve-HRP de camundongo anti-coelho, SouthernBiotech, Birmingham, AL) por poço, após uma diluição de 1/ 4.000 no diluente de ensaio. As placas foram então incubadas por 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Após lavagem adicional, 100 μΙ de substrato HRP (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, TMB, da Kirkegard & Perry Laboratory, Gaithersburg, MD) foram adicionados a cada poço, seguidos por 15 minutos de incubação à temperatura ambiente com agitação suave. A reação foi parada com 100 pL de ácido fosfórico 1M. A placa foi lida a 450 nm para detecção e 630 nm para comprimento de onda de referência (SpectraMax 384-plus; Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os valores de densidade óptica dos padrões foram plotados usando um software de ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Softmax, Molecular Devices), a partir do qual os valores de concentração para controles e amostras de teste foram obtidos por extrapolação.

[0598] As concentrações no vítreo foram determinadas por ELISA de ligação ao antígeno, como descrito acima, e plotadas em função do tempo. A Figura 12 mostra um gráfico resumindo as concentrações vitreais em função do tempo pós-injeção. O RabFab livre após a administração de IVT é apresentado em azul, enquanto o da liberação do HA reticulado é apresentado em vermelho. Os pontos são os dados observados individuais, enquanto as linhas são previsões modelo das concentrações vítreas esperadas com base em parâmetros conhecidos de PK para Fab livre no vítreo, a liberação in vitro

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248/254 do ligante de pró-fármaco reversível e o pH e a temperatura do vítreo de coelho. Esses dados foram submetidos a uma análise não compartimental para obter parâmetros farmacocinéticos (PK).

[0599] Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados por análise não compartimental com tempo e dose nominais (Phoenix WinNonlin, Pharsight Corp, Mountain View, CA). Os parâmetros PK calculados usando uma análise não compartimental estão resumidos na Tabela 2.

Tabela 1: Estimativas dos Parâmetros PK do Estudo de PK de Coelho NZW

	Cmax (ug/mL)	AUCall (dia*ug/mL)	CL (mL/dia)	Vss (mL)
Vítreo	1030	5360	0,271	0,812
Aquoso	4,50	148	5,16	403
Soro	0,147	2,32	1260	19000

[0600] A PK de RabFab vitreal, após a liberação do RabFab HA reticulado em coelhos NZW, é consistente com as previsões baseadas na liberação in vitro. As concentrações iniciais mais altas são devidas à solução de dose contendo ~ 3,6% de Fab livre e ~ 4,9% de espécies de Fab-HA livre. A meia-vida de liberação no fluido vítreo de coelho é estimada em 53 dias.

[0601] A meia-vida terminal de Fab livre no vítreo é igual à meiavida do ligante de pró-fármaco reversível. Isso significa que, assim que a dinâmica da liberação do fármaco do HA e a subsequente eliminação do vítreo atinge o equilíbrio, a meia-vida de eliminação efetiva do fármaco ativo no vítreo será 53/ 3,2 = 16,5 vezes mais em comparação com o normalmente observado após uma injeção IVT de Fab livre.

Exemplo 5E - Ausência de Fragmentação Significativa ou Movimento de Partículas no Olho NHP [0602] Dois macacos cynomolgus foram administrados bilateralmente em uma única administração ITV de gel de HA reticulado

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249/254 placebo com fluoresceina (50 uL/ olho) no quadrante temporal inferior. Os animais foram observados por 30 dias para observações clínicas, alterações no peso corporal, consumo alimentar e observações oculares (IOP, biomicroscópica (lâmpada de fenda) e exames fundoscópicos. Além disso, a localização e coesão do material foram monitoradas durante o mesmo período usando gonioscopia, gonioimagem, imagem de fundo usando um oftalmoscópio a laser de varredura confocal e fluorometria usando um Fluoroton.

[0603] A Figura 13A é uma imagem representativa de cSLO tirada no dia 15. O TA (seta) permanece no vítreo inferior e não obscurece a fóvea (F) ou o disco óptico (ON). A Figura 13B é uma imagem tirada na necropsia com luz azul cobalto após a remoção do segmento anterior e da lente. Observe que o TA (seta) permanece coeso. Como pode ser visto, o gel de HA reticulado placebo (m2) mostrou fragmentação e movimento mínimos após 30 dias.

Exemplo 7F - Estudo de Tolerabilidade ao Gel de RabFab HA Reticulado em Coelho [0604] Três coelhos Nova Zelândia Branco foram administrados bilateralmente com uma única administração ITV de gel de RabFab-HA reticulado (50 pL/ olho) no quadrante temporal inferior. Os animais foram observados por 60 dias para observações clínicas, alterações no peso corporal, consumo alimentar e observações oculares (IOP, exames biomicroscópicos (lâmpada de fenda) e fundoscópicos). Amostras de soro foram coletadas para ADA e TK. Na necropsia, os olhos foram removidos e processados para histopatologia. A Figura 14 mostra uma seção histológica. Como pode ser visto, o gel de RabFab-HA reticulado foi bem tolerado em um estudo de 2 meses. Não foi observado infiltrado celular, reação inflamatória e reação de corpo estranho (6 olhos).

Exemplo 7G - Estudo de Tolerabilidade ao Gel G6.31 AARR HA Reticulado em Macacos Cynomolgus [0605] Dois macacos cynomolgus foram administrados

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250/254 bilateralmente com uma injeção única de ITV de gel de HA reticulado conjugado com o anti-VEGF Fab, G6.31 AARR (50 μΙ_/ olho; 1,92 mg Fab/ olho) no quadrante temporal inferior. Os animais foram observados por 3 meses (92 dias) para observações clínicas, alterações no peso corporal, consumo de alimentos e observações oculares (IOP, biomicroscópica (lâmpada de fenda) e exames fundoscópicos). A localização e coesão do material foi monitorada durante o mesmo período, utilizando gonioscopia e gonioimagem. Amostras de soro foram coletadas para avaliação de ADA e TK e os olhos foram avaliados por histopatologia em 3 meses.

[0606] O hidrogel permaneceu coeso e no vítreo inferior durante todo o período de avaliação. Não foi observada inflamação significativa na vida, apesar da indução de ADA em ambos os animais no dia 28. Não houve alterações relacionadas ao artigo de teste na observação clínica, consumo qualitativo de alimentos e peso corporal. A Figura 15 mostra uma seção histológica superoinferior da calota inferior do olho que contém o artigo de teste. Como pode ser visto, o gel de G6.31 AARR-HA reticulado foi bem tolerado em um estudo de 3 meses. Não foi observado infiltrado celular, reação inflamatória e reação de corpo estranho (4 olhos).

[0607] Comparado ao hidrogel particulado à base de PEG, conjugado ao ranibizumabe, o gel de G6.31 AARR-HA reticulado apresenta um perfil de segurança superior. Quando injetado na cavidade vítrea inferior, o gel de G6.31 AARR-HA reticulado não se move e permanece abaixo do eixo visual e, portanto, não se espera que interfira na visão do paciente. Por outro lado, os hidrogéis de partículas à base de PEG se moviam livremente dentro da cavidade vítrea.

[0608] O gel de G6.31 AARR-HA reticulado permanece coeso e não forma um número significativo de fragmentos semelhantes a partículas livres, limitando assim o risco de bloqueio da saída. Uma fração do hidrogel

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251/254 particulado à base de PEG foi observada na câmara anterior dos olhos de macacos cynomolgus.

Exemplo 8 - Exemplos de Anticorpos Anti-VEGF Otimizados para Uso nos Conjugados de Anticorpos da Invenção [0609] Qualquer um dos anticorpos anti-VEGF otimizados descritos neste Exemplo pode ser usado para preparar conjugados de anticorpos como descrito nos Exemplos 3A a 4D acima. Por exemplo, qualquer anticorpo anti-VEGF otimizado descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2016/053454 pode ser usado. A Tabela 3 descreve exemplos de anticorpos anti-VEGF otimizados que podem ser utilizados, bem como as sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL para cada anticorpo. A Tabela 4 descreve as sequências de aminoácidos VL HVR para os anticorpos anti-VEGF descritos na Tabela 3. A Tabela 5 descreve as sequências de aminoácidos VH HVR para os anticorpos anti-VEGF descritos na Tabela 3. Em formas de realização particulares, o anticorpo anti-VEGF G6.31 AARR (aqui também referido como “G6.31 .AARR”) é usado.

Tabela 3 - Sequências de Aminoácidos VH e VL para Anticorpos Anti-VEGF

Exemplificativos

Nome do Anticorpo	Variante VH (SEQ ID NO)	Variante VL (SEQ ID NO)
G6.31 WT	G6.31 WT (SEQ ID NO: 42)	G6.31 WT (SEQ ID NO: 38)
LC-N94A	G6.31 WT (SEQ ID NO: 42)	N94A (SEQ ID NO: 41)
LC-N94A.LC-F83A	G6.31 WT (SEQ ID NO: 42)	N94A.F83A (SEQ ID NO: 12)
LC-N94A.LC-F83A. HC-A40E.HC-T57E (G6.31 ΑΑΕΕ)	A40E.T57E (SEQ ID NO: 40)	N94A.F83A (SEQ ID NO: 12)
N94A.F83A.N82aR.Y58R (G6.31 AARR)	N82aR.Y58R (SEQ ID NO:11)	N94A.F83A (SEQ ID NO: 12)
HCcombo	HCcombo (SEQ ID NO: 33)	G6.31 WT (SEQ ID NO: 38)
HCLC2	HCcombo (SEQ ID NO: 33)	LCcombo2 (SEQ ID NO: 35)
HCLC4	HCcombo (SEQ ID NO: 33)	LCcombo4 (SEQ ID NO: 37)
HCLC5	HCcombo (SEQ ID NO: 33)	N94A.F83A (SEQ ID NO: 12)
HCLC3	HCcombo (SEQ ID NO: 33)	LCcombo3 (SEQ ID NO: 36)

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252/254

Nome do Anticorpo	Variante VH (SEQ ID NO)	Variante VL (SEQ ID NO)
HCLC1	HCcombo (SEQ ID NO: 33)	LCcombol (SEQ ID NO: 34)
R19HCcombo	R19HCcombo (SEQ ID NO: 51)	G6.31 WT (SEQ ID NO: 38)
R19HCLC2	R19HCcombo (SEQ ID NO: 51)	LCcombo2 (SEQ ID NO: 35)
R19HCLC4	R19HCcombo (SEQ ID NO: 51)	LCcombo4 (SEQ ID NO: 37)
R19HCLC5	R19HCcombo (SEQ ID NO: 51)	N94A.F83A (SEQ ID NO: 12)

Tabela 4 - Sequências de VL HVR rara Anticorpos da Tabela 3

Nome do Anticorpo	HVR-L1	HVR-L2	HVR-L3
G6.31 WT	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)
LC-N94A	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
LC-N94A.LC-F83A	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
LC-N94A.LC-F83A. HC-A40E.HC-T57E (G6.31 AAEE)	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
N94A.F83A.N82aR.Y58R (G6.31 AARR)	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
HCcombo	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)
HCLC2	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
HCLC4	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
HCLC5	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
HCLC3	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
HCLC1	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
R19HCcombo	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23)
R19HCLC2	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
R19HCLC4	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)
R19HCLC5	RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8)	SASFLYS (SEQ ID NO:9)	QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10)

Tabela 5 - Sequências VH HVR para Anticorpos da Tabela 3

Nome do Anticorpo	HVR-H1	HVR-H2	HVR-H3
G6.31 WT	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 53)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
LC-N94A	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 53)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
LC-N94A.LC-F83A	DYWIH	GITPAGGYTYYADSVKG	FVFFLPYAMDY

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253/254

Nome do Anticorpo	HVR-H1	HVR-H2	HVR-H3
	(SEQ ID NO:1)	(SEQ ID NO: 53)	(SEQ ID NO:3)
LC-N94A.LC-F83A. HC-A40E.HC-T57E (G6.31 AAEE)	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
N94A.F83A.N82aR.Y58R (G6.31 AARR)	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
HCcombo	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
HCLC2	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
HCLC4	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
HCLC5	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
HCLC3	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
HCLC1	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
R19HCcombo	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
R19HCLC2	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
R19HCLC4	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)
R19HCLC5	DYWIH (SEQ ID NO:1)	GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22)	FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO:3)

[0610] A região de dobradiça superior da cadeia pesada de Fab de qualquer um dos anticorpos listados acima, por exemplo, G6.31 AARR, pode ser mutada para remover a reatividade aos auto-anticorpos de dobradiça anti-lgG1 que foram relatados na literatura. Ver, por exemplo, Brezski et al., J. Immunol. 181: 3183-3192, 2008 e Brezski et al., mAbs 2: 3, 212-220, 2010. Assim, o aminoácido C-terminal da cadeia pesada de G6.31 AARR pode ser um T (versão tipo selvagem (WT)) ou L (versão variante sem reatividade ao Fab de IgG anti-humano). A sequência de aminoácidos de cadeia pesada completa de G6.31 AARR do tipo selvagem é SEQ ID NO: 48. A sequência de aminoácidos de cadeia pesada completa da versão variante que carece de reatividade ao Fab de IgG anti-humano é a SEQ ID NO: 49. A sequência de aminoácidos de cadeia leve completa para ambos os G6.31 AARR e a versão

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254/254 variante que não possui reatividade ao Fab de IgG anti-humano é SEQ ID NO: 50.

[0611] Esta descrição escrita usa exemplos para divulgar a invenção, incluindo o melhor modo, e também para permitir que qualquer técnico no assunto pratique a invenção, incluindo fabricar e usar quaisquer dispositivos ou sistemas e executar quaisquer métodos incorporados. O escopo patenteável da invenção é definido pelas reivindicações e pode incluir outros exemplos que ocorrem aos técnicos no assunto. Esses outros exemplos devem estar dentro do escopo das reivindicações se eles tiverem elementos estruturais que não diferem da linguagem literal das reivindicações ou se incluírem elementos estruturais equivalentes com diferenças não substanciais em relação às linguagens literais das reivindicações.

Claims

Reivindicações

1. CONJUGADO de fármaco de HA reticulado, caracterizado por compreender uma pluralidade de polímeros de ácido hialurônico 2A e uma pluralidade de polímeros de ácido hialurônico 2B, em que:

cada 2A compreende uma pluralidade de unidades conectadas linearmente, as unidades consistindo essencialmente em:

cada 2B compreende uma pluralidade de unidades conectadas linearmente, as unidades consistindo essencialmente em:

em que uma linha tracejada não marcada indica um ponto de ligação a uma unidade adjacente em uma linha tracejada marcada com # ou a um hidrogênio, uma linha tracejada marcada com # indica um ponto de ligação a uma unidade adjacente em uma linha tracejada não marcada ou a uma hidroxila; e uma linha tracejada marcada com * indica um ponto de ligação de

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2/31 reticulação entre uma unidade Z³ de 2A e uma unidade Z⁴ de 2B, de modo que pelo menos um 2A seja reticulado a pelo menos um 2B;

o Fármaco é um agente terapêutico;

Ra¹ e Ra² são, cada um, independentemente, hidrogênio, alquila C1-4, um íon de metal alcalino, um íon de amônio ou um íon de metal alcalinoterroso;

L² é um ligante de pró-fármaco reversível;

L⁴ é um espaçador opcionalmente biodegradável e pode ser igual ou diferente em Z² e Z⁴;

2A compreende um total de unidades s, em que s é de 25 a 2500, em que;

o número de unidades Z¹ em 2A é de cerca de 0,8s a cerca de 0,99s, e o número de unidades Z³ é de cerca de 0,1 s a cerca de 0,01 s;

2B compreendendo um total de unidades t, em que t é de 25 a 2500, em que;

o número de unidades Z¹ em 2B é de cerca de 0,75t a cerca de 0,94t;

o número combinado de unidades Z² e Z⁴ é de cerca de 0,14t a cerca de 0,06t;

o número de unidades Z² é de pelo menos 0,011; e o número de unidades Z⁴ é de pelo menos 0,011.

2. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ligante de pró-fármaco reversível L² que acopla o fármaco ao espaçador L⁴ ser de fórmula Xlla

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3/31 em que:

a linha tracejada indica a ligação a um nitrogênio de um composto de fármaco (não mostrado) através da formação de uma ligação am ida;

-X- é -C(R⁴R^4a)-, -N(R⁴)-, -O-, -C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a)-, -C(R⁵R^5a)C(R⁴R^4a)-, -C(R⁴R^4a)-N(R⁶)-, -N(R⁶)-C(R⁴R^4a)-, -C(R⁴R^4a)-O-, -O-C(R⁴R^4a)-, ou -C(R⁷R^7a)-;

X¹ é C, ou S(O);

-X²- é -C(R⁸R^8a)-, ou -C(R⁸R^8a)-C(R⁹R^9a)-;

=X³ é =0, =S, ou =N-CN;

-R¹, -R^1a, -R², -R^2a, -R⁴, -R^4a, -R⁵, -R^5a, -R⁶, -R⁸, -R^8a, -R⁹, -R^9a são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em -H, e alquila C1-6;

_r³ _R3a _sã₀ selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em -H, e alquila C1-6, desde que no caso de um de -R³, -R^3a ou ambos serem diferentes de -H, eles estão conectados ao N ao qual estão ligados através de um átomo de carbono hibridizado em SP³;

-R⁷ é -N(R¹⁰R^10a), ou -NR¹⁰-(C=O)-R¹¹;

-R^7a, -R¹⁰, -R^10a, -R¹¹ são, independentemente um do outro, -H ou alquila C1-10;

opcionalmente, um ou mais dos pares -R^1a/-R^4a, -R^1a/-R^5a, -R^1a/-R^7a, -R^4a/-R^5a, -R^8a/-R^9a formam uma ligação química; opcionalmente, um ou mais dos pares -R¹/-R^1a, -R²/-R^2a, -R⁴/-R^4a, -R⁵/-R^5a, -R⁸/-R^8a, -R⁹/-R^9a são unidos

juntamente com o átomo ao qual estão ligados para formar uma cicloalquila C310 ou heterociclila de 3 a 10 membros;

opcionalmente, um ou mais dos pares -R¹/-R⁴, -R¹/-R⁵, -R¹/-R⁶, -R¹/-R^7a, -R⁴/-R⁵, -R⁴/-R⁶, -R⁸/-R⁹, -R²/-R³ são

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4/31 unidos juntamente com os átomos aos quais estão ligados para formar um anel A;

opcionalmente, R³/R^3a são unidos juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um heterociclo de 3 a 10 membros;

o anel A é selecionado a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 3 a 10 membros, e heterobiciclila de 8 a 11 membros; e em que o grupo de fórmula Xlla é substituído com -L⁴, desde que o hidrogênio marcado com o asterisco na fórmula (Xlla) não seja substituído por -L⁴ ou outro substituinte;

em que -L⁴- é uma ligação química simples ou uma porção espaçadora, conforme aqui definido.

3. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

2, caracterizado por:

X³ ser =0;

-R¹ e -R^1a serem hidrogênio;

-R³ ser metila e R^3a ser hidrogênio; e

X ser -C(R⁷R^7a)-, com R⁷ sendo NR¹⁰-(C=O)-R¹¹.

4. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo ligante de pró-fármaco reversível L² ser da fórmula Vlla(i):

*

H N

H N

Vlla(i) em que:

cada asterisco representa um sítio independente de ligação ao espaçador L⁴.

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5/31

5. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo ligante de pró-fármaco reversível

L², juntamente com o espaçador L⁴, ser da fórmula VIlc:

em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação ao átomo de nitrogênio do fármaco; e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z² do ácido hialurônico 2B.
6. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por:

o espaçador L⁴ que conecta o polímero de ácido hialurônico 2A ao polímero de ácido hialurônico 2B ser da fórmula:

o

em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação a uma unidade Z³ no polímero de ácido hialurônico 2A; e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z⁴ no polímero de ácido hialurônico 2B;

o espaçador l_4 que une o ligante de pró-fármaco reversível L² ao polímero de ácido hialurônico 2B ser da fórmula:

o

o

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6/31 em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação ao L²; e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z² no polímero de ácido hialurônico 2B;

em que:

L¹ é um espaçador; e

L³ é um espaçador biodegradável.
7. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por:

e

em que:

L¹ é um espaçador;

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7/31

L³ é um espaçador biodegradável; e

2A, 2B, Fármaco, R^a1, R^a2, R^a3, R^a4, L₂, Z¹, Z², Z³ e Z⁴ são conforme definidos na reivindicação 1.
8. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo espaçador L⁴ que conecta o polímero de ácido hialurônico 2A ao polímero de ácido hialurônico 2B ser da fórmula:

em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação a uma unidade Z³ no polímero de ácido hialurônico 2B; e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z⁴ no polímero de ácido hialurônico 2A;

e o espaçador l_4 que une o ligante de pró-fármaco reversível L²ao polímero de ácido hialurônico 2A ser da fórmula ^L Γ o

em que: a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação a L²;

e a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação a uma unidade Z² no polímero de ácido hialurônico 2B;

em que:

L^A é um espaçador;

L^B é um espaçador; e

L^c é um espaçador biodegradável.

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9. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

8, caracterizado pelo L^A ser alquileno C1-10 opcionalmente substituído e/ ou opcionalmente interrompido.
10. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado pelo L^A ser alquileno C2-4 linear.
11. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo L^B ser -(O)-alquileno C1-5 linear.
12. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo L^c ser:

o

em que m é de 0 a 10, n é de 1 a 4 e o é de 1 a 4.
13. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo L^c ser:

000
14. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fármaco ser um anticorpo.
15. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

14, caracterizado pelo anticorpo ser um antagonista de VEGF.
16. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

15, caracterizado pelo anticorpo ser um fragmento de anticorpo anti-VEGF.
17. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

16, caracterizado pelo fragmento de anticorpo ser um fragmento de anticorpo Fab.
18. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

17, caracterizado pelo fragmento de anticorpo Fab ser ranibizumabe.

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19. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis regiões hipervariáveis (HVRs) a seguir:

(g) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(h) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8 (SEQ ID NO: 2), em que X1 é lie ou His, X2 é Ala ou Arg, X3 é Tyr ou Lys, X4 é Thr ou Glu, X5 é Arg, Tyr, Gin ou Glu, Xe é Ala ou Glu, X7 é Lys ou Glu e Xe é Gly ou Glu;

(i) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(j) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQX1VSTAVA (SEQ ID NO: 4), em que X1 é Asp ou Arg;

(k) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de X1ASFLYS (SEQ ID NO: 5), em que X1 é Ser ou Met; e (l) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de X1QGYGX2PFT (SEQ ID NO: 6), em que X1 é Gin, Asn ou Thr e X2 é Ala, Asn, Gin ou Arg.
20. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis HVRs a seguir:

(g) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(h) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21), ou GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22);

(i) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(j) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de

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10/31

RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(k) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (l) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10) ou QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).
21. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis HVRs a seguir:

(g) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(h) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7);

(i) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(j) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(k) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (l) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10).
22. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes regiões estruturais (FRs) de domínio variável da cadeia pesada (VH):

(e) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13);

(f) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14);

(g) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de

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11/31

RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); e (h) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16).
23. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes FRs do domínio variável da cadeia leve (VL):

(e) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17);

(f) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18);

(g) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (h) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
24. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis HVRs a seguir:

(g) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(h) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22);

(i) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(j) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(k) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (l) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de

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QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).
25. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

24, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes FRs de domínio VL:

(e) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17);

(f) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18);

(g) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); e (h) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
26. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis HVRs a seguir:

(g) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(h) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22);

(i) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(j) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(k) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (l) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10).
27. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

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26, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes FRs de domínio VL:

(e) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17),

DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25) ou

DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26);

(f) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) ou WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27);

(g) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19) ou GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); e (h) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
28. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes FRs de domínio VH:

(i) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) ou EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52);

(j) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30);

(k) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (l) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).
29. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo anticorpo compreender (a) um domínio VH

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14/31 compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 40 ou 42; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 41 ou 46; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).
30. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

16, caracterizado pelo anticorpo compreender (a) um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 40 ou 42; (b) um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 41 ou 46; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).
31. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

17, caracterizado pelo anticorpo compreender um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
32. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

18, caracterizado pelo anticorpo compreender uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
33. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo anticorpo compreender uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
34. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo conjugado de anticorpo-hidrogel possuir uma meia-vida ocular eficaz que é aumentada em relação a um anticorpo de referência que não está covalentemente ligado ao hidrogel.
35. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

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34, caracterizado pela meia-vida ocular eficaz ser aumentada pelo menos cerca de 2 vezes em relação ao anticorpo de referência.
36. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

35, caracterizado pela meia-vida ocular eficaz ser aumentada pelo menos cerca de 2,5 vezes em relação ao anticorpo de referência.
37. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

36, caracterizado pela meia-vida ocular eficaz ser aumentada pelo menos cerca de 3 vezes em relação ao anticorpo de referência.
38. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

37, caracterizado pela meia-vida ocular eficaz ser aumentada pelo menos cerca de 3,5 vezes em relação ao anticorpo de referência.
39. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

38, caracterizado pela meia-vida ocular eficaz ser aumentada pelo menos cerca de 4 vezes em relação ao anticorpo de referência.
40. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

39, caracterizado pela meia-vida ocular eficaz ser aumentada pelo menos cerca de 5 vezes em relação ao anticorpo de referência.
41. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com a reivindicação

40, caracterizado pela meia-vida ocular eficaz ser aumentada pelo menos cerca de 6 vezes em relação ao anticorpo de referência.
42. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 41, caracterizado pela meia-vida ocular eficaz ser uma meia-vida vitreal eficaz.
43. CONJUGADO de hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 42, caracterizado pelo anticorpo de referência ser idêntico ao anticorpo do conjugado de hidrogel.
44. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o conjugado de hidrogel, conforme definido em qualquer uma das

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16/31 reivindicações 1 a 43, e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
45. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada por compreender ainda um segundo agente, em que o segundo agente é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um agente antiangiogênico, uma citocina, um antagonista de citocinas, um corticosteróide, um analgésico e um composto que se liga a uma segunda molécula biológica.
46. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo agente antiangiogênico ser um antagonista de VEGF.
47. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo antagonista de VEGF ser um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo anti-receptor de VEGF, uma proteína de fusão solúvel do receptor de VEGF, um aptâmero, um anti-VEGF DARPin® ou um inibidor de tirosina quinase de VEGFR.
48. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo anticorpo anti-VEGF ser ranibizumabe (LUCENTIS®), RTH-258 ou um anticorpo anti-VEGF biespecífico.
49. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo anticorpo anti-VEGF biespecífico ser um anticorpo anti-VEGF/ anti-Ang2.
50. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo anticorpo anti-VEGF/ anti-Ang2 ser RG7716.
51. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pela proteína de fusão solúvel do receptor de VEGF ser aflibercept (EYLEA®).

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52. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo aptâmero ser pegaptanib (MACUGEN®).
53. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo anti-VEGF DARPin® ser abicipar pegol.
54. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo inibidor de tirosina quinase de VEGFR ser selecionado a partir do grupo que consiste em 4-(4-bromo-2-fluoroanilino)-6metoxi-7-(1 -metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474), 4-(4-fluoro-2-metil indol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-1-ilpropoxi)quinazolina (AZD2171), vatalanib (PTK787), semaxaminib (SU5416), e SUTENT® (sunitinib).
55. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pela segunda molécula biológica ser selecionada a partir do grupo que consiste em IL-1 β, IL-6, IL-6R, IL-13, IL-13R, PDGF, angiopoietina, angiopoietina 2, Tie2, S1P, integrinas ανβ3, ανβ5 e α5β1, betacelulina, apelina/ APJ, eritropoietina, fator de complemento D, TNFa, HtrA1, um receptor de VEGF, receptor ST-2, e uma proteína geneticamente ligada ao risco de AMD.
56. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo receptor de VEGF ser VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR ou sVEGFR.
57. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pela proteína geneticamente ligada ao risco de AMD ser selecionada a partir do grupo que consiste em componentes da via do complemento C2, fator B, fator H, CFHR3, C3b, C5, C5a e C3a, HtrA1, ARMS2, TIMP3, HLA, IL-8, CX3CR1, TLR3, TLR4, CETP, LIPC, COL10A1 e TNFRSF10A.
58. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 e 55 a 57, caracterizada pelo composto que se liga

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18/31 a uma segunda molécula biológica ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
59. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ser selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv e (Fab')2.
60. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 59, caracterizada por ser para uso como um medicamento.
61. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 59, caracterizada por ser para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica em um sujeito.
62. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 59, caracterizada por ser para uso na redução ou inibição de angiogênese em um sujeito com um distúrbio associado à angiogênese patológica.
63. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 59, caracterizada por ser para uso no tratamento de um distúrbio associado à angiogênese patológica em um sujeito.
64. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 44 a 59, caracterizada pelo distúrbio associado à angiogênese patológica ser um distúrbio ocular.
65. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo distúrbio ocular ser selecionado a partir do grupo que consiste em degeneração macular relacionada com a idade (AMD), degeneração macular, edema macular, edema macular diabético (DME) (incluindo DME focal, não central e DME difuso, envolvido no centro),

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19/31 retinopatia, retinopatia diabética (DR) (incluindo DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) e DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquemia, retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão de veia da retina (RVO) (incluindo formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), CNV (incluindo a CNV míope), neovascularização da córnea, uma doença associada à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, uma doença associada à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, vitreorretinopatia exsudativa familiar (FEVR), doença de Coats, doença de Norrie, síndrome de Osteoporose-Pseudoglioma (OPPG), hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intraocular, degeneração da retina, edema macular cistoide (CME), vasculite, papiloedema, retinite, conjuntivite (incluindo conjuntivite infecciosa e conjuntivite nãoinfecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber, uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não-infecciosa), coroidite, histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática e doença de Sjogren.
66. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo distúrbio ocular ser AMD, DME, DR ou RVO.
67. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 66, caracterizada pelo distúrbio ocular ser AMD.
68. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 67, caracterizada pela AMD ser AMD úmida.
69. MÉTODO PARA TRATAR UMA INDICAÇÃO OCULAR,

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20/31 caracterizado pelo método compreender a administração de uma quantidade terapêutica de uma solução da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 44 a 68, a um sujeito que necessite de tal tratamento.
70. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pela administração ser intraocular.
71. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pela composição ser injetada no vítreo do sujeito.
72. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pela composição ser injetada usando uma agulha com um calibre de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32.
73. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pela indicação ocular ser selecionada a partir de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), degeneração macular, edema macular, edema macular diabético (DME) (incluindo DME focal, não central e DME difuso, envolvido no centro), retinopatia, retinopatia diabética (DR) (incluindo DR proliferativa (PDR), DR não proliferativa (NPDR) e DR de grande altitude), outras retinopatias relacionadas à isquem ia, retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão de veia da retina (RVO) (incluindo formas central (CRVO) e ramificada (BRVO)), CNV (incluindo CNV míope), neovascularização da córnea, uma doença associada à neovascularização da córnea, neovascularização da retina, uma doença associada à neovascularização da retina/ coróide, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, vitreorretinopatia exsudativa familiar (FEVR), doença de Coats, doença de Norrie, síndrome de Osteoporose-Pseudoglioma (OPPG), hemorragia subconjuntival, rubeose, doença neovascular ocular, glaucoma neovascular, retinite pigmentosa (RP), retinopatia hipertensiva, proliferação angiomatosa da retina, telangiectasia macular, neovascularização da íris, neovascularização intra-ocular, degeneração da retina, edema macular cistoide (CME), vasculite,

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21/31 papiloedema, retinite, conjuntivite (incluindo conjuntivite infecciosa e conjuntivite não-infecciosa (por exemplo, alérgica)), amaurose congênita de Leber, uveíte (incluindo uveíte infecciosa e não infecciosa), coroidite, histoplasmose ocular, blefarite, olho seco, lesão ocular traumática e doença de Sjogren.
74. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pela indicação ocular ser AMD, DME, DR ou RVO.
75. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pela indicação ocular ser AMD.
76. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pela AMD ser AMD úmida.
77. MÉTODO PARA PRODUZIR UM CONJUGADO DE FÁRMACO DE HIDROGEL, caracterizado pelo método compreender:

(a) fornecer um primeiro ácido hialurônico ou um derivado do mesmo, tendo pelo menos três primeiros grupos reativos no mesmo;

(b) fornecer um segundo ácido hialurônico ou um derivado do mesmo, tendo pelo menos dois segundos grupos reativos no mesmo, em que o primeiro e o segundo grupos reativos são capazes de reagir entre si para formar uma ligação covalente;

(c) acoplar pelo menos um fármaco a um dos primeiros grupos reativos; e (d) reticular o primeiro e o segundo ácidos hialurônicos por reação de um primeiro grupo reativo e um segundo grupo reativo para formar um agente de reticulação e formar o conjugado de hidrogel;

em que os eventos (b) e (c) podem, opcionalmente, ser trocados.
78. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fármaco ser acoplado ao primeiro ácido hialurônico por meio de um ligante de pró-fármaco reversível.

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79. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fármaco ser acoplado ao ligante de pró-fármaco reversível e purificado para formar um conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível purificado antes do acoplamento com o primeiro ácido hialurônico, em que o conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível é purificado por:

(a) marcação do conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível com um marcador de purificação para formar uma mistura de conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível marcada;

(b) purificação de um monoconjugado de fármaco-ligante de prófármaco reversível marcado da mistura por separação cromatográfica; e (c) remoção do marcador de purificação do monoconjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível marcado para formar o conjugado de fármaco-ligante de pró-fármaco reversível purificado.
80. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo ligante de pró-fármaco reversível que acopla o fármaco ao primeiro ácido hialurônico ser de fórmula XIIa

em que:

a linha tracejada indica a ligação a um nitrogênio de um composto de fármaco (não mostrado) através da formação de uma ligação am ida;

-X- é -C(R⁴R^4a)-, -N(R⁴)-, -O-, -C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a)-, -C(R⁵R^5a)C(R⁴R^4a)-, -C(R⁴R^4a)-N(R⁶)-, -N(R⁶)-C(R⁴R^4a)-, -C(R⁴R^4a)-O-, -O-C(R⁴R^4a)-, ou -C(R⁷R^7a)-;

X¹ é C, ou S(O);

-X²- é -C(R⁸R^8a)-, ou -C(R⁸R^8a)-C(R⁹R^9a)-;

=X³ é =0, =S, ou =N-CN;

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-R¹, -R^1a, -R², -R^2a, -R⁴, -R^4a, -R⁵, -R^5a, -R⁶, -R⁸, -R^8a, -R⁹, -R^9a são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em -H, e alquila C1-6;

-R³, -R^3a são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em -H, e alquila C1-6, desde que no caso de um de -R³, -R^3a ou ambos serem diferentes de -H, eles estão conectados ao N ao qual estão ligados através de um átomo de carbono hibridizado em SP³;

-R⁷ é -N(R¹⁰R^10a), ou -NR¹⁰-(C=O)-R¹¹;

-R^7a, -R¹⁰, -R^10a, -R¹¹ são, independentemente um do outro, -H ou alquila C1-10;

opcionalmente, um ou mais dos pares -R^1a/-R^4a, -R^1a/-R^5a, -R^1a/-R^7a, -R^4a/-R^5a, -R^8a/-R^9a formam uma ligação química; opcionalmente, um ou mais dos pares -R¹/-R^1a, -R²/-R^2a, -R⁴/-R^4a, -R⁵/-R^5a, -R⁸/-R^8a, -R⁹/-R^9a são unidos

juntamente com o átomo ao qual estão ligados para formar uma cicloalquila C310 ou heterociclila de 3 a 10 membros;

opcionalmente, um ou mais dos pares -R¹/-R⁴, -R¹/-R⁵, -R¹/-R⁶, -R¹/-R^7a, -R⁴/-R⁵, -R⁴/-R⁶, -R⁸/-R⁹, -R²/-R³ são unidos juntamente com os átomos aos quais estão ligados para formar um anel A;

opcionalmente, R³/R^3a são unidos juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um heterociclo de 3 a 10 membros;

o anel A é selecionado a partir do grupo que consiste em fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, cicloalquila C3-10, heterociclila de 3 a 10 membros, e heterobiciclila de 8 a 11 membros; e em que o grupo de fórmula Xlla é substituído com -L⁴, desde que

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24/31 o hidrogênio marcado com o asterisco na fórmula (Xlla) não seja substituído por -L⁴ ou outro substituinte;

em que -L⁴- é uma ligação química simples ou uma porção espaçadora, conforme aqui definido.
81. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado por:

X³ ser =0;

-R¹ e -R^1a serem hidrogênio;

-R³ ser metila e R^3a ser hidrogênio; e

X ser -C(R⁷R^7a)-, com R⁷ sendo NR¹⁰-(C=O)-R¹¹.
82. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo ligante de pró-fármaco reversível ser da fórmula Vlla(i): o *

H N

H N

Vlla(i) em que: cada asterisco representa um sítio independente de ligação ao primeiro ácido hialurônico por um espaçador L⁴.
83. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo ligante de pró-fármaco reversível, juntamente com, opcionalmente, um espaçador L⁴, ser da fórmula VIIc:

N

N H

N H em que:

a linha ondulada mais à direita representa o ponto de ligação ao

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25/31 átomo de nitrogênio de um fármaco;

a linha ondulada mais à esquerda representa o ponto de ligação ao primeiro ácido hialurônico; e

L⁴ é um espaçador opcionalmente biodegradável.
84. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo agente de reticulação compreender uma porção espaçadora biodegradável.
85. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo agente de reticulação compreender uma porção éster de ácido azelaico.
86. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fármaco ser um anticorpo.
87. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo anticorpo ser um antagonista de VEGF.
88. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo anticorpo ser um fragmento de anticorpo anti-VEGF.
89. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fragmento de anticorpo ser um fragmento de anticorpo Fab.
90. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fragmento de anticorpo Fab ser ranibizumabe.
91. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis regiões hipervariáveis (HVRs) a seguir:

(m) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(n) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8 (SEQ ID NO: 2), em que X1 é lie ou His, X2 é Ala ou Arg, X3 é Tyr ou Lys, X4 é Thr ou Glu, X5 é Arg, Tyr, Gin ou Glu, Xe é Ala ou Glu, X7 é Lys ou Glu e Xe é Gly ou Glu;

(0) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos

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26/31 de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(p) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQX1VSTAVA (SEQ ID NO: 4), em que Xi é Asp ou Arg;

(q) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de X-iASFLYS (SEQ ID NO: 5), em que Xi é Ser ou Met; e (r) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de X1QGYGX2PFT (SEQ ID NO: 6), em que Xi é Gin, Asn ou Thr e X2 é Ala, Asn, Gin ou Arg.
92. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis HVRs a seguir:

(m) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(n) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21) ou GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22);

(0) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(p) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(q) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (r) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10) ou QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).
93. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 92, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis HVRs a seguir:

(m) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(n) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos

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27/31 de GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7);

(o) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(p) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(q) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (r) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10).
94. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 93, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes regiões estruturais (FRs) de domínio variável da cadeia pesada (VH):

(i) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13);

(j) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14);

(k) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); e (l) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16).
95. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 94, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes FRs de domínio variável da cadeia leve (VL):

(i) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17);

(j) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18);

(k) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de

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GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); e (l) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
96. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

91 a 92, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis HVRs a seguir:

(m) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(n) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22);

(o) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(p) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(q) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (r) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).
97. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes FRs de domínio VL:

(i) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17);

(j) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18);

(k) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); e (l) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
98. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

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91 a 92, caracterizado pelo anticorpo compreender as seis HVRs a seguir:

(m) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de DYWIH (SEQ ID NO: 1);

(n) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22);

(o) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3);

(p) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8);

(q) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 9); e (r) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10).
99. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes FRs de domínio VL:

(i) uma FR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17),

DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25) ou

DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26);

(j) uma FR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) ou WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27);

(k) uma FR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19) ou GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); e (l) uma FR-L4 que compreende a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
100. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

Petição 870200029674, de 05/03/2020, pág. 294/313

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96 a 98, caracterizado pelo anticorpo compreender ainda as seguintes FRs de domínio VH:

(m) uma FR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) ou EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52);

(n) uma FR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30);

(o) uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); e (p) uma FR-H4 que compreende a sequência de aminoácidos de WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).
101. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo anticorpo compreender (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 40 ou 42; (b) um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 41 ou 46; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).
102. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo anticorpo compreender (a) um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 40 ou 42; (b) um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 41 ou 46; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).
103. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo anticorpo compreender um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

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104. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo anticorpo compreender uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
105. CONJUGADO de anticorpo-hidrogel, conforme definido na reivindicação 86, caracterizado pelo anticorpo compreender uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.