JP2018522835A - Ｇｌｐ−１／グルカゴン二重アゴニストリンカーヒアルロン酸コンジュゲートを含むプロドラッグ - Google Patents

Ｇｌｐ−１／グルカゴン二重アゴニストリンカーヒアルロン酸コンジュゲートを含むプロドラッグ Download PDF

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Abstract

本発明は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストリンカーコンジュゲートＺ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０を含むプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩に関し、Ｙは、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト部分を表し；−Ｌは、式（Ｉａ）によるリンカー部分であり、点線は、アミド結合を形成することによるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト部分のアミノ基の１つへの結合を示す。本発明はさらに、前記プロドラッグを含む医薬組成物ならびにＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストにより治療することができる疾患または障害を治療または予防するための医薬としてのそれらの使用に関する。
【化１】

Description

本発明は、ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストプロドラッグ、前記プロドラッグを含む医薬組成物ならびに例えば、糖尿病および肥満を含む、代謝症候群の障害の治療におけるＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストにより治療することができる疾患もしくは障害を治療または予防するための、ならびに過度の食物摂取の低減のための医薬としてのそれらの使用に関する。
ＧＬＰ−１アゴニスト
エキセンディン−４は、毒腺を有するアメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液分泌物から単離された３９アミノ酸ペプチドである。それは、グルカゴン様ペプチドファミリーのいくつかのメンバーとある程度の配列類似性を有し、グルカゴン様ペプチド−１［７−３６］−アミド（ＧＬＰ−１）が５３％の最も高い相同性を有する。エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１受容体に対するアゴニストとして作用し、単離ラット膵島におけるＧＬＰ−１様のインスリン分泌促進作用を有する。エキセンディン−４は、高い効力のアゴニストであり、切断型ＧＬＰ−１アゴニスト−（９−３９）−アミドは、インスリン分泌ベータ細胞のグルカゴン様ペプチド１−（７−３６）−アミド受容体におけるアンタゴニストである（例えば、非特許文献１を参照）。エキセンディン−４（「エキセナチド」）は、メトホルミンおよび／またはスルホニル尿素を服用しているが、十分な血糖コントロールを達成しなかった２型糖尿病を有する患者における血糖コントロールを改善するために米国およびＥＵにおいて最近承認された。
エキセンディン−４のアミノ酸配列は、配列番号１
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２として示される。
ＧＬＰ−１（７−３６）−アミドのアミノ酸配列は、配列番号２
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２として示される。
グルカゴンは、循環グルコースが低い場合に血流中に放出される２９アミノ酸ペプチドである。グルカゴンのアミノ酸配列は、配列番号３
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−ＯＨに示されている。
血糖値が正常値以下に低下する低血糖時に、グルカゴンは、グリコーゲンを分解し、グルコースを放出して、正常レベルに到達するように血糖値の上昇をもたらすシグナルを肝臓に伝達する。低血糖は、糖尿病に起因する高血糖（血糖値の上昇）を有する患者のインスリン治療の一般的な副作用である。したがって、グルコースの調節におけるグルカゴンの最も重要な役割は、インスリンの作用に対抗し、血糖値を維持することである。
Ｈｏｌｓｔ（非特許文献２）およびＭｅｉｅｒ（非特許文献３）は、ＧＬＰ−１、リラグルチドおよびエキセンディン−４などのＧＬＰ−１受容体アゴニストが空腹時および食後グルコース（ＦＰＧおよびＰＰＧ）を減少させることによりＴ２ＤＭを有する患者における血糖コントロールを改善する３つの主要な薬理活性：（ｉ）グルコース依存性インスリン分泌の増加（第１および第２相の改善）、（ｉｉ）高血糖状態のもとでのグルカゴン抑制活性、（ｉｉｉ）食事由来のグルコースの吸収の遅延をもたらす胃排出速度の遅延を有することを記載している。
ＧＬＰ−１／グルカゴン（Ｇｌｃ）アゴニスト
Ｐｏｃａｉら（非特許文献４；非特許文献５）およびＤａｙら（非特許文献６）は、例えば、１つの分子におけるＧＬＰ−１およびグルカゴンの作用を組み合わせることによる、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体の二重活性化が抗糖尿病作用および顕著な体重低下効果を伴う治療原理につながることを記載している。
グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方に結合して活性化し（非特許文献７；非特許文献８）、体重増加を抑制し、食物摂取を減少させるペプチドは、内容を参照によって本明細書に組み入れる、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７および特許文献１８に記載されている。
さらに、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体だけでなく、ＧＩＰ受容体（胃抑制ポリペプチド）も活性化する三重共アゴニストペプチドは、特許文献１９に、およびＶＡ Ｇａｕｌｔら（非特許文献９、非特許文献１０）によりに記載されている。
Ｂｌｏｏｍら（特許文献２０）は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方に結合し、活性化するペプチドは、Ｎ末端部分（例えば、残基１〜１４または１〜２４）がグルカゴンに由来し、Ｃ末端部分（例えば、残基１５〜３９または２５〜３９）がエキセンディン−４に由来する、グルカゴンおよびエキセンディン−４からのハイブリッド分子として構築することができることを開示している。
Ｏｔｚｅｎら（非特許文献１１）は、基礎をなす残基の疎水性および／または高いβシート傾向のため、ＮおよびＣ末端疎水性パッチは、グルカゴンのフィブリル化に関与することを開示している。
特許文献２１は、少なくとも１４位のアミノ酸が半減期の延長のために側鎖を有する、エキセンディン−４に由来するグルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方に結合し、活性化するペプチドを開示している。
本発明で用いるペプチドは、１０位にロイシンおよび１３位にグルタミンを含むエキセンディン−４ペプチド類似体であり、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４に記載されている。
本発明で用いるペプチドはまた、２８位にベータ−アラニンを含むエキセンディン−４ペプチド類似体であり、特許文献２５に記載されている。
さらに、３位にグルタミン、２８位にベータ−アラニンならびに２９および３４位にＤ−アラニンを含むエキセンディン−４ペプチド類似体であるペプチドを本発明で用いる。
本発明で用いるペプチドは、好ましくは中性ｐＨにおいてだけでなく、ｐＨ４．５においても可溶性である。また４．５〜５のｐＨ値における化学的安定性は、長時間作用性のプロドラッグ製剤に関する重要な基準である。該プロドラッグは、好ましくは４℃で少なくとも６カ月の貯蔵寿命を得るためにこのｐＨ範囲で製剤化する。
長時間作用性ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト
理想的には、ペプチドは、週１回またはより長い注射頻度が得られる人体への適用の後少なくとも１週間にわたるヒトにおける血漿レベルの持続をもたらす方法で製剤化する。
長時間作用性ＧＬＰ−１アゴニストを用いた現行の療法は、２３ゲージ針を用いたグリコール−乳酸コポリマーに基づく週１回の注射用のデボ懸濁液中エキセンディン−４であるＢｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標）である。
特許文献２６は、ペプチドがオキシントモジュリンに由来する、週１回投与用の免疫グロブリンのＦｃ領域にコンジュゲートされたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを記載している。
担体結合プロドラッグ
半減期などのｉｎ ｖｉｖｏでの薬物の物理化学的または薬物動態特性を向上させるために、そのような薬物を担体にコンジュゲートすることができる。薬物を担体および／またはリンカーに一時的に結合させる場合、そのようなシステムは、一般的に担体結合プロドラッグと指定される。ＩＵＰＡＣにより示されている（２００９年７月２２日にアクセスした、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ．ｍｅｄｃｈｅｍのもとに示されている）定義によれば、担体結合プロドラッグは、物理化学的または薬物動態特性の改善をもたらし、通常加水分解による切断によってｉｎ ｖｉｖｏで容易に除去することができる所定の活性物質と担体グループとの一時的な結合を含むプロドラッグである。
そのような担体結合プロドラッグに用いられるリンカーは、一時的なものであり、これは、それらが、生理的条件（ｐＨ７．４の水性緩衝液、３７℃）下で非酵素的加水分解により分解可能（切断可能）であり、例えば、１時間から３カ月までの範囲の半減期を有するものであることを意味する。適切な担体は、ポリマーであり、直接または非切断性スペーサーを介してリンカーにコンジュゲートすることができる。
痕跡を残さないプロドラッグリンカーを介する一時的ポリマーコンジュゲーションは、ポリマーの結合に起因する長期の滞留時間およびポリマーコンジュゲートからの放出後の天然ペプチドの元来の薬理作用の回復という利点を兼ね備えている。
ポリマー−リンカーコンジュゲートを用いることにより、天然未変化ペプチドは、リンカーの放出速度論およびポリマー担体の薬物動態によってのみ支配されて、患者への適用の後に徐々に放出される。理想的には、放出速度論は、一貫性があり、均一な放出パターンを保証するために体液中のプロテアーゼまたはエステラーゼのような酵素の存在と無関係である。
特許文献２７、特許文献２８および特許文献２９は、リンカーが、ＧＬＰ−１アゴニストエキセンディン−４などの、生物学的に活性な部分に切断可能な結合を介して共有結合している、薬物リンカーコンジュゲートを含むプロドラッグに言及している。生物学的に活性な部分は、環状イミド形成による環化活性化によりプロドラッグから放出される。放出速度論は、ｐＨ値に依存し、４．５〜５のｐＨ値においてプロドラッグの保存のために最小限であり、およそ７．４〜７．５の生理的ｐＨにおいてその意図される放出速度に達する。リンカーがＬ−アラニンに基づくものであり、ポリマー担体がＰＥＧ−リシンベースのヒドロゲルである、ＧＬＰ−１アゴニストプロドラッグが記載されている。二重ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、記載されていない。
ヒアルロン酸（ＨＡ）
Ｄｈａｌら（非特許文献１２）は、ヒアルロン酸を薬物コンジュゲート用の適切な担体として報告している。Ｋｏｎｇら（非特許文献１３）は、マウスにおいて３日間にわたりグルコース低下効果を示したエキセンディン−４−ヒアルロン酸コンジュゲートを報告している。使用されたＨＡは、薬物担持が約２．４〜１２％の範囲の線状ポリマーであった。
本発明では、適用部位における局所貯留槽としてのその滞留時間が可溶性ＨＡよりもより長いため、架橋ヒアルロン酸のヒドロゲルを選択する。担体ポリマーとしてのヒアルロン酸（ＨＡ）の使用の重要な基準は、ポリマー自体における薬物担持および最終溶液／懸濁液の濃度によって決定される、最終医薬品における達成可能な薬物担持である。皮下薬物デポ剤の注射容量が１ｍＬに等しい／未満、好ましくは０．６ｍＬに等しい／未満に実際上限定されることが前提である。
ＨＡのポリマー溶液／懸濁液が濃縮されるほど、製剤がより粘稠になり、これがプロドラッグ製剤の注射針通過性に負の影響を及ぼす。粘稠な溶液は、注射器を加圧するプランジャーへの力を制限するためにより大きな直径の注射針を必要とする。注射の時間もより長い。
国際公開第２００８／０７１９７２号 国際公開第２００８／１０１０１７号 国際公開第２００９／１５５２５８号 国際公開第２０１０／０９６０５２号 国際公開第２０１０／０９６１４２号 国際公開第２０１１／０７５３９３号 国際公開第２００８／１５２４０３号 国際公開第２０１０／０７０２５１号 国際公開第２０１０／０７０２５２号 国際公開第２０１０／０７０２５３号 国際公開第２０１０／０７０２５５号 国際公開第２０１１／１６０６３０号 国際公開第２０１１／００６４９７号 国際公開第２０１１／１５２１８１号 国際公開第２０１１／１５２１８２号 国際公開第２０１１／１１７４１５号 国際公開第２０１１／１１７４１６号 国際公開第２００６／１３４３４０号 国際公開第２０１２／０８８１１６号 国際公開第２００６／１３４３４０号 国際公開第２０１４／０５６８７２号 国際公開第２０１５／０８６７３１号 国際公開第２０１５／０８６７３２号 国際公開第２０１５／０８６７３３号 欧州特許第１５３０５８９９．５号 国際公開第２０１２／１７３４２２号 国際公開第２００８／１４８８３９号 国際公開第２００９／０９５４７９号 国際公開第２０１２／０３５１３９号
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８巻（２６号）：１９６５０〜１９６５５頁 Ｈｏｌｓｔ、Ｊ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２００７年、８７巻、１４０９頁 Ｍｅｉｅｒ、Ｊ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１２年、８巻、７２８頁 Ｐｏｃａｉら、Ｏｂｅｓｉｔｙ．２０１２年、２０巻、１５６６〜１５７１頁 Ｐｏｃａｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００９年、５８巻、２２５８頁 Ｄａｙら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９年、５巻、７４９頁 Ｈｊｏｒｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９巻、３０１２１〜３０１２４頁、１９９４年 Ｄａｙ ＪＷら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、５巻、７４９〜７５７頁、２００９年 ＶＡ Ｇａｕｌｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、８５巻、１６６５５〜１６６６２頁、２０１３年 ＶＡ Ｇａｕｌｔら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、５６巻、１４１７〜１４２４頁、２０１３年 Ｏｔｚｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５巻、１４５０３〜１４５１２頁、２００６年 Ｄｈａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、２０１３年、１〜１３頁 Ｋｏｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３１巻（２０１０年）、４１２１〜４１２８頁
投与の間の少なくとも６日間の期間にわたり活性型のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを放出し、患者コンプライアンスが良好になるように２６ゲージ注射針を介してまたはより小さな内径の針を介してすら注射することができる皮下デポ剤として投与するためのＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグを提供することが本発明の一目的である。
本発明の目的は、式（Ｉ）の薬物リンカーコンジュゲートを含むプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩である。
Ｚ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０ （Ｉ）
式中、Ｙは、式（ＩＩ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩ）
であり、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
またはＹは、式（ＩＩＩ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩＩ）
であり、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＬｅｕおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
または
Ｙは、式（ＩＶ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＶ）
であり、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
または
Ｙは、式（ＩＶａ）を有するペプチド部分
Ｈ２Ｎ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｂａｌ−Ｘ２９−Ｇｌｙ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ３９−Ｒ２０ （ＩＶａ）
であり、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＡｓｐ）を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏ、（好ましくは）Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＰｒｏ）を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＳｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）を表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ）を表し、
Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表し、
または
Ｙは、式（ＩＶｂ）を有するペプチド部分
Ｈ２Ｎ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｂａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｒ２０
またはその塩もしくは溶媒和物であり；
Ｒ２０は、ＯＨまたはＮＨ２であり；
Ｌは、式（Ｉａ）のリンカー
（式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹのＮ末端への結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）；Ｎ（Ｒ４）であり；
Ｒ１、Ｒ１ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ４、Ｒ４ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ４またはＲ４ａは、１つの基Ｌ２−Ｌ１−Ｚで置換されており；Ｌ２は、単一化学結合またはＣ１−２０アルキル鎖であり、これは、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されており、Ｒ３ａａおよび Ｒ３ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択される）であり、
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており、
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており、
Ｌ１は、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基によって場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａＲ５ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａおよびＲ５ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ１は、Ｚのヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してＺに結合しており；
Ｚは、単量体二糖単位の０．０５〜２０％が架橋剤により架橋され、単量体二糖単位の０．２〜８．５％がＬ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである。
本発明は、投与の間の少なくとも６日間の期間にわたり活性型の皮下デポ剤からのＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストの放出をもたらすプロドラッグに関する。
これは、患者が、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストの血漿レベルおよびその結果として血糖の最適なコントロールを維持することができると同時に、注射の頻度を減少させる助けとなる。
本発明の架橋ヒアルロン酸担体のさらなる利点は、２６ゲージ針によるまたはより小さな内径の針によってすら良好な注射可能性である。
ヒアルロン酸ヒドロゲルを合成するための様々な架橋化学を示す図である。 図１ａ−１の続き。 ヒアルロン酸ヒドロゲルを合成するための様々な架橋化学を示す図である。 図１ｂ−１の続き。 ヒアルロン酸ヒドロゲルを合成するための様々な架橋化学を示す図である。 図１ｃ−１の続き。 図１ｃ−２の続き。 図１ｃ−３の続き。 異なる時点に撮像した、注射部位におけるＨＡヒドロゲルの磁気共鳴（ＭＲ）画像である。 異なる時点に撮像した、注射部位における１：１（重量／重量）ＨＡヒドロゲル−８００ｋＤａ可溶性ＨＡを含むポリマー懸濁液の磁気共鳴（ＭＲ）画像である。 ＨＡヒドロゲルからの弱いリンカーを含むエキセンディン−４配列番号２６二重アゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出速度論（実施例１８）を示す図である。半減期は、５日である。 ｄｂ／ｄｂマウスにおける非絶食血糖に対するＨＡヒドロゲル−二重アゴニスト（配列番号２６）コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図であり、異なる用量についての異なるレベルのｍｍｏｌ／Ｌ単位の血糖を動物の治療時間に対して示す。 ｄｂ／ｄｂマウスにおける非絶食血糖に対するＨＡヒドロゲル−二重アゴニスト（配列番号２６）コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図であり、異なるヒドロゲル構築物：可溶性および架橋ヒアルロン酸についての異なるレベルのｍｍｏｌ／Ｌ単位の血糖を動物の治療時間に対して示す。 ｄｂ／ｄｂマウスにおける非絶食血糖に対するＨＡヒドロゲル−二重アゴニスト（配列番号４５、４６および４８）コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図であり、ｍｍｏｌ／Ｌ単位の血糖のレベルを動物の治療時間に対して示す。 ｄｂ／ｄｂマウスにおける非絶食血糖に対するＨＡヒドロゲル−二重アゴニスト（配列番号４９）コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図であり、ｍｍｏｌ／Ｌ単位の血糖のレベルを動物の治療時間に対して示す。 注射可能性試験：異なるペプチド担持量のＨＡヒドロゲルについての注射器プランジャーに対する押出し力を示すグラフである。
本発明のアミノ酸配列は、天然アミノ酸の通常の一文字および三文字コード、ならびにＡｉｂ（α−アミノイソ酪酸）などの、他のアミノ酸の一般的に受け入れられている三文字コードを含む。さらに、以下のコードを下表に示すアミノ酸について用いた。
リンカーに結合したＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストは、「ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト部分」と呼ぶ。
「保護基」は、後の化学反応における化学的選択性を得るために合成中に分子の化学官能基を一時的に保護する部分を意味する。アルコールに対する保護基は、例えば、ベンジルおよびトリチルであり、アミンに対する保護基は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルおよびベンジルであり、チオールについての保護基の例は、２，４，６−トリメトキシベンジル、フェニルチオメチル、アセトアミドメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、トリフェニルメチル、３−ニトロ−２−ピリジルチオ、４−メチルトリチルである。
「保護官能基」は、保護基により保護された化学官能基を意味する。
「アシル化剤」は、酸塩化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールおよびパラ−ニトロフェノールなどの、脱離基に場合により連結された、アシル化反応においてアシル基を供給する、構造Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の部分を意味する。
「アルキル」は、直鎖または分枝炭素鎖を意味する。アルキル炭素の各水素は、置換基により置換することができる。
「アリール」は、場合によりさらに置換することができる、複素環、例えば、フェニル、チオフェニル、インドリル、ナフチル、ピリジルを含む、単環もしくは多環または縮合芳香環に由来する置換基のいずれかを意味する。
「アシル」は、Ｒがアルキルまたはアリールである、構造Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の化学官能基を意味する。
「Ｃ１−４アルキル」は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル鎖、例えば、分子の末端に存在する場合には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、または分子の２つの部分がアルキル基によって連結されている場合には、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−を意味する。Ｃ１−４アルキル炭素の各水素は、置換基により置換することができる。
「Ｃ１−６アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル鎖、例えば、分子の末端に存在する場合には、Ｃ１−４アルキル、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、または分子の２つの部分がアルキル基によって連結されている場合には、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−を意味する。Ｃ１−６アルキル炭素の各水素は、置換基により置換することができる。
したがって、「Ｃ１−１８アルキル」は、１〜１８個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味し、「Ｃ８−１８アルキル」は、８〜１８個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味する。したがって、「Ｃ１−５０アルキル」は、１〜５０個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味する。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。ハロゲンがフルオロまたはクロロであることが一般的に好ましい。
「ヒアルロン酸」は、ベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸およびベータ−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンならびにそれらのそれぞれのナトリウム塩からなる二糖のポリマーを意味する。これらのポリマーは、線状である。
「二糖単位」は、ベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸およびベータ−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンならびにそれらのそれぞれのナトリウム塩からなる二糖を意味し、ＨＡの単量体構築ブロックである。
「架橋ヒアルロン酸」は、ＨＡの異なる鎖が架橋剤により共有結合により連結されて、３次元ポリマー網目構造を形成している、ヒアルロン酸のポリマーを意味する。架橋の程度は、ポリマー網目構造における二糖単位と架橋剤単位とのモル比を指す。
「架橋ヒアルロン酸」は、種々の方法により得ることができる。ＨＡと架橋剤との反応、修飾（活性化）ＨＡと架橋剤との反応、２つの異なる修飾ＨＡと架橋剤との反応である。例は、Ｏｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１４１巻（２０１０年）、２〜１２頁に記載されている。実施例１１にジビニルスルホンによる非修飾ＨＡの架橋について記載する。架橋ＨＡを調製するさらなる方法は、図１ａ、図１ｂおよび図１ｃにも示し：アルデヒド（ジオール酸化）およびその後のアミンの還元的アミノ化、ヒドロキシル媒介アルキル化、アミド形成反応、マイケル付加架橋（チオール−マレイミド）、ジオール−エポキシド化学反応ならびにその他である。
「架橋剤」は、線状もしくは分枝状分子または化学基であり得、好ましくは各遠位末端に少なくとも化学官能基を有する線状分子である。
「官能基化ヒアルロン酸」は、ＨＡがその遠位末端に化学官能基を有するＬ１基により化学的に修飾されているヒアルロン酸のポリマーを意味する。官能基化の程度は、ポリマーにおける二糖単位とＬ１単位とのモル比を指す。
「化学官能基」という用語は、カルボン酸および活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオールおよび誘導体、スルホン酸および誘導体、カーボネートおよび誘導体、カルバメートおよび誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸および誘導体、ホスホン酸および誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アクリロイルおよび他のアルファ−ベータ不飽和マイケル受容体、フッ化アリールのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、オキシランならびにアジリジンを意味するが、これらに限定されない。
化学官能基が他の化学官能基と結合する場合、得られる化学構造を「結合」と呼ぶ。例えば、アミン基とカルボキシル基との反応は、アミド結合をもたらす。
「反応性官能基」は、多分枝部分に結合している主鎖部分の化学官能基である。
「官能基」は、「反応性官能基」、「分解性相互結合官能基」または「コンジュゲート
官能基」について用いる総称である。
「ブロッキング基」または「キャッピング基」という用語は、同義で用いられ、反応性官能基に不可逆的に結合して、それらが例えば、化学官能基と反応することができないようにする部分を意味する。
「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」または「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）」という用語は、反応性官能基に可逆的に結合して、それらが特定の条件下で他の化学官能基と反応することができないようにする部分を意味する。
「誘導体」という用語は、保護および／もしくは活性化基で適切に置換された化学官能基または当業者に公知の対応する化学官能基の活性化型を意味する。例えば、カルボキシル基の活性化型は、スクシンイミジルエステル、ベンゾトリアジルエステル、ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、アザベンゾトリアジルエステル、アシルハロゲン化物、混合または対称酸無水物、アシルイミダゾールを含むが、これらに限定されない。
「非酵素的に開裂可能なリンカー」という用語は、酵素活性によらずに生理的条件下で加水分解により分解可能であるリンカーを意味する。
「スペーサー」、「スペーサー基」、「スペーサー分子」および「スペーサー部分」という用語は、同義で用いられ、本発明のヒドロゲル担体に存在する部分を記述するために用いる場合、その断片が−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１−４アルキル）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１−４アルキル）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−から選択される１つまたはそれ以上の基によって場合により中断される、Ｃ１−５０アルキルなどの、２つの部分を結合させるのに適する任意の部分を意味する。
「末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）」、「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」または「遠位末端」という用語は、分子または部分内の官能基または結合の位置を意味し、そのような官能基は、化学官能基であり、結合は、分解性もしくは永続的結合であり、２つの部分の間の結合に隣接してもしくは結合内にまたはオリゴマーもしくはポリマー鎖の末端に位置することを特徴とする。
「結合した形態の（ｉｎ ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍ）」または「部分」という語句は、より大きい分子の一部である下部構造を意味する。「結合した形態の」という語句は、当技術分野で周知の試薬、出発物質または仮定の出発物質の名称を挙げるまたは列挙することによって単に部分について言及するために用いられ、「結合した形態の」は、例えば、１つもしくはそれ以上の水素ラジカル（−Ｈ）、または試薬もしくは出発物質に存在する１つもしくはそれ以上の活性化基もしくは保護基がその部分に存在しないことを意味する。
ポリマー部分を含むすべての試薬および部分は、分子量、鎖長もしくは重合度または官能基の数に関して変動性を示すことが公知の巨大分子実体を意味すると理解される。したがって、架橋試薬および架橋部分について示す構造は、代表的な例にすぎない。
試薬または部分は、線状または分枝状であり得る。試薬または部分が２つの末端基を有する場合、それは、線状試薬または部分と呼ばれる。試薬または部分が２つを超える末端基を有する場合、それは、分枝または多官能性試薬または部分とみなされる。
そのような担体結合プロドラッグに用いられるリンカーは、一時的なものであり、これは、それらが、生理的条件（ｐＨ７．４の水性緩衝液、３７℃）下で非酵素的加水分解により分解可能（切断可能）であり、例えば、１時間から３カ月までの範囲の半減期を有するものであることを意味する。
「ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ」という用語は、担体がヒドロゲルである、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストの担体結合プロドラッグを意味する。「ヒドロゲルプロドラッグ」および「ヒドロゲル結合プロドラッグ」という用語は、ヒドロゲルに一時的に連結された生物学的に活性な薬剤のプロドラッグを意味し、同義で用いられる。
「ヒドロゲル」は、大量の水を吸収することができる３次元親水性または両親媒性ポリマー網目構造と定義することができる。網目構造は、ホモポリマーまたはコポリマーからなり、共有結合性化学的または物理的（イオン性、疎水相互作用、絡み合い）架橋の存在に起因して不溶性である。架橋は、網目構造および物理的完全性をもたらす。ヒドロゲルは、水性媒体中でそれらを膨潤させる水との熱力学的適合性を示す。網目構造の鎖は、細孔が存在し、これらの細孔のかなりの割合が１ｎｍから１０００ｎｍまでの間の寸法になるような様式で連結されている。
「遊離型」の薬物は、ポリマーコンジュゲートから放出された後などの、その非修飾で、薬理学的に活性な形態の、薬物、具体的にはＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
「薬物」、「生物学的に活性な分子」、「生物学的に活性な部分」、「生物学的に活性な薬剤」、「活性薬剤」という用語は、同義で用いられ、その結合または遊離型のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストの「治療有効量」は、本明細書で用いているように所定の疾患およびその合併症の臨床症状を治癒させる、軽減するまたは部分的に停止させるのに十分な量を意味する。これを達成するための十分な量は、「治療有効量」と定義される。各目的のための有効量は、疾患または傷害の重症度ならびに対象の体重および一般状態に依存する。適切な用量の決定は、値の行列を作り、行列における異なる箇所を試験することによって、常用の実験を用いて達成することができ、これらはすべて、訓練を受けた医師の通常の技術の範囲内にあることは、理解されよう。
「安定」および「安定性」は、表示貯蔵時間内においてヒドロゲルコンジュゲートがコンジュゲートされたままであり、実質的な程度に加水分解せず、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストに関する容認できる不純物プロファイルを示すことを意味する。安定であるとみなされるためには、組成物は、５％未満のその遊離型の薬物を含む。
「薬学的に許容される」という用語は、動物、好ましくはヒトにおける使用についてＥＭＥＡ（ヨーロッパ）および／またはＦＤＡ（米国）などの規制当局および／または他の国家規制当局により承認済みであることを意味する。
「医薬組成物」または「組成物」は、１つもしくはそれ以上の有効成分、および１つもしくはそれ以上の不活性成分、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組合せ、錯化もしくは凝集により、または１つもしくはそれ以上の成分の解離により、または１つもしくはそれ以上の成分の他の種類の反応もしくは相互作用により、直接的もしくは間接的に得られる任意の生成物を意味する。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容される賦形剤（薬学的に許容される担体）を混合することによって製造された任意の組成物を包含する。
「乾燥組成物」は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ組成物を乾燥した形態で容器入りで提供することを意味する。乾燥のための適切な方法は、例えば、噴霧乾燥および凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））である。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグのそのような乾燥組成物は、最大１０％、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満の残留含水率（カールフィッシャー法により測定される）を有する。乾燥の好ましい方法は、凍結乾燥である。「凍結乾燥組成物」は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルポリマープロドラッグ組成物を最初に凍結し、その後、減圧という手段による水の減少に供することを意味する。この術語は、組成物を最終容器中に充填する前の製造プロセスで発生する追加の乾燥工程を排除しない。
「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））は、組成物を凍結し、次いで周囲圧力を低下させ、場合により、熱を加えて、組成物中の凍結水を固相から気体に直接昇華させることを特徴とする、脱水法である。一般的に、昇華した水は、凝結により収集される。
「復元」は、乾燥組成物を液体または懸濁組成物の形態にするための乾燥組成物への液体の添加を意味する。「復元」という用語は、水の添加に限定されるものではなく、例えば、緩衝液または他の水性溶液を含む、任意の液体の添加を意味すると理解される。
「復元溶液」は、それを必要とする患者への投与の前にＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物を復元するために用いられる液体を意味する。
「容器」は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ組成物をそれに含め、復元時まで保存することができる容器を意味する。
「緩衝液」または「緩衝剤」は、ｐＨを所望の範囲に維持する化学化合物を意味する。生理的に耐容される緩衝剤は、例えば、リン酸、コハク酸、ヒスチジン、重炭酸、クエン酸および酢酸、ピルビン酸ナトリウムである。Ｍｇ（ＯＨ）２またはＺｎＣＯ３などの制酸剤も用いることができる。緩衝能は、ｐＨ安定性に最も感度の高い条件に適合するように調節することができる。
「賦形剤」は、治療薬と一緒に投与される化合物、例えば、緩衝剤、等張性調整剤、保存剤、安定剤、吸着防止剤、酸化保護剤または他の助剤を意味する。しかし、場合によっては、１つの賦形剤が二重または三重機能を有し得る。
「凍結乾燥防止剤」は、目的のタンパク質と組み合わせた場合、一般的に乾燥時の、とりわけ凍結乾燥およびその後の貯蔵中の化学的および／または物理的不安定性を著しく防止または低減する分子である。
例示的な凍結乾燥防止剤は、スクロースまたはトレハロースなどの糖；アルギニン、グリシン、グルタミン酸またはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどの離液性塩；三価または高級糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどのポリオール；エチレングリコール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；ヒドロキシアルキルデンプン、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）ならびにそれらの組合せを含む。
「界面活性剤」は、液体の表面張力を低下させる湿潤剤を意味する。
「等張性調整剤」は、注射デポ剤における浸透圧差に起因する細胞損傷によってもたらされ得る疼痛を最小限にする化合物を意味する。
「安定剤」は、ポリマープロドラッグを安定化するために用いられる化合物を意味する。安定化は、変性状態の不安定化による、タンパク質安定化力の増強によって、またはタンパク質への賦形剤の直接結合によって達成される。
「吸着防止剤」は、組成物の容器の内表面を被覆するかまたはそれに競合的に吸着するために用いられる、主としてイオン性もしくは非イオン性界面活性剤または他のタンパク質もしくは可溶性ポリマーを意味する。賦形剤の選択される濃度および種類は、避けるべき影響に依存するが、一般的に界面活性剤の単層がＣＭＣ値のすぐ上で界面に形成される。
「酸化保護剤」は、アスコルビン酸、エクトイン、グルタチオン、メチオニン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥなどの抗酸化剤、クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサホスフェート、チオグリコール酸などのキレート化剤を意味する。
「抗菌剤」は、細菌、真菌、酵母、原生動物を殺滅もしくはその増殖を抑制し、および／またはウイルスを壊滅する化学物質を意味する。
「容器を密封すること」は、気密であり、外側と内側の間の気体の交換を起こさせず、内容物を無菌状態に維持するような方法で容器が閉められていることを意味する。
「試薬」または「前駆体」という用語は、本発明のプロドラッグをもたらす製造法に用いられる中間体または出発物質を意味する。
本発明の目的は、式（Ｉ）の薬物リンカーコンジュゲートを含むプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩である。
Ｚ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０ （Ｉ）
式中、Ｙは、式（ＩＩ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩ）
であり、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
またはＹは、式（ＩＩＩ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩＩ）
であり、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＬｅｕおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
または
Ｙは、式（ＩＶ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＶ）
またはその塩もしくは溶媒和物であり；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｒ２０は、ＯＨまたはＮＨ２であり、
Ｌは、以下の式（Ｉａ）のリンカー
（式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹのＮ末端への結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）；Ｎ（Ｒ４）であり、
Ｒ１、Ｒ１ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ４、Ｒ４ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ４またはＲ４ａは、１つの基Ｌ２−Ｌ１−Ｚで置換されており；Ｌ２は、単一化学結合またはＣ１−２０アルキル鎖であり、これは、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されており、Ｒ３ａａおよび Ｒ３ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択される）であり；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており、
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
Ｌ１は、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基によって場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａＲ５ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａおよびＲ５ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ１は、Ｚのヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してＺに結合しており；
Ｚは、単量体二糖単位の０．０５〜２０％が架橋剤により架橋され；単量体二糖単位の０．２〜８．５％がＬ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである。
Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、ＺおよびＹのさらなる実施形態
他の実施形態では、
Ｌは、式（Ｉｂ）のリンカー部分であり、
式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；Ｒ１、Ｒ１ａ、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、上
述のように定義される。
他の実施形態では、
Ｌは、式（Ｉｂ）のリンカー部分であり、式中、
Ｒ１は、ＣＨ３であり；
Ｒ１ａは、Ｈであり；
Ｒ２ａは、Ｈであり；
Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、上述のように定義される。
他の実施形態では、
Ｌは、式（Ｉｂ）のリンカー部分であり、式中、
Ｒ１は、Ｈであり；
Ｒ１ａは、ＣＨ３であり；
Ｒ２ａは、Ｈであり；
Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、上述のように定義される。
他の実施形態では、
Ｌは、式（Ｉｂ）のリンカー部分であり、式中、
Ｒ１は、ＣＨ３であり；
Ｒ１ａは、ＣＨ３であり；
Ｒ２ａは、Ｈであり；
Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、上述のように定義される。
他の実施形態では、
Ｌは、式（Ｉｃ）のリンカー部分−Ｌであり、
式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；
Ｒ１は、ＨまたはＣ１−４アルキルから選択され、好ましくはＨであり；
Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１−４アルキルから選択され、好ましくはＨであり；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、上述のように定義される。
他の実施形態では、
Ｌは、式（Ｉｃ）のリンカー部分−Ｌであり、
式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；
Ｒ１およびＲ１ａは、Ｈであり；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣＨ３からなる群から独立に選択され；
Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、上述のように定義される。
他の実施形態では、
Ｌは、式（Ｉｃ）のリンカー部分−Ｌであり、式中、
Ｒ１およびＲ１ａは、Ｈであり；
Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ２ａは、ＣＨ３であり；
Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、上述のように定義される。
他の実施形態では、
Ｌ２は、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から独立に選択される１つまたは２つの基によって場合により中断されているＣ１−１０アルキル鎖であり、Ｒ３ａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており、
Ｌ２は、点線で示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線で示されている位置に結合し；
他の実施形態では、
Ｌ２は、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から独立に選択される１つの基によって場合により中断されているＣ１−６アルキル鎖であり、Ｒ３ａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており、
Ｌ２は、点線で示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線で示されている位置に結合する。
他の実施形態では、
Ｌ２は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、以下の末端基を介してＬ１に結合しており、
Ｌ２は、点線で示されている硫黄原子に結合し、Ｌ１は、点線で示されている窒素原子に結合する。
他の実施形態では、
Ｌ１は、１つの遠位末端にアミノ基を有し、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から独立に選択される１つまたは２つの基によって場合により中断されているＣ１−１０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択される。
さらなる実施形態は、Ｚが、単量体二糖単位の０．０５〜１５％が架橋剤により架橋されている、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである、プロドラッグに関する。
さらなる実施形態は、Ｚが、単量体二糖単位の１〜１０％が架橋剤により架橋されている、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである、プロドラッグに関する。
さらなる実施形態は、Ｚが、単量体二糖単位の０．２〜８．５％がＬ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである、プロドラッグに関する。
さらなる実施形態は、Ｚが、単量体二糖単位の０．２〜６％がＬ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである、プロドラッグに関する。
さらなる実施形態は、Ｚが、単量体二糖単位の０．２〜５％がＬ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである、プロドラッグに関する。
さらなる実施形態は、Ｚが、単量体二糖単位の０．４〜４％がＬ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである、プロドラッグに関する。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、式（Ｖ）により表される構造を有する。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、式（ＶＩ）により表される構造を有する。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、式（ＶＩＩ）により表される構造を有する。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇを表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒを表し、
Ｘ３は、Ｈｉｓを表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇを表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒを表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇを表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ａｌａを表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、Ｈｉｓを表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇを表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２８は、Ａｌａを表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇを表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ａｌａを表し、
Ｘ３２は、Ｖａｌを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、Ｌｅｕを表し、
Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ａｉｂを表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＨｉｓおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し；
Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ａｉｂを表し、
Ｘ３は、Ｈｉｓを表し、
Ｘ１８は、Ｌｅｕを表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、Ｈｉｓを表し、
Ｘ１８は、ＨｉｓおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、Ｇｌｎを表し、
Ｘ１８は、Ｌｅｕを表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ａｌａを表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＨｉｓおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＨｉｓおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ａｉｂを表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、Ｌｅｕを表し、
Ｘ２０は、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、Ｇｌｕを表し、
Ｘ２８は、Ａｌａを表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＨｉｓおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ａｌａを表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＨｉｓおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のペプチド部分Ｙを有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、ＡｉｂおよびＤ−Ｓｅｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、Ｈｉｓを表し、
Ｘ１８は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＬｅｕおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒを表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、Ｈｉｓを表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基、とりわけＬｅｕを表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒを表し、
Ｘ３は、Ｇｌｎを表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇを表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群
Ｈ２Ｎ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｂａｌ−Ｘ２９−Ｇｌｙ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ３９−Ｒ２０ （ＩＶａ）
（式中、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＡｓｐ）を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏ、（好ましくは）Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＰｒｏ）を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＳｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）を表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ）を表し、
Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す）
またはその塩もしくは溶媒和物に関する。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、ＨｉｓおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３４は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３５は、Ａｌａを表し、
Ｘ３９は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２９は、Ｄ−Ａｌａを表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３２は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３４は、Ｄ−Ａｌａを表し、
Ｘ３５は、ＡｌａおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３１は、Ｈｉｓを表し、
Ｘ３２は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３４は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３５は、ＡｌａおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒを表し、
Ｘ３４は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３５は、Ａｌａを表し、
Ｘ３９は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３２は、Ｈｉｓを表し、
Ｘ３４は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３５は、Ａｌａを表し、
Ｘ３９は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３４は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２９は、Ｄ−Ａｌａを表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３４は、Ｄ−Ａｌａを表し、
Ｘ３５は、ＡｌａおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕからから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ａｌａを表し、
Ｘ３９は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３１は、ＰｒｏおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３４は、Ｇｌｙを表し、
Ｘ３５は、Ｌｙｓを表し、
Ｘ３９は、Ｓｅｒを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、Ａｓｐを表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３２は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ｐｒｏを表し、
Ｘ３９は、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す。
さらなる実施形態は、式（ＩＶａ）のペプチド部分を有するプロドラッグの群に関し、式中、
Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３９は、Ｓｅｒを表す。
一実施形態では、Ｙは、配列番号６０のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
一実施形態では、Ｙは、配列番号４〜６０から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
一実施形態では、Ｙは、配列番号４〜４４から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
一実施形態では、Ｙは、配列番号４〜２２から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
一実施形態では、Ｙは、配列番号２３〜３９から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
一実施形態では、Ｙは、配列番号４０〜４４から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
一実施形態では、Ｙは、配列番号４５〜５９から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
一実施形態では、Ｙは、配列番号１８、２１および２６から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
一実施形態では、Ｙは、配列番号１８、２１、２６、４５、４８、４９および６０から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
他の実施形態は、配列番号６０のペプチドおよび医薬品としてのその使用である。
式（Ｉ）による化合物を含むＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグが１つまたはそれ以上の酸性または塩基性基を含む場合、本発明は、対応する薬学的または毒性学的に許容される塩、とりわけそれらの薬学的に利用可能な塩も含む。したがって、酸性基を含む式（Ｉ）の化合物を含むＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩としてまたはアンモニウム塩として本発明により用いることができる。そのような塩のより詳細な例は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩またはアンモニアもしくは例えば、エチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミンなどの有機アミンもしくはアミノ酸を含む塩を含む。１つまたはそれ以上の塩基性基を含む、すなわち、プロトンを付加することができる式（Ｉ）の化合物を含むＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、無機または有機酸とのそれらの付加塩の形態で存在し得るものであり、本発明により用いることができる。適切な酸の例は、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸および当業者に公知の他の酸を含む。式（Ｉ）の化合物を含むＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグが分子内に酸性および塩基性基を同時に含む場合、本発明は、述べた塩の形態に加えて、分子内塩またはベタイン（両性イオン）も含む。式（Ｉ）を含むＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグによるそれぞれの塩は、当業者に公知の通常の方法により、例えば、これらを溶媒もしくは分散剤中で有機もしくは無機酸もしくは塩基と接触させることにより、または他の塩との陰イオン交換もしくは陽イオン交換により得ることができる。本発明は、低い生理学的適合性のため、医薬品における使用に直接的に適していないが、例えば、化学反応の中間体としてまたは薬学的に許容される塩の調製に用いることができる式（Ｉ）の化合物を含むＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグのすべての塩も含む。
製造の方法
ペプチドＹは、当技術分野で公知の通常の方法により製造することができる。
リンカーＬは、実施例で記載され、国際公開第２００９／０９５４７９号、国際公開第２０１１／０１２７１８号および国際公開第２０１２／０３５１３９号に開示されている方法により製造される。
本発明のヒドロゲル結合ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、構築ブロックである活性化ヒアルロン酸ヒドロゲルＺ−Ｌ１＊および活性化ペプチドリンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙを合成することによって製造することができる。
活性化基Ｌ１＊およびＬ２＊は、ペプチドをポリマーにコンジュゲートするために用いる。スキーム１にペプチドを自己犠牲リンカーによりポリマーにコンジュゲートするために用いることができる種々の種類の結合化学を示す。したがって、チオール−マレイミド化学反応に加えて、他の生体直交性化学反応を用いることができる。スキーム１において、点線は、Ｌ１およびＬ２が結合する位置を示す。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートを官能基化ヒアルロン酸ヒドロゲルに担持した後、すべての残存官能基を適切なブロッキング試薬を用いて場合によりキャップして、望ましくない副反応を防ぐ。
官能基化マレイミド基含有ＨＡ−ヒドロゲルの場合、メルカプトエタノールのようなチオール含有化合物が適切なブロッキング剤である。
スキーム１
本発明の他の態様は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙを含む官能基化中間体である。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙの一実施形態は、以下の式をもたらす、チオール官能基化を含む。
ＨＳ−Ｌ２−Ｌ−Ｙ
（式中、Ｌ２、ＬおよびＹは、上述の意味を有する。）
チオール官能基化ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートＬ２＊
−Ｌ−Ｙの一実施形態は、式（ＶＩＩＩ）のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートである。
チオール官能基化ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙの一実施形態は、式（ＩＸ）のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートである。
チオール官能基化ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙの一実施形態は、式（Ｘ）のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートである。
医薬組成物
本発明の他の態様は、薬学的に許容される賦形剤と共に本発明のプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物である。該医薬組成物を以下のパラグラフでさらに述べる。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルドラッグの組成物は、懸濁液組成物または乾燥組成物として提供することができる。一実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの医薬組成物は、乾燥組成物である。乾燥の適切な方法は、例えば、噴霧乾燥および凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））である。好ましくは、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの医薬組成物は、凍結乾燥により乾燥する。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの医薬組成物は、すぐ使用できる懸濁液である。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの医薬組成物は、プロドラッグが０．５〜８（重量／容積）％の濃度まで水／緩衝液で膨潤している、すぐ使用できる懸濁液である。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの医薬組成物は、プロドラッグが１〜４（重量／容積）％の濃度まで水／緩衝液で膨潤している、すぐ使用できる懸濁液である。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの医薬組成物は、プロドラッグが１．５〜３（重量／容積）％の濃度まで水／緩衝液で膨潤している、すぐ使用できる懸濁液である。
好ましくは、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグは、１回の適用で治療有効量のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを少なくとも３日間供給するのに十分なように組成物に加えられる。より好ましくは、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの１回の適用は、１週間にわたり十分なものである。
本発明によるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの医薬組成物は、１つまたはそれ以上の賦形剤を含む。
非経口組成物に用いる賦形剤は、緩衝剤、等張性調整剤、保存剤、安定剤、吸着防止剤、酸化保護剤、増粘剤／粘性増強剤または他の助剤と分類することができる。場合によっては、これらの成分は、二重または三重機能を有し得る。本発明によるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの組成物は、以下からなる群から選択される１つまたは１つ以上の賦形剤を含む：
（ｉ）緩衝剤：リン酸、重炭酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸および酢酸、硫酸、硝酸、塩化、ピルビン酸ナトリウムなどのｐＨを所望の範囲に維持するための生理学的に耐容される緩衝剤。Ｍｇ（ＯＨ）２またはＺｎＣＯ３などの制酸剤も用いることができる。緩衝能は、ｐＨ安定性に最も感度の高い条件に適合するように調節することができる。
（ｉｉ）等張性調整剤：注射デポ剤における浸透圧差に起因する細胞損傷によってもたらされ得る疼痛を最小限にするため。グリセリンおよび塩化ナトリウムが例である。有効濃度は、血清について２８５〜３１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの推定オスモル濃度を用いて浸透圧測定により決定することができる。
（ｉｉｉ）保存剤および／または抗菌剤：複数回投与非経口製剤は、患者が注射により感染するリスクを最小限にするのに十分な濃度の保存剤の添加および対応する規制要件が確立されていることを必要とする。一般的な保存剤は、ｍ−クレゾール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クロロクレゾールおよび塩化ベンザルコニウムを含む。
（ｉｖ）安定剤：安定化は、タンパク質安定化力の強化により、変性状態の不安定化により、またはタンパク質への賦形剤の直接的結合により、達成される。安定剤は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リシン、プロリンなどのアミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどのポリオール、リン酸カリウム、硫酸ナトリウムなどの塩、ＥＤＴＡ、ヘキサホスフェートなどのキレート化剤、二価金属イオン（亜鉛、カルシウム等）などのリガンド、フェノール誘導体などの他の塩または有機分子であり得る。さらに、シクロデキストリン、デキストラン、デンドリマー、ＰＥＧもしくはＰＶＰまたはＨＳＡなどのオリゴマーもしくはポリマーを用いることができる。
（ｖ）吸着防止剤：組成物のもしくは組成物の容器の内表面を被覆するかまたはそれに競合的に吸着するために、主としてイオン性もしくは非イオン性界面活性剤または他のタンパク質もしくは可溶性ポリマーを用いる。例えば、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８）、ＰＥＧドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ ３５）、ポリソルベート２０および８０、デキストラン、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ−ポリヒスチジン、ＢＳＡおよびＨＳＡならびにゼラチンなどである。賦形剤の選択される濃度および種類は、避けるべき影響に依存するが、一般的に界面活性剤の単層がＣＭＣ値のすぐ上で界面に形成される。
（ｖｉ）凍結乾燥および／または凍結防止剤：凍結乾燥または噴霧乾燥中に、賦形剤は、水素結合の切断および水の除去によってもたらされる不安定化作用を妨ぐことができる。この目的のために、糖およびポリオールを用いることができるが、対応する正の効果は、界面活性剤、アミノ酸、非水性溶媒および他のペプチドについても認められた。トレハロースは、水分によってもたらされる凝集の低減に特に効果的であり、水へのタンパク質疎水性基の曝露により引き起こされる可能性がある熱安定性も改善する。マンニトールおよびスクロースも単独の凍結乾燥／凍結防止剤または互いの組合せとして用いることができ、マンニトール：スクロースのより高い比率のものが凍結乾燥ケーキの物理的安定性を高めることが公知である。マンニトールは、トレハロースとも組み合わせることができる。トレハロースをソルビトールと組み合わせるかまたはソルビトールを単独の防止剤としても用いることができる。デンプンまたはデンプン誘導体も用いることができる。
（ｖｉｉ）酸化保護剤：アスコルビン酸、エクトイン、メチオニン、グルタチオン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥなどの抗酸化剤、クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサホスフェート、チオグリコール酸などのキレート化剤
（ｖｉｉｉ）増粘剤または粘性増強剤：バイアルおよび注射器中の粒子の沈降を遅らせるものであり、粒子の混合および再懸濁を促進し、懸濁液を注射することをより容易にする（すなわち、注射器のプランジャーへの低い力）ために用いられる。適切な増粘剤または粘性増強剤は、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９４０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ Ｕｌｔｒｅｚ１０のようなカルボマー増粘剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース、ＨＰＭＣ）またはジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥまたはＤＥＡＥ−Ｃ）のようなセルロース誘導体、コロイドケイ酸マグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）またはケイ酸ナトリウム、ヒドロキシアパタイトゲル、リン酸三カルシウムゲル、キサンタン、ＳａｔｉａゴムＵＴＣ３０のようなカラゲナン、ポリ（Ｄ，Ｌ−もしくはＬ−乳酸）（ＰＬＡ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）ならびにそれらのコポリマー（ＰＬＧＡ）などの脂肪族ポリヒドロキシ酸、Ｄ，Ｌ−ラクチド、グリコリドおよびカプロラクトンのターポリマー、ポロキサマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロック（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））を構成する親水性ポリオキシエチレンブロックおよび疎水性ポリオキシプロピレンブロック、ポリエチレングリコールテレフタレート／ポリブチレンテレフタレートコポリマーなどの、ポリエーテルエステルコポリマー、スクロースアセテートイソ酪酸（ＳＡＩＢ）、デキストランまたはその誘導体、デキストランおよびＰＥＧの組合せ、ポリジメチルシロキサン、コラーゲン、キトサン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および誘導体、ポリアルキルイミド、ポリ（アクリルアミド−コ−ジアリルジメチルアンモニウム（ＤＡＤＭＡ））、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナンなどのグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）もしくはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）などの疎水性Ａブロックおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリビニルピロリドンなどの親水性ＢブロックからなるＡＢＡトリブロックまたはＡＢブロックコポリマーである。そのようなブロックコポリマーならびに上述のポロキサマーは、逆熱ゲル化挙動を示し得る（投与を促進する室温における液体状態および注射後の体温でのゾル−ゲル転移温度以上でゲル状態）。
（ｉｘ）展着または拡散剤：結合組織の細胞間隙に見いだされるヒアルロン酸、多糖などであるが、これらに限定されない間質腔における細胞外マトリックスの成分の加水分解による結合組織の透過性を変化させる。ヒアルロニダーゼなどであるが、これに限定されない展着剤は、細胞外マトリックスの粘度を一時的に低下させ、注射薬物の拡散を促進する。
（ｘ）他の助剤：湿潤剤、粘度調整剤、抗生物質、ヒアルロニダーゼなど。塩酸および水酸化ナトリウムなどの酸および塩基は、製造中のｐＨの調整に必要な助剤である。
一実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの組成物は、１つまたは１つ以上の増粘剤および／または粘度調整剤を含む。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの組成物は、増粘剤および／または粘度調整剤としてのヒアルロン酸を含む。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの組成物は、５〜３０重量％の濃度の増粘剤および／または粘度調整剤としてのヒアルロン酸を含む。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの組成物は、２００ｋＤａ〜６００万ｋＤａの分子量の増粘剤および／または粘度調整剤としてのヒアルロン酸を含む。
他の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの組成物は、５００ｋＤａ〜３００万ｋＤａの分子量の増粘剤および／または粘度調整剤としてのヒアルロン酸を含む。
「賦形剤」という用語は、好ましくは、治療薬が共に投与される希釈剤、アジュバントまたは媒体を意味する。そのような医薬賦形剤は、無菌の液体であり得る。水は、医薬組成物を経口投与する場合に好ましい賦形剤である。生理食塩水および水性デキストロースは、医薬組成物を静脈内投与する場合に好ましい賦形剤である。生理食塩溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは注射用溶液用の液体賦形剤として用いられる。
適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望の場合、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態をとり得る。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を備えるように適量の賦形剤と一緒に、好ましくは精製された形の治療有効量の治療薬を含む。製剤は、投与方法に適合すべきである。
一般的な実施形態では、本発明の医薬組成物は、乾燥した形態か、または懸濁剤としてか、または他の形態かを問わず、１回または複数投与組成物として提供することができる。
本発明の一実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物は、それが供給される容器が１回分の医薬品の用量を含むことを意味する、１回量として提供される。
したがって、本発明の他の態様では、組成物は、１回量組成物として提供される。
本発明の他の態様では、組成物は、容器に含まれている。
一実施形態では、容器は、デュアルチャンバーシリンジである。特に、本発明による乾燥組成物をデュアルチャンバーシリンジの第１のチャンバーに用意し、復元溶液をデュアルチャンバーシリンジの第２のチャンバーに用意する。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物をそれを必要とする患者に適用する前に、乾燥組成物を復元する。復元は、バイアル、注射器、デュアルチャンバーシリンジ、アンプルおよびカートリッジなどの、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物が用意されている容器中で行うことができる。復元は、所定の量の復元溶液を乾燥組成物に加えることによって行う。復元溶液は、保存剤および／または抗菌剤などの、さらなる添加剤をさらに含み得る、水または緩衝液などの、無菌の液体である。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ組成物が１回量として提供される場合、復元溶液は、１つまたはそれ以上の保存剤および／または抗菌剤を含み得る。好ましくは、復元溶液は、滅菌水である。
本発明のさらなる態様は、復元ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ組成物の投与方法に関する。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ組成物は、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内および腹腔内を含む、注射または注入の方法により投与することができる。
さらなる態様は、治療有効量のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ、および場合により１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形を含む復元組成物を製造する方法であり、ここで、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストは、ヒドロゲルに一時的に結合しており、方法は、
・ 本発明の組成物を復元溶液と接触させる
工程を含む。
他の態様は、治療有効量のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ、および場合により１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む復元組成物であり、ここで、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストは、上記の方法により得られるヒドロゲルに一時的に結合している。
本発明の他の態様は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物を製造する方法である。一実施形態では、そのような懸濁組成物は、
（ｉ）ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグを１つまたはそれ以上の賦形剤と混合すること、
（ｉｉ）１回または複数回量に相当する量を適切な容器中に移すこと、
（ｉｉｉ）組成物を前記容器中で乾燥すること、および
（ｉｖ）容器を密封すること
によって製造される。
適切な容器は、バイアル、注射器、デュアルチャンバーシリンジ、アンプルおよびカートリッジである。
他の態様は、部品のキットである。投与装置が単に皮下注射器である場合、キットは、注射器、針および注射器と共に使用する乾燥ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグ組成物を含む容器ならびに復元溶液を含む第２の容器を含み得る。より好ましい実施形態では、注射装置は、単一皮下注射器以外のものであり、そのため、復元ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグを含む別個の容器は、使用において、容器中の液体組成物が注射装置の出口と流体連結するように注射装置と連結するように適合されている。投与装置の例は、皮下注射器およびペン型注入装置を含むが、これらに限定されない。特に好ましい注射装置は、ペン型注入器であり、この場合、容器は、カートリッジ、好ましくは使い捨てカートリッジである。
好ましい部品のキットは、針および本発明による組成物を含む容器を含み、復元溶液を場合によりさらに含み、容器は、針と共に使用するように適合されている。好ましくは、容器は、デュアルチャンバーシリンジである。
他の態様では、本発明は、ペン型注入装置と共に使用するための上述のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの組成物を含むカートリッジを提供する。カートリッジは、１回または複数回量のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを含み得る。
本発明の一実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグの懸濁組成物は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルプロドラッグおよび１つまたは１つ以上の賦形剤だけでなく、遊離型のまたはプロドラッグとしてのいずれかの、生物学的に活性な他の薬剤も含む。好ましくは、そのような追加の１つまたはそれ以上の生物学的に活性な薬剤は、プロドラッグ、より好ましくはヒドロゲルプロドラッグである。そのような生物学的に活性な薬剤は、以下のクラスの化合物を含むが、それらに限定されない。
注射可能性
好ましくは、製剤は、内径が０．２６ｍｍ（２６ゲージ）より小さな針を介する、より好ましくは内径が０．１８ｍｍ（２８ゲージ）より小さな針を介する、最も好ましくは内径が０．１６ｍｍ（３０ゲージ）より小さな針を介する注射によって投与することができる。
「注射によって投与することができる」、「注射可能」または「注射可能性」という用語は、特定の濃度（重量／容積）および特定の温度の液体で膨潤した本発明による生分解性ＨＡヒドロゲルを含む注射器のプランジャーに加えられる特定の力、そのような注射器の出口に接続された所定の内径の針ならびに針を介して注射器から特定の容積の本発明による生分解性ヒドロゲルを押し出すのに必要な時間のような因子の組合せを意味すると理解される。
注射可能性を備えるために、水で膨潤し、注射器（直径４．７ｍｍのプランジャーを有する）に含まれている本発明による１ｍＬの容積のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、２６ゲージの針を介して２０ニュートンに等しい／未満の力を加えることによって室温で１０秒以内に押し出すことができる。
好ましい注射可能性は、３０ゲージの針を介して２０ニュートンに等しい／未満の力を加えることによって室温で１０秒以内に押し出すことができる、水で膨潤し、注射器（直径４．７ｍｍのプランジャーを有する）に含まれている本発明による１ｍＬの容積のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグである。
驚くべきことに、本発明のＨＡ担体は、ポリマーへのペプチド担持量が多いほど、注射のために低い力が必要であることが見いだされた（図５）。
注射可能性を得るためには、水／緩衝液で少なくとも１．５％（重量／容積）の濃度まで膨潤させ、直径４．７ｍｍのプランジャーを有する注射器に含まれている本発明による１ｍＬの容積のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグを、３０ゲージの針を介して３０ニュートン未満の力を加えることによって室温で１０秒以内に押し出すことができる。
より好ましくは、注射可能性は、３０ゲージの針を介して３０ニュートン未満の力を加えることによって、少なくとも２％（重量／容積）の濃度まで水／緩衝液で膨潤させた本発明によるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグで達成される。
最も好ましくは、注射可能性は、３０ゲージの針を介して２０ニュートン未満の力を加えることによって、少なくとも２％（重量／容積）の濃度まで水／緩衝液で膨潤させた本発明によるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグについて達成される。
プロドラッグの重要な特性は、その適用部位に留まる安定なデポ剤の形成である。ポリマーの分解は、薬物の放出後に始まるべきである。
併用療法
ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対する二重アゴニストである、本発明のプロドラッグは、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１５に記載されているすべての薬物のような、他の薬理学的に活性な化合物と、例えば、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１５の１章に記載されているすべての体重減量薬もしくは食欲抑制薬、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１５の５８章に記載されているすべての脂質低下薬、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１５に記載されているすべての抗高血圧薬および腎臓保護薬、またはＲｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１５の３６章に記載されているすべての利尿薬と広く併用することができる。
有効成分の組合せは、とりわけ作用の相乗的改善のために用いることができる。それらは、患者への有効成分の個別の投与によって、または複数の有効成分が１つの医薬品に存在する組合せ製品の形のいずれかで適用することができる。有効成分を有効成分の個別の投与によって投与する場合、これを同時または連続して行うことができる。
下文で述べる有効成分の大部分は、ＵＳＰ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＵＳＡＮおよびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｎａｍｅｓ、米国薬局方、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ２０１１に開示されている。
そのような組合せに適する他の活性物質は、とりわけ、例えば、言及された適応症の１つに関する１つもしくはそれ以上の活性物質の治療効果を増強し、かつ／または１つもしくはそれ以上の活性物質の用量を減少させるものを含む。
組合せに適する治療薬は、例えば、以下のような抗糖尿病薬を含む：
インスリンおよびインスリン誘導体、例えば：グラルギン／Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、２７０〜３３０Ｕ／ｍＬのインスリングラルギン（欧州特許第２３８７９８９号）、３００Ｕ／ｍＬのインスリングラルギン（欧州特許第２３８７９８９号）、グルリシン／Ａｐｉｄｒａ（登録商標）、デテミル／Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標）、リスプロ／Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）／Ｌｉｐｒｏｌｏｇ（登録商標）、デグルデク／デグルデクプラス、アスパルト、基礎インスリンおよび類似体（例えば、ＬＹ−２６０５５４１、ＬＹ２９６３０１６、ＮＮ１４３６）、ＰＥＧ化インスリンリスプロ、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）、リンジェタ、ＳｕｌｉＸｅｎ（登録商標）、ＮＮ１０４５、インスリンプラスシムリン、ＰＥ０１３９、即効性および短時間作用型インスリン（例えば、リンジェタ、ＰＨ２０、ＮＮ１２１８、ＨｉｎｓＢｅｔ）、（ＡＰＣ−００２）ヒドロゲル、経口、吸入可能、経皮および舌下インスリン（例えば、Ｅｘｕｂｅｒａ（登録商標）、Ｎａｓｕｌｉｎ（登録商標）、アフレッザ、トレゴピル、ＴＰＭ０２、カプスリン、Ｏｒａｌ−ｌｙｎ（登録商標）、Ｃｏｂａｌａｍｉｎ（登録商標）経口インスリン、ＯＲＭＤ−０８０１、ＮＮ１９５３、ＮＮ１９５４、ＮＮ１９５６、ＶＩＡｔａｂ、Ｏｓｈａｄｉ経口インスリン）。さらに二官能性リンカーによりアルブミンまたは他のタンパク質に結合しているインスリン誘導体も含まれる。
ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１受容体アゴニスト、例えば：リキシセナチド／ＡＶＥ００１０／ＺＰ１０／リクスミア、イクセナチド／エキセンディン−４／ビエッタ／ビデュレオン／ＩＴＣＡ６５０／ＡＣ−２９９３、リラグルチド／ビクトザ、セマグルチド、タスポグルチド、シンクリア／アルビグルチド、デュラグルチド、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４、ＣＪＣ−１１３４−ＰＣ、ＰＢ−１０２３、ＴＴＰ−０５４、ラングレナチド／ＨＭ−１１２６０Ｃ、ＣＭ−３、ＧＬＰ−１エリゲン、ＯＲＭＤ−０９０１、ＮＮ−９９２４、ＮＮ−９９２６、ＮＮ−９９２７、ノデキセン、ビアドール−ＧＬＰ−１、ＣＶＸ−０９６、ＺＹＯＧ−１、ＺＹＤ−１、ＧＳＫ−２３７４６９７、ＤＡ−３０９１、ＭＡＲ−７０１、ＭＡＲ７０９、ＺＰ−２９２９、ＺＰ−３０２２、ＴＴ−４０１、ＢＨＭ−０３４．ＭＯＤ−６０３０、ＣＡＭ−２０３６、ＤＡ−１５８６４、ＡＲＩ−２６５１、ＡＲＩ−２２５５、エキセナチド−ＸＴＥＮおよびグルカゴン−
Ｘｔｅｎ。
ＤＰＰ−４阻害薬、例えば：アログリプチン／ネシナ、トラジェンタ／リナグリプチン／ＢＩ−１３５６／オンデロ／トラジェンタ／トラドジェンタ／トラエンタ／トラドゼンタ、サキサグリプチン／オングリザ、シタグリプチン／ジャヌビア／キセレビア／テサベ／ジャヌメット／ベルメチア、ガルブス／ビリダグリプチン、アナグリプチン、ゲミグリプチン、テネリグリプチン、メログリプチン、トレラグリプチン、ＤＡ−１２２９、オマリグリプチン／ＭＫ−３１０２、ＫＭ−２２３、エボグリプチン、ＡＲＩ−２２４３、ＰＢＬ−１４２７、ピノキサシン。
ＳＧＬＴ２阻害薬、例えば：インボカナ／カナグリフロジン、ホルキシガ／ダパグリフロジン、レモグリフロジン、セルグリフロジン、エムパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、ルセオグリフロジン、ＬＸ−４２１１、エルツグリフロジン／ＰＦ−０４９７１７２９、ＲＯ−４９９８４５２、ＥＧＴ−０００１４４２、ＫＧＡ−３２３５／ＤＳＰ−３２３５、ＬＩＫ０６６、ＳＢＭ−ＴＦＣ−０３９、
ビグアニド（例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン）、チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン）、二重ＰＰＡＲアゴニスト（例えば、アレグリタザール、ムラグリタザール、テサグリタザール）、スルホニル尿素（例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリメピリド／アマリル、グリピジド）、メグリチニド（例えば、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド）、アルファ−グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボース、ミグリトール、ボグリボース）、アミリンおよびアミリン類似体（例えば、プラムリンチド、シムリン）。
ＧＰＲ１１９アゴニスト（例えば、ＧＳＫ−２６３Ａ、ＰＳＮ−８２１、ＭＢＸ−２９８２、ＡＰＤ−５９７、ＺＹＧ−１９、ＤＳ−８５００）、ＧＰＲ４０アゴニスト（例えば、ファシグリファム／ＴＡＫ−８７５、ＴＵＧ−４２４、Ｐ−１７３６、ＪＴＴ−８５１、ＧＷ９５０８）。
他の適切な組合せパートナーは、１１−ベータ−ＨＳＤの阻害薬である、シクロセット（例えば、ＬＹ２５２３１９９、ＢＭＳ７７０７６７、ＲＧ−４９２９、ＢＭＳ８１６３３６、ＡＺＤ−８３２９、ＨＳＤ−０１６、ＢＩ−１３５５８５）、グルコキナーゼの活性化剤（例えば、ＴＴＰ−３９９、ＡＭＧ−１５１、ＴＡＫ−３２９、ＧＫＭ−００１）、ＤＧＡＴの阻害薬（例えば、ＬＣＱ−９０８）、タンパク質チロシンホスファターゼ１の阻害薬（例えば、トロダスケミン）、グルコース−６−ホスファターゼの阻害薬、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼの阻害薬、グリコーゲンホスホリラーゼの阻害薬、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの阻害薬、グリコーゲンシンターゼキナーゼの阻害薬、ピルビン酸デヒドロキナーゼの阻害薬、アルファ２−アンタゴニスト、ＣＣＲ−２アンタゴニスト、ＳＧＬＴ−１阻害薬（例えば、ＬＸ−２７６１）である。
例えば、以下のような、１つまたはそれ以上の脂質低下薬も組合せパートナーとして適している：ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ阻害薬（例えば、シンバスタチン、アトルバスタチン）、フィブレート（例えば、ベンザフィブレート、フェノフィブレート）、ニコチン酸およびその誘導体（例えば、ナイアシン）、
ＰＰＡＲ−（アルファ、ガンマまたはアルファ／ガンマ）アゴニストまたは調節薬（例えば、アレグリタザール）、
ＰＰＡＲ−デルタアゴニスト、ＡＣＡＴ阻害薬（例えば、アバシミブ）、コレステロール吸収阻害薬（例えば、エゼチミブ）、胆汁酸結合物質（例えば、コレスチラミン、コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送阻害薬、ＭＴＰ阻害薬またはＰＣＳＫ９の調節薬。
以下のようなＨＤＬ上昇化合物：ＣＥＴＰ阻害薬（例えば、トルセトラピブ、アナセトラピド、ダルセトラピド、エバセトラピド、ＪＴＴ−３０２、ＤＲＬ−１７８２２、ＴＡ−８９９５）またはＡＢＣ１調節薬。
他の適切な組合せパートナーは、例えば、以下のような、肥満の治療用の１つまたはそれ以上の活性物質である：シブトラミン、テソフェンシン、オルリスタット、カンナビノイド−１受容体のアンタゴニスト、ＭＣＨ−１受容体アンタゴニスト、ＭＣ４受容体アゴニスト、ＮＰＹ５またはＮＰＹ２アンタゴニスト（例えば、ベルネペリト）、ベータ−３−アゴニスト、レプチンまたはレプチン模倣薬、５ＨＴ２ｃ受容体のアゴニスト（例えば、ロルカセリン）またはブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、ブプロピオン／フェンタルミンまたはプラムリンチド／メトレレプチンの組合せ。
他の適切な組合せパートナーは、以下の通りである：
ペプチドＹＹ３〜３６（ＰＹＹ３〜３６）またはその類似体などのさらなる消化管ペプチド、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）またはその類似体。
グルカゴン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、ＧＩＰ受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、グレリンアンタゴニストまたは逆アゴニスト、キセニンおよびその類似体。
さらに、例えば、以下のような、高血圧、慢性心不全またはアテローム動脈硬化症に影響を及ぼす薬物との組合せ：アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、テルミサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、ロサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、タソサルタン、アジルサルタン）、ＡＣＥ阻害薬、ＥＣＥ阻害薬、利尿薬、ベータ遮断薬、カルシウムアンタゴニスト、中枢性高血圧、アルファ−２−アドレナリン受容体のアンタゴニスト、中性エンドペプチダーゼの阻害薬、血小板凝集阻害薬およびその他またはそれらの組合せが適している。
使用
他の態様では、本発明は、ＧＬＰ−１およびグルカゴンの受容体に結合することによって、またそれらの活性を調節することによって作用を及ぼすことができる疾患または状態の治療または予防に適する医薬を製造するための、組合せパートナーとして上述した活性物質の少なくとも１つと組み合わせた本発明によるプロドラッグまたはその生理学的に許容される塩の使用に関する。
前記組成物は、例えば、高血糖症の治療および予防のためのならびにあらゆる種類の糖尿病、例えば、インスリン依存性糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、前糖尿病もしくは妊娠性糖尿病の治療および予防のための、代謝症候群および／または肥満および／または摂食障害、インスリン抵抗性症候群の予防および治療、血漿脂質レベルの低下、心臓リスクの低減、食欲の低減、体重の減少等のための、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストおよびＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストアゴニストについて公知の疾患または障害を治療または予防する方法における使用のためのものである。
本発明の化合物は、肝臓脂肪症、好ましくは非アルコール性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療または予防に有用である。
１つまたはそれ以上の活性物質と組み合わせた、本発明によるプロドラッグまたはその生理学的に許容される塩の使用は、同時に、個別にまたは連続的に行うことができる。
他の活性物質と組み合わせた、本発明によるプロドラッグまたはその生理学的に許容される塩の使用は、同時にまたは時間をずらして、特に短時間内に行うことができる。それらを同時に投与する場合、２つの活性物質を一緒に患者に投与し；それらを時間をずらして使用する場合、２つの活性物質を１２時間以下、特に６時間以下の期間内に患者に投与する。
したがって、他の態様では、本発明は、本発明によるプロドラッグまたはそのような化合物の生理学的に許容される塩ならびに組合せパートナーとしての上述の活性物質の少なくとも１つを、場合により１つまたはそれ以上の不活性担体および／または希釈剤と一緒に含む医薬に関する。
本発明による化合物またはその生理学的に許容される塩もしくは溶媒和物、ならびにそれと組み合わせるべき追加の活性物質は、両方が１つの製剤中、例えば、懸濁剤中に一緒に存在しても、または２つの同じもしくは異なる製剤中に個別に、例えば、いわゆる部品のキットとして存在してもよい。
本発明のさらに他の態様は、治療有効量の本発明のプロドラッグまたは本発明の医薬組成物もしくはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む１つ以上の状態の治療を必要とする哺乳類患者、好ましくはヒトにおける治療、コントロール、遅延または予防する方法である。
材料および方法
用いる略語は、次の通りである。
ＡＡ アミノ酸
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡｃＯＥｔ 酢酸エチル
ｃＡＭＰ 環状アデノシン一リン酸
Ｂｎ ベンジル
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＯＰ （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ｔＢｕ 第三級ブチル
ＤＢＵ １，３−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン
ＤＣＣ Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ ジクロロメタン
Ｄｄｅ １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−エチル
ｉｖＤｄｅ １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）３−メチル−ブチル
ＤＩＣ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ ジメチルアミノ−ピリジン
ＤＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ ＤＬジチオトレイトール
ＥＤＣ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＴ エタンジチオール
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ｅｑ 化学量論的等価
ＥｔＯＨ エタノール
ＦＢＳ ウシ胎児血清
Ｆｍｏｃ フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＳＳ ハンクス平衡塩類溶液
ＨＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＥＰＥＳ ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＳｕ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＴＲＦ 均一時間分解蛍光
ＩＢＭＸ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン
ＬＣ／ＭＳ 液体クロマトグラフィー／質量分析
Ｍａｌ ３−マレイミドプロピル
Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ Ｎ−（３−マレイミドプロピル）−２１−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸ＮＨＳエステル
Ｍｅ メチル
ＭｅＯＨ メタノール
Ｍｍｔ ４−メトキシトリチル
ＭＳ 質量スペクトル／質量分析
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＭＷ 分子質量
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
Ｐａｌｍ パルミトイル
ｉＰｒＯＨ ２−プロパノール
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＫ 薬物動態
ＰｙＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｐｈｔｈ フタルイミド
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相高速液体クロマトグラフィー
ｒｐｍ 毎分回転数
ＲＴ 室温
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＣＥＰ トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
ＴＥＳ トリエチルシラン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＭＥＤＡ Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン
Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｔｒｔ トリチル
ＵＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィー
ＵＶ 紫外線
Ｖ 容積
実施例１
ペプチド化合物の一般的合成
材料：
異なるＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；４−［（２，４−ジメトキシフェニル）（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル］フェノキシアセトアミドメチル樹脂、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を０．３〜０．４ｍｍｏｌ／ｇの範囲の担持量でペプチドアミドの合成に用いた。
Ｆｍｏｃ保護天然アミノ酸は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｅｎｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＮａｇａｓｅまたはＢａｃｈｅｍから購入した。以下の標準アミノ酸を、合成を通して用いた：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ。
さらに、以下の特殊なアミノ酸は、上記と同じ供給業者から購入した：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（トルエン溶媒和物として入手できる）およびＢｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｎｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ（Ｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（Ｓ）ＭｅＬｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（Ｒ）ＭｅＬｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（Ｓ）ＭｅＯｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ。
固相ペプチド合成は、標準Ｆｍｏｃ化学およびＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化を用いて、例えば、Ｐｒｅｌｕｄｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）または同様な自動合成装置で実施した。ＤＭＦを溶媒として用いた。脱保護：２０％ピペリジン／ＤＭＦ、２ｘ２．５分間。洗浄：７ｘＤＭＦ。カップリング：ＤＭＦ中２：５：１０ ２００ｍＭ ＡＡ／５００ｍＭ ＨＢＴＵ／２Ｍ ＤＩＰＥＡ、２ｘ２０分間、洗浄：５ｘＤＭＦ。
合成されたすべてのペプチドを８２．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％水、５％チオアニソール、２．５％ＥＤＴからなるＫｉｎｇの切断カクテルを用いて樹脂から切断した。次いで粗ペプチドをジエチルまたはジイソプロピルエーテルで沈殿させ、遠心分離し、凍結乾燥した。ペプチドを分析用ＨＰＬＣにより分析し、ＥＳＩ質量分析により確認した。粗ペプチドを通常の分取ＨＰＬＣ精製法により精製した。
分析用ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ
方法Ａ：２１５ｎｍで検出
カラム： Ａｅｒｉｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ、３．６μｍ、ＸＢ−Ｃ１８（２５０ｘ４．６ｍｍ）、６０℃
溶媒： Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（流量１．５ｍｌ／分）
勾配： ９０：１０（０分）〜９０：１０（３分）〜１０：９０（４３分）〜１０：９０（４８分）〜９０：１０（４９分）〜９０：１０（５０分）
方法Ｂ：２２０ｎｍで検出
カラム： Ｚｏｒｂａｘ、５μｍ、Ｃ１８（２５０ｘ４．６ｍｍ）、２５℃
溶媒： Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ：９０％ＡＣＮ＋１０％Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ（流量１．０ｍｌ／分）
勾配： １００：０（０分）〜９８：２（２分）〜３０：７０（１５分）〜５：９５（２０分）〜０：１００（２５分）〜０：１００（３０分）〜９８：２（３２分）〜９８：２（３５分）
方法Ｃ１：２１０〜２２５ｎｍで検出、場合により質量分析計Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ、エレクトロスプレーポジティブイオンモードと連結
カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ（商標）Ｃ１８ １．７μｍ（１５０ｘ２．１ｍｍ）、５０℃
溶媒： Ｈ２Ｏ＋１％ＦＡ：ＡＣＮ＋１％ＦＡ（流量０．５ｍｌ／分）
勾配： ９５：５（０分）〜９５：５（１．８０分）〜８０：２０（１．８５分）〜８０：２０（３分）〜６０：４０（２３分）〜２５：７５（２３．１分）〜２５：７５（２５分）〜９５：５（２５．１分）〜９５：５（３０分）
方法Ｃ２：２１０〜２２５ｎｍで検出、場合により質量分析計Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ、エレクトロスプレーポジティブイオンモードと連結
カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ（商標）Ｃ１８ １．７μｍ（１５０ｘ２．１ｍｍ）、５０℃
溶媒： Ｈ２Ｏ＋１％ＦＡ：ＡＣＮ＋１％ＦＡ（流量０．６ｍｌ／分）
勾配： ９５：５（０分）〜９５：５（１分）〜６５：３５（２分）〜６５：３５（３分）〜４５：５５（２３分）〜２５：７５（２３．１分）〜２５：７５（２５分）〜９５：５（２５．１分）〜９５：５（３０分）
方法Ｃ３：２１０〜２２５ｎｍで検出、場合により質量分析計Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ、エレクトロスプレーポジティブイオンモードと連結
カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ（商標）Ｃ１８ １．７μｍ（１５０ｘ２．１ｍｍ）、５０℃
溶媒： Ｈ２Ｏ＋１％ＦＡ：ＡＣＮ＋１％ＦＡ（流量１ｍｌ／分）
勾配： ９５：５（０分）〜９５：５（１分）〜６５：３５（２分）〜６５：３５（３分）〜４５：５５（２０分）〜２：９８（２０．１分）〜２：９８（２５分）〜９５：５（２５．１分）〜９５：５（３０分）
方法Ｃ４：２１０〜２２５ｎｍで検出、場合により質量分析計Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ、エレクトロスプレーポジティブイオンモードと連結
カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ（商標）Ｃ１８ １．７μｍ（１５０ｘ２．１ｍｍ）、５０℃
溶媒： Ｈ２Ｏ＋１％ＦＡ：ＡＣＮ＋１％ＦＡ（流量１ｍｌ／分）
勾配： ９５：５（０分）〜９５：５（１．８０分）〜８０：２０（１．８５分）〜８０：２０（３分）〜６０：４０（２３分）〜２：９８（２３．１分）〜２：９８（２５分）〜９５：５（２５．１分）〜９５：５（３０分）
方法Ｄ：２１４ｎｍで検出
カラム： Ｗａｔｅｒｓ Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ２．１ｘ１５０ｍｍ
溶媒： Ｈ２Ｏ＋０．５％ＴＦＡ：ＡＣＮ（流量０．５５ｍｌ／分）
勾配： ９０：１０（０分）〜４０：６０（５分）〜１：９９（１５分）
方法Ｅ：２１０〜２２５ｎｍで検出、場合により質量分析計Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ、エレクトロスプレーポジティブイオンモードと連結
カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ（商標）Ｃ１８ １．７μｍ（１５０ｘ２．１ｍｍ）、５０℃
溶媒： Ｈ２Ｏ＋１％ＦＡ：ＡＣＮ＋１％ＦＡ（流量０．９ｍｌ／分）
勾配： ９５：５（０分）〜９５：５（２分）〜３５：６５（３分）〜６５：３５（２３．５分）〜５：９５（２４分）〜９５：５（２６分）〜９５：５（３０分）
一般的分取ＨＰＬＣ精製法：
粗ペプチドをＡｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＳｙｓｔｅｍまたはＪａｓｃｏ ｓｅｍｉｐｒｅｐ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍのいずれかで精製した。精製する粗ペプチドの量によって、異なるサイズの分取ＲＰ−Ｃ１８−ＨＰＬＣカラムおよび異なる流量を用いた。アセトニトリル＋０．０５〜０．１％ＴＦＡ（Ｂ）および水＋０．０５〜０．１％ＴＦＡ（Ａ）を溶出液として用いた。あるいは、アセトニトリルおよび微量の酢酸を含む水からなる緩衝系を用いた。生成物含有画分を収集し、凍結乾燥して、一般的にＴＦＡまたは酢酸塩としての精製された生成物を得た。
溶解度および安定性−エキセンディン−４誘導体の試験
ペプチドバッチの溶解度および安定性の試験の前に、その含量を測定した。したがって、その純度（ＨＰＬＣ−ＵＶ）およびバッチの塩担持の量（イオンクロマトグラフィー）の２つのパラメーターを検討した。
実施例２
溶解度試験のために、目標濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ純化合物とした。したがって、固体サンプルから、以前に測定した含量に基づいて１．０ｍｇ／ｍＬ化合物の濃度を有する異なる緩衝系中で溶液を調製した。４０００ｒｐｍでの２０分間の遠心分離によって得られた上清について２時間の緩やかな撹拌の後にＨＰＬＣ−ＵＶを実施した。
次いで、純水中２ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチドの保存溶液または可変量のアセトニトリル（化合物のすべてが溶解した光学対照）を用いて得られたＵＶピーク面積との比較によって溶解度を決定した。この分析は、安定性試験の出発点（ｔ０）ともなった。
実施例３
安定性試験のために、溶解度の場合に得られた上清の一定分量を２５℃または４０℃で７日間保存した。その時間経過の後、サンプルを４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を、ＨＰＬＣ−ＵＶを用いて分析した。
残存ペプチドの量の測定のために、ｔ０およびｔ７における標的化合物のピーク面積を比較し、以下の式に従って「残存ペプチド％」を得た。
残存ペプチド％＝［（ペプチドピーク面積 ｔ７）ｘ１００］／ペプチドピーク面積 ｔ０
可溶性分解生成物の量は、ｔ０において観測されたピーク面積の合計により引かれたすべての観測された不純物からのピーク面積の合計の比較（すなわち、新たに形成されたペプチドに関連した種の量を決定するため）から計算した。この値は、以下の式に従って、
ｔ０におけるペプチドの初期の量に対するパーセントで示した。
可溶性分解生成物％＝｛［（不純物のピーク面積の合計 ｔ７）−（不純物のピーク面積の合計 ｔ０）］ｘ１００｝／ペプチドピーク面積 ｔ０
１００％と「残存ペプチド％」および「可溶性分解生成物％」の合計との可能な差は、以下の式に従って、ストレス条件で可溶性の状態に留まっていなかったペプチドの量を反映している。
沈殿物％＝１００−（［残存ペプチド％］＋［可溶性分解生成物％］）
この沈殿物は、遠心分離によって分析から除外された、不溶性分解生成物、ポリマーおよび／またはフィブリルを含む。
化学的安定性は、「残存ペプチド％」として表される。
アニオンクロマトグラフィー
機器：Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣＳ−２０００、プレ／カラム：Ｉｏｎ Ｐａｃ ＡＧ−１８
２ｘ５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ）／ＡＳ１８ ２ｘ２５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ）、溶出液：水性水酸化ナトリウム、流量：０．３８ｍＬ／分、勾配：０〜６分：２２ｍＭ ＫＯＨ、６〜１２分：２２〜２８ｍＭ ＫＯＨ、１２〜１５分：２８〜５０ｍＭ ＫＯＨ、１５〜２０分：２２ｍＭ ＫＯＨ、サプレッサー：ＡＳＲＳ ３００ ２ｍｍ、検出：伝導度
ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ法と同様に、方法ＤまたはＥを用いた。
実施例４
ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に関するｉｎ ｖｉｔｒｏデータ
ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体におけるペプチド化合物の効力は、実施例２７で述べるように、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧｌｕｃａｇｏｎ Ｒ）またはヒトＧＬＰ−１受容体（ｈＧＬＰ−１ Ｒ）を発現する細胞を列挙した漸増濃度の化合物に曝露し、形成されたｃＡＭＰを測定することによって決定した。結果を以下の表２に示す。
リンカーの合成
実施例５
リンカー試薬５ｃの合成
リンカー試薬５ｃは、以下のスキームに従って合成した。
リンカー試薬中間体５ａの合成：
塩化ｍ−メトキシトリチル（３ｇ、９．７１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中エチレンジアミン（６．５ｍＬ、９７．１ｍｍｏｌ）の溶液に１滴ずつ加えた。２時間後に溶液をジエチルエーテル（３００ｍＬ）中に注加し、３０／１（容積／容積）ブライン／０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液（各５０ｍｌ）で３回、ブライン（５０ｍｌ）で１回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去した。Ｍｍｔ保護中間体（３．１８ｇ、９．５６ｍｍｏｌ）をさらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
Ｍｍｔ保護中間体（３．１８ｇ、９．５６ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解した。６−（Ｓ−トリチルメルカプト）ヘキサン酸（４．４８ｇ、１１．４７ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（５．６７ｇ、１１．４７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５．０ｍＬ、２８．６８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。溶液をジエチルエーテル（２５０ｍＬ）で希釈し、３０／１（容積／容積）ブライン／０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液（各５０ｍｌ）で３回、ブライン（５０ｍｌ）で１回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去した。５ａをフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
収量：５．６９ｇ（８．０９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ７０５．４＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝７０５．０）
リンカー試薬中間体５ｂの合成：
無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中５ａ（３．１９ｇ、４．５３ｍｍｏｌ）の溶液にＢＨ３・ＴＨＦ（１Ｍ溶液、８．５ｍＬ、８．５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で１６時間撹拌した。さらなるＢＨ３・ＴＨＦ（１Ｍ溶液、１４ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。メタノール（８．５ｍＬ）の添加により反応を停止させた。Ｎ，Ｎ−ジメチル−エチレンジアミン（３ｍＬ、２７．２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を加熱還流し、３時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、次いで酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液（２ｘ１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去して、粗アミン中間体（３．２２ｇ）を得た。
アミン中間体（３．２２ｇ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した。Ｂｏｃ２Ｏ（２．９７ｇ、１３．６９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３．９５ｍＬ、２２．６５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、粗ＢｏｃおよびＭｍｔ保護中間体（３．００ｇ）を得た。
ＭＳ：ｍ／ｚ７９１．４＝［Ｍ＋Ｈ］＋、５１９．３＝［Ｍ−Ｍｍｔ＋Ｈ］＋（計
算ＭＷ＝７９１．１）
０．４Ｍ水性ＨＣｌ（４８ｍＬ）をアセトニトリル（４５ｍＬ）中ＢｏｃおよびＭｍｔ保護中間体の溶液に加えた。混合物をアセトニトリル（１０ｍＬ）で希釈し、室温で１時間攪拌した。その後、５Ｍ ＮａＯＨ溶液の添加により反応混合物のｐＨ値を５．５に調整した。アセトニトリルを減圧下で除去し、水溶液をＤＣＭ（４ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去した。粗５ｂをさらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
収量：２．５２ｇ（３．１９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ５１９．３＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝５１９．８ｇ／ｍｏｌ）
リンカー試薬５ｃの合成：
中間体５ｂ（９８５ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（３３０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ)を無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（０．６５３ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。溶液を酢酸（１ｍＬ）の添加により酸性化した。５ｃをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量：７７６ｍｇ、（１．１３ｍｍｏｌ）
ＭＳ ｍ／ｚ７０６．３＝［Ｍ＋Ｎａ］＋（計算ＭＷ＝７０６．３）
ペプチドリンカー試薬の合成
ａ）ペプチド合成
固相ペプチド合成を標準Ｆｍｏｃ化学およびＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化を用いて例えば、Ｐｒｅｌｕｄｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）または同様な自動合成装置で実施した。ＤＭＦを溶媒として用いた。脱保護：２０％ピペリジン／ＤＭＦ、２ｘ２．５分間。洗浄：７ｘＤＭＦ。カップリング：ＤＭＦ中２：５：１０ ２００ｍＭ ＡＡ／５００ｍＭ ＨＢＴＵ／２Ｍ ＤＩＰＥＡ、２ｘ２０分間、洗浄：５ｘＤＭＦ
ｂ）Ｄ−Ａｌａを用いたＮ末端の伸長
Ｎ末端に遊離アミノ基を有する工程ａで述べたように合成した０．９ｍｍｏｌ樹脂結合ペプチド（４ｇ樹脂に相当する）を５等分に分割した。各部分をＤＭＦ １５ｍｌに懸濁し、その後、２．５ｅｑ．のＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、２．５ｅｑ．のＨＡＴＵ、２．５ｅｑ．のＨＯＡｔおよび２．５ｅｑ．のＤＩＰＥＡを加えた。混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。次いで反応混合物を濾過により除去し、樹脂をＤＭＦ １８ｍｌ、ＤＣＭ １８ｍｌ、イソプロパノール１８ｍｌ、ジエチルエーテル１８ｍｌで３回洗浄した。残存溶媒を真空中で除去した。
ｃ）Ｆｍｏｃ脱保護、リンカーの結合および切断
Ｎ末端に遊離アミノ基を有する工程ｂで述べたように合成した０．３７ｍｍｏｌ樹脂結合ペプチド（１．６ｇ樹脂に相当する）を２等分に分割した。各部分をＤＭＦ中ピペリジンの１２ｍｌの２０％溶液に懸濁し、５分間撹拌した。溶媒を除去し、この手順を２回繰り返した。
樹脂結合ペプチドをＤＭＦ １２ｍｌで５回洗浄した。
次いで樹脂をＤＭＦ １０ｍｌおよび２．５ｅｑ．のｔｅｒｔ−ブチル（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アミノ）エチル）（６−（トリチルチオ）ヘキシル）カルバメート５ｃに懸濁し、２．５ｅｑ．のＤＩＰＥＡを加えた。混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。次いで反応混合物を濾過により除去し、樹脂をＤＭＦ １５ｍｌ、ＤＣＭ １５ｍｌ、イソプロパノール１５ｍｌ、ジエチルエーテル１５ｍｌで３回洗浄した。
残存溶媒を真空中で除去した。反応は、Ｋａｉｓｅｒｔｅｓｔによって完結したかどうか試験した。
次いで、ＴＦＡ／ＤＴＴ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／チオアニソール／Ｂｕ４ＮＢｒ（１００／３／２／３／１／０．０５）の混合物を加え、混合物を３．５時間撹拌した。混合物を濾過し、樹脂をＴＦＡ １ｍｌで洗浄した。合わせた濾液を冷却ジエチルエーテル１００ｍｌに加えた。沈殿物を遠心分離により単離し、ジエチルエーテル１００ｍｌで２回洗浄した。
粗生成物をアセトニトリル／水勾配（両方が０．１％ＴＦＡで緩衝された）を用いてＷａｔｅｒｓカラム（ＸＢｒｉｄｇｅ、ＢＥＨ１３０、Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μＭ）上分取ＨＰＬＣにより精製した。精製中間体を直ちに凍結乾燥し、Ａｒ雰囲気中で保存するかまたは次の工程に直接用いた。
実施例６
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストリンカー試薬６ｄ（Ａｌａリンカー）の合成
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストリンカー試薬６ｄは、以下のスキームに従って合成した。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストリンカー試薬中間体６ａの合成：
樹脂上遊離Ｎ末端を有する完全側鎖保護ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト（２．００ｇ、０．２ｍｍｏｌ、約０．１ｍｍｏｌ／ｇを担持）を、フィルターフリットを取り付けた２０ｍＬ注射器中に移した。無水ＤＭＦ ８ｍＬを注射器内に引き込み、樹脂をあらかじめ膨潤させるために注射器を１５分間振盪した（６００ｒｐｍ）。溶媒を捨て、無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中Ｆｍｏｃ−Ｄ−アラニン−ＯＨ（１８７ｍｇ、０．６ｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（３１２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１７４μＬ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を注射器内に引き込んだ。注射器を室温で６００ｒｐｍで６０分間振盪した。溶液を捨て、樹脂をＤＭＦで１０回洗浄した。
Ｆｍｏｃ脱保護は、上述のように実施した。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストリンカー試薬中間体６ｂの合成：
無水ＤＭＦ（３ｍＬ）中５ｃ（１３７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の溶液を、樹脂６ａ（０．２ｍｍｏｌ）に加え、続いて無水ＤＭＦ（４．５ｍＬ）中ＤＩＰＥＡ（８０μＬ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応混合物を２２℃で１５時間振盪した（６００ｒｐｍ）。樹脂をＤＭＦで１０回、ＤＣＭで１０回洗浄し、真空中で乾燥した。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストリンカー試薬中間体６ｃの合成：
３−ニトロ−２−ピリジン−スルフェニルクロリド（４８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を６ｂ（０．０５ｍｍｏｌ、０．５ｇ）を含む注射器に入れた。無水ＤＣＭ（４ｍＬ）を注射器内に引き込み、混合物を室温で振盪した（６００ｒｐｍ）。２時間後に溶液を捨て、樹脂をＤＣＭで１４回洗浄し、真空中で乾燥した。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストリンカー試薬中間体６ｄの合成：
丸底フラスコ中でｏ−クレゾール（１．５ｍＬ）、チオアニソール（１．５ｍＬ）、ＤＴＴ（１．１２５ｇ）、ＴＥＳ（１．１２５ｍＬ）および水（１．５ｍＬ）をＴＦＡ（３７．５ｍＬ）に溶解した。均一な懸濁液を得るために、６ｃ（０．１５ｍｍｏｌ、１．５ｇ）を撹拌（２５０〜３５０ｒｐｍ）溶液に室温で加えた。撹拌を４５分間続けた。溶液を濾過により樹脂ビーズから分離し、ビーズをＴＦＡで２回（それぞれ２ｍＬ）洗浄し、洗浄溶液を濾液と合わせた。ＴＦＡを窒素の気流中で合わせた溶液から除去した。
ジエチルエーテル（３０ｍＬ）の添加および激しい振盪によって粗６ｄを濃縮溶液（約１０ｍＬ）から沈殿させた。遠心分離（２分、５０００ｒｐｍ）の後、上清を捨て、沈殿物をジエチルエーテルで２回（それぞれ２０ｍＬ）洗浄した。
乾燥沈殿物を、０．０１％ＴＦＡ（容積／容積）を含む１／１９（容積／容積）アセトニトリル／水中ＴＣＥＰ（１１４ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）３０ｍｌの溶液に溶解した。混合物を室温で１５時間インキュベートした。１５０ｘ３０ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）ＢＥＨ３００ Ｃ１８ １０μｍカラムおよび４０ｍｌ／分の流量を用いて材料および方法の項で述べたように、６ｄをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
最大１２ｍＬの混合物をカラムに加えた。溶出は、５％〜３０％溶媒Ｂ（５分）の直線勾配とそれに続く３０％〜３５％溶媒Ｂ（４０分）の直線勾配を用いて行った。生成物６ｄを含む画分をプールし、凍結乾燥した。純度：８６％（２１５ｎｍ）
収量：８５．２ｍｇ（１９．２μｍｏｌ、２．００ｇ樹脂から出発）
ＭＳ ｍ／ｚ１４８６．７＝［Ｍ＋３Ｈ］３＋、（計算ＭＷ＝４４６０．０ｇ／ｍｏｌ）
実施例７
（Ａｓｎリンカー）
リンカー試薬７ｆの合成
リンカー試薬７ｆは、以下のスキームに従って合成した。
ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）および酢酸（０．５ｍＬ）中Ｎ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−エチレンジアミン（０．５ｍＬ、２．７９ｍｍｏｌ）およびＮａＣＮＢＨ３（１４０ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液にＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中２，４，６−トリメトキシベンズアルデヒド（０．５４７ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、２Ｍ ＨＣｌ（１ｍＬ）で酸性化し、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍＬ）で中和した。すべての揮発性物質の蒸発、得られた水性スラリーのＤＣＭ抽出および有機画分の濃縮により、Ｎ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−Ｎ’−ｔｍｏｂ−エチレンジアミン（７ａ）が粗油として得られ、これをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量：５９３ｍｇ（１．５２ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ３７７．３５＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝３７７．１４）
Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２２５ｍｇ、０．５２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、７ａ（３００ｍｇ、０．８４７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２０１ｍｇ、０．５２９ｍｍｏｌ）およびコリジン（０．４８ｍＬ、３．７０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、７ｂを得た。ｆｍｏｃ脱保護のためにピペリジン（０．２２ｍＬ、２．１６ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を１時間続けた。酢酸（１ｍＬ）を加え、７ｃをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量：２８５ｍｇ（ＴＦＡ塩として０．４３６ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ５６２．５４＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝５６２．６７）
６−トリチルメルカプトヘキサン酸（０．８４７ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（７ｍＬ）に溶解した。ＨＡＴＵ（０．８２５ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）およびコリジン（０．８ｍＬ、６．１ｍｍｏｌ）ならびに７ｃ（０．７８ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０分間撹拌し、ＡｃＯＨ（１ｍＬ）で酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ３で中和し、濃縮した。残存水相をＤＣＭで抽出し、溶媒の蒸発により７ｄを単離した。
収量：１．４ｇ（９４％）
ＭＳ：ｍ／ｚ９３４．７＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝９３４．５）
ＭｅＯＨ（１２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２ｍＬ）中７ｄ（１．４０ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）の溶液にＬｉＯＨ（２５０ｍｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で１４時間撹拌した。混合物をＡｃＯＨ（０．８ｍＬ）で酸性化し、７ｅをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ３で中和し、濃縮した。水相をＤＣＭで抽出し、溶媒の蒸発により７ｅを単離した。
収量：７８０ｍｇ（６０％）
ＭＳ：ｍ／ｚ８７８．８＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝８７８．４０）
無水ＤＣＭ（４ｍＬ）中７ｅ（１７０ｍｇ、０．１９８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＣ（１２３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１１４ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液をＡｃＯＨ ０．５ｍＬで酸性化し、７ｆをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ３で中和し、濃縮した。残存水相をＤＣＭで抽出し、溶媒の蒸発により７ｆを単離した。
収量：１５４ｍｇ（０．１６１ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ９５３．４＝［Ｍ＋Ｈ］＋、（計算＝９５３．４３）
あるいは、リンカー試薬７ｆは、以下の手順に従って合成した。
代替反応スキーム：
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中Ｎ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−エチレンジアミン（２ｇ、１１．４８ｍｍｏｌ）およびＮａＣＮＢＨ３（８１９ｍｇ、１２．６３ｍｍｏｌ）の溶液に２，４，６−トリメトキシベンズアルデヒド（２．０８ｍｇ、１０．６１ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で９０分間撹拌し、３Ｍ ＨＣｌ（４ｍＬ）で酸性化し、さらに１５分間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２００ｍＬ）に加え、ＣＨ２Ｃｌ２で５回抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を真空中で蒸発させた。得られたＮ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−Ｎ’−ｔｍｏｂ−エチレンジアミン（７ａ）を高真空中で完全に乾燥し、さらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
収量：３．７６ｇ（１１．４８ｍｍｏｌ、純度８９％、７ａ：二重Ｔｍｏｂ保護生成物＝８：１）
ＭＳ：ｍ／ｚ３５５．２２＝［Ｍ＋Ｈ］＋、（計算＝３５４．２１）
ＣＨ２Ｃｌ２（２４ｍｌ）中７ａ（２ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）の溶液にＣＯＭＵ（４．８４ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−ＯＨ（２．０８ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）およびコリジン（２．６５ｍＬ、２０．３４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）で希釈し、０．１Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１００ｍｌ）で３回、ブライン（１００ｍｌ）で３回洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、残留物を２４ｍＬの容積に濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて７ｇを精製した。
収量：５．３１ｇ（１４８％、６．６６ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ７９６．３８＝［Ｍ＋Ｈ］＋、（計算＝７９５．３７）
ＴＨＦ（６０ｍＬ）中７ｇ［５．３１ｇ、最大４．５１ｍｍｏｌ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−ＯＨを参照］の溶液にＤＢＵ（１．８ｍＬ、３％容積／容積）を加えた。溶液を室温で１２分間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍｌ）で希釈し、０．１Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１５０ｍｌ）で３回、ブライン（１５０ｍｌ）で３回洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒の蒸発により７ｈを単離し、
さらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ５７４．３１＝［Ｍ＋Ｈ］＋、（計算＝５７３．３０）
７ｈ（５．３１ｇ、４．５１ｍｍｏｌ、粗精製）をアセトニトリル（２６ｍＬ）に溶解し、ＣＯＭＵ（３．８７ｇ、９．０４ｍｍｏｌ）、６−トリチルメルカプトヘキサン酸（２．１２ｇ、５．４２ｍｍｏｌ）およびコリジン（２．３５ｍＬ、１８．０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍｌ）で希釈し、０．１Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１００ｍｌ）で３回、ブライン（１００ｍｌ）で３回洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒の蒸発により７ｉを単離した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて生成物７ｉを精製した。
収量：２．６３ｇ（６２％、純度９４％）
ＭＳ：ｍ／ｚ８５６．４１＝［Ｍ＋Ｈ］＋、（計算＝８５５．４１）
ｉ−ＰｒＯＨ（３３ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１１ｍＬ）中７ｉ（２．６３ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）の溶液にＬｉＯＨ（２６７ｍｇ、１１．１２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で７０分間撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）で希釈し、０．１Ｍ Ｈ２ＳＯ４（５０ｍｌ）で３回、ブライン（５０ｍｌ）で３回洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、溶媒の蒸発により７ｅを単離した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて７ｊを精製した。収量：２．１ｇ（８８％）
ＭＳ：ｍ／ｚ８７８．４＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝８７８．４０）
無水ＤＣＭ（４ｍＬ）中７ｅ（１７０ｍｇ、０．１９８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＣ（１２３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰを加えた。５分後にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１１４ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、溶媒を真空中で除去し、残留物を９０％アセトニトリル＋０．１％ ＴＦＡ（３．４ｍｌ）に溶解した。粗混合物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を０．５Ｍ ｐＨ７．４リン酸緩衝液で中和し、濃縮した。残存水相をＤＣＭで抽出し、溶媒の蒸発により７ｆを単離した。
収量：１５４ｍｇ（８１％）
ＭＳ：ｍ／ｚ９５３．４＝［Ｍ＋Ｈ］＋、（計算＝９５３．４３）
実施例８
リンカー試薬８ｅの合成
リンカー試薬８ｅは、以下のスキームに従って合成した。
リンカー試薬中間体８ｂの合成は、窒素雰囲気下で実施した。ＴＨＦ ３０ｍＬ（乾燥、ｍｏｌ．ｓｉｅｖｅ）中アミン８ａ（１．６９ｇ、４．５ｍｍｏｌ、調製については国際公開第２００９／１３３１３７号を参照）の溶液を０℃に冷却した。ＴＨＦ ３ｍＬ（乾燥、ｍｏｌ．ｓｉｅｖｅ）中クロロギ酸ブチル（６３０μｌ、４．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９８０μｌ、５．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で１０分間撹拌し、冷却を除去し、混合物を室温でさらに２０分間撹拌した。ＴＨＦ中１Ｍ ＬｉＡｌＨ４（９ｍＬ、９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１．５時間還流した。メタノール（１１ｍＬ）および１００ｍＬの飽和酒石酸Ｎａ／Ｋ溶液を徐々に加えることによって反応を停止させた。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発した。粗生成物８ｂ（１．９７ｇ）をさらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ３９０．２＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝３８９．６）
アセトニトリル１２０ｍＬ中粗生成物８ｂ（１．９７ｇ）、Ｎ−（ブロモエチル）−フタルイミド（１．４３ｇ、５．６３ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１．２４ｇ、９．０ｍｍｏｌ）の溶液を６時間還流した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液６０ｍＬを加え、混合物を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。ヘプタン（０．０２％ＮＥｔ３を含む）および漸増量の酢酸エチル（０．０２％ＮＥｔ３を含む）を溶出液として用いることによってフタルイミド８ｃをシリカ上で精製した。
収量：０．８２ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ５６３．３＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝５６２．８）
フタルイミド８ｃ（８１９ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をエタノール３５ｍＬに溶解し、ヒドラジン水和物（１７６μｌ、３．６４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３時間還流した。沈殿物を濾別した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン１５ｍＬで処理した。沈殿物を濾別し、ジクロロメタンを減圧下で除去した。残留物をＲＰ ＨＰＬＣにより精製した。プールしたＨＰＬＣ画分をＮａＨＣＯ３の添加によりｐＨ７に調整し、ジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去して、アミン８ｄを得た。
収量：５７９ｍｇ（１．３４ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ４３３．３＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝４３２．７）
クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（４８３ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍＬ（乾燥、ｍｏｌ．ｓｉｅｖｅ）に溶解した。ジクロロメタン５ｍＬ（乾燥、ｍｏｌ．ｓｉｅｖｅ）中アミン８ｄ（１．００ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の溶液およびｓｙｍ−コリジン１．８ｍＬを加え、混合物を室温で４０分間撹拌した。ジクロロメタンを減圧下で除去し、残留物を酢酸で酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、ｐ−ニトロフェニルカルバメート８ｅを得た。
収量：３３９ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ５９８．３＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝５９７．８）
ペプチド−リンカー−ポリマーコンジュゲートの合成
実施例９
ＧＬＰ／グルカゴンアゴニストチオールリンカー１の合成は、以下のスキームに従って合成した。
ペプチド合成容器中のリンク樹脂上、樹脂結合Ｆｍｏｃ保護エキセンディン−４配列番号２６ ４００ｍｇにＤＭＦ中２０％ピペリジン４ｍＬを加え、反応混合物を５分間撹拌した。このプロセスを３回繰り返した。樹脂結合ペプチドをその後ＤＭＦ４ｍｌで３回洗浄した。
リンカー１ａ ８０ｍｇ（２．５ｅｑｖ．）およびＰｙＢＯＰ ６０ｍｇ（３．０ｅｑｖ．）に無水ＤＭＦ ５ｍＬを加えた。この溶液にジイソプロピルジエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）１６μｌ（３．０ｅｑｖ．）を加えた。得られた溶液を上記で処理した樹脂結合エキセンディン−４配列番号３１２６−樹脂に加えた。混合物を２５℃で１８時間処理した。この時間の終了時に、樹脂を濾過し、無水ＤＭＦ（５ｍｌｘ５）、ジクロロメタン（５ｍｌｘ５）、イソプロパノール（５ｍｌｘ５）およびジエチルエーテル（５ｍｌｘ５）で洗浄した。
上記の樹脂結合ペプチド−リンカーコンジュゲートを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリエチルシラン（ＴＥＳ）／ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／チオアニソール／水（１００／２／３／１／２）を含む溶液１０ｍｌで処理した。反応混合物を２５℃で３時間振盪した。反応の終了時に、溶媒を濾別し、樹脂をジクロロメタン（５ｘ１０ｍｌ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮した。残留物を氷冷エーテル５０ｍｌ中に注加した。白色固体が析出した。混合物を遠心分離し、デカントした。固体をジエチルエーテル（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄した。ペプチドリンカーを逆相ＨＰＬＣ（３０ｘ１００ｍｍ Ｃ１８カラム、２０分で２５〜４０％ＡｃＣＮ／０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ）により精製した。適切な画分を収集し、蒸発乾固して、所望の生成物１６ｍｇを白色固体として得た。生成物を質量分析により同定した（分子イオンピーク、ｍ／ｚ１４６９、ｚ＝３）。
実施例１０
ＧＬＰ／グルカゴンチオールリンカー２は、以下のスキームに従って合成した。
ペプチド合成容器中のリンク樹脂上、樹脂結合Ｆｍｏｃ保護エキセンディン−４配列番号２６ １．８ｇにＤＭＦ中２０％ピペリジン２０ｍＬを加え、反応混合物を５分間撹拌した。このプロセスを３回繰り返した。樹脂結合ペプチドをその後ＤＭＦ ２０ｍｌで３回洗浄した。
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ １６３ｍｇ（２．５ｅｑｖ．）、ＨＡＴＵ １９９ｍｇ（２．５ｅｑｖ．）およびＨＯＡｔ ７１ｍｇ（２．５ｅｑｖ．）に無水ＤＭＦ １５ｍｌを加えた。この溶液にジイソプロピルジエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）９２μｌ（２．５ｅｑｖ．）を加えた。得られた溶液を上記で処理した樹脂結合エキセンディン−４配列番号２６−樹脂に加えた。混合物を２５℃で１６時間処理した。この時間の終了時に、樹脂を濾過し、無水ＤＭＦ（２０ｍｌｘ５）、ジクロロメタン（２０ｍｌｘ５）、イソプロパノール（２０ｍｌｘ５）およびジエチルエーテル（２０ｍｌｘ５）で洗浄した。
ペプチド合成容器中のリンク樹脂上の上記樹脂結合Ｆｍｏｃ保護Ｄ−Ａｌａ−エキセンディン−４配列番号２６にＤＭＦ中２０％ピペリジン１５ｍｌを加え、反応混合物を５分間撹拌した。このプロセスを３回繰り返した。樹脂結合ペプチドをその後ＤＭＦ１５ｍｌで３回洗浄した。
リンカー２ａ ３５２ｍｇ（２．５ｅｑｖ．）に無水ＤＭＦ１５ｍＬを加えた。この溶液にジイソプロピルジエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）９２μｌ（２．５ｅｑｖ．）を加えた。得られた溶液を上記で処理した樹脂結合Ｄ−Ａｌａ−エキセンディン−４配列番号２６−樹脂に加えた。混合物を２５℃で１６時間処理した。この時間の終了時に、樹脂を濾過し、無水ＤＭＦ（１５ｍｌｘ５）、ジクロロメタン（１５ｍｌｘ５）、イソプロパノール（１５ｍｌｘ５）およびジエチルエーテル（１５ｍｌｘ５）で洗浄した。
上記の樹脂結合ペプチド−リンカーコンジュゲートを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリエチルシラン（ＴＥＳ）／ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／チオアニソール／水（１００／２／３／１／２）を含む溶液４０ｍｌで処理した。反応混合物を２５℃で１時間振盪した。反応の終了時に、溶媒を濾過した。濾液を氷冷エーテル４００ｍｌ中に注加した。白色固体が析出した。混合物を遠心分離し、デカントした。固体をジエチルエーテル（２ｘ２００ｍｌ）で洗浄した。ペプチドリンカーを逆相ＨＰＬＣ（３０ｘ１００ｍｍ Ｃ１８カラム、２０分で２５〜４０％ＡｃＣＮ／０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ）により精製した。適切な画分を収集し、蒸発乾固して、所望の生成物１０４ｍｇを白色固体として得た。生成物を質量分析により同定した（分子イオンピーク、ｍ／ｚ１４６５．３、ｚ＝３およびｍ／ｚ１０９９．２、ｚ＝４）。
ヒアルロン酸ヒドロゲルの合成
実施例１１
ジビニルスルホン架橋ヒアルロン酸は、以下のスキームに従って合成した。
実施例１１ａ
０．２Ｍ水酸化ナトリウム（１６８．９ｇ）に溶解するまで撹拌しながら塩化ナトリウム（２３．４ｇ）を加えた。２時間続けた迅速な機械的撹拌下の溶液にヒアルロン酸ナトリウム（２５．４ｇ、４００〜５００ｋＤａ）を加えた。得られたポリマー溶液は、約１２重量／重量％の濃度を有する。イソプロパノール（１．６ｍＬ）中ジビニルスルホン（０．４１ｍＬ、０．４８ｇ）の溶液を調製し、約３０秒にわたって加えた（５ｘ０．４ｍＬ）。混合物をさらに２分間撹拌し、２３ｘ２８ｘ６．５ｃｍガラストレー中に注加し、プラスチックカバーで密封した。室温で４時間放置した後、ゲルを一片として０．９％食塩水（３ｋｇ）中１Ｍ塩酸（１００．１ｇ）の溶液に移した。それを室温で緩やかに撹拌した。２４時間後に溶液のｐＨは、２．２８であった。溶液を捨て、ゲル（４１６．２ｇ）を残した。次いでゲルに０．９％食塩水（３ｋｇ）を加え、それを室温で１８時間緩やかに撹拌した。混合物に０、２、４、６および８時間目に１Ｍ水酸化ナトリウム（９．７ｍＬ）を加えた。ゲルを室温でさらに２４時間緩やかに撹拌し、ゲルのその時点のｐＨは、６．６５であった。ゲルを２〜８℃で１２０時間保存し、次いで１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液ｐＨ７．４（２Ｌ）を加えた。ゲルをさらに２１時間撹拌し、洗浄液を捨てて、２．４％の最終ポリマー濃度を有するゲル（１０３６．２ｇ）を残した。
実施例１１ｂ
ジビニルスルホン架橋ヒアルロン酸の代替合成
ヒアルロン酸ナトリウム３５ｇに滅菌水９４６ｍＬを加えた。反応混合物を２〜８℃に７日間保持し、その間に透明溶液が形成された。この溶液に１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液１１１ｍＬを加え、得られた反応混合物を５分間激しく撹拌した。反応混合物を２〜８℃に９０分間保持した。その後、滅菌水１０ｍＬ中ジビニルスルホン６．７ｍＬの懸濁液をポリマー溶液に加え、得られた反応混合物を５分間激しく撹拌した。その後、反応混合物を２〜８℃で１５０分間、その後、２５℃で９０分間保存した。そのように形成されたポリマーゲルを０．９％滅菌食塩水で４日間洗浄した。懸濁液のｐＨを１．０Ｍ ＮａＯＨまたは１．０Ｍ ＨＣｌのいずれかで７．０に調整した。ゲル懸濁液の最終濃度は、０．５８％であった。
実施例１２
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパンの合成
２５０ｍｌ丸底フラスコに１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−アミノプロパン）３．０ｇおよび無水クロロホルム１００ｍＬを入れた。反応混合物を透明な溶液が形成されるまで２５℃で撹拌した。この溶液に溶解するまで撹拌しながらＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオネート（５．０５ｇ）を、その後、ジイソプロピルエチルアミン３．４２ｍＬを加えた。得られた反応混合物を２５℃で１８時間撹拌した。溶液を１Ｍ塩酸（５０ｍＬ）、１０％ブライン（５０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）、半飽和ブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を単離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過により硫酸ナトリウムを除去した後、溶液を減圧下で濃縮し、残留物を、酢酸エチル：ヘキサン勾配を移動相として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。減圧下での溶媒の除去の後の真空乾燥により、所望の生成物を灰色がかった白色固体として得た（４．０３ｇ）。
実施例１３
１−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ８−（３−マレイミドプロピル）アミノ−３，６−ジオキサオクタンの合成
１００ｍｌ丸底フラスコに１−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン（１．００７ｇ）および無水アセトニトリル２５ｍＬ（２５ｍＬ）を入れた。反応混合物を溶解するまで窒素中で撹拌した。この溶液にＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオネート（１．３０２ｇ）を加え、反応混合物を窒素中で２５℃で６時間撹拌した。この時間の終了時に、溶媒を減圧下で除去した。残留物を２〜６％のメタノールを含むジクロロメタンを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。減圧下での溶媒の除去および残留物の真空下での乾燥の後に、１．０８ｇの所望の生成物を灰色がかった白色固体として得た。
実施例１４
３−（３−マレイミド−プロピル）アミノプロパン官能基化ヒアルロン酸の合成
ジビニルスルホン架橋懸濁液（実施例１）１５ｇに脱イオン（ＤＩ）水４５ｍｌを加え、得られた懸濁液を２５℃で１０分間撹拌した。エタノール４５ｍｌを懸濁液に加えた後、それをさらに６０分間撹拌した。それに続いて、エタノール６０ｍＬを加え、１０分間撹拌した。この懸濁液にエタノール５ｍＬに溶解した４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）０．２４ｇを加えた。得られた反応混合物を２５℃で６０分間撹拌した。無水ジクロロメタン２ｍＬに溶解した１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパン（実施例２）７０ｍｇにトリフルオロ酢酸２ｍＬを加えた。得られた反応物を室温で２時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。得られた残留物をメタノール３ｍＬで処理し、蒸発乾固した。このプロセスをもう１回繰り返した後、残留物をエタノール（５ｍＬ）に溶解し、エタノール中１０％Ｎ−メチルモルホリンを用いてｐＨを６〜６．５に調整した。得られた溶液を上記のヒアルロン酸懸濁液に加えた。バイアルをエタノール（５ｍＬ）ですすぎ、スラリーに加えた。２５℃で１８時間撹拌した後、飽和ブライン（２ｍＬ）を反応混合物に加えた。懸濁液をエタノール（３ｘ３０ｍＬ、２ｘ１５ｍＬ）で処理して、ポリマーゲルを沈殿させた。反応混合物を４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をデカントした。残留物をＤＩ水（２０ｍＬ）で約２０分間水和し、エタノール（４ｘ１０ｍＬ）から沈殿させた。グルコサミンアッセイ法により、置換度が１９モル％であることが示唆されている。
実施例１５
３−（３−マレイミド−プロピル）アミノプロパン官能基化ヒアルロン酸の合成
ジビニルスルホン架橋懸濁液（実施例１）２０ｇに脱イオン（ＤＩ）水６０ｍｌを加え、得られた懸濁液を２５℃で１０分間撹拌した。エタノール６０ｍｌを懸濁液に加えた後、それをさらに６０分間撹拌した。それに続いて、エタノール６０ｍＬを加え、１０分間撹拌した。この懸濁液にエタノール１０ｍＬに溶解したＤＭＴ−ＭＭ ０．３２５ｇを加えた。得られた反応混合物を２５℃で６０分間撹拌した。無水ジクロロメタン２．５ｍＬに溶解した１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパン（実施例２）０．３８ｇにトリフルオロ酢酸２．５ｍＬを加えた。得られた反応物を室温で２時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。得られた残留物をメタノール３ｍＬで処理し、蒸発乾固した。このプロセスをもう１回繰り返した後、残留物をエタノール（５ｍＬ）に溶解し、エタノール中１０％Ｎ−メチルモルホリンを用いてｐＨを６〜６．５に調整した。得られた溶液を上記のヒアルロン酸懸濁液に加えた。バイアルをエタノール（５ｍＬ）ですすぎ、スラリーに加えた。２５℃で１８時間撹拌した後、飽和ブライン（２ｍＬ）を反応混合物に加えた。懸濁液をエタノール（３ｘ３０ｍＬ、２ｘ１５ｍＬ）で処理して、ポリマーゲルを沈殿させた。反応混合物を４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をデカントした。残留物をＤＩ水（２０ｍＬ）で約２０分間水和し、エタノール（４ｘ１０ｍＬ）から沈殿させた。グルコサミンアッセイ法により、置換度が２４モル％であることが示唆されている。
実施例１６ａ
３−（３−マレイミド−プロピル）アミノプロパン官能基化ＨＡヒドロゲルの合成の一般的方法
適切な量のジビニスルホン架橋ＨＡ懸濁液（実施例１１ｂ）に滅菌生理食塩水を加えて、約１重量／容積％のゲル濃度を得た。得られた懸濁液を２５℃で１５〜３０分間撹拌した。水混和性有機溶媒（好ましくはエタノール）を懸濁液に加え、得られた懸濁液をさらに３０〜６０分間撹拌した。この懸濁液に適切な量の４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）のエタノール溶液を加えた。ＤＭＴ−ＭＭ溶液を含む容器をエタノールで２回すすぎ、洗液を上記の懸濁液に加えた。得られた反応混合物を２５℃で９０分間撹拌した。適切な量の１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパンをジクロロメタンに溶解した。この溶液にトリフルオロ酢酸を加えて、１：１（容積／容積）を得た。室温で６０〜９０分間撹拌した後、反応混合物を減圧下で蒸発乾固した。残留物をエタノールに溶解し、上記の懸濁液に加えた。マレイミド誘導体を含む容器をエタノールで２回すすぎ、洗液を懸濁液に加えた。懸濁液のｐＨを有機または無機塩基（例えば、エタノール中１０％Ｎ−メチルモルホリン）を用いてｐＨ６．４〜６．６に調整した。２５℃で１６〜２０時間撹拌した後、懸濁液を６０〜６５容積／容積％までエタノールで処理した。１２０Ｇでの遠心分離の後に上清をデカントすることにより、またはＮ２ガスのわずかな過圧を系にかけ、ガラスフリットもしくはフィルター膜を介して濾過することにより、溶媒を反応混合物から除去した。その後、残留物をｐＨ３．８の滅菌済み２０ｍＭコハク酸生理食塩水（０．９％）で約１５〜２０分間処理し、６０〜６５容積／容積％の容積までエタノールを加えることによって沈殿させた。上記の手順に従うことによって溶媒を反応混合物から除去した。この手順をもう１回繰り返した。
実施例１６ｂ
２０モル％の置換度の３−（３−マレイミド−プロピル）アミノプロパン官能基
化ＨＡヒドロゲルの合成
ＨＡヒドロゲル懸濁液（実施例１１ｂ）５．６５ｇに滅菌生理食塩水７．５ｍＬを加え、得られた懸濁液を１５分間緩やかに撹拌した。この懸濁液にエタノール３ｍＬを加え、得られた反応混合物を６０分間緩やかに撹拌した。この懸濁液にエタノール３ｍＬに溶解したＤＭＴ−ＭＭ ９４ｍｇを加えた。ＤＭＴ−ＭＭを含むバイアルをエタノール（２ｘ１ｍＬ）で洗浄し、洗液を懸濁液に加えた。反応混合物を周囲温度で９０分間緩やかに撹拌した。１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパン２１．７ｍｇにジクロロメタン０．２５ｍＬを加え、透明な溶液が形成されるまで反応物を緩やかに混合した。この溶液にトリフルオロ酢酸０．２５ｍＬを加え、周囲温度で７５分間緩やかに混合した。その後、溶液を蒸発乾固した。残留物をエタノール３ｍＬに溶解し、得られた溶液を上記のヒドロゲル懸濁液に加えた。マレイミド試薬を含むバイアルをエタノール（２ｘ１ｍＬ）ですすぎ、洗液を反応混合物に加えた。次いで反応混合物のｐＨを、エタノール中１０容積／容積％Ｎ−メチルモルホリンを用いて６．４１に調整し、得られた反応混合物を周囲温度で１８時間緩やかに振盪した。この時間の終了時に、１．０Ｍ ＨＣｌで処理することにより反応混合物のｐＨをｐＨ３．８９に調整した。エタノール（４ｘ３．５ｍＬ）を加えることによりゲルを沈殿させた。懸濁液を２０℃で１２０Ｇで２分間遠心分離し、ピペットを用いて上清を注意深く除去した。１５分間の緩やかな振盪／混合により残留物を２０．０ｍＭ ＳＢＳ緩衝液（ｐＨ３．８）１２ｍＬで再水和した。懸濁液をさらなるエタノール処理（４ｘ５ｍｌ、１ｘ４ｍＬ）にかけた。各エタノール処理の後に、懸濁液を２０℃で１２０Ｇで２分間遠心分離した後、上清を注意深く除去した。最後に、バイアルを反転し、１５分間排液し、上清をデカントして、０．８８７６ｇの湿潤ゲルを得た。
実施例１６ｃ
３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパン官能基化ヒアルロン酸の合成
ジビニルスルホン架橋懸濁液（実施例１１ａ）１０ｇに脱イオン（ＤＩ）水４０ｍｌを加え、得られた懸濁液を２５℃で１０分間撹拌した。エタノール３０ｍｌを懸濁液に加えた後、それをさらに６０分間撹拌した。それに続いてエタノール６０ｍＬを加え、１０分間撹拌した。この懸濁液にエタノール７．５ｍＬに溶解したＤＭＴ−ＭＭ ０．１６２ｇを加えた。得られた反応混合物を２５℃で６０分間撹拌した。無水ジクロロメタン０．５ｍＬに溶解した１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパン（実施例２）２９ｍｇにトリフルオロ酢酸０．５ｍＬを加えた。得られた反応物を室温で２時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。得られた残留物をメタノール２ｍＬで処理し、蒸発乾固した。このプロセスをもう１回繰り返した後、残留物をエタノール（７．５ｍＬ）およびＮ−メチルモルホリン９．５μＬに溶解した。溶液を上記のヒアルロン酸懸濁液に加え、Ｎ−メチルモルホリンを用いてｐＨを７．１に調整した。バイアルをエタノール（５ｍＬ）ですすぎ、スラリーに加えた。２５℃で２１時間撹拌した後、飽和ブライン（２ｍＬ）を加え、エタノール（４ｘ１５ｍＬ）を加えることによってゲルを沈殿させた。スラリーを１５分間沈降させ、上清をデカントした。ヒドロゲルを２０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ５（３５ｍＬ）で水和し、エタノール（５ｘ１５ｍＬ）を加えることによって沈殿させた。このプロセスを繰り返し、サンプルを２５００ｒｐｍで１．５分間遠心分離し、上清をデカントした。グルコサミンアッセイ法により、置換度が２４モル％であることが示唆されている。
実施例１７
８−（３−マレイミドプロピル）アミノ−３，６−ジオキサオクタン官能基化ヒ
アルロン酸の合成
２５０ｍＬ丸底フラスコに凍結乾燥ＨＡ（実施例１１ａ）０．５ｇおよび０．９％食塩溶液５０ｍＬを入れた。反応混合物を２５℃で１時間緩やかに撹拌した。この懸濁液にエタノール４０ｍＬを加え、懸濁液を５分間撹拌した。１０ｍＬバイアルにＤＭＴ−ＭＭ ０．３５ｇおよびエタノール５ｍＬを入れた。溶液をＨＡ懸濁液に加えた。バイアルをエタノール５ｍＬですすぎ、懸濁液に加えた。得られた反応混合物を２５℃で１時間撹拌した。その後、無水ジクロロメタン０．５ｍＬに溶解した１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ８−（３−マレイミドプロピル）アミノ−３，６−ジオキサオクタン８６ｍｇをトリフルオロ酢酸０．５ｍＬで処理し、加えた。溶液を室温で１時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、エタノール２ｍＬに溶解し、減圧下で蒸発乾固した。エタノール処理を２回繰り返した。残留物をエタノール／水（１：１）５ｍＬに溶解し、Ｎ−メチルモルホリン（６０μＬ）を用いて溶液のｐＨを６．５に調整した。得られた溶液を上記の懸濁液に加えた。２５℃で４時間撹拌した後、０．１Ｍ ＨＣｌで懸濁液のｐＨを３．７５に調整し、エタノール（７ｘ２５ｍＬ）を加えることによってゲルを沈殿させた。スラリーを３０分間沈降させ、上清の８０％をデカントにより除去した。残存懸濁液を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶媒を除去した後、残留物を０．９％食塩水で処理し、エタノール（７ｘ２５ｍＬ）から沈殿させた。残留物を凍結乾燥により乾燥した。グルコサミンアッセイにより決定されるように、置換度は、７．３ｍｏｌ％であることが見いだされた。
実施例１８
２−ピリジルジチオ基含有ヒアルロン酸の合成
脱イオン水２４ｍＬに溶解したヒアルロン酸ナトリウム（分子量＝５００ｋＤａ）２００ｍｇの迅速撹拌溶液にアセトニトリル１６ｍＬを１滴ずつ加えた。アセトニトリルの添加が完了した後、水／アセトニトリル（１：１）２ｍＬ中クロロジメトキシトリアジン１７．６ｍｇを、続いてＮ−メチルモルホリン２０μＬを反応混合物に加えた。反応物を２５℃で１時間撹拌した。その後、脱イオン水１ｍＬに溶解した２−（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）エタンアミン塩酸塩２６．８ｍｇを加えた。反応物を１８時間撹拌した。１Ｍ ＨＣｌを加えることにより反応物のｐＨを６．０に調整した。得られた反応混合物にあらかじめ洗浄したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＣＧ−１２０（Ｎａ＋型）１５ｍＬを加え、反応混合物を２０分間撹拌した。樹脂を濾別し、脱イオン水（２ｘ５ｍＬ）で洗浄した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＣＧ−１２０（Ｎａ＋型）処理プロセスを２回繰り返した。溶液を水で希釈して、２０容積％のアセトニトリルを含む溶液を形成した。Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）遠心分離装置(３０Ｋ分子量カットオフ)を用いて溶液を遠心濾過した。保持液を脱イオン水（５ｘ２００ｍｌ）で洗浄した。保持液を合わせ、凍結乾燥して、生成物１２０ｍｇを灰色がかった白色固体として得た。修飾の程度は、１０％であった。７０ｋＤａの分子量のヒアルロン酸ナトリウムを用い、同様な手順に従って他の２−ピリジルジチオ基含有ヒアルロン酸を合成した。
実施例１９
可溶性マレイミド官能基化ＨＡの合成
１００ｍＬフラスコにヒアルロン酸ナトリウム塩（分子量＝５００ｋＤａ）２００ｍｇおよびＤＩ水２４ｍＬを入れた。透明溶液が得られるまでそれを撹拌した。迅速撹拌ＨＡ溶液にエタノール１６ｍＬを加え、水／エタノール中４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム塩酸塩（５５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）にＮ−メチルモルホリン（２０μｌ、０．２ｍｍｏｌ）と一緒に加え、反応物を１時間熟成させた。１−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン・トリフルオロ酢酸塩（６０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。反応物を終夜放置した。ｐＨをわずかに酸性に調整し、あらかじめ洗浄したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＣＧ−１２０、Ｎａ＋型（≧１５ｍｌ）を反応混合物に加え、２０分間撹拌した。樹脂を濾別し、水で洗浄した。濾液にあらかじめ洗浄したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＣＧ−１２０、Ｎａ＋型（≧１５ｍｌ）を再び加え、上記と同じ手順に従った。全サイクルをもう１回繰り返した。溶液を水で希釈して、＜２０％エタノールを含む水性溶液を形成した。ＰＡＬＬ製の４つのＭａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）遠心分離装置、３０Ｋ分子量カットオフ（５０００ｒｐｍ、１５分遠心時間。膜は、その上にスパチュラを緩やかになでつけ、密閉装置を激しく振盪することによって毎回清掃する）を用いて溶液を遠心濾過した。保持液を脱イオン水（＞２００ｍｌ）で数回洗浄した。得られた修飾ＨＡ濃縮物を合わせ、凍結乾燥した。回収率は、５０〜７５％である。修飾の程度は、ＮＭＲにより約２０％である。
実施例２０
ヒアルロン酸ヒドロゲル中のマレイミド含量の推定
ＨＡヒドロゲルに取り込まれたマレイミド基の推定は、比色分析法により実施した。５−チオ２−ニトロ安息香酸は、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液中トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）による５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の還元により調製した。２０ｍｏｌ％過剰の５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を用いて、ＴＣＥＰとの副反応を防いだ。所定の量のマレイミド官能基化ヒドロゲルをｐＨ３．５の２０ｍＭコハク酸緩衝生理食塩水（ＳＢＳ）に懸濁した。上記の５−チオ２−ニトロ安息香酸溶液をヒドロゲル懸濁液に加え、反応混合物をボルテックス混合し（２ｘ１０秒）、その後、２５℃で４５分間緩やかに撹拌した。その後、懸濁液を２５℃で１０分間遠心分離し、上清の一定分量を採取した。上清の吸光度を４１２ｎｍで測定した。溶液中の５−チオ２−ニトロ安息香酸の濃度を、校正曲線を用いて推定した。ヒドロゲル中のマレイミド濃度は、加えた５−チオ２−ニトロ安息香酸の量と上清中に存在するその量との差から計算される、反応したチオールのモル数に相当する。
実施例２１
近赤外色素（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）コンジュゲートＨＡヒドロゲルの合成
実施例２１ａ ３−ニトロ−２−（２’−アミノ−エチルジスルファニル）ピリジン塩酸塩（ＮＥＡ）コンジュゲートジビニルスルホン架橋ヒアルロン酸の合成
ジビニルスルホン架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル（実施例５）５．１ｇ（２３ｍｇ／ｇ水）および滅菌水２０ｍＬを含む懸濁液を２５℃で１５分間緩やかに撹拌した。この懸濁液にエタノール（２０ｍＬ）を加え、得られた反応混合物を２５℃で１時間撹拌した。この懸濁液にエタノール５ｍＬに溶解したＤＭＴ−ＭＭ ０．０８１ｇを加えた。ＤＭＴ−ＭＭ溶液を含むバイアルをエタノール２．５ｍＬですすぎ、洗液を懸濁液に加えた。反応混合物を２５℃で１時間撹拌した後、ＮＥＡ０．０１７ｇを加えた。反応混合物を２５℃で２２時間撹拌した後、ブライン２ｍＬをゲルに加えた。溶媒を遠心分離により除去し、残留物を複数回のエタノール処理（４ｘ１０ｍＬ、１ｘ５ｍＬ）により洗浄した。懸濁液を２５００ｒｐｍで５分間、続いて５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した（遠心分離の温度は５℃に維持した）。上清をデカントし、残留物を滅菌水（２０ｍＬ）中で２０分間平衡化させた。その後、それを２回のエタノール処理（４ｘ１０ｍＬ）にかけた。スラリーを３０分間沈降させ、上清をデカントした。エタノール処理プロセスをもう１回繰り返し、湿潤ゲルを次の工程まで２℃で保存した。
実施例２１ｂ ＮＩＲ色素コンジュゲートＨＡヒドロゲルの合成
無菌的条件下で、ＮＥＡ修飾ヒアルロン酸（実施例１５ａ）０．２２４ｇおよび滅菌水１３ｍＬを５０ｍＬの滅菌済み反応バイアルに入れ、混合物を２５℃で１５分間緩やかに振盪した。この懸濁液にエタノール２０ｍＬを加え、懸濁液を２５℃で１時間撹拌した。その後、ＴＣＥＰ １４ｍｇを懸濁液に加え、反応混合物を２５℃で１６時間撹拌した。反応の終了時に、ブライン２ｍＬを反応混合物に加えた。その後、ゲルを５サイクルのエタノール処理（５ｍＬ）および遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分、５℃）にかけた。上清の除去の後、残留物を０．９％滅菌食塩水１０ｍＬにより処理した後、上述のように５ラウンドのエタノール処理（５ｍＬ）および遠心分離にかけた。残留物を滅菌０．９％食塩水１０ｍＬ中に懸濁した。この懸濁液に滅菌済み脱水素フィルターを用いて滅菌０．９％食塩水（３ｍＬ）に溶解したマレイミド官能基化ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ １．８ｍｇを加えた。フィルターをエタノール５ｍＬおよびエタノール／生理食塩水１：１（２ｘ５ｍＬ）ですすぎ、洗液を反応混合物に加えた。反応容器を暗所で２５℃で２時間緩やかに撹拌し、２℃に６６時間保持した。その後、エタノール３ｍＬに溶解したＮ−メチルマレイミド１１．５ｍｇを反応混合物に加え、懸濁液を２５℃でさらに３時間緩やかに撹拌した。反応の終了時に、懸濁液を遠心分離し（５０００ｒｐｍ、５°Ｃ、２ｘ１５分）、上清２０ｍＬを除去した。残存懸濁液をエタノール（５ｘ５ｍＬ）から沈殿させ、さらに遠心分離し（５０００ｒｐｍ、５℃、５分）、上清をデカントした。０．９％滅菌食塩水１０ｍＬを、続いてエタノール５ｍＬを残留物に加えた。懸濁液を遠心分離し（５０００ｒｐｍ、５分、５℃）、上清をデカントした。エタノール処理および遠心分離プロセスをさらに４回繰り返した。残留物を滅菌０．９％食塩水１０ｍＬで処理し、バイアルをアルミニウムフォイルで包むことにより暗条件下で２℃で保存した。
マレイミド官能基化ＨＡヒドロゲルへのリンカーチオペプチドのコンジュゲーション
実施例２２
マレイミド官能基化ＨＡヒドロゲルに対するチオール末端トレースリンカー保有ペプチドでの一般的手順
中多孔質フリットまたはフィルターを備えた滅菌済みおよび発熱性物質除去処理済み反応器に適切な量のマレイミド修飾ＨＡヒドロゲル（実施例３）を入れた。その後、適切な量の濾過滅菌済み２０ｍＭоｌ ＳＢ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．８を含む）を、得られる懸濁液の濃度が約１重量／重量％となるように反応に加えた。懸濁液を緩やかに振盪しながら３０〜９０分間混合した。この時間の終了時に、濾過滅菌済み２０ｍＭоｌ ＳＢ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．８を含む）に溶解した適切な量のチオール末端トレースリンカー保有ペプチドを反応器に加え、得られた反応混合物を周囲温度で１．５〜２４時間緩やかに振盪した。反応の終了時に、窒素のわずかな過剰な圧力を用いた濾過によりまたは懸濁液の遠心分離により上清を除去した。残留物を、濾過滅菌済み２０ｍＭ ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０を含む）で処理して、０．７重量／容積％懸濁液を調製し、３分間振盪し、遠心分離し、デカントにより上清を除去した。このプロセスを５回繰り返した。残留物を、濾過滅菌済み２０ｍＭ ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０を含む）に溶解した１−ヒドロキシ−２−メルカプトエタンの１０ｍＭ溶液で処理して、約１重量％の懸濁液を調製し、緩やかな振盪／混合により３０分間緩やかに撹拌した。上述のように遠心分離とそれに続くデカントによって溶媒を除去した。１−ヒドロキシ−２−メルカプトエタン処理のこのプロセスを４回繰り返した。残留物を濾過滅菌済み２０ｍＭ ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０を含む）に懸濁して、約０．５重量％の濃度の懸濁液を調製し、３分間混合した後、遠心分離およびデカントにより除去した。得られた残留物を２０ｍＭ ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．５を含む）に懸濁して、０．７重量％の懸濁液を調製し、２０分間撹拌し、濾過した。このプロセスをもう１回繰り返した後、残留物を、２０ｍＭ ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ４．５を含む）に懸濁して、０．５重量％の懸濁液を調製し、１５分間撹拌し、濾過した。このプロセスを１回繰り返した。残留物を滅菌水（ｐＨ４．５）に懸濁し、５分間攪拌し、濾過した。このプロセスを５回繰り返した。残留物を滅菌済み膜フィルターを用いて無菌的に濾過し、凍結乾燥した。
リンカー７含有チオール官能基化エキセンディン−４配列番号２６とマレイミド官能基化ヒアルロン酸とのコンジュゲーション
３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパン修飾ＤＶＳ−ＨＡヒドロゲル（実施例１５）５３ｍｇに０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、プロピレングリコール（１５容積／容積％）を含む、２０ｍＭ ＳＢＳ ７ｍＬを加えた。緩衝液のｐＨは、３．８である。懸濁液を２５℃で９０分間緩やかに撹拌した。この懸濁液に、上記の緩衝液１ｍｌに溶解した実施例７のリンカーを含むチオール官能基化エキセンディン−４配列番号２６ ２．１ｍｇを加えた。ペプチドバイアルを緩衝液（２ｘ０．５ｍＬ）ですすぎ、洗液を懸濁液に加えた。反応混合物を２５℃で１８時間緩やかに撹拌した。その後、懸濁液を１７５０ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を注意深くデカントした。ヒドロゲルを０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、プロピレングリコール１５容積／容積％、ｐＨ３を含む２０ｍＭ ＳＢＳ １０ｍＬに懸濁し、２分間撹拌し、１７５０ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をデカントした。このプロセスをさらに４回繰り返した。残留物を２０ｍＭ ＳＢＳ ｐＨ３に溶解した１０ｍＭ １−ヒドロキシ−２−メルカプトエタン２ｍＬで処理し、反応を３０分間進行させた。反応混合物を２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、溶媒をデカントした。このプロセスをさらに３回繰り返した。残留物を０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ３を含む２０ｍＭ ＳＢＳ １０ｍＬに懸濁し、２分間撹拌し、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、溶媒をデカントした。その後、残留物を、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む酸性化滅菌水（ｐＨ３．５）１０ｍＬに懸濁し、１０分間撹拌し、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、溶媒をデカントした。このプロセスを、上記の酸性化滅菌水８、７および６ｍＬを用いて繰り返した。サンプルを凍結乾燥して、ＨＡヒドロゲルコンジュゲートペプチド７８ｍｇを、ヒドロゲル中にペプチドが４重量％担持されている灰色がかった白色固体として得た。
実施例２３
リンカーを含むチオール官能基化エキセンディン−４配列番号２６のマレイミド官能基化ヒアルロン酸とのコンジュゲーション
反応および後処理は、脱酸素緩衝液を用い、窒素雰囲気下で実施した。３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパン修飾ＤＶＳ−ＨＡヒドロゲル（実施例１５）３６ｍｇに２０ｍＭ ＳＢＳ（０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０容積／容積％プロピレングリコールを含む）６ｍＬを加えた。媒体のｐＨを６に調整した。懸濁液を２５℃で３０分間緩やかに振盪した。この懸濁液に上記の緩衝液（ｐＨ６）１ｍｌに溶解したリンカーを含むチオール官能基化エキセンディン−４配列番号２６（実施例７）２．４ｍｇを加えた。ペプチドバイアルを緩衝液（２ｘ０．５ｍＬ）ですすぎ、洗液を懸濁液に加えた。反応混合物を２５℃で９０分間緩やかに振盪した。その後、懸濁液を４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を注意深くデカントした。ヒドロゲルをｐＨ３の２０ｍＭ ＳＢＳ（０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０容積／容積％プロピレングリコールを含む）１０ｍｌに懸濁し、２分間混合し、３００５Ｇで２分間遠心分離し、溶媒をデカントした。このプロセスをさらに４回繰り返した。残留物を２０ｍＭ ＳＢＳ ｐＨ３中１０ｍＭ １−ヒドロキシ−２−メルカプトエタン２ｍＬで３０分間処理し、４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、溶媒をデカントした。このプロセスをさらに３回繰り返した。残留物を、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ｐＨ３）を含む２０ｍＭ ＳＢＳ １０ｍｌに懸濁し、２分間混合し、４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、溶媒をデカントした。このプロセスをさらに４回繰り返した。残留物を、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む酸性化（ｐＨ３．５）滅菌水に懸濁し、１０分間混合し、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、溶媒をデカントした。このプロセスを上記の滅菌水８、７および６ｍＬを用いて繰り返した。残留物を凍結乾燥して、ＨＡコンジュゲートペプチド３１ｍｇを、ヒドロゲル中に２．４重量％ペプチド担持された灰色がかった白色固体として得た。
実施例２４
ヒドロゲルペプチドコンジュゲートにおけるペプチド担持量の推定の手順
所定の量のＨＡヒドロゲルペプチドコンジュゲートをＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．５）に懸濁し、懸濁液を７０℃で緩やかに撹拌した。懸濁液を遠心分離し、一定分量をＨＰＬＣ法によりペプチド含量について分析した。ＨＰＬＣ法は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣを用いてｑＣ−１８Ｋｉｎｅｔｉｃｓカラム（内径＝４．６ｍｍおよび長さ＝１００ｍｍ、粒径２．６μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いることを含む。移動相Ａの組成は、９０％水／１０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、移動相Ｂは、１０％アセトニトリル／９０％水／０．０９％ＴＦＡである。勾配は、８分で移動相２５％Ｂ〜５５％Ｂである。流量は、１ｍＬ／分を維持した。純ペプチドを標準として用いて、ヒドロゲルから放出されたペプチドを定量した。
実施例２５
ＨＡヒドロゲルのｉｎ ｖｉｖｏ滞留時間の決定
皮下腔におけるｉｎ ｖｉｖｏでのヒドロゲルの滞留時間を磁気共鳴（ＭＲ）撮像法により検討した。ヒドロゲルの内部の水プロトンコントラストの強度を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒドロゲルの滞留時間を評価した。この目的のために、ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｃｒｌマウスを動物として用いた。すべての承認済み動物管理プロトコールに従って３１Ｇ針を用いてヒドロゲルを注射した。注射部位のＭＲ画像を一定の期間にわたって定期的に撮影した。１つの群にヒドロゲルを注射し、他の群にヒドロゲルおよび８００，０００Ｄａ可溶性ＨＡの１：１（重量／重量）混合物を含む懸濁液を用いた。純ヒドロゲルの場合、ゲルは、３週間認められ、強度が徐々に減少した（図２）。他方で、可溶性ＨＡを含む混合物については、１日目に強かったＭＲシグナルは、４日目に著しく低下した（２）。これは、ポリマー担体の滞留時間を改善するためには、非常に高い分子量を達成するために架橋することが必要であることを示唆するものである。
図２ａ．時間の関数としての注射部位におけるＨＡヒドロゲルのＭＲの画像
図２ｂ．時間の関数としての注射部位における１：１（重量／重量）ＨＡヒドロゲル−８００ｋＤａ可溶性ＨＡを含むポリマー懸濁液のＭＲの画像
実施例２６
ｉｎ ｖｉｔｏでの放出速度論
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストリンカーヒドロゲル８（０．５ｍｇ ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト）の一定分量を、フィルターフリットを取り付け、ｐＨ７．４リン酸緩衝液（６０ｍＭ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で５回洗浄した注射器に移した。ヒドロゲルを同じ緩衝液に懸濁し、３７℃でインキュベートした。規定の時点（１〜７日間の各インキュベーション時間の後）に上清を交換し、放出されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストをＲＰ−ＨＰＬＣにより２１５ｎｍで定量した。放出されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストに相関するＵＶシグナルを積分し、インキュベーション時間に対してプロットした。曲線当てはめソフトウエアを適用して、放出の対応する半減期を推定した。
図３．ＨＡヒドロゲル（実施例２３）からのリンカーを含むエキセンディン−４配列番号２６二重アゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出速度論。半減期は、約５日である。
実施例２７
ＧＬＰ−１受容体、グルカゴン受容体およびＧＩＰ受容体に対する効能に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ
受容体に対するペプチドのアゴニズムは、ヒトＧＩＰ、ＧＬＰ−１またはグルカゴン受容体を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞株のｃＡＭＰ応答を測定する機能アッセイにより決定された。
細胞のｃＡＭＰ含量は、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）に基づくＣｉｓｂｉｏ Ｃｏｒｐ．製のキット（カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＣ）を用いて測定した。準備のために、細胞をＴ１７５培養フラスコに分割して入れ、培地（ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ）中でほぼ融合性の状態に終夜増殖させた。次いで培地を除去し、細胞をカルシウムおよびマグネシウム不含有ＰＢＳで洗浄した後、ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ａ６９６４）を用いてプロテイナーゼ処理した。剥離細胞を洗浄し、アッセイ緩衝液（１ｘＨＢＳＳ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＩＢＭＸ）に再懸濁し、細胞密度を測定した。次いでそれらを４０００００細胞／ｍｌに希釈し、２５μｌずつを９６ウエルプレートのウエルに分注した。測定のために、アッセイ緩衝液中試験化合物２５μｌをウエルに加えた後、室温で３０分間インキュベートした。溶解緩衝液（キット成分）で希釈したＨＴＲＦ試薬を添加した後、プレートを１時間インキュベートし、その後、６６５／６２０ｎｍにおける蛍光比を測定した。アゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力は、最大応答の５０％の活性化を引き起こした濃度（ＥＣ５０）を測定することにより定量化した。
実施例２８
雌糖尿病ｄｂｄｂマウスにおける血糖降下
試験開始時に２４〜２７週齢の雌糖尿病ｄｂｄｂマウス（ＢＫＳ．ＣＧ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ（ｄｂ）／Ｊ）を用いた。１０〜１３週齢で受領したマウスを給餌および収容条件に少なくとも１週間慣れさせ、次いで、最初の試験に用い、少なくとも２週間のウォッシュアウト期間の後に最終的に本試験に再使用した。試験開始の１９日前に、層別化するために個々のＨｂＡ１ｃ値を測定し、その後、平均ＨｂＡ１ｃ値を可能な限り同等に有する群を設けるために群当たりＮ＝８として動物を４群に割り当てた。全試験期間を通して動物に飼料および水を自由に摂取させた。試験の初日に尾の先端の切開部からの血糖を、媒体（滅菌コハク酸緩衝液）または媒体で希釈した５０、１００および２００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量の実施例２３のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト配列番号２６のＨＡコンジュゲートのいずれかを用いて単回皮下処置（午前０８：００〜０９：００）の直前および４時間後に測定した。その後、次の１６日間における毎日の血糖の測定は、１１および１２日目（週末）を除いて、すべて同様の時刻（午前０８：００〜０９：００）に実施した。さらに摂餌量および水消費量を毎日モニターした。血糖データは、反復測定に関する二元配置ＡＮＯＶＡとその後のｐ＜０．０５の有意水準を用いたＤｕｎｎｅｔｔの事後検定により解析した。血糖ＡＵＣ解析は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のｐ＜０．０５の有意水準を用いたＤｕｎｎｅｔｔの事後検定を用いて行った。
図４にベースラインを基準とした血糖濃度を、配列番号２６を有するＨＡ−ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストコンジュゲートの様々な用量での１回の注射後の時間に対して示す。
実施例２８ｂ
雌糖尿病ｄｂｄｂマウスにおける血糖降下効果
雌肥満糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．ＣＧ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ（ｄｂ）／Ｊ）および健常痩せ型対照（ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ（ｄｂ）／Ｊ）を１０〜１１週齢で受領し、給餌および動物施設条件に慣れさせた。１２〜１３週齢時に層別化するために個々のＨｂＡ１ｃ値を測定し、群当たりＮ＝８として動物を異なる群に割り当てた。目的は、平均ＨｂＡ１ｃ値を可能な限り同等に有する群を設けることであった。１３〜１４週齢時にｄｂ／ｄｂマウスの２群が可溶性または架橋ＨＡのいずれかの配列番号２６を有するコンジュゲートのｓ．ｃ．１００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の単回投与を受けた。７日目の同じ時刻および第２の時刻にｄｂ／ｄｂマウスの第３の群および健常痩せ型対照が１：１の比のコハク酸緩衝液および可溶性ＨＡのｓ．ｃ．注射を受けた。すべての群において５ｍｌ／ｋｇ体重の総容量が注射された。朝の給餌血糖濃度は、治療の直前（午前０８：００〜０９：００）および４時間後に、その後は毎日午前０８：００〜０９：００に測定した。血液を尾の先端の切開部から採取し、濃度を携帯式血糖値計（Ａｃｃｕ Ｃｈｅｃｋ）により測定した。全試験期間を通して動物に飼料および水を自由に摂取させた。
図４ｂにベースラインを基準とした血糖濃度を架橋および可溶性の配列番号２６を有するＨＡ−ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストコンジュゲートの１回の注射後の時間に対して示す。
実施例２８ｃ
雌糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖降下効果
受領後、雌肥満糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．ＣＧ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ（ｄｂ）／Ｊ）を給餌および動物施設条件に慣れさせ、試験開始時に１２週齢であった。層別化するために投与前期の１０日目に個々のＨｂＡ１ｃ値を測定し、群当たりＮ＝８として動物を異なる群に割り当てた。目的は、平均ＨｂＡ１ｃ値を可能な限り同等に有する群を設けることであった。投与期の１日目にｄｂ／ｄｂマウスは、配列番号４５、４６、４８および４９を有するいずれかのコンジュゲートの１２．７５ｍｇ／ｋｇ体重のｓ．ｃ．単回投与を受けた。媒体群のｄｂ／ｄｂ動物は、ｓ．ｃ．ＰＢＳ注射を受けた。すべての群において１０ｍｌ／ｋｇ体重の総容量が注射された。朝の給餌血糖濃度は、投与期の１日目の治療の直前（午前０８：００〜０９：００）および４時間後に、その後は毎日午前０８：００〜０９：００に測定した。血液を尾の先端の切開部から採取し、濃度を携帯式血糖値計（Ａｃｃｕ Ｃｈｅｃｋ）により測定した。全試験期間を通して動物に飼料および水を自由に摂取させた。
図４ｃにベースラインを基準とした血糖濃度を配列番号４５（三角）、４６（四角）、４８（丸）を有するＨＡ−ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストコンジュゲートの様々な用量での１回の注射後の時間に対して示す。
図４ｄにベースラインを基準とした血糖濃度を、配列番号４９（丸）を有するＨＡ−ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストコンジュゲートの様々な用量での１回の注射後の時間に対して示す。
実施例２９
注射可能性試験
３．７５％（ｍｇ／ｍＬ）ＨＡ−ペプチドコンジュゲートの懸濁液を適切な量のペプチドコンジュゲートをｐＨ４．５の２０ｍＭコハク酸緩衝生理食塩水（ＳＢＳ）に分散させることによって調製した。他のバイアルにおいて、天然ＨＡポリマーの２％（ｍｇ／ｍＬ）溶液を、凍結乾燥ＨＡをｐＨ４．５の２０ｍＭ ＳＢＳに溶解することによって調製した。両サンプルを２〜８℃で２４〜４８時間水和させた。バイアルを室温にした。室温での平衡化の後、１ｍＬのペプチド−ＨＡヒドロゲルコンジュゲート懸濁液およびＨＡを３ｍＬ注射器に入れた。この懸濁液に可溶性ＨＡ溶液０．２５ｍＬを加えた。得られた懸濁液を２つの３ｍＬ注射器の間の２０回の前後方向の混合にかけた。この懸濁液約２２０μｌを１ｍｌ注射器に入れた。この注射器に３０ｇ、１／２インチ針を取り付けた。針に試験物質が入らないようにすべきである。懸濁液を含む注射器をＩｎｓｔｒｏｎ装置の注射器取付具に装着し、Ｉｎｓｔｒｏｎのクロスヘッドを注射器のプランジャーと合わせた。クロスヘッドの速度を、目標注射速度を達成するように調節した。試験を開始した。各サンプルについて、３回の測定を実施し、示した結果は、これらの測定の平均値である。種々のペプチド−ＨＡヒドロゲルコンジュゲートについての注射可能性力に関する結果を表４に示す。
図５に１ｍＬ注射器に取り付けた２．５ｃｍ長３０Ｇ針を介して液体を押すことによる平均押出し力を示す。ＨＡヒドロゲルへのペプチド担持量が多いほど、もたらされる押出し力は低くなり、したがって注射可能性が増大することが明らかに認められる。
実施例２９ｂ
配列番号４５、Ａｉｂリンカーを含むＨＡコンジュゲートの注射可能性試験
１ｍＬルアロック注射器（ＢＤ注射器、内径４ｍｍ）に約５００μＬ（注射器目盛りで４６０μＬ）のサンプル溶液を充填し、２９Ｇｘ１２．７ｍｍ針を取り付けた。測定は、Ｌｌｏｙｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のＬＦ Ｐｌｕｓ検力計で行った。２９Ｇ針の先端に小液滴が出現するまでプランジャーロッドを押した。注射器を注射器ホルダーに入れ、検力計がプランジャーロッドに接触するように検力計を移動した。測定の設定は：５０Ｎの中断力（ａｂｏｒｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ）および５．８ｍｍ／秒（この場合、１００μＬ／秒に等しい）の注射速度であった。
測定が開始され、プランジャーロッドが注射器の底に到達したとき（注射器が空）または測定中に５０Ｎより高い力に達したとき、自動的に中断された。
表５に可溶性ＨＡ（ｓＨＡ）の異なる混合比を有する異なるコンジュゲート濃度の最大注射力を示す。

Claims (28)

  1. 式（Ｉ）の薬物リンカーコンジュゲートを含むプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩であって、
    Ｚ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０ （Ｉ）
    式中、Ｙは、式（ＩＩ）を有するペプチド部分
    Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩ）
    であり、
    Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２０は、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
    またはＹは、式（ＩＩＩ）を有するペプチド部分
    Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩＩ）
    であり、
    Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１８は、ＬｅｕおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
    または
    Ｙは、式（ＩＶ）を有するペプチド部分
    Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＶ）
    であり、
    Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
    または
    Ｙは、式（ＩＶａ）を有するペプチド部分
    Ｈ２Ｎ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｂａｌ−Ｘ２９−Ｇｌｙ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ３９−Ｒ２０ （Ｖ）
    であり、
    Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＡｓｐ）を表し、
    Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏ、（好ましくは）Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＰｒｏ）を表し、
    Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＳｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）を表し、
    Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ）を表し、
    Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表し、
    または
    Ｙは、式（ＩＶｂ）を有するペプチド部分
    Ｈ２Ｎ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｂａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｒ２０
    またはその塩もしくは溶媒和物であり；
    Ｒ２０は、ＯＨまたはＮＨ２であり；
    Ｌは、式（Ｉａ）のリンカー
    （式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹのＮ末端への結合を示し；
    Ｘは、Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）；Ｎ（Ｒ４）であり；
    Ｒ１、Ｒ１ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｒ４、Ｒ４ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ４またはＲ４ａは、１つの基Ｌ２−Ｌ１−Ｚで置換されており；Ｌ２は、単一化学結合、またはＣ１−２０アルキル鎖であり、これは、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されており、Ｒ３ａａおよび Ｒ３ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択される）であり、
    Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており、
    Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
    Ｌ１は、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基によって場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａＲ５ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａおよびＲ５ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｌ１は、Ｚのヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してＺに結合しており；
    Ｚは、単量体二糖単位の０．０５〜２０％が架橋剤により架橋され；単量体二糖単位の０．２〜８．５％がＬ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである、前記プロドラッグまたはその薬学的に許容される塩。
  2. 式（Ｉ）の薬物リンカーコンジュゲートを含むプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩であって、
    Ｚ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０ （Ｉ）
    式中、Ｙは、式（ＩＩ）を有するペプチド部分
    Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩ）
    であり、
    Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２０は、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
    またはＹは、式（ＩＩＩ）を有するペプチド部分
    Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩＩ）
    であり、
    Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１８は、ＬｅｕおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２０は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２８は、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
    または
    Ｙは、式（ＩＶ）を有するペプチド部分
    Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＶ）
    またはその塩もしくは溶媒和物であり、
    Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−ＳｅｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１８は、ＡｒｇおよびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し；
    Ｒ２０は、ＯＨまたはＮＨ２であり；
    Ｌは、式（Ｉａ）のリンカー、
    （式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹのＮ末端への結合を示し；
    Ｘは、Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）；Ｎ（Ｒ４）であり；
    Ｒ１、Ｒ１ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｒ４、Ｒ４ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ４またはＲ４ａは、１つの基Ｌ２−Ｌ１−Ｚで置換されており；Ｌ２は、単一化学結合またはＣ１−２０アルキル鎖であり、これは、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されており、Ｒ３ａａおよび Ｒ３ａａａは、ＨおよびＣ１−
    ４アルキルからなる群から独立に選択される）であり；
    Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており、
    Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
    Ｌ１は、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基によって場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａＲ５ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａおよびＲ５ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｌ１は、Ｚのヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してＺに結合しており；
    Ｚは、単量体二糖単位の０．０５〜２０％が架橋剤により架橋され；単量体二糖単位の０．２〜８．５％がＬ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルである、請求項１に記載の前記プロドラッグまたはその薬学的に許容される塩。
  3. Ｌが式（Ｉｂ）のリンカー部分
    （式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；Ｒ１、Ｒ１ａ、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、
    請求項１に記載のように定義される）である、請求項１に記載のプロドラッグ。
  4. Ｌが式（Ｉｃ）のリンカー部分−Ｌ
    （式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；
    Ｒ１およびＲ１ａは、Ｈであり；
    Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣＨ３からなる群から独立に選択され；
    Ｌ２−Ｌ１−Ｚは、請求項１に記載のように定義される）である、請求項１に記載のプロドラッグ。
  5. Ｌ２が−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される１つの基によって場合により中断されているＣ１−６アルキル鎖であり、Ｒ３ａａがＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
    Ｌ２が以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており、
    Ｌ２が点線で示されている１つの位置に結合し、Ｌ１が他の点線で示されている位置に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  6. Ｙは、式（ＩＩ）を有するペプチド部分
    Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩ）
    （式中、
    Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒを表し、
    Ｘ３は、Ｈｉｓを表し、
    Ｘ１８は、Ａｒｇを表し、
    Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
    Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す）であり、
    またはＹは、式（ＩＩＩ）を有するペプチド部分
    Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＩＩＩ）
    （式中、
    Ｘ２は、Ａｉｂを表し、
    Ｘ３は、Ｈｉｓを表し、
    Ｘ１８は、Ｌｅｕを表し、
    Ｘ２０は、Ｌｙｓを表し、
    Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２８は、ＳｅｒおよびＡｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３２は、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表す）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  7. Ｙが、式（ＩＶａ）を有するペプチド部分
    Ｈ２Ｎ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｂａｌ−Ｘ２９−Ｇｌｙ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ３９−Ｒ２０ （ＩＶａ）
    であり、
    Ｘ１５は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＡｓｐ）を表し、
    Ｘ２９は、Ｇｌｙ、Ｄ−ＡｌａおよびＰｒｏ、（好ましくは）Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３１は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＰｒｏ）を表し、
    Ｘ３２は、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏおよびＡｒｇ（好ましくはＳｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）から選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３４は、ＧｌｙおよびＤ−Ａｌａから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ３５は、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基（好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ）を表し、
    Ｘ３９は、ＳｅｒまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを表す、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  8. Ｙが、式（ＩＶｂ）を有するペプチド部分
    Ｈ２Ｎ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｂａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｒ２０
    である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  9. Ｙが、配列番号４〜６０から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグまたはその薬学的塩を、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
  11. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグまたはその薬学的塩を、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および粘度調整剤と一緒に含む医薬組成物。
  12. 粘度調整剤がヒアルロン酸である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 注射用製剤の形態の請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 懸濁液の形態の請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロドラッグが０．５〜８重量／容積パーセントの濃度を有する、懸濁液の形態の請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロドラッグが１．５〜３重量／容積パーセントの濃度を有する、懸濁液の形態の請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. プロドラッグが、１回の適用で治療有効量のＧＬＰ１／グルカゴンアゴニストを少なくとも６日間供給するのに十分なように組成物に加えられる、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. １回量組成物である、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 医薬として使用する請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  20. ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストにより治療することができる疾患または障害を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 糖尿病を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  22. 異脂肪血症を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. 代謝症候群を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  24. 肝臓脂肪症、好ましくは非アルコール性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療または予防の方法における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  25. 式（ＶＩＩＩ）のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲート中間体Ｌ２＊−Ｌ−Ｙ
    （式中、Ｙは、配列番号４〜６０のペプチドである）。
  26. 式（ＩＸ）のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲート中間体Ｌ２＊−Ｌ−Ｙ
    （式中、Ｙは、配列番号４〜６０のペプチドである）。
  27. 式（Ｘ）のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲート中間体Ｌ２＊−Ｌ−Ｙ
    （式中、Ｙは、配列番号４〜６０のペプチドである）。
  28. プロドラッグ懸濁液を内径が０．２６ｍｍより小さな針を介する注射によって投与することができる、請求項１８に記載の組成物。
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