JP6047178B2 - 経皮伝達用ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの製造方法及びこれによって製造された経皮伝達用ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲート - Google Patents

経皮伝達用ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの製造方法及びこれによって製造された経皮伝達用ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲート Download PDF

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Description

本発明は薬物の経皮伝達のための剤形及びその製造方法に関するものである。より詳しくは、生体適合性、生分解性及び経皮伝達特性を有する伝達体を用いることによって多様な蛋白質医薬品、化学医薬品及びワクチンの経皮薬物伝達システムに適用可能であり、人体に安全に適用でき、また蛋白質の生体活性度を最大化した状態で、生接合効率が高く、薬効時間を増大することができる経皮伝達用薬物伝達体の製造方法及びこれによって製造された経皮伝達用薬物伝達体及びその用途に関するものである。
経皮伝達システムは皮膚を通じて有効薬効成分を伝達するシステムであって、これを用いて薬物伝達をする場合、苦痛がなく患者自ら薬物の投与が可能であり、時間と場所にかかわらず治療ができるという長所がある。
しかし、身体の外部物質の汚染に対する１次防御膜である皮膚組織を通過して体内に入れる有効薬効成分の量が少ないため活発に応用されていない。
したがって、最近は皮膚組織障壁（ｂａｒｒｉｅｒ）の透過度を高めて体内に伝達される薬物の量を増やすためにマイクロ大きさの針を用いたパッチシステムや電場、超音波などの外部刺激を用いる経皮薬物伝達システムに対する研究が活発に行なわれている。
しかし、細密に成形されたマイクロ針を含む構造のパッチ形態は製作が難しく価格が高いという短所があり、皮膚透過度を高めるために外部刺激を用いなければならない場合、適切な装備と刺激が必要であるため実質的な経皮伝達システムの長所を失うようになる問題がある。
したがって、皮膚透過率が高く別途の装備乃至刺激を要しないと共に薬物を経皮に伝達することができる効果的なシステムの開発が必要である。
本発明は、前記のような従来技術の問題点を克服し、蛋白質医薬品の生体活性度を最大限に維持しながら生接合効率が高く多様な水溶性有効薬効成分に適用可能な経皮伝達用薬物製剤としてのヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの製造方法、これによって製造されたヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲート及びその多様な用途を提供するためのものである。
本発明者の研究結果、生分解性、生適合性に優れた生体高分子であるヒアルロン酸の場合、高分子量を有するにもかかわらず、皮膚を通じた経皮伝達特性があり、このように経皮伝達能力に優れたヒアルロン酸を用いて経皮薬物伝達製剤として応用すれば、注射より簡便であり、高い効率で薬物伝達が可能であることを確認した。また、ヒトの皮膚細胞にはヒアルロン酸のレセプターが存在しヒアルロン酸の濃度によって細胞の増殖が調節できることを確認し、このような特性を用いて皮膚組織の再生などの治療効果はもちろん、化粧料組成物としても効果的に応用可能であることを確認して本発明を完成した。本発明は特に、伝達しようとする薬物である蛋白質とヒアルロン酸を接合する時、特定ｐＨ条件下に接合工程を行うことによって蛋白質内の他のアミン基を有する例えば、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）などのような他のアミノ酸との反応を防止することができ、したがって、蛋白質の活性を最大化した状態で、生接合効率及び薬効時間を増大することができる。
よって、本発明の一実施形態により、下記化学式１のヒアルロン酸−アルデヒド（ＨＡ−ａｌｄｅｈｙｄｅ）を製造する第１段階；及び前記ヒアルロン酸−アルデヒドを水溶性蛋白質のＮ−末端と反応させる第２段階を含むヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲート製造方法が提供される。
また、本発明の他の一実施形態により、前記製造方法によって製造される下記化学式２のヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートが提供される。
上記化学式１で、ｍとｎの合計は５０乃至１０，０００の整数であり、ｎは５乃至５，０００の整数である。
上記化学式２で、Ｐは水溶性蛋白質を示し、ｍ、ｎ、及びｌの総合計は５０乃至１０，０００の整数であり、ｎとｌの合計は５乃至５，０００の整数であり、ｌは１乃至１００の整数である。
以下、本発明の好ましい一実施形態によるヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲート及びその製造方法についてより詳細に説明する。
本発明の一実施形態に使用されるヒアルロン酸は生体適合性及び生分解性特性を有するだけでなく、経皮伝達特性を有しており、人体に安全に適用することができ、抗原蛋白質をはじめとする多様な蛋白質医薬品及び化学医薬品の経皮薬物伝達システムに適用可能であるという長所がある（実験例８乃至１３参照）。
一方、明示的な記載がない限り、本明細書全体で‘ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）’は下記一般式１で表現される繰り返し単位を有する高分子を称し、ヒアルロン酸の塩または誘導体形態を全て含む意味として使用される。
上記一般式１で、ｍ”は５０乃至１０，０００の整数であり得る。
‘ヒアルロン酸誘導体’は、前記一般式１のヒアルロン酸基本構造を基盤としてアミン基、アルデヒド基、ビニル基、チオール基、アリルオキシ基、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ、ＳＰＤＰ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）などの官能基が導入されているヒアルロン酸の全ての変形体を称する。例えば、ＨＡ−ジアミノブタン（ＨＡ−ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔａｎｅ）、ＨＡ−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＨＡ−アルデヒド（ＨＡ−ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ＨＡ−アジピン酸ジヒドラジド（ＨＡ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｉｈｙｄｒａｚｉｄｅ、ＨＡ−ＡＤＨ）、ＨＡ−２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロライド（ＨＡ−２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＨＡ−スペルミン（ＨＡ−Ｓｐｅｒｍｉｎｅ）、ＨＡ−スペルミジン（ＨＡ−ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、ＨＡ−ＳＰＤＰ、ＨＡ−ＮＨＳなどであり得る。
そして、‘ヒアルロン酸−アルデヒド置換率’は全体ヒアルロン酸繰り返し単位の中のセルロースの環構造がオープン（ｏｐｅｎ）されてアルデヒド基が形成された繰り返し単位のモル比率と定義され、定義上０超過１以下の数値または０モル％超過１００モル％以下の数値で表現できる。
前記ヒアルロン酸は大部分の動物に存在し、生分解性及び生適合性を有し、免疫反応がない線状的な多糖類の高分子として人体に安全に適用することができる。ヒアルロン酸は体内で分子量によって様々な異なる役割を果たすため様々な用途に用いることができる。
一方、前記実施形態によるヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの製造方法において、使用されるヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、またはヒアルロン酸の誘導体はその構成の限定はないが、好ましくは分子量が１０，０００乃至３，０００，０００ダルトン（Ｄａ）であるものを使用することができる。前記のような範囲の分子量を有するヒアルロン酸、またはヒアルロン酸の塩、またはヒアルロン酸の誘導体は薬物伝達のためのコンジュゲートに使用されるのに適する。
以下、本発明のヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲート製造方法を下記反応式１を参照して各段階別に具体的に説明する。
上記反応式１で、ｍ”、ｍ、ｎ、ｌ、及びＰはそれぞれ前記一般式１、化学式１、及び化学式２で説明した通りである。
第１段階はヒアルロン酸−アルデヒド（ＨＡ−ａｌｄｅｈｙｄｅ）（化学式１）を製造する段階であって、好ましくはヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）、ヒアルロン酸の塩、またはヒアルロン酸の誘導体を水に溶解させた後、酸化剤と暗（ｄａｒｋ）条件下で反応させてセルロースの環（ｒｉｎｇ）構造をオープンする段階を含んでなるものであり得る。このように、本発明の好ましい一実施形態による製造方法は、ヒアルロン酸単位体の中のヒアルロン酸受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合する部位であるカルボキシル基を残したまま環構造をオープンして形成されたアルデヒド基と活性成分である蛋白質を特異的に結合させることによって、ヒアルロン酸の経皮伝達特性を最大化することができる。
前記酸化剤はヒアルロン酸の環構造を壊すことができるものであれば特に制限されず、好ましくは 過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ、ＮａＩＯ４）であり得る。
また好ましくは、前記酸化剤はヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）、ヒアルロン酸の塩、またはヒアルロン酸誘導体の単位体当り１乃至１０モル（ｍｏｌｅ）倍で添加して２乃至２４時間、より好ましくは１乃至５モル（ｍｏｌｅ）倍で添加して２乃至１２時間反応させることができる。前記酸化剤を用いて２モル倍を添加して３時間を反応させた場合、１０モル％置換され、５モル倍を添加して１２時間反応させた場合、５０モル％置換された誘導体を得ることができる。
前述の範囲内で酸化剤と反応させることによって、置換率が１０乃至５０モル％であるＨＡ−アルデヒド誘導体を製造することができる。置換率が前記範囲に達しない場合、結合可能な蛋白質の量が過度に少なくて所望の効果が十分に得られず、前記範囲を超過する場合、置換率が過度に高くてＨＡ受容体と相互作用をするのが難しく標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）効果を期待するのが難しいという問題があって好ましくない。
前記酸化剤との反応以後に、好ましくは蒸溜水に対して透析して精製する工程をさらに行なうことができる。
第２段階は前記第１段階を経て製造されたヒアルロン酸−アルデヒドを蛋白質のＮ−末端と反応させてヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲート（化学式２）を製造する段階であって、好ましくはｐＨ５乃至７の緩衝溶液、好ましくはｐＨ５乃至６．５の酢酸ナトリウムバッファー内で行うことができる。前記のような範囲を有するｐＨ条件下で接合工程を行うことによって蛋白質内に他のアミン基を有する例えば、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）などのような他のアミノ酸との前記ヒアルロン酸−アルデヒド間の反応を防止することができ、したがって、蛋白質の活性を最大化した状態で、生接合効率及び薬効時間を増大することができる。
詳しくは、前記ヒアルロン酸−アルデヒドを前記緩衝溶液に溶解させた後、蛋白質を添加してヒアルロン酸−アルデヒド誘導体内に含まれているアルデヒド基と蛋白質のＮ−末端のアミン基を反応させることができる。
蛋白質のＮ−末端基にはアミン基が存在するので、第２段階で使用される蛋白質は別途の準備過程なく活性成分である蛋白質自体で使用でき、好ましくは前記蛋白質は水に溶解させて水溶液状態で使用することができる。
前記ヒアルロン酸−アルデヒドに生接合される蛋白質は水溶液上で溶解されるものであれば特に制限されずに使用可能である。好ましくは、長期間周期的な薬物治療が伴われる疾病または皮膚疾患を予防、治療するための蛋白質薬物であり得、このような蛋白質薬物は例えばヒト成長ホルモン、インターフェロンアルファ、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トレイル（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ、ＴＲＡＩＬ）、またはインシュリンであり得る。また、長期間周期的な薬物治療が伴われる疾病または皮膚疾患は好ましくは矮小症、癌、糖尿病、火傷、アトピー、乾癬、湿疹、皮膚炎、にきび、または帯状疱疹であり得る。
また好ましくは、前記ヒアルロン酸−アルデヒドに生接合される蛋白質は抗原蛋白質であり得る。抗原蛋白質は例えば、病原体の蛋白質、組み換え蛋白質、糖蛋白質、またはペプチドであり得る。
抗原蛋白質がヒアルロン酸と結合されたコンジュゲートは皮膚組織内免疫細胞であるランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌ）と樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）を刺激して抗原蛋白質のみを投与した場合に比べてより強力な免疫反応を起こすことができワクチン組成物としての効果が非常に優れる（実験例１５参照）。
好ましくは、前記蛋白質はヒアルロン酸−アルデヒド１分子当り１乃至１０個分子数で結合されるように反応させることができる。前記のような範囲内の分子数の蛋白質が結合されたヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートはヒアルロン酸誘導体の置換率によって体内で２４時間乃至９６時間以上滞留可能であり、これを調節することによって薬効長期持続性薬物伝達システムとしての応用が可能である。本発明の一実施形態によるヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートは特に経皮伝達特性が良く皮膚疾患治療剤及び／または化粧品に応用可能であり、その他にも多様な蛋白質医薬品の経皮伝達薬物製剤への応用が可能である。
また好ましくは、前記蛋白質と共にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ、ＮａＣＮＢＨ３）を添加して反応させることができ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは前記蛋白質のＮ−末端のアミン基とヒアルロン酸誘導体のアルデヒド基が反応した後に生ずる二重結合を還元させる役割を果たす。前記シアノ水素化ホウ素ナトリウムは好ましくは、ヒアルロン酸−アルデヒドの置換率によってアルデヒド基の２乃至１０モル倍で添加して１２乃至２４時間反応させることができる。
一方、アルデヒド基は反応性が非常に良い特性があるので、好ましくは前記第２段階以後に、蛋白質と反応せず残っているアルデヒド基をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）する第３段階をさらに含むことができる。
このように反応に関与せず残っているアルデヒド基をブロッキングすることによって、残っているアルデヒド基がヒアルロン酸誘導体に結合された蛋白質の他のアミン基との反応を防止することができ、また本発明の一実施形態によるヒアルロン酸−蛋白質接合体が体内に入った以後、前記アルデヒド基と体内に存在する多様な蛋白質が非特異的（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に反応することを防止することができるなど、望まない反応を効果的に防止することができ、目的する反応の効率をより向上させることができる。
前記ブロッキングのために使用される物質はカルボキシル基やアルデヒド基と反応するものであれば特に制限されず使用可能であるが、好ましくはアミン類を用いることができる。このようなブロッキング過程は下記反応式２で示すことができる。
上記アミン類は、炭素数１乃至５の直鎖または分枝鎖アルキルカルバゼート（ａｌｋｙｌ ｃａｒｂａｚａｔｅ）、または炭素数１乃至５の低級アルカノールアミンであり得る。
前記アルキルカルバゼートは好ましくは、エチルカルバゼート（ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｚａｔｅ）またはｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（ｔｅｒｔ ｂｕｔｙｌ ｃａｒｂａｚａｔｅ）であり得、前記低級アルカノールアミンは例えばアミノメタノール（ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｏｌまたはＭＥＡ）、アミノエタノール（ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｏｌ）、アミノプロパノール（１−ａｍｉｎｏ−２−ｐｒｏｐａｎｏｌ、または１−ａｍｉｎｏ−３−ｐｒｏｐａｎｏｌ）、アミノブタノール（ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｌ）、またはアミノペンタノール（ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｌ）であり得、好ましくはアミノエタノールであり得る。
アミン類としてアルキルカルバゼート、例えばエチルカルバゼートを使用する場合、第３段階は下記反応式３のように示すことができ、好ましくは化学式２の化合物のアルデヒド基のモルユニットに対して５乃至１０モル倍で添加して１２乃至２４時間反応させ、蛋白質と反応せず残っているアルデヒド基がブロッキングされた化学式３の化合物を製造することができる。
またアミン類として、アルカノールアミン、例えばアミノエタノールを用いる場合、好ましくは前記化学式２の化合物のアルデヒド基のモルユニットに対して５乃至１０モル倍で添加して１２乃至２４時間反応させることができる。
アミン類を前記範囲内で添加することによって１００％ブロッキングが可能であり、前記範囲未満で添加する場合は１００％ブロッキングがされない可能性があるので好ましくない。
一方、前記アミン類として、アルキルカルバゼートを使用する場合、好ましくは好ましくはｐＨ５乃至７の条件下で反応させることができ、このために好ましくは前記第１段階に使用されたもののようなアセテートバッファーを使用することができる。
またアルカノールアミンを使用する場合、好ましくはｐＨ７乃至９の条件下で反応させることができ、このために好ましくはホスフェートバッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）のようなバッファーを使用することができる。
前述のように、本願のヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの製造方法はコンジュゲーション反応が水溶液上で行われ、水溶液に溶解可能な水溶性ペプチド及び蛋白質活性成分の生接合を通じた薬物伝達システム準備に応用可能である。
本発明の好ましい他の一実施形態は前述の製造方法によって製造された下記化学式２のヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートを提供する。
上記化学式２で、
Ｐは水溶性蛋白質を示し、
ｍ、ｎ、及びｌの総合計は５０乃至１０，０００の整数であり、ｎとｌの合計は５乃至５，０００の整数であり、ｌは１乃至１００の整数である。
前記ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートは人体に安全に適用でき、また蛋白質の特定アミノ酸と反応して蛋白質の生体活性度を最大化した状態で、生接合効率が高く、薬効時間を増大することができ効果的な経皮伝達剤形に応用できる。
一方、ヒアルロン酸は保湿及びシワ改善のために多数化粧品にも含まれている成分であって、皮膚の表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）細胞層に存在する角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）及び皮膚奥深い真皮（ｄｅｒｍｉｓ）層に存在する線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）などの皮膚細胞はヒアルロン酸の受容体を有しているためヒアルロン酸の濃度によって増殖が調節される。また、皮膚組織には多様な免疫細胞が存在しており、これを刺激した時、免疫反応活性化に寄与するので、より強力な免疫反応を起こすことができる効果的な経皮伝達用ワクチン組成物に適用できる。したがって、このような経皮伝達特性のあるヒアルロン酸を用いたヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートは皮膚疾患治療剤、蛋白質治療剤の経皮伝達薬物製剤、化粧品及びワクチンなどへの応用が期待される。
従って、本発明の好ましい他の一実施形態は、前記ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートを治療学的有効量で含む経皮伝達用薬学組成物、皮膚細胞の再生のための治療剤、化粧料組成物及びワクチン組成物を提供する。
前記治療学的有効量とは有利な効果または好ましい臨床的または生化学的結果、例えば疾病状態の緩和、改善、安定、復帰、進行を遅らせたり遅延させるのに十分な量を意味し、このような有効量は１回またはそれ以上で投与できる。
好ましくは、前記薬学組成物、化粧料組成物またはワクチン組成物はそれぞれ薬学的に許容可能な担体または化粧用として許容可能な担体、ワクチンとして許容可能な担体をさらに含むことができ、これに使用される好ましい担体及びその他の添加剤、賦形剤、安定化剤などは当分野で広く知られたものを当業者が適切に選択して使用することができる。
また本発明の他の好ましい一実施形態は、前述のような本発明の好ましい一実施形態による製造方法で化学式２のヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートを製造する段階；及び前記製造されたヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートを治療学的有効量で対象に投与する段階を含むヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの伝達方法を提供する。
前記蛋白質、ヒアルロン酸、及び治療学的有効量などについては前記で言及したものを同一に適用したり、当業者が適切に調整して適用することができる。
前記投与は好ましくは経皮投与であり得、前記対象は好ましくは哺乳類であり得る。
本発明のヒアルロン酸−バイオ医薬品接合体は、水溶液上でコンジュゲーション反応を行なうことができるので、水溶性の多様なペプチド及び蛋白質活性成分に適用可能であり、生体適合性、生分解性高分子であるヒアルロン酸の経皮透過伝達特性を維持して簡便で人体に適用するのに安全な蛋白質治療剤、化粧品及びワクチンの多様な応用が可能である。また、ヒアルロン酸アルデヒド誘導体と蛋白質のＮ−末端基が特定ｐＨ条件で特異的に反応して接合するため蛋白質の他のアミン基を有するアミノ酸と反応せず蛋白質の活性を高めた状態で接合体を合成することができる。従って、本発明のヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートは皮膚疾患治療剤、蛋白質治療剤の経皮伝達薬物製剤、化粧品、ワクチンなどとして効果的に用いることができる。
本発明の一実施形態によるアルデヒド基が導入されたヒアルロン酸誘導体及びこれを用いたヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの製造方法に関する化学的スキームを簡略に示したものである。 本発明の実施例による方法で製造されたＨＡ−アルデヒド−ＴＢＣ誘導体の１Ｈ−ＮＭＲ結果である。 本発明の実施例１による方法で製造されたヒアルロン酸−ヒト成長ホルモン（ＨＡ−ｈＧＨ）コンジュゲートとヒト成長ホルモン蛋白質（ｈＧＨ）のＧＰＣ結果を示したものである。 本発明の実施例２による方法で製造されたヒアルロン酸−オボアルブミン（ＨＡ−ＯＶＡ）コンジュゲートとオボアルブミン（ＯＶＡ）のＧＰＣ結果を示したものである。 ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの一つのヒアルロン酸チェ−ンに含まれているヒト成長ホルモン分子数及びヒト成長ホルモン分子数による生接合効率を示したものである。 ヒト成長ホルモンとヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの円偏光二色性分光分析（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ、ＣＤ）分析結果を比較して示したものである。 本発明の実施例１によるヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートとヒト成長ホルモンの活性度分析結果をＥＬＩＳＡ／ブラッドフォードアッセイ（ＥＬＩＳＡ／Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）の比率で示したものである。 本発明の実施例２によるヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲートとオボアルブミンの活性度分析結果をＥＬＩＳＡ／ブラッドフォードアッセイ（ＥＬＩＳＡ／Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）の比率で示したものである。 本発明の実施例１によるヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートとヒト成長ホルモンのヒト血清内安定性を比較して示したものである。 ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートとヒト成長ホルモンのＩＭ−９（ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ）細胞への信号伝達活性を確認したものである（Ａ：ヒト成長ホルモンの濃度別細胞信号伝達測定結果、Ｂ：５００ｎｇ／ｍｌのｈＧＨを含むＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートの細胞信号伝達測定結果、Ｃ：Ａ及びＢのバンド強度を測定して定量的に示すグラフ）。 ヒト皮膚細胞であるＤｅｔｒｏｉｔ５５１細胞に対するｈＧＨとＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート処理によるＪＡＫ２リン酸化程度を確認したものである（Ａ：ｈＧＨ処理によるＪＡＫ２リン酸化測定を通じたｈＧＨ受容体による信号伝達測定結果、Ｂ：ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート処理によるＪＡＫ２リン酸化測定を通じたｈＧＨ受容体による信号伝達測定結果、Ｃ：Ａのバンド強度を測定して定量的に示すグラフ、Ｄ：Ｂのバンド強度を測定して定量的に示すグラフ）。 ヒト皮膚細胞（ＨＥＫｎ、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１）のヒアルロン酸とヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの濃度別処理による細胞増殖効果を確認したものである（Ａ：ＨＥＫｎ細胞にヒアルロン酸を処理した時の濃度別細胞増殖効果、Ｂ：Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞にヒアルロン酸を処理した時の濃度別細胞増殖効果、Ｃ：ＨＥＫｎ細胞にヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートを処理した時の濃度別細胞増殖効果、Ｄ：Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞にヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートを処理した時の濃度別細胞増殖効果）。 本発明の実施例１によるヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの静脈内注射（ｉ．ｖ． ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）後の薬理特性分析（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）結果を示したものである。 本発明の実施例１によるヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートとヒト成長ホルモン、ヒアルロン酸の経皮透過特性分析結果を示したことである（Ａ：ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｂ：ＦＩＴＣ、Ｃ：ｈＧＨ−ＦＩＴＣ、Ｄ：ＨＡ−ＦＩＴＣ、Ｅ：ＨＡ−ｈＧＨ−ＦＩＴＣ）。 本発明の実施例２によるヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲートとオボアルブミン、ヒアルロン酸の経皮透過特性分析結果を示したものである（Ａ：ＰＢＳ、Ｂ：ＦＩＴＣ、Ｃ：ＯＶＡ−ＦＩＴＣ、Ｄ：ＨＡ−ＦＩＴＣ、Ｅ：ＨＡ−ＯＶＡ−ＦＩＴＣ）。 本発明の実施例１によるヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの経皮伝達後の薬理特性分析（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）結果を示したものである。 本発明の実施例２によるヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲートの経皮ワクチン特性分析結果であって、ＰＢＳ、オボアルブミン、ヒアルロン酸−オボアルブミンを経皮伝達した時の２週、４週後の血中オボアルブミン抗体濃度をＥＬＩＳＡで測定して示したものである。
以下、発明の多様な実施例について説明する。但し、これは発明の例示として提示されるもので、これによって発明の権利範囲が制限されるわけではない。
＜実施例：ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの製造＞
実施例１．ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートの製造
ヒアルロン酸（ＨＡ）（ＭＷ＝１００ｋＤａ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶かした後、過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ、ＮａＩＯ４）をヒアルロン酸単位体当り１モル（ｍｏｌｅ）倍で添加してそれぞれ３時間、６時間、１２時間光を遮断した状態で反応させた後、分画分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）が７０００ダルトンである透析膜を用いて蒸溜水に対して３日間透析して精製した後に３日間凍結乾燥させて置換率の異なるＨＡ−アルデヒド誘導体を得た。
前記で得られたＨＡ−アルデヒド誘導体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で１００ｍＭ、ｐＨ５．５のアセテートバッファーに溶かした後、ＬＧ生命科学から提供された水溶液状態のヒト成長ホルモンをＨＡ１分子（ｃｈａｉｎ）当りそれぞれ１個、４個、６個、８個が結合されるように添加した。ＨＡ−アルデヒド誘導体の置換率（置換率は下記実験例１の方法によって分析）によってアルデヒドの５モル倍でシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ、ＮａＣＮＢＨ３）を添加し２４時間反応させてヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートを製造した。その後、反応せず残っているアルデヒドをブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するためにエチルカルバゼート（ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｚａｔｅ）をアルデヒドの５モル倍で入れた後、２４時間さらに反応させた。本実施例ではエチルカルバゼートを用いてブロッキングしたが、アミノエタノール（ａｍｉｎｏ ｅｔｈａｎｏｌ）を用いることもでき、この場合、アルデヒドの５モル倍でアミノエタノールを入れた後にＮａＯＨを用いてｐＨを８に上げた後、１２時間さらに反応させる。
反応させた溶液をｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ））に対して透析した後、−７０℃に保管した。
実施例２．ＨＡ−ＯＶＡコンジュゲートの製造
ヒアルロン酸（ＨＡ）（ＭＷ＝２１５ｋＤａ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶かした後、過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ、ＮａＩＯ４）をヒアルロン酸単位体当り２モル（ｍｏｌｅ）倍で添加して３時間光を遮断した状態で反応させた後、分画分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）が７０００ダルトンである透析膜を用いて蒸溜水に対して３日間透析して精製した後、３日間凍結乾燥させてＨＡ−アルデヒド誘導体を得た。
前記で得られたＨＡ−アルデヒド誘導体を８ｍｇ／ｍｌの濃度で１００ｍＭ、ｐＨ５のアセテートバッファーに溶かした後、オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＡ１分子（ｃｈａｉｎ）当り３個、６個が結合されるように添加した。ＨＡ−アルデヒド誘導体の置換率（置換率は下記実験例１の方法によって分析）によってアルデヒドの５モル倍でシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ、ＮａＣＮＢＨ３）を添加し２４時間反応させてヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートを製造した。その後、反応せず残っているアルデヒドをブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するためにエチルカルバゼート（ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｚａｔｅ）をアルデヒドの５モル倍で入れた後、２４時間さらに反応させた。本実施例ではエチルカルバゼートを用いてブロッキングしたが、アミノエタノール（ａｍｉｎｏ ｅｔｈａｎｏｌ）を使用することもでき、この場合、アルデヒドの５モル倍でアミノエタノールを入れた後、ＮａＯＨを用いてｐＨを８に上げた後、１２時間さらに反応させる。
下記のような条件でＧＰＣ分析を実施してＨＡ−ＯＶＡを反応しないＯＶＡ、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、エチルカルバゼートなどから分離精製した後、分離精製されたＨＡ−ＯＶＡを遠心分離フィルターを用いて５０００ｇで濃縮し、濃縮された溶液を−７０℃に保管した。
＜ＧＰＣ分析条件＞
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ １５２５ ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣ ｐｕｍｐ
吸光度測定器：Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ｄｕａｌ λ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
サンプラ：Ｗａｔｅｒｓ ７１７ ｐｌｕｓ ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ５００＋Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ １０００
移動相（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ．
測定波長：２１０ｎｍと２８０ｎｍで二重測定（ｄｕａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）。
＜実験例＞
１．ヒアルロン酸アルデヒド誘導体の置換率分析
１）分析方法
実施例１のＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート製造過程と実施例２のＨＡ−ＯＶＡコンジュゲート製造過程中に製造されたＨＡ−アルデヒド誘導体の置換率を分析するために、製造されたＨＡ−アルデヒド誘導体を５ｍｇ／ｍｌの濃度で１００ｍＭ、ｐＨ５．２のアセテートバッファーに溶かした後、ヒアルロン酸単位体当りそれぞれ５モル倍のｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（Ｔｅｒｔ ｂｕｔｙｌ ｃａｒｂａｚａｔｅ、ＴＢＣ）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ、ＮａＣＮＢＨ３）を添加し２４時間反応させて、ＨＡ−アルデヒド誘導体内に含まれているアルデヒド基にＴＢＣが結合されたＨＡ−アルデヒド−ＴＢＣを製造した後、ＭＷＣＯ７０００透析膜を用いて蒸溜水に対して３日間透析した後、３日間凍結乾燥して１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＰＸ３００、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でアルデヒドの置換率を分析した。
２）分析結果
図２に示されているように、前記１）で製造されたＨＡ−アルデヒド−ＴＢＣ誘導体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルではヒアルロン酸のピーク以外にも、δ＝１．２〜１．４ｐｐｍに９個の水素を示すＴＢＣの３個のメチル（ｍｅｔｈｙｌ）ピークが現れた。定量分析のためにδ＝１．８５〜１．９５ｐｐｍのヒアルロン酸のアセトアミド官能基のメチル共鳴（ｍｅｔｈｙｌ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｏｆ ａｃｅｔａｍｉｄｏ ｍｏｉｅｔｙ ｏｆ ＨＡ）を内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ）に決めた。
実施例１、実施例２によるＨＡ−アルデヒドの置換率はδ＝１．８５〜１．９５ｐｐｍのピーク面積とδ＝１．２〜１．４ｐｐｍのピーク面積を比較して求めた。このような１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を通じてＨＡ−アルデヒドの置換率を計算してみた結果、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応時間を調節して１０〜５０モル％の置換率を調節して得ることができるのを確認した。即ち、ＨＡ−アルデヒドの置換率は過ヨウ素酸ナトリウムとの反応時間を長くするほど高く示され、より具体的に実施例１の場合、反応時間を３時間、６時間、及び１２時間とした場合にそれぞれ１０モル％、２０モル％、及び５０モル％の置換率を示し、実施例２の場合、反応時間を３時間とした場合に１５モル％の置換率を示した。
２．ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートのＧＰＣ分析
１）分析方法
実施例１によって製造されたヒアルロン酸−ヒト成長ホルモン（ＨＡ−ｈＧＨ）コンジュゲート（ＮａＩＯ４と３時間反応させて約１０モル％の置換率を有するＨＡ−ａｌｄ誘導体にヒト成長ホルモンをＨＡ（１００ｋＤａ）１分子（ｃｈａｉｎ）当り６モル倍で入れて反応させた接合体：反応率９５モル％以上）と実施例２によって製造されたヒアルロン酸−オボアルブミン（ＨＡ−ＯＶＡ）コンジュゲート（ＮａＩＯ４と３時間反応させて約１５モル％の置換率を有するＨＡ−ａｌｄ誘導体にオボアルブミンをＨＡ（２１５ｋＤａ）１分子（ｃｈａｉｎ）当り３モル倍で入れて反応させた接合体：反応率８０モル％以上）のＧＰＣ（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析を通じてヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの形成を確認した。ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いてヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートをＧＰＣ分析した。分析条件は下記の通りである。
＜ＧＰＣ分析条件＞
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ １５２５ ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣ ｐｕｍｐ
吸光度測定器：Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ｄｕａｌ λ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
サンプラ：Ｗａｔｅｒｓ ７１７ ｐｌｕｓ ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ
カラム：（ｈＧＨ）Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ５００＋Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ２５０
（ＯＶＡ）Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ５００＋Ｗａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ １０００
移動相：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ．
測定波長：２１０ｎｍと２８０ｎｍで二重測定（ｄｕａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）。
２）分析結果
ＨＡ−ｈＧＨのＧＰＣ分析結果、図３ａに示されているように、２８０ｎｍの波長で高分子量のヒアルロン酸の滞留時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）である１４〜１５分付近でピークが現れ、ヒアルロン酸（ＨＡ）に蛋白質がコンジュゲーションされたことを確認した。また、ＨＡ−ＯＶＡのＧＰＣ分析結果、図３ｂに示されているように、２１０ｎｍでＯＶＡのピークが高分子量側にシフトされ３１〜３２分台で現れ、蛋白質がコンジュゲーションされたことを確認した。
３．ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの定量分析
１）分析方法
前記実施例１及び実施例２によって製造されたＨＡ−蛋白質コンジュゲート内の蛋白質含量は前記実験例２のＧＰＣ分析結果でピークの下の面積を測定して求めた。
ＨＡ−ｈＧＨの場合、１ｍｇ／ｍＬ濃度でｈＧＨ原液を準備した後、蒸溜水に希釈してｈＧＨ標準溶液を準備した。ｈＧＨ標準溶液を前記実験例２のＧＰＣ分析条件で分析してｈＧＨ濃度によるＧＰＣピークの下の面積の標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を求めた。前記実施例１によって製造されたＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート（ＮａＩＯ４と３時間反応させて約１０モル％の置換率を有するＨＡ−ａｌｄ誘導体にヒト成長ホルモンをＨＡ（１００ｋＤａ）１分子（ｃｈａｉｎ）当り６モル倍で入れて反応させた接合体：反応率９５モル％以上）を同じ条件で分析して得られたＧＰＣピークの下の面積を標準曲線に代入してｈＧＨ含量を求めた。
ＨＡ−ＯＶＡの場合にはＨＡ−ｈＧＨと同様に標準溶液を準備して標準曲線を求め、精製前に反応せず残っているＯＶＡの濃度を計算して反応したＯＶＡの含量を求めた。前記実施例２によって製造されたＨＡ−ＯＶＡコンジュゲートの場合、図３ｂのように反応しないＯＶＡピークが３６〜３７分程度に現れるので、その面積を標準曲線に代入することによって反応しないＯＶＡ含量を通じてコンジュゲート内のＯＶＡ含量を計算した。
２）分析結果
実施例１によって製造されたＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート内の蛋白質（ｈＧＨ）含量はフィード（ｆｅｅｄ）内でＨＡ一分子当り反応させた蛋白質の分子数によって増加することが分かった。ＨＡ一分子当り反応させた蛋白質の分子数を１、４、６、８個に変化させた時、ＨＡ一分子当り結合した蛋白質の平均分子数は１、４、６、８個に調節可能であった。即ち、蛋白質の生接合効率（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（％）は分子数に関係なく９５％以上と示された（図４）。実施例２によって製造されたＨＡ−ＯＶＡコンジュゲート内の生接合効率（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（％）は分子数３である時に８０％内外、分子数６である時に６５％内外と示された。
４．ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートのＣＤ分析
１）分析方法
ｈＧＨ濃度を基準にして（０．２５ｍｇ／ｍｌ）ｈＧＨ溶液とＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート溶液を用いて円偏光二色性分光分析（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）をした。分析条件は下記の通りである。
＜ＣＤ分析条件＞
ＵＶ分光光度計（ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）：ＪＡＳＣＯ Ｊ−７１５
測定条件：２５℃、２００〜２５０ｎｍ、Ｎ２雰囲気
石英キュベット（Ａ ｑｕａｒｔｚ ｃｕｖｅｔｔｅ）：２ｍｍ経路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）
未加工データ（Ｒａｗ ｄａｔａ）：反応時間１秒によって０．２ｍｍ間隔
２）分析結果
図５に示されているように、ｈＧＨのスペクトルとＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートのＣＤのピーク（ｐｅａｋ）が一致することと示され、ヒト成長ホルモンの２次構造がヒアルロン酸と接合された状態でも維持されることが分かった。
５．ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの活性度分析
１）分析方法
１ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモン溶液の原液をそれぞれ０．５、１、５、１０、２０、３０、５０ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈してヒト成長ホルモン標準溶液を準備し、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を用いて標準曲線を求めた。即ち、ヒト成長ホルモン標準溶液とクマシーブルー試薬（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）を１：１の体積比率で混合した後、常温で１０分間反応（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させた後に５９５ｎｍで吸光度を測定して標準曲線を求めた。
その後、前記実施例１によって準備されたヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲート（それぞれ約１０モル％、２０モル％、及び３５モル％（ＮａＩＯ４との反応時間を８時間にしたこと以外は実施例１と同一に製造）の置換率を有するＨＡ−ａｌｄ誘導体にヒト成長ホルモンをＨＡ（１００ｋＤａ）１分子（ｃｈａｉｎ）当り６モル倍で入れて反応させた接合体：反応率９５モル％以上）とヒト成長ホルモンを１００倍に希釈して同じ条件でブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）で吸光度を測定した後、標準曲線に代入してヒト成長ホルモンの含量を求めた。
その次に、先にブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を実施したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及び各ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲート（ＨＡ−ｈＧＨ）サンプルとヒト成長ホルモン標準溶液を１００００倍希釈してＥＬＩＳＡを通じて活性度を有するヒト成長ホルモンの含量を求めた。即ち、ｈＧＨ１ｍｇ／ｍｌ標準溶液を希釈して０、１、２、５、１０、２０ｎｇ／ｍｌの間の基準溶液を作り、前記各サンプルを０、１、２、５、１０、２０ｎｇ／ｍｌ範囲に入るようにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を用いて希釈した。その次に、ｈＧＨ抗体が敷かれている９６ウェルに各基準溶液とサンプルを希釈した溶液を２００ｕｌずつローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）した後、３７℃で一時間反応させた。その後、洗浄液（Ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて２５０ｕｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄し、ａｎｔｉ−ｈＧＨ−ＤＩＧ溶液を２００ｕｌ／ｗｅｌｌでローディングした後、３７℃で１時間反応させた。再び５回を洗浄しａｎｔｉ−ＤＩＧ−ＰＯＤ二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を２００ｕｌ／ｗｅｌｌに処理した後、３７℃で一時間反応させた。その後、洗浄を５回さらに行なった後にＰＯＤ基質（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）溶液を２００ｕｌ入れ、光を遮断した状態で２０分間反応させた後、４０５ｎｍで吸光を測定した。測定された吸光度の値を基準溶液の標準曲線に代入して抗体と相互作用をするサンプルの濃度を測定した。ＥＬＩＳＡに使用された全ての物質はｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ｒｏｃｈｅ）内に含まれたものを使用した、
ＥＬＩＳＡ／ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）の比率を通じてヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの活性度を分析した。
２）分析結果
図６ａに示されているように、ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートのＥＬＩＳＡ／ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）の比率が７０％以上と示されることが分かった。
具体的に、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）は蛋白質のリシン（ｌｙｓｉｎｅ）を測定するアッセイ方法であり、ＥＬＩＳＡはｈＧＨと結合する抗体との相互作用を通じて定量するアッセイ方法であって、この比率を通じてヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの活性度を測定することができ、図６ａに示されているようにコンジュゲート内に存在する蛋白質中の７０％以上が活性を有していることが分かった。
６．ヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲートの活性度分析
１）分析方法
１ｍｇ／ｍｌのオボアルブミン溶液の原液をそれぞれ０．６、１．２、２．５、５、１０、２０ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈して製造したオボアルブミン標準溶液を使用したこと以外は前記実験例５と同様な方法で標準曲線を求めた。
その後、前記実施例２によって準備されたヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲート（それぞれ約１５モル％の置換率を有するＨＡ−ａｌｄ誘導体にオボアルブミンをＨＡ（２１５ｋＤａ）１分子（ｃｈａｉｎ）当り３モル倍、６モル倍で入れて反応させた接合体）とオボアルブミンを１０００倍に希釈して同じ条件でブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）で吸光度を測定した後、標準曲線に代入してオボアルブミンの含量を求めた。
その次に、先にブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を実施したオボアルブミン（ＯＶＡ）及び各ヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲート（ＨＡ−ＯＶＡ）サンプルとオボアルブミン標準溶液を１０００倍希釈してＥＬＩＳＡを通じて活性度を有するオボアルブミンの含量を求めた。
９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウェル（ｗｅｌｌ）にＯＶＡ抗体（Ａｎｔｉ−ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を一時間ローディングしてコーティングし、洗浄液（Ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて３００ｕｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。ＯＶＡ １ｍｇ／ｍｌ標準溶液を希釈して０、０．６、１．２、２．５、５、１０、２０ｎｇ／ｍｌの間の基準溶液を作り、前記各サンプルを０−２０ｎｇ／ｍｌ範囲に入るようにＰＢＳを用いて希釈した。９６ウェルに各基準溶液とサンプルを希釈した溶液を５０ｕｌずつローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）した後、常温で一時間反応させた。その後、洗浄液（Ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて３００ｕｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、ａｎｔｉ−ＯＶＡ−ＨＲＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１００ｕｌ／ｗｅｌｌでローディングした後、常温で１時間反応させた。再び３回を洗浄しＴＭＢ（３、３’、５、５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液を５０ｕｌ入れ、光を遮断した状態で２０分間反応させた。停止液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（２Ｎ硫酸溶液）を処理し、４５０ｎｍで吸光を測定した。測定された吸光度の値を基準溶液の標準曲線に代入して抗体と相互作用をするサンプルの濃度を測定した。
ＥＬＩＳＡ／ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）の比率を通じてヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲートの活性度を分析した。
２）分析結果
図６ｂに示されているように、ヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲートのＥＬＩＳＡ／ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）の比率が８０％以上と示されることが分かった。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）とＥＬＩＳＡについては前記実験例５で言及した通りであり、したがって図６ｂに示されているように、ヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲート内に存在する蛋白質中の８０％以上が活性を有していることが分かった。
７．ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの血清安定性（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）分析（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
１）分析方法
製造されたヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートの血清安定性を確認してみるためにヒアルロン酸に結合されないｈＧＨと、次のサンプルを使用した。
−ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート（２０／６：アルデヒド基置換率が２０モル％でありＨＡ一分子（ｃｈａｉｎ）当り６個のｈＧＨ分子が結合したもの）
上記サンプルとｈＧＨをｈＧＨ濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように同一に調節してそれぞれヒト血清（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ）（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解して３７℃で１２０時間培養した。定められた時間になった時、一部をサンプリングしてヒト血清の影響を防止するためにＰＢＳに１０００倍に希釈した後、冷凍させた。各サンプルの生物学的活性度はｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ｒｏｃｈｅ）を用いてｒｏｃｈｅ製造社の基準プロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に沿って測定した。
２）分析結果
図７に示されているように、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）よりＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートがヒト血清内でさらに長時間安定するのを確認することができ、特にＨＡに対するｈＧＨ分子の結合量が増加するほど安定性がさらに高まることが分かった。
８．ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの細胞信号伝達活性テスト（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ）（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
１）分析方法
ＩＭ−９細胞はヒトＢリンパ芽球細胞（ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ）であって、ｈＧＨ受容体を有しておりｈＧＨが受容体に結合するとＪＡＫ２（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ２、ヤヌスキナーゼ２）がリン酸化される特性があるので、これを用いてＨＡ−ｈＧＨ接合体の生物学的活性度を確認した。
ＩＭ−９細胞（韓国細胞株銀行）を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと２５ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれているＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で培養した。全ての細胞は標準組織培養皿（ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）で培養し、培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）は５％ＣＯ２（ｇ）と相対湿度が維持される３７℃培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に保管した。ＩＭ−９細胞にｈＧＨを濃度別に処理して３７℃で２４時間培養した後、リン酸化されたＪＡＫ２をウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じて定量して細胞信号伝達が最もよく起こるｈＧＨの濃度を確認し、このような濃度でＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート（ＮａＩＯ４と３時間反応させて約１０モル％の置換率を有するＨＡ−ａｌｄ誘導体にヒト成長ホルモンをＨＡ（１００ｋＤａ）１分子（ｃｈａｉｎ）当り６モル倍で入れて反応させた接合体：反応率９５モル％以上）を細胞に処理して同様に信号伝達が起こるか確認した（参考文献：Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０−６８５（１９７０）；実験に使用された抗体はｓａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏ．で購入）。
２）分析結果
図８Ａ乃至８Ｃに示されているように、ヒト成長ホルモンを５００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した時に細胞信号伝達が最もよく起こるのを確認することができ（図８のＡ）、同じ濃度のｈＧＨを含むＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートを処理した時も細胞信号伝達が起こるのを確認することができた（図８のＢ）。図８Ｃは８Ａ及び８Ｂのウエスタンブロット結果として示されたバンド強度（ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定して定量的に示すグラフである。したがって、ｈＧＨがＨＡに接合された後にも生物学的活性を有するのを確認することができた。
９．ヒト皮膚細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞にｈＧＨ及びＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート処理によるＪＡＫ２のリン酸化
１）分析方法
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＤｅｔｒｏｉｔ５５１（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳと２５ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれているＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で培養した。全ての細胞は標準組織培養皿で培養し、培養皿は５％ＣＯ２（ｇ）と相対湿度が維持される３７℃培養器に保管した。Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞にｈＧＨとＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート（ＮａＩＯ４と３時間反応させて約１０モル％の置換率を有するＨＡ−ａｌｄ誘導体にヒト成長ホルモンをＨＡ（１００ｋＤａ）１分子（ｃｈａｉｎ）当り６モル倍で入れて反応させた接合体：反応率９５モル％以上）を濃度別に処理して細胞信号伝達（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によるＪＡＫ２のリン酸化程度を実験例７のような方法でウエスタンブロットを通じて確認した。
２）分析結果
ＪＡＫ２のリン酸化は前述のようにｈＧＨがｈＧＨ受容体に結合する時に起こる現象である。
図９Ａに示されているように、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞にｈＧＨを処理した時にＪＡＫ２がリン酸化されｈＧＨ受容体による信号伝達が起こるのを確認することができ、図９Ｂに示されているようにＨＡ−ｈＧＨ接合体を処理した時もＪＡＫ２がリン酸化されＨＡ受容体による信号伝達が起こるのを確認することができた。図９Ｃ、９Ｄは濃度による信号伝達物質の濃度を図９Ａと９Ｂでウエスタンブロット結果として示されたバンド強度（ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を定量化して示すグラフである。
このようにＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートはヒト皮膚細胞のＨＡ受容体及び／またはｈＧＨ受容体に結合して細胞信号伝達効果を奏することが分かった。
１０．ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート処理によるヒト皮膚細胞株の増殖測定
１）分析方法
ヒト新生児の表皮角化細胞（ｈｕｍａｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨＥＫｎ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１％ＨＫＧＳ（ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）が含まれているＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１（ＡＴＣＣ）は１０％ＦＢＳと２５ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれているＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で培養した。全ての細胞は標準組織培養皿で培養し、培養皿は５％ＣＯ２（ｇ）と相対湿度が維持される３７℃培養器に保管した。９６−ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウェルに３＊１０３個の細胞（Ａ：ＨＥＫｎ Ｂ：Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１）を分注（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間経過した後にそれぞれ異なる濃度のヒアルロン酸とｈＧＨを含むＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート（ＮａＩＯ４と３時間反応させて約１０モル％の置換率を有するＨＡ−ａｌｄ誘導体にヒト成長ホルモンをＨＡ（１００ｋＤａ）１分子（ｃｈａｉｎ）当り６モル倍で入れて反応させた接合体：反応率９５モル％以上）を処理した。その次に、細胞増殖程度を確認するために４８時間以後にＷＴＳ−１（ＴａＫａＲａ）を細胞に処理した。生きている細胞でミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）の脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によってＷＴＳ−１（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ）がホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に変換されることによって培地溶液に対する吸光度の変化が起こるようになるので、ＷＳＴ−１を処理した９６ウェルプレートを３７℃で１時間放置した後、４５０ｎｍ波長に対する吸光度を測定した。
２）分析結果
図１０に示されているように、ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートの濃度変化によって細胞増殖が起こるのを確認することができた。
ＨＡを１０ｕｇ／ｍｌの高濃度に処理した時、ＨＥＫｎ細胞の場合は２０％の増殖効果を（図１０のＡ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞の場合は６０％の増殖効果をそれぞれ示したが（図１０のＢ）、このようにＨＡ濃度が高い場合には接合されたｈＧＨの濃度が過度に高くなりｈＧＨの信号伝達を妨害することがあるので、ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートの場合、ＨＡとｈＧＨの効果を適切に見るための低濃度条件で実験を行なった。
低濃度条件で測定時、ＨＡ受容体は存在するがｈＧＨ受容体は存在しないＨＥＫｎ細胞（図１０のＣ）の場合、ＨＡ−ｈＧＨ接合体の濃度増加による細胞増殖効果の差が比較的に小さく示されたが、これとは異なり、ｈＧＨ受容体とＨＡ受容体が全て存在すると確認されたＤｅｔｒｏｉｔ５５１細胞（図１０のＤ）の場合、ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートの濃度が増加するほど細胞増殖がさらによく起こるのを確認することができ、特に信号伝達が最もよく起こるヒト成長ホルモン濃度である５００ｎｇ／ｍｌでＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートを処理した時に最も細胞増殖効果が優れているの（約４０％増殖）を確認することができた。
１１．ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの薬理（ＰＫ）特性分析（Ｉｎ ｖｉｖｏ）
１）分析方法
ＳＤラット（雌、６週齢、２００ｇ）の尾静脈を通じてＰＢＳ、ｈＧＨ、ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートをｈＧＨ基準に１ｍｇ／ｍｌ溶液を準備して３００ｕｌ容量をそれぞれ投与した後、定められた時間になった時、尾静脈から血液を採取し、各サンプルの血中濃度をｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ｒｏｃｈｅ）を用いて製造社の方法によって測定した。
２）分析結果
図１１に示されているように、ｈＧＨ血中濃度は２４時間以前に基準線（ｂａｓｅｌｉｎｅ）に落ちたが、ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートの形態に提供される場合には血中濃度が高く維持され、特にアルデヒド置換率が高い２０％のアルデヒドが導入されているＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート（２０／６）の血中濃度は３日目にも基準線に落ちなく、本発明の一実施例によるコンジュゲート形態に蛋白質薬物が提供される場合、薬物の体内半減期が長くなり薬効が長続きするのを確認することができた。
１２．ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの経皮薬物伝達特性分析
１）分析方法
毛がない（Ｈａｉｒｌｅｓｓ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、６週齢、２０ｇ）とＰＢＳ、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏ−ｃｙａｎａｔｅ）、ｈＧＨ−ＦＩＴＣ、ＨＡ−ＦＩＴＣ、ＨＡ−ｈＧＨ−ＦＩＴＣコンジュゲートを準備した。
ＦＩＴＣがタギングされたｈＧＨ−ＦＩＴＣ及びＨＡ−ｈＧＨ−ＦＩＴＣコンジュゲートは先ずＦＩＴＣを２ｍｇ／ｍｌの濃度にｐＨ９リン酸塩バッファーに溶かした後、ＦＩＴＣが蛋白質（ｈＧＨ）の５モル倍になるようにｈＧＨ溶液と混合した後、３時間反応させた。その後、ＰＤ１０カラムを用いて反応しないＦＩＴＣを精製して準備した。
アミン基がないＦｒｅｅ ＨＡの場合、ＦＩＴＣと反応するためにＨＡのカルボキシ基にヘキサメチレンジアミン（Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）をＥＤＣを触媒として用いて接合してアミン基を導入した後、前記ＨＡ−ｈＧＨと同じ条件でＦＩＴＣと反応させてＦＩＴＣがタギングされたＨＡ−ＦＩＴＣを準備した。準備されたサンプルをマウスの背中側皮膚１ｃｍ×１ｃｍ面積にＦＩＴＣ基準に１ｍｇ／ｍｌの濃度で１００ｕｌを塗った。１時間以後に皮膚組織を採取して凍結用包埋剤であるＯＣＴコンパウンド（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で固定した後、３０ｕｍ厚さに凍結切断（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）して共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）組織の蛍光分析を通じて、各サンプルの経皮透過率を確認した。
２）分析結果
図１２（Ａ：ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｂ：ＦＩＴＣ、Ｃ：ｈＧＨ−ＦＩＴＣ、Ｄ：ＨＡ−ＦＩＴＣ、Ｅ：ＨＡ−ｈＧＨ−ＦＩＴＣ）に示されているように、ＨＡと結合しないＦＩＴＣ（Ｂ）、ｈＧＨ−ＦＩＴＣ（Ｃ）の場合、皮膚組織層を通過せず皮膚組織の外側部分のみで蛍光が観察されるが、ＨＡと結合を形成したＨＡ−ＦＩＴＣ（Ｄ）、ＨＡ−ｈＧＨ−ＦＩＴＣ（Ｅ）の場合、皮膚組織内部にも均等に蛍光が分布することと示されＨＡの経皮伝達特性を確認することができた。また、このような結果を通じて親水性蛋白質であるヒト成長ホルモンが接合されたＨＡの誘導体（Ｅ）の場合にもＨＡと同様に優れた経皮伝達特性を有することを確認した。
１３．ヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲートの経皮薬物伝達特性分析
１）分析方法
毛がない（Ｈａｉｒｌｅｓｓ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、６週齢、２０ｇ）とＰＢＳ、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏ−ｃｙａｎａｔｅ）、ＯＶＡ−ＦＩＴＣ、ＨＡ−ＦＩＴＣ、ＨＡ−ＯＶＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートを準備した。
ＦＩＴＣがタギングされたＯＶＡ−ＦＩＴＣ及びＨＡ−ＯＶＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートは先ずＦＩＴＣを２ｍｇ／ｍｌの濃度にｐＨ９リン酸塩バッファーに溶かした後、ＦＩＴＣが蛋白質（ＯＶＡ）の１０モル倍になるようにＯＶＡ溶液と混合した後、３時間反応させた。ＯＶＡ溶液と混合した後、ｐＨ９の炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝溶液で１２時間反応させた。その後、過量の水に透析して反応しないＦＩＴＣを精製して準備した。
アミン基がないＦｒｅｅＨＡの場合、ＦＩＴＣと反応するためにＨＡのカルボキシ基にヘキサメチレンジアミン（Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）をＥＤＣを触媒として用いて接合してアミン基を導入した後、前記ＨＡ−ＯＶＡと同じ条件でＦＩＴＣと反応させてＦＩＴＣがタギングされたＨＡ−ＦＩＴＣを準備した。準備されたサンプルをマウスの背中側皮膚１ｃｍ×１ｃｍ面積にＦＩＴＣ基準に１ｍｇ／ｍｌの濃度で５０ｕｌを塗った。１時間以後に皮膚組織を採取して凍結用包埋剤であるＯＣＴコンパウンド（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で固定した後、３０ｕｍ厚さに凍結切断（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）して共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の蛍光分析を通じて、皮膚組織断面で物質の経皮透過率を確認した。
２）分析結果
図１３（Ａ：ＰＢＳ、Ｂ：ＦＩＴＣ、Ｃ：ＯＶＡ−ＦＩＴＣ、Ｄ：ＨＡ−ＦＩＴＣ、Ｅ：ＨＡ−ＯＶＡ−ＦＩＴＣ）に示されているように、ＨＡと結合しないＦＩＴＣ（Ｂ）、ＯＶＡ−ＦＩＴＣ（Ｃ）の場合、皮膚組織層を通過せず皮膚組織の外側部分のみで蛍光が観察されるが、ＨＡと結合を形成したＨＡ−ＦＩＴＣ（Ｄ）、ＨＡ−ＯＶＡ−ＦＩＴＣ（Ｅ）の場合、皮膚組織内部にも均等に蛍光が分布することと示されＨＡの経皮伝達特性を確認することができた。また、このような結果を通じて親水性蛋白質であるオボアルブミンが接合されたＨＡの誘導体（Ｅ）の場合にもＨＡと同様に優れた経皮伝達特性を有するのを確認した。
１４．ヒアルロン酸−ヒト成長ホルモンコンジュゲートの薬理（ＰＫ）特性分析（Ｉｎ ｖｉｖｏ）
１）分析方法
ＳＤラット（雌、６週齢、２００ｇ）の背中皮膚の毛を刈った後、３ｃｍ×３ｃｍの面積にＰＢＳ、ｈＧＨ、ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートをそれぞれｈＧＨ濃度基準に１．５ｍｇ／ｍｌ溶液を３００ｕｌ塗った後、定められた時間になった時に尾静脈から血液を採取して各サンプルの血中濃度をｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。また、経皮伝達効率を皮下注射時と比較するために、ＨＡ−ｈＧＨコンジュゲートを上記のような容量で皮下注射形態に投入した後、同様な方法で時間別血中濃度を測定した。
２）分析結果
図１４に示されているように、ＨＡと結合されないｈＧＨの場合、皮膚組織層を通過せず血中濃度が基準線（ｂａｓｅｌｉｎｅ）と示されたが、経皮伝達されたＨＡ−ｈＧＨコンジュゲート（１０／６）の場合、血中濃度がＣｍａｘ：２０ｎｇ／ｍｌ程度であることと示され血液でｈＧＨが検出されたのを確認することができ、したがって、ＨＡ−ｈＧＨの形態に経皮伝達する場合、ｈＧＨが皮膚組織層を通過して血中に効果的に伝達されることが分かった。
また、前記経皮伝達剤形は皮下注射剤形の２０％以上に該当する生物学的利用能（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を有することと示され、これは経皮伝達時に皮膚組織層を通過しなければならないため注射剤型に比べて効率が低いしかない点を考慮する時、経皮伝達剤形としては非常に優れた効果を有するものと見なすことができる。だけでなく、患者の便宜性を考慮する時、周期的な注射をすることより、皮膚に塗ることのみで注射の２０％以上の効果が得られるという点は患者の便宜が大きく増進されるという点で非常に効果的である。特に矮小症など長期間の周期的な治療を受けなければならない場合、その長所がさらに強調される。
１５．ヒアルロン酸−オボアルブミンコンジュゲートの経皮ワクチン特性分析（Ｉｎ ｖｉｖｏ）
１）分析方法
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雄、８週齢、２０ｇ）背中皮膚の毛を刈った後、１ｃｍ×１ｃｍの面積にＰＢＳ、ＯＶＡ、ＨＡ−ＯＶＡコンジュゲートをそれぞれＯＶＡ濃度基準に１０ｍｇ／ｍｌ溶液を５０ｕｌ塗った。経皮伝達後、それぞれ２週と４週後に血液サンプルを採取してＡｎｔｉ−ＯＶＡ ＩｇＧ抗体濃度をＥＬＩＳＡで定量した。
具体的に、９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウェル（ｗｅｌｌ）にオボアルブミンを一時間ローディングしてコーティングし、洗浄液（Ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて３００ｕｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。マウスａｎｔｉ−ＯＶＡ抗体標準溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を希釈して０、３、６、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍｌの間の基準溶液を作り、前記各サンプルを０−２０ｎｇ／ｍｌ範囲に入るようにＰＢＳを用いて希釈した。９６ウェルプレートに各基準溶液とサンプルを希釈した溶液を５０ｕｌずつローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）した後、常温で一時間反応させた。その後、洗浄液（Ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて３００ｕｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ）−ＨＲＰ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１００ｕｌ／ｗｅｌｌでローディングした後、常温で１時間反応させた。再び３回洗浄し、ＴＭＢ溶液を５０ｕｌ入れて光を遮断した状態で２０分間反応させた。停止液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（２Ｎ硫酸溶液）を５０ｕｌ処理して４５０ｎｍで吸光を測定した。測定された吸光度の値を基準溶液の標準曲線に代入して血中ａｎｔｉ−ＯＶＡ ＩｇＧ抗体濃度を測定した。
２）分析結果
図１５に示されているように、同じ容量、同じ濃度のＯＶＡとＨＡ−ＯＶＡを経皮伝達した時、ＨＡ−ＯＶＡコンジュゲート形態に経皮伝達された場合、ＯＶＡのみを経皮伝達した場合に比べて２週後には５倍、４週後には１５倍程度高い濃度の抗体を生成するようにすることが分かった。このような結果はＨＡ−ＯＶＡコンジュゲートがＯＶＡに比べて表皮と真皮に効果的に伝達されたためであると考えられる。皮膚組織の奥深くに透過したＨＡ−ＯＶＡコンジュゲートは皮膚組織内免疫細胞であるランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌ）と樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）を刺激して効果的に免疫反応を起こす。このような結果に基づいてＨＡ−ＯＶＡコンジュゲートをはじめとするＨＡ−ワクチンコンジュゲートは優れた経皮伝達特性によって抗体生成率を顕著に高めることができるのを確認することができ、したがって患者便宜性と共にワクチン効果を顕著に向上させることができる優れたワクチン伝達体として有用に用いられると期待される。

Claims (6)

  1. 下記化学式２のヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートを含む、蛋白質経皮伝達用組成物：
    上記化学式２で、
    Ｐは水溶性蛋白質を示し、
    ｍとｎ及びｌの総合計は５０乃至１０，０００の整数であり、ｎとｌの合計は５乃至５，０００の整数であり、ｌは１乃至１００の整数であり、
    前記ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲートが、ヒアルロン酸−アルデヒド１分子あたり１乃至１０分子の蛋白質が結合されていて、
    前記ヒアルロン酸−蛋白質コンジュゲート中のヒアルロン酸は、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の塩であることを特徴とする組成物。
  2. 前記水溶性蛋白質は、ヒト成長ホルモン、インターフェロンアルファ、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トレイル（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ、ＴＲＡＩＬ）、オボアルブミンまたはインシュリンである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ヒアルロン酸、またはヒアルロン酸の塩は分子量が１０，０００乃至３，０００，０００ダルトン（Ｄａ）である、請求項１に記載の組成物。
  4. 請求項１に記載の組成物を含む薬物。
  5. 請求項１に記載の組成物を含む化粧料。
  6. 請求項１に記載の組成物を含む経皮伝達用ワクチン。
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