JP5784142B2 - ヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲート及びその製造方法 - Google Patents
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Description
製造例1:ヒアルロン酸アルデヒド誘導体の製造
ヒアルロン酸(HA)(MW=6.4kDa、35kDa、100kDa、230kDa)10mg/mlの濃度で水に溶かした後、過ヨード酸ナトリウム(sodium periodate)を単位体当たり1mole倍で添加して、各々2時間、6時間、12時間の間光を遮断した状態で反応させた。その後、前記溶液を蒸溜水に対して透析して精製した後、3日間凍結乾燥させて置換率が異なるヒアルロン酸アルデヒド誘導体(HA−aldehyde誘導体)を得た。
ヒアルロン酸(HA)(MW=6.4kDa、35kDa、100kDa、230kDa)5mg/mlの濃度で水に溶かした後、HA単位体の20mole倍分量のAdipic Acid Dihydrazide(ADH)を添加した後、HClで溶液のpHを4.8で合わせた後、30分間stirringさせた後、溶液にHA単位体の4mole倍分量のN−(3Dimethylaminopropyl)N’thylcarbodiimidehydro chloride(EDC、Mw=191.71)を添加した後、各3分、2時間の間pHを4.8で維持しながら反応させる。その後、前記溶液を蒸溜水に対して透析して精製した後、3日間凍結乾燥させて置換率が異なるHA−ADH誘導体を得た。作られたHA−ADH誘導体を10mg/mlの濃度でpH5.2の酢酸ナトリウム緩衝液に溶かした後、導入されたADHの10mole倍のグルタルアルデヒドを添加した後24時間の間反応させる。その後、溶液を蒸溜水に対して透析して精製した後、3日間凍結乾燥させて置換率が異なるHA−ADH−Aldehyde誘導体を得た。
製造例1により用意したヒアルロン酸アルデヒド誘導体を5mg/mlの濃度でpH5.2の酢酸ナトリウム緩衝液に溶かした後、ヒアルロン酸単位体当たり5mole倍のカルバジン酸テトラブチル(TBC:Tetrabutyl carbazate)とシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN:sodium cyannoborohydride)を添加して24時間反応させた。この溶液を蒸溜水に対して透析した後、3日間凍結乾燥して1H−NMR(DPX300、Bruker、Germany)でアルデヒドの置換率を分析した。
製造例2により用意したヒアルロン酸アルデヒド誘導体を5mg/mlの濃度でpH5.2の酢酸ナトリウム緩衝液に溶かした後、ヒアルロン酸単位体当たり5mole倍のカルバジン酸テトラブチル(TBC:Tetrabutyl carbazate)とシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN:sodium cyannoborohydride)を添加して24時間反応させた。この溶液を蒸溜水に対して透析した後、3日間凍結乾燥して1H−NMR (DPX300、Bruker、Germany)でアルデヒドの置換率を分析した。その結果、図1の(B)に示したように、製造例2によるHA−TBCの1H−NMRスペクトルでは、ヒアルロン酸のピーク以外にも、δ=1.2〜1.4ppmに9個の水素を示すTBCの3個のメチルピークが現われた。定量分析のためにδ=1.85〜1.95ppmのヒアルロン酸のヒアルロン酸のアセトアミド官能基のメチル共鳴(methyl resonance of acetamido moiety of HA)を内部標準(internal standard)で決めた。製造例2によるHA−Aldehydeの置換率は、δ=1.85〜1.95ppmのピーク面積とδ=1.2〜1.4ppmのピーク面積を比較して求めた。このような1H−NMR分析結果を通じてヒアルロン酸−アルデヒド誘導体の置換率を計算した結果後に導入されたADHの置換率によって20〜70%のアルデヒド置換率を調節して得ることができた。
製造例1から得られたヒアルロン酸−アルデヒド誘導体を10mg/mlの濃度でpH6のアセテート緩衝液に溶かした後、水溶液状態のインターフェロンアルファをヒアルロン酸1鎖当たり各々1個、4個、6個、9個になるように添加した。ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体の置換率によってアルデヒドの5mole倍でシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN:sodium cyannoborohydride)を添加して24時間の間反応させて、ヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲート(HA−IFN conjugate)を得た。
製造例3により用意したヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲートのGPC分析を通じてヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲートの形成を確認した。
ポンプ:Waters 1525 binary HPLC pump
吸光度測定器:Waters 2487 dual λ absorbance detector
サンプラー:Waters 717 plus auto−sampler
コラム: Waters Ultrahydrogel 500 +Waters Ultrahydrogel 250
移動相:PBS at pH 7.4、flow rateは0.5mL/min。
測定波長:210nmと280nmで二重測定(dual detection)。
前記製造例3によるHa−インターフェロンアルファコンジュゲート内のインターフェロンアルファの含量は、GPCでピークの下面積を測定して求めた。まず、蒸溜水に1mg/mLの濃度でインターフェロンアルファ原液を準備した後、希釈させてインターフェロンアルファ標準溶液を準備した。前記実験例3のGPC分析条件でインターフェロンアルファ標準溶液を分析してインターフェロンアルファの濃度によるGPCピークの下の面積の標準曲線(standard curve)を求めた。前記製造例3によるヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲートを同じ条件で分析して得たGPCピークの下面積を標準曲線に代入してタンパク質含量を求めた。
インターフェロンの濃度を基準として(0.25mg/ml)インターフェロンアルファ溶液と前記製造例3によるヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲート溶液を利用してCircular Dichroism分析した。分析条件は下記の通りである。
UV spectrophotometer:JASCO J−715
測定条件:25℃、200〜250nm、N2 atmosphere
A quartz cuvette:2mm path length
Raw data : 0.2mm intervals with a response time of 1s.
ELISA/Bradford assayの割合を通じてヒアルロン酸−インターフェロンコンジュゲートの活性度を分析した。まず、1mg/mlのインターフェロンアルファ溶液の原液を準備した後、希釈させてインターフェロンアルファ標準溶液を準備した。Bradford assayを利用して濃度による吸光度を測定して標準曲線を求めた。前記製造例3により用意したヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲートとインターフェロンを希釈して同じ条件でBradford assayで吸光度を測定した後、標準曲線に代入してインターフェロンアルファの含量を求めた。また、Bradford assayを示したサンプルと標準溶液を10000倍希釈してELISAを通じて活性度を有したインターフェロンの含量を求めた。その後、ELISA/Bradford assayの割合を通じてヒアルロン酸−インターフェロンコンジュゲートの活性度を分析した。
インターフェロンが存在する場合に増殖が難しい細胞で知られているHuman B-lymphoblastoid cell(Daudi cell)を利用してインターフェロンの活性度をテストした。
肝癌細胞であるHepG2細胞にヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲートを処理し、MTT assayを通じてHepG2細胞の生存率を分析することで、ヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲートの坑癌効果を試した。
IFNとHA IFNコンジュゲート(10%/6)(アルデヒド置換率が10%であり、HA一鎖当たり6個のIFN分子が結合しているヒアルロン酸−インターフェロンアルファコンジュゲート)を分析サンプルで使用してこれらの半減期を分析した。
HA−IFNαの全身的な分布を調査するために生体内撮像を実行した。IFNα及びHA−IFNαコンジュゲート(10%/6)を近赤外線蛍光(NIRF)染料でラベリンして、Balb/cマウスの尾静脈にこれを注射した。注射した後30分及び1時間後にマウスを痲酔して蛍光を発光イメージ分析器でキャプチャした。図9に示したように、NIRF染料がラベリングされたHA−IFNαコンジュゲートは、ターゲット特異的に肝臓に伝達された一方、NIRF染料−IFNαは、均一に分布されて膀胱での蛍光を示す腎臓消失により除去された。この結果は、量子ドットを利用したHA誘導体のターゲット特異的の肝伝達に対して報告した以前論文のリアルタイムバイオイメージング結果とよく一致して、HA−IFNα コンジュゲートの肝疾患治療のための実現可能性を裏付ける。
2'−5'−oligoadenylate synthetase1(OAS 1)は、INFαにより由来される抗ウイルス性タンパク質として、ウイルス感染に対する先天的免疫反応に参加する。OAS 1は、二重本RNAの分解及びウイルス複製の阻害に対してRNase Lを活性化させる2'−5'−oligoadenylateを合成する反応に対する酵素である。INFαの抗ウイルス活性はOAS 1発現レベルと深い関係がある。
Claims (18)
- ヒアルロン酸またはその塩のグルクロン酸骨格に一つ以上のアルデヒド基が導入されているヒアルロン酸−アルデヒド誘導体をタンパク質のN−末端と反応させる工程であって、前記ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体とタンパク質のN−末端との反応が、pH5〜pH7の緩衝液内で実行される工程、および
前記ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体が5%以上30%未満のアルデヒド置換率を有するように、前記ヒアルロン酸またはその塩のアルデヒド置換率を調節する工程
を含むヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法であって、
前記ヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートは、肝疾患の治療のために使用されるものであり、かつ、前記タンパク質は、インターフェロンアルファ(IFNα)、インターフェロンベータ(IFNβ)、インターフェロンガンマ(IFNγ)および腫瘍壊死因子(TNF)からなる群から選択される、
製造方法。 - 前記ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体は、ヒアルロン酸またはその塩のグルクロン酸骨格が開環されており、開環された環の末端に一つ以上のアルデヒド基を有する請求項1に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- 前記ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体は、ヒアルロン酸またはその塩を酸化剤と反応させて得る請求項2に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- 前記酸化剤は、ヒアルロン酸またはその塩のグルクロン酸骨格を開環させて一つ以上のアルデヒド基を形成させることができる請求項3に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- 前記酸化剤は、過ヨード酸(periodate)である請求項4に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- ヒアルロン酸またはその塩と酸化剤との間の反応時間を調節することで、ヒアルロン酸またはその塩のアルデヒド置換率を調節する請求項3に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- 前記ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体は、ヒアルロン酸またはその塩のグルクロン酸骨格に存在するカルボキシル位置にアルデヒド基が導入されている誘導体である請求項1に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- 前記ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体は、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシル基をジアミンまたはジヒドラジド基を有した分子と反応させた後、その分子の誘導体をジアルデヒド基を有した別の分子と反応させて得る請求項7に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体とタンパク質のN−末端との反応は、還元的アミノ化(reductive amination)を誘導する試薬の存在下で実行される請求項1に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- 還元的アミノ化を誘導する試薬は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN:sodium cyannoborohydride)またはナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(NaBH(OCOCH3) 3:sodium triacetoxyborohydride)である請求項9に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- 前記ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体とタンパク質のN−末端との反応は、pH5.5〜pH6.5の緩衝液内で実行される請求項1に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体でタンパク質のN−末端と反応しない未反応アルデヒド基を保護基でブロッキングするステップをさらに含む請求項1に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- ヒアルロン酸またはその塩は、10,000〜3,000,000ダルトン(Da)の分子量を有する請求項1に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体1分子当たり結合されるタンパク質の分子数は、1〜20個である請求項1に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートの製造方法。
- ヒアルロン酸またはその塩のグルクロン酸骨格に一つ以上のアルデヒド基が導入されているヒアルロン酸−アルデヒド誘導体がタンパク質のN−末端と結合されているヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートであって、
前記ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体が、5%以上30%未満のアルデヒド置換率を有し、
前記ヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲートは、肝疾患の治療のために使用されるものであり、かつ、前記タンパク質は、インターフェロンアルファ(IFNα)、インターフェロンベータ(IFNβ)、インターフェロンガンマ(IFNγ)および腫瘍壊死因子(TNF)からなる群から選択される、
ヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲート。 - ヒアルロン酸またはその塩は、10,000〜3,000,000ダルトン(Da)の分子量を有する請求項15に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲート。
- ヒアルロン酸−アルデヒド誘導体1分子当たり結合されているタンパク質の分子数は、1〜20個である請求項16に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲート。
- 前記タンパク質は、インターフェロンアルファである請求項15に記載のヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲート。
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