WO2012077950A2 - 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 - Google Patents

히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to hyaluronic acid-protein conjugates and methods for their preparation.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEGylation reaction is one of the representative biopolymer materials approved by the FDA, but is used as a drug carrier.
  • APC accelerated blood clearance
  • pegylated products are commercialized once a week, but pegylated interferon drugs for treating type C infection have serious side effects.
  • Many genotype 1 shows only 50% antiviral effect, so new drug development is needed.
  • drug delivery using PEG there is no delivery characteristic to a specific tissue and simply increases the retention time in the body. Therefore, a targeting moiety is separately required for delivery to a specific tissue for treating a specific disease.
  • the conjugation of hyaluronic acid to the active drug component has the advantage of being delivered specifically to liver tissue, but the limitations on the low-conjugation efficiency of these conjugate reactions have been pointed out.
  • the present invention overcomes the problems of the prior art as described above, a method of producing a hyaluronic acid-protein conjugate which is high in bioconjugation efficiency and applicable to various water-soluble effective active ingredients while maintaining the bioactivity of protein pharmaceuticals to the maximum, and prepared by the same Hyaluronic acid-protein conjugates, and uses thereof.
  • the present invention provides a method for producing a hyaluronic acid-protein conjugate comprising reacting a hyaluronic acid-aldehyde derivative having an aldehyde group introduced into a hyaluronic acid or a salt thereof with the N-terminus of a protein.
  • the present invention also provides a hyaluronic acid-protein conjugate in which a hyaluronic acid-aldehyde derivative having an aldehyde group introduced into the hyaluronic acid or a salt thereof is bonded to the N-terminus of the protein.
  • Hyaluronic acid is a D-glucuronic acid (GlcA) and N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) group ⁇ 1,3-glycosidic bond ( ⁇ 1,3-glycosidic It is a high molecular weight linear polysaccharide including repeating units of disaccharides connected by a bond).
  • the disaccharide repeating unit of hyaluronic acid is represented by the following Chemical Formula 1.
  • hyaluronic acid refers to a derivative of hyaluronic acid including not only hyaluronic acid including the disaccharide of Formula 1 as a repeating unit, but also derivatives derived from the disaccharide skeleton of Formula 1 as a repeating unit. It is to be interpreted as including.
  • the derivative of hyaluronic acid means a hyaluronic acid having a structure in which the terminal of the carboxyl group, hydroxyl group, acetyl group, or disaccharide repeating unit in the disaccharide structure of Formula 1 is substituted with another substituent.
  • the substituent may be one or more substituents selected from, for example, hydrogen, C 1-6 alkyl group, C 1-6 alkylcarbonyl group, carboxyl group, hydroxyl group and acetyl group.
  • Salts of hyaluronic acid include all of the salts of hyaluronic acid or a derivative of hyaluronic acid, but are not limited thereto, and sodium salts, potassium salts, magnesium salts, calcium salts, aluminum salts and the like are exemplified.
  • the present invention provides a method for producing a hyaluronic acid-protein conjugate comprising reacting a hyaluronic acid-aldehyde derivative having an aldehyde group introduced into a hyaluronic acid or a salt thereof with the N-terminus of a protein.
  • hyaluronic acid-aldehyde derivative used in the present invention is interpreted to include all derivatives of hyaluronic acid or a salt thereof in which an aldehyde group is introduced into hyaluronic acid or a salt thereof.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative may be one or more aldehyde groups are introduced into the glucuronic acid skeleton of the hyaluronic acid or salts thereof.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative of the present invention contains an aldehyde group in the glucuronic acid skeleton of hyaluronic acid or a salt thereof, a hyaluronic acid-aldehyde derivative in which an aldehyde group is formed at the terminal of the disaccharide repeating unit of hyaluronic acid is used.
  • the substitution rate of the aldehyde group is freely controlled.
  • the substitution rate of an aldehyde group means that a specific functional group of hyaluronic acid or a salt thereof is replaced or modified with an aldehyde group.
  • the substitution rate with an aldehyde group is defined as the ratio of the repeating unit substituted with the aldehyde group among all the hyaluronic acid repeat units, and is defined as a value greater than 0 and less than 1, or greater than 0% and less than 100%, or greater than 0 mol% and less than 100 mol%. It can be expressed as a numerical value of.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative may be one in which the glucuronic acid skeleton of hyaluronic acid or a salt thereof is ring-opened and has one or more aldehyde groups at the ends of the ring-opened ring.
  • a hyaluronic acid-aldehyde derivative includes a polymer including at least one repeating unit represented by Formula 2 below.
  • the method for producing such hyaluronic acid-aldehyde derivative is not particularly limited. Those skilled in the art will be able to ring-open glucuronic acid using known methods and form one or more aldehyde groups at the ends of the ring-opened ring.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative having the glucuronic acid backbone of hyaluronic acid or a salt thereof ring-opened and having at least one aldehyde group at the terminal of the ring-opened ring can be obtained by reacting hyaluronic acid or a salt thereof with an oxidizing agent.
  • n and n represent the number of repetitions of the repeating unit, and m and n may each independently be an integer of 1 to 10000.
  • the oxidizing agent may be one that induces a ring opening reaction of glucuronic acid, and the oxidizing agent is limited to periodate, such as sodium periodate, potassium periodate (potassium periodate) and the like.
  • periodate such as sodium periodate, potassium periodate (potassium periodate) and the like.
  • a hyaluronic acid derivative having a substitution rate of 10% can be obtained by reacting hyaluronic acid or a salt thereof with periodate under dark conditions for 2 hours, and the reaction time is increased to 24 hours to 50% substitution rate.
  • the hyaluronic acid derivative which has can be obtained.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative may be one in which an aldehyde group is introduced at a carboxyl position present in the glucuronic acid skeleton of hyaluronic acid or a salt thereof.
  • the method of introducing an aldehyde group to the carboxyl position of hyaluronic acid can be variously selected by those skilled in the art.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative includes a polymer including one or more repeating units of Formula 3 below.
  • the method for producing such hyaluronic acid-aldehyde derivative is not particularly limited. Those skilled in the art will be able to introduce aldehyde groups at the carboxyl positions present in the glucuronic acid backbone of hyaluronic acid or salts thereof using known methods.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative in which an aldehyde group is introduced at a carboxyl position present in the glucuronic acid skeleton of hyaluronic acid or a salt thereof is selected from the group consisting of a hyaluronic acid or a carboxyl group of the derivative thereof as a diamine or dihydrazide group.
  • the derivative After reacting with a molecule having, the derivative can be obtained by reacting with a molecule having a dialdehyde group.
  • Scheme 2 below schematically illustrates an example of a method of forming the hyaluronic acid-aldehyde derivative.
  • the carboxyl group of the hyaluronic acid or some salts thereof repeats with a molecule having a hydrazide group or an amine group to synthesize a hyaluronic acid derivative having a hydrazide or amine group, and then By reacting with a substance having an aldehyde group, a hyaluronic acid derivative having an aldehyde introduced therein may be synthesized.
  • Molecules having hydrazide or amine groups at both ends are not limited to molecules having hydrazide or amine groups at both ends, and are not limited to adipic acid dihydrazide (ADH) and hexanedihydra.
  • HMDA hexamethylene diamine
  • molecules in which aldehydes are introduced at both ends are not limited to molecules in which aldehydes are introduced at both ends, and are not limited to adialdehyde, heptanedial, octanedial, and glutaaldehyde (adipaldehyde). glutaraldehyde) and the like.
  • a hyaluronic acid derivative in which 20% of ADH is substituted for 2 minutes and 70% of 2% of ADH can be obtained.
  • 20% to 70% hyaluronic acid-aldehyde derivative can be obtained according to the substitution rate of ADH.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative according to the present invention by adjusting the aldehyde substitution rate of the hyaluronic acid-aldehyde derivative to target to the liver depending on the type of protein drug conjugated with hyaluronic acid or to bypass the liver You can control whether or not to do so.
  • the aldehyde substitution rate of the hyaluronic acid-aldehyde derivative of the present invention can be freely controlled, for example, by adjusting the treatment time of the oxidizing agent that induces the ring-opening reaction of glucuronic acid.
  • the substitution rate of the cargyl group can be freely controlled.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative may have an aldehyde group substitution rate of 5% or more and less than 30%. Proteins conjugated with hyaluronic acid-aldehyde derivatives having an aldehyde group substitution rate of at least 5% and less than 30% can be targeted to the liver.
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative may have an aldehyde group substitution rate of 30% or more and 100% or less. Proteins conjugated with hyaluronic acid-aldehyde derivatives having an aldehyde substitution rate of 30% or more and 100% or less will not be targeted to the liver but will have target nonspecific properties.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate of the present invention can be prepared by combining the hyaluronic acid-aldehyde derivative thus obtained with the N-terminus of the protein.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate of the present invention may be, for example, one or more repeating units of Formula 4 in hyaluronic acid.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate of the present invention may be, for example, one or more repeating units of Formula 5 in hyaluronic acid.
  • Conjugation of the hyaluronic acid-aldehyde derivative with a protein may preferably be carried out in the presence of a reagent that induces reductive amination.
  • a reagent that induces reductive amination For example, using direct reductive amination reagents such as sodium cyannoborohydride (NaBH 3 CN), sodium triacetoxyborohydride (NaBH (OCOCH 3 ) 3 ), etc.
  • One step can induce hyaluronic acid-protein conjugation.
  • the reaction of the hyaluronic acid-aldehyde derivative with the N-terminus of the protein is preferably performed in a buffer of pH 5-7. This is because by adjusting the pH of the buffer to the above range, the aldehyde group of the hyaluronic acid-aldehyde derivative can be reacted specifically with the N-terminus of the protein without reacting with an amino acid such as lysine having other amine groups of the protein. More preferably, the reaction of the hyaluronic acid-aldehyde derivative with the N-terminus of the protein is preferably performed in a buffer of pH 5.5 to 6.5, most preferably pH 6.0.
  • unreacted aldehyde groups that do not react with the N-terminus of the protein in the hyaluronic acid-aldehyde derivative may be blocked using a protecting group.
  • the unreacted aldehyde group of the hyaluronic acid-aldehyde derivative may be unnecessarily reacted with other amino acid residues of the protein drug or with other protein substances in the body during the preparation of the drug carrier or in vivo administration. have.
  • Materials that block unreacted aldehyde groups include ethyl carbazate, alkyl carbazate such as tetrabutyl carbazate, and aminoalchol such as aminoethanol. May be used, but is not limited thereto. It is also possible to use an acylal protecting group, an acetal protecting group, a ketal protecting group, and the like, which are generally known as protecting groups of aldehyde groups.
  • the hyaluronic acid or a salt thereof used for preparing the hyaluronic acid-protein conjugate may have a molecular weight of 10,000 to 3,000,000 Daltons (Da), but is not limited thereto.
  • Hyaluronic acid or a salt thereof having a molecular weight in the above range can be usefully used in the preparation of drug carriers for the sustained drug efficacy.
  • the number of molecules of the protein bound per molecule of the hyaluronic acid-aldehyde derivative may be adjusted according to the concentration of the aqueous protein solution reacted with the hyaluronic acid-aldehyde derivative.
  • the protein in the hyaluronic acid-protein conjugate of the present invention may be linked to 1 to 20 molecules per molecule of the hyaluronic acid-aldehyde derivative.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate bound to a protein of a molecular number within the above range can exhibit a desired drug duration and can be applied as a therapeutic agent for liver disease due to its good delivery property to liver tissue.
  • the kind of protein medicine used for manufacture of the hyaluronic acid-protein conjugate of this invention is not specifically limited.
  • the protein medicine is preferably water-soluble so that it can be easily applied to the method of the present invention, but is not limited thereto. Any protein medicament that requires long-term durability of the protein drug can be prepared and used in the form of the hyaluronic acid-protein conjugate of the present invention.
  • the protein is interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, insulin, insulin-like growth factor 1 (IGF-1), growth hormone, erythropoietin, granulocyte-colony stimulating factors (GCSFs), GM Granulocyte / macrophage-colony stimulating factors (CSFs), interleukin-1 alpha, interleukin-1 beta, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-2, EGFs (epidermal growth factors), calcitonin, ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), atobisban, buserelin, cetrorelix, deslorelin, desmopressin, dino Dynorphin A (1-13), elcatonin, eleidosin, eptifibatide, growth hormone releasing hormone-II (GHRHII), gonadorelin, Goserelin, hys
  • the present invention also provides a hyaluronic acid-protein conjugate wherein a hyaluronic acid-aldehyde derivative having an aldehyde group introduced into the hyaluronic acid or a salt thereof is bonded to the N-terminus of the protein.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate of the present invention may be prepared by the method described above, but is intended to include all those prepared by other methods.
  • the protein bound with the hyaluronic acid-aldehyde derivative having an aldehyde group introduced into the hyaluronic acid or a salt thereof not only reaches 95% of bioconjugation but also has excellent stability, It was confirmed that the conformational structure of the protein was not affected, and the drug drug sustainability of the protein was very excellent.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate of the present invention can be usefully used for drug delivery systems of proteins.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate which opens the ring structure and conjugates the protein while leaving the carboxyl group binding to the hyaluronic acid receptor, maximizes the liver tissue specific delivery characteristics of hyaluronic acid for the development of a therapeutic agent for liver disease. It can be applied in various ways. In addition, by adjusting the aldehyde substitution rate of the hyaluronic acid-aldehyde derivative, it is possible to freely control the hepatic target directivity of the hyaluronic acid, it can also be useful for ensuring the sustained drug efficacy of drugs requiring bypass of the liver.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate according to the present invention is very excellent in the bioconjugation rate and drug sustainability of the protein drug, and the hyaluronic acid is specifically bound to the N-terminus of the protein, so the protein drug activity is excellent.
  • the aldehyde substitution rate of the hyaluronic acid-aldehyde derivative it is possible to freely control the target targeting of the liver of hyaluronic acid, so that it can be usefully used not only for the treatment of liver disease, but also for securing the continuity of the medicine requiring the bypass of the liver.
  • Hyaluronic acid-protein conjugates of the invention can be usefully used for drug delivery systems of proteins.
  • Figure 1 (a) is a 1 H-NMR results of the HA-adehyde-TBC derivatives for each substitution rate prepared by the method according to Preparation Example 1 of the present invention.
  • (b) shows the 1 H-NMR results of the HA-adehyde-TBC derivatives for each substitution rate prepared by the method according to Preparation Example 2 of the present invention.
  • Figure 2 shows the GPC results of the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate and protein prepared by the method according to the preparation example of the present invention.
  • Figure 3 shows the bioconjugation efficiency according to the number of interferon molecules and the number of protein molecules contained in one hyaluronic acid chain of the hyaluronic acid-interferon conjugate.
  • Figure 4 shows a comparison of the results of Circular Dichroism (CD) analysis of interferon alpha and hyaluronic acid-interferon alpha conjugate.
  • CD Circular Dichroism
  • Figure 5 shows the results of the activity analysis of the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate and interferon alpha according to an embodiment of the present invention through an ELISA assay.
  • Figure 6 shows the results of the activity analysis of the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate and interferon alpha in accordance with one embodiment of the present invention through an antiproliferation assay using daudi cells.
  • Figure 7 shows the anticancer effect of the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate and interferon alpha according to the preparation of the present invention through an antiproliferation assay using HepG2 liver cancer cells.
  • Figure 8 shows the comparison of the stability in the human serum of the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate and the dayferon according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows real-time bioimaging results after tail vein injection of (A) interferon alpha and (B) hyaluronic acid-interferon alpha conjugates according to one embodiment of the present invention labeled with near infrared fluorescent dyes.
  • Figure 10 shows the results of the Pharmacokinetic analysis of the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 shows the results of antiviral analysis in the rat liver of hyaluronic acid-interferon alpha conjugate according to one embodiment of the present invention.
  • ADH Adipic Acid Dihydrazide
  • the solution was dialyzed against distilled water, purified, and then lyophilized for 3 days to obtain HA-ADH derivatives having different substitution rates.
  • the prepared HA-ADH derivative was dissolved in sodium acetate buffer at pH 5.2 at a concentration of 10 mg / ml, and then reacted for 24 hours after adding 10 mole of glutaaldehyde of ADH. Then, the solution was purified by dialysis with distilled water, and then lyophilized for 3 days to obtain HA-ADH-Aldehyde derivatives having different substitution rates.
  • the hyaluronic acid aldehyde derivative prepared according to Preparation Example 1 was dissolved in sodium acetate buffer at pH 5.2 at a concentration of 5 mg / ml, followed by 5 mole times of tetrabutyl carbazate (TBC) and sodium cyanoboro Hydride (Sodium cyanoborohydride, NaBH 3 CN) was added and reacted for 24 hours.
  • TBC tetrabutyl carbazate
  • sodium cyanoboro Hydride sodium cyanoborohydride, NaBH 3 CN
  • the hyaluronic acid aldehyde derivative prepared according to Preparation Example 2 was dissolved in sodium acetate buffer at pH 5.2 at a concentration of 5 mg / ml, and then 5 mole times of tetrabutyl carbazate (TBC) and sodium cyanoboro hydride per hyaluronic acid unit. Hydride (Sodium cyanoborohydride, NaBH 3 CN) was added and reacted for 24 hours. The solution was dialyzed against distilled water and then lyophilized for 3 days to analyze the substitution rate of aldehyde by 1 H-NMR (DPX300, Bruker, Germany).
  • the hyaluronic acid-aldehyde derivative obtained in Preparation Example 1 was dissolved in an acetate buffer of pH 6 at a concentration of 10 mg / ml, and then an interferon alpha in aqueous solution was added so that 1, 4, 6, and 9 were each per chain of hyaluronic acid. It was. According to the substitution rate of the hyaluronic acid-aldehyde derivative, sodium cyanoborohydride (NaBH 3 CN) was added for 5 hours of aldehyde, followed by reaction for 24 hours, and the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate (HA-IFN conjugate) was reacted. Got it.
  • NaBH 3 CN sodium cyanoborohydride
  • Ethyl carbazate was added to 5 mole times of aldehyde for blocking the aldehyde remaining unreacted in the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate, followed by further reaction for 24 hours, or amino ethanol ) was added to 5 mole times of aldehyde and further reacted at pH 8 for 3 hours.
  • the reacted solution was dialyzed against phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4 and stored at -70C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Measurement wavelength Dual detection at 210 nm and 280 nm.
  • the interferon alpha content in the HA-interferon alpha conjugate according to Preparation Example 3 was determined by measuring the area under the peak in GPC. First, an interferon alpha stock solution was prepared at a concentration of 1 mg / mL in distilled water, and then diluted to prepare an interferon alpha standard solution. The interferon alpha standard solution was analyzed under the GPC analysis conditions of Experimental Example 3 to obtain a standard curve of the area under the GPC peak according to the interferon alpha concentration. The protein content was determined by substituting the area under the GPC peak obtained by analyzing the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate according to Preparation Example 3 in the standard curve.
  • the protein content in the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate according to Preparation Example 3 was found to increase with the number of molecules of the protein reacted per molecule of HA in the feed.
  • the number of molecules of the protein reacted per molecule of HA was changed to 1, 4, 6, and 9, the average number of molecules bound to each molecule of HA was 1, 4, 6, and 9.
  • Bioconjugation efficiency (%) was over 95% regardless of the number of molecules.
  • Circular Dichroism analysis was performed using an interferon alpha solution and a hyaluronic acid-interferon alpha conjugate solution according to Preparation Example 3 based on the concentration of interferon (0.25 mg / ml). Analysis conditions are as follows.
  • UV spectrophotometer JASCO J-715
  • a quartz cuvette 2 mm path length
  • Raw data 0.2 mm intervals with a response time of 1 s.
  • the peaks of the interferon splitrum and the CD of the hyaluronic acid-interferon conjugate coincide with each other, indicating that the secondary structure of the interferon is maintained even when conjugated with the hyaluronic acid.
  • the activity of hyaluronic acid-interferon conjugate was analyzed by the ratio of ELISA / Bradford assay.
  • a stock solution of 1 mg / ml interferon alpha solution was prepared, and then diluted to prepare an interferon alpha standard solution. Standard curves were obtained by measuring absorbance according to concentration using Bradford assay.
  • the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate prepared according to Preparation Example 3 and the interferon were diluted, and the absorbance was measured by Bradford assay under the same conditions.
  • 10000-fold dilutions of Bradford assay samples and standard solutions were used to determine the content of interferon with activity through ELISA.
  • the activity of hyaluronic acid-interferon conjugate was analyzed by the ratio of ELISA / Bradford assay.
  • the ELISA / Bradford assay of hyaluronic acid-interferon alpha conjugate was 70% or more.
  • Bradford assay is a method for measuring protein lysine
  • ELISA is an assay method for quantifying the binding of interferon alpha and antibody. This ratio shows that more than 70% of the proteins present are active.
  • the interferon activity was tested using human B-lymphoblastoid cells (Daudi cells), which are known to have poor growth in the presence of interferon.
  • interferon alpha standard solution 1 mg / ml interferon alpha was prepared, and then diluted to prepare an interferon alpha standard solution.
  • Standard curves were obtained by measuring absorbance according to concentration using Bradford assay. After diluting the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate and interferon alpha prepared according to Preparation Example 3 and measuring the absorbance by Bradford assay under the same conditions, the content of interferon alpha was obtained by substituting the standard curve. After incubating the Daudi cells for 5 days in a medium containing the sample diluted with each standard solution, the growth rate of the Daudi cells was confirmed by MTS assay.
  • HepG2 cells which are liver cancer cells, were treated with hyaluronic acid-interferon alpha conjugates, and the anticancer effects of hyaluronic acid-interferon alpha conjugates were tested by analyzing the survival rate of HepG2 cells through an MTT assay.
  • interferon alpha standard solution 1 mg / ml interferon alpha was prepared, and then diluted to prepare an interferon alpha standard solution.
  • Standard curves were obtained by measuring absorbance according to concentration using Bradford assay. After diluting the hyaluronic acid-interferon alpha conjugate and interferon alpha prepared according to Preparation Example 3 and measuring the absorbance by Bradford assay under the same conditions, the content of interferon alpha was obtained by substituting the standard curve.
  • HepG2 cells were incubated for 3 days in each medium including the standard solution and the diluted sample, and then the survival rate of HepG2 cells was confirmed by MTT assay.
  • IFN and HA IFN conjugates (10% / 6) (hyaluronic acid-interferon alpha conjugates with an aldehyde substitution rate of 10% and six IFN molecules bound to one chain of HA) were used as analytical samples to determine their half-life. Analyzed.
  • the above samples were each dissolved in human serum so that the IFN concentration was equal to 1 mg / mL and incubated at 37 ° C. for 120 hours. At the appointed time, a portion of the sample was sampled and diluted 1000-fold in PBS to prevent human serum effects and frozen. Biological activity of each sample was measured using an IFN ELISA kit and an MTS assay using Daudi cells.
  • IFN ⁇ and HA-IFN ⁇ conjugates (10% / 6) were labeled with near infrared fluorescence (NIRF) dye and injected into the tail vein of Balb / c mice. Mice were anesthetized 30 minutes and 1 hour after injection and fluorescence was captured with a luminescence image analyzer.
  • NIRF near infrared fluorescence
  • FIG. 9 the HA-IFN ⁇ conjugate labeled NIRF dye was delivered to the target specific liver, while the NIRF dye-IFN ⁇ was evenly distributed and removed by kidney loss indicating fluorescence in the bladder .
  • OAS 1 2'-5'-oligoadenylate synthetase 1
  • INF ⁇ 2'-5'-oligoadenylate synthetase 1
  • OAS 1 is an antiviral protein induced by INF ⁇ and participates in the innate immune response to viral infection.
  • OAS 1 is an enzyme for the reaction of synthesizing 2'-5'-oligoadenylate which activates RNase L against degradation of double stranded RNA and inhibition of viral replication.
  • the antiviral activity of INF ⁇ is strongly correlated with the OAS 1 expression level.
  • OAS 1 2'-5'-oligoadenylate synthetase 1
  • the HA-IFN ⁇ conjugate having a lower substitution rate than IFN ⁇ can be confirmed to be higher in the liver, and the OAS 1 level, which acts as an antiviral in the liver, is higher because of better transit time and longer residence time in the liver. there was.
  • the HA-IFN ⁇ conjugate of the high substitution rate was lower than the HA-IFN ⁇ conjugate of the low substitution rate, but the delivery characteristics to the liver was lowered, but the OAS 1 level was higher than IFN ⁇ by increasing the residence time.

Abstract

본 발명은 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체가 단백질의 N-말단과 결합되어 있는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질 의약의 생접합율과 약효 지속성이 매우 우수하고, 히알루론산이 단백질의 N-말단과 특이적으로 결합되어 있어 단백질 의약의 활성이 뛰어나다. 또한, 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율을 조절함으로써 히알루론산의 간 표적 지향성을 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 간 질환 치료용 의약뿐만 아니라, 간의 우회가 필요한 의약의 약효 지속성 확보를 위해서도 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질의 약물 전달 시스템을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
본 발명은 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
단백질 의약품의 장기 약효 지속 제형에 관한 연구는 최근까지 생체적합한 생분해성 고분자와의 컨쥬게이션 반응을 통한 제형 개발에 중점을 두고 진행되고 있다. 상기와 같은 단백질 의약품의 약효 지속 시간은 제형의 형태 및 컨쥬게이션 되는 유효 약효 성분에 따라 몇 주까지 연장되기도 한다. 상기와 같은 제형의 개발을 위해서는 제형의 약효 유지 및 약효 지속 시간의 증대와 더불어, 유효 약효 성분에 컨쥬게이션 되는 고분자의 생체적합성 유무에 관한 것도 고려해야 한다. 또한 고분자와의 컨쥬게이션에 의한 단백질 의약품의 활성도 감소의 문제가 고려되어야 한다.
이와 같은 제형 연구의 일예로, 최근에는 생체적합한 생분해성 폴리에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 또는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)과 유효 약효 성분을 컨쥬게이션하여 약물 전달 시스템에 응용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
하지만, 유효 약효 성분에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 컨쥬게이션하는 반응, 즉 소위 말하는 페길화(PEGylation) 반응에 사용되는 PEG는 FDA에서 공인한 대표적인 생체용 고분자 재료 중의 하나이지만, 약물전달체로 활용되는 PEG-Liposome 접합체를 반복 주사하게 되면 체내에서 투여된 약물의 소실이 빨리 일어나는 ‘accelerated blood clearance’ (ABC) 현상이 일어나는 것으로 보고된 바 있다. 실제로 간질환 치료용 단백질 의약품인 인터페론 알파의 경우 페길화된 상품이 주 1회 주사 제형으로 상품화 되어있지만, C형 감염 치료를 위한 페길화된 인터페론 약제의 경우 부작용이 심각하여 치료 도중 중단하는 환자가 많고 유전자형 1형의 경우 50% 정도의 항바이러스 효과 밖에 나타내지 않아 새로운 약물의 개발 필요하다. PEG를 이용한 약물전달체의 경우 특정 조직으로 전달특성이 존재하지 않고 단순히 체내 잔류 시간을 증가시켜주는 역할을 하기 때문에 특정 질환 치료를 위해 특정 조직으로 전달하기 위해서는 표적화 부위(targeting moiety)가 따로 필요하다.
한편, 히알루론산을 유효 약효 성분에 컨쥬게이션하게 되면 간 조직에 특이적으로 전달되는 장점이 있긴 하나, 이들 컨쥬게이트 반응의 생접합 효율이 낮아 이에 대한 한계점이 지적되어 왔다.
또한 PEG나 히알루론산과 같은 고분자와 단백질 의약품의 컨쥬게이트의 경우 고분자가 단백질의 아미노산 서열의 다양한 반응기와 비특이적으로 반응하여 단백질의 3차 구조를 깨뜨려 단백질 의약품의 생체 활성도를 낮추는 문제점이 지적되어 왔다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 극복하여, 단백질 의약품의 생체 활성도를 최대한으로 유지하면서 생접합 효율이 높고 다양한 수용성 유효 약효 성분에 적용 가능한 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 히알루론산-단백질 컨쥬게이트, 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질의 N-말단과 반응시키는 것을 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체가 단백질의 N-말단과 결합되어 있는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제공한다.
이하, 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법에 대해 보다 상세하게 설명한다.
히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid, GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)기 β 1,3-글라이코시드 결합(β 1,3-glycosidic bond)에 의해 연결되어 있는 디시카라이드를 반복단위로 포함하는 고분자량의 선형 폴리사카라이드이다. 히알루론산의 디사카라이드 반복단위는 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000001
본 발명에 있어서, 『히알루론산』은 상기 화학식 1의 디사카라이드를 반복단위로 포함하는 히알루론산뿐만 아니라, 화학식 1의 디사카라이드 골격으로부터 유도된 유도체를 반복단위로 포함하는 히알루론산의 유도체를 포함하는 것으로 해석된다. 히알루론산의 유도체는 상기 화학식 1의 디사카라이드 구조 중 카르복시기, 수산화기, 아세틸기, 또는 디사카라이드 반복 단위의 말단이 다른 치환기로 치환되어 있는 구조를 갖는 히알루론산을 의미한다. 예를 들어, 상기 치환기는 예를 들어, 수소, C1-6알킬기, C1-6알킬카르보닐기, 카르복시기, 수산화기 및 아세틸기로부터 선택되는 하나 이상의 치환기일 수 있다.
히알루론산의 염은 히알루론산 또는 히알루론산의 유도체의 염을 모두 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 알루미늄염 등이 예시된다.
본 발명은 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질의 N-말단과 반응시키는 것을 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다.
히알루론산과 단백질과의 컨쥬게이션 방법으로 기존에는 히알루론산의 카르복실기와 단백질의 아민기를 결합시키는 방법을 사용하여 왔다. 그러나, 이러한 방법은 통상적으로 결합 형성을 위한 링커를 사용해야 했기 때문에 반응이 복잡하고, 반응의 효율, 즉, 생접합 효율이 떨어졌을 뿐만 아니라 단백질의 N-말단뿐만 아니라 단백질 아미노산 서열에 따라 다수 존재하는 라이신의 아민기와 비특이적으로 반응하는 등의 문제점이 있었다.
반면, 본 발명에서는 히알루론산의 카르복실기를 이용하는 대신 히알루론산-알데하이드 유도체를 이용함으로써, 히알루론산-단백질 컨쥬게이션의 생접합 효율 및 반응특이성을 현저하게 개선하였다.
본 발명에서 사용되는 『히알루론산-알데하이드 유도체』는 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산 또는 그의 염의 유도체를 모두 포함하는 것으로 해석된다.
한 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 하나 이상의 알데하이드기가 도입되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 알데하이드기를 포함하고 있기 때문에, 히알루론산의 디사카라이드 반복단위의 말단에 알데하이드기가 형성되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체를 사용하는 경우에 비해 알데하이드기의 치환율 조절이 자유롭다. 본 발명에 있어서, 알데하이드기의 치환율이라 함은 히알루론산 또는 그의 염의 특정 기능기가 알데하이드기로 대체되거나 수식되는 것을 의미한다. 알데하이드기로의 치환율은 전체 히알루론산 반복단위 중 알데하이드기로 치환된 반복단위의 비율로 정의되며, 정의상 0 초과 1이하의 수치, 또는 0% 초과 100% 이하의 수치, 또는 0몰% 초과 100몰% 이하의 수치로 표현될 수 있다. 알데하이드기의 치환율을 조절하면 히알루론산-알데하이드 유도체를 간으로 표적화할 것인지, 또는 간을 우회하도록 할 것인지를 제어할 수 있으므로 히알루론산과 컨쥬게이션되는 약물의 종류에 따라 간으로의 표적성을 조절할 수 있는 장점을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격이 개환되어 있고 개환된 환의 말단에 하나 이상의 알데하이드기를 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 이러한 히알루론산-알데하이드 유도체는 하기 화학식 2의 반복단위를 하나 이상 포함하는 고분자를 포함한다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000002
이러한 히알루론산-알데하이드 유도체를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 당업자라면 공지의 방법을 사용하여 글루쿠론산을 개환시키고, 개환된 환의 말단에 하나 이상의 알데하이드기를 형성시킬 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격이 개환되어 있고 개환된 환의 말단에 하나 이상의 알데하이드기를 갖는 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염을 산화제와 반응시켜 얻을 수 있다. 하기 반응식 1은 상기 히알루론산-알데하이드 유도체의 형성 방법의 예를 모식화한 것이다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000003
본 명세서의 반응식들에 있어서, m 및 n은 반복단위의 반복 횟수를 나타내며, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 10000의 정수일 수 있다.
반응식 1과 같이, 히알루론산 또는 그의 염 중 일부 반복단위를 화학식 2의 구조로 유도할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 산화제는 글루쿠론산의 개환반응을 유도하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 이러한 산화제는 퍼리오데이트(periodate), 예컨대, 소듐 퍼리오데이트(sodium periodate), 포타슘 퍼리오데이트(potassium periodate) 등을 포함한다. 퍼리오데이트를 산화제로 이용할 경우, 히알루론산 또는 그의 염을 암 조건 하에서 퍼리오데이트와 2시간 반응시킴으로써 10%의 치환율을 갖는 히알루론산 유도체를 얻을 수 있으며 반응시간을 24시간까지 늘려 50%의 치환율을 갖는 히알루론산 유도체를 얻을 수 있다. 산화제와의 반응시간을 조절함에 따라 히알루론산의 알데하이드 치환율을 조절하는 것이 가능하며, 이는 당업자가 히알루론산과 컨쥬게이션시키고자 하는 단백질 의약의 종류에 따라 적절히 선택하여 조절할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 존재하는 카르복실 위치에 알데하이드기가 도입되어 있는 것일 수 있다. 히알루론산의 카르복실 위치에 알데하이드기를 도입하는 방법은 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 이러한 히알루론산-알데하이드 유도체는 하기 화학식 3의 반복단위를 하나 이상 포함하는 고분자를 포함한다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000004
이러한 히알루론산-알데하이드 유도체를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 당업자라면 공지의 방법을 사용하여 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 존재하는 카르복실 위치에 알데하이드기를 도입시킬 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 존재하는 카르복실 위치에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실 그룹을 다이아민 또는 다이하이드라자이드 그룹을 가진 분자와 반응시킨 뒤, 그 유도체를 다이 알데하이드 그룹을 가진 분자와 반응시켜 얻을 수 있다. 하기 반응식 2는 상기 히알루론산-알데하이드 유도체의 형성 방법의 예를 모식화한 것이다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000005
반응식 2와 같이 히알루론산 또는 그 염 일부 반복 단위의 카르복실기를 하이드라자이드 그룹 또는 아민 그룹을 말단에 가진 분자와 반응시켜 하이드라자이드 또는 아민 그룹을 가진 히알루론산 유도체를 합성한 후, 이를 양쪽 말단에 알데하이드기를 가진 물질과 반응시켜 알데하이드가 도입된 히알루론산 유도체를 합성할 수 있다. 양쪽 말단에 하이드라자이드 또는 아민 그룹을 가진 분자에는 양쪽 말단에 하이드라자이드 또는 아민그룹을 가진 분자로 그 한정이 없으며, 아디프산 다이하이드라자이드(Adipic acid dihydrazide, ADH), 헥산다이하이드라자이드(hexanedihydrazide), 헵탄다이하이드라자이드(heptanedihydrazide), 옥탄다이하이드라자이드(octanedihydrazide), 노난-1,9-다이아민(nonane-1,9-diamine), 옥탄-1,8-다이아민(octane-1,8-diamine), 헥사메틸렌 다이아민(hexamethlyene diamine, HMDA), 다이아미노 펜탄(diamino pentane), 다이아미노 부탄(diamino butane), 다이아미노 에탄(diamino ethane) 등을 포함한다. 또한 양 쪽 말단에 알데하이드가 도입되어 있는 분자에는 양쪽 말단에 알데하이드가 도입되어 있는 분자로 그 한정이 없으며, 아디프알데하이드(adipaldehyde), 헵탄다이알(heptanedial), 옥탄다이알(octanedial), 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 등을 포함한다. ADH를 사용하여 유도체를 합성하는 경우 3분간 반응 시킬 때 20%, 2시간 반응시킬 때 70%의 ADH가 치환된 히알루론산 유도체를 얻을 수 있다. HA-ADH 유도체와 글루타알데하이드 (glutaraldehyde)를 이용하는 경우 ADH의 치환율에 따라 20%~70%의 히알루론산-알데하이드 유도체를 얻을 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 히알루론산-알데하이드 유도체를 이용하게 되면, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율을 조절함으로써 히알루론산과 컨쥬게이션시키는 단백질 약물의 종류에 따라 간으로 표적화할 것인지 또는 간을 우회하도록 할 것인지를 제어할 수 있게 된다.
본 발명의 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율은 예를 들어, 글루쿠론산의 개환 반응을 유도하는 산화제의 처리 시간을 조절함으로써 자유롭게 조절할 수 있다. 또한 히알루론산의 카르복실기와 다이하이드라자이드 또는 다이아민 그룹을 가진 분자와의 반응시간을 조절함으로써 카그복실기의 치환율을 자유롭게 조절할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 5% 이상 30% 미만의 알데하이드기 치환율을 가질 수 있다. 5% 이상 30% 미만의 알데하이드기 치환율을 갖는 히알루론산-알데하이드 유도체와 컨쥬게이션된 단백질은 간으로 표적화될 수 있게 된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 30% 이상 100%이하의 알데하이드기 치환율을 가질 수 있다. 30% 이상 100% 이하의 알데하이드기 치환율을 갖는 히알루론산-알데하이드 유도체와 컨쥬게이션된 단백질은 간으로 표적화되지 않고 표적 비특이적인 특성을 갖게 된다.
하기 실시예에서는, 10% 치환된 저치환율의 히알루론산 알데하이드 유도체를 이용한 경우 체내 잔류 시간은 짧지만 간으로의 전달 특성이 좋았으며, 45% 치환된 고치환율의 히알루론산 알데하이드 유도체를 이용한 경우 체내 잔류 시간이 보다 길어지는 반면 간으로의 전달 특성이 낮아짐을 확인할 수 있다.
이렇게 얻어진 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질의 N-말단과 결합시킴으로써 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제조할 수 있다.
본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 예를 들어, 히알루론산 중에 하기 화학식 4의 반복단위를 하나 이상 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000006
예를 들어, 화학식 2의 반복단위를 하나 이상 포함하는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질과 컨쥬게이션시키게 되면, 하기 반응식 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 화학식 2에 존재하는 알데하이드기와 단백질의 N-말단의 아민기가 서로 반응하여 컨쥬게이션을 형성하게 되는 것이다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000007
다른 구체예에서, 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 예를 들어, 히알루론산 중에 하기 화학식 5의 반복단위를 하나 이상 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000008
예를 들어, 화학식 3의 반복단위를 하나 이상 포함하는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질과 컨쥬게이션시키게 되면, 하기 반응식 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 화학식 3에 존재하는 알데하이드기와 단백질의 N-말단의 아민기가 서로 반응하여 컨쥬게이션을 형성하게 되는 것이다.
[반응식 4]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000009
히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질과의 컨쥬게이션은 바람직하게는 환원적 아미노화(reductive amination)를 유도하는 시약의 존재 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyannoborohydride, NaBH3CN),소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride, NaBH(OCOCH3)3)등과 같은 직접 환원적 아미노화 시약을 이용하면 단시간 내에 원스텝으로 히알루론산-단백질 컨쥬게이션을 유도할 수 있다.
상기 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 pH 5 내지 7의 완충액 중에서 수행되는 것이 바람직하다. 완충액의 pH를 상기 범위로 조절함에 의해 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드기가 단백질의 다른 아민기를 가지는 라이신과 같은 아미노산과 반응하지 않고, 단백질의 N-말단과 특이적으로 반응하도록 할 수 있기 때문이다. 보다 바람직하게는 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 pH 5.5 내지 6.5, 가장 바람직하게는 pH 6.0의 완충액 중에서 수행되는 것이 바람직하다.
한편, 히알루론산-알데하이드 유도체에서 단백질의 N-말단과 반응하지 않은 미반응 알데하이드기는 보호기를 사용하여 블로킹(blocking)할 수 있다. 히알루론산-알데하이드 유도체의 미반응 알데하이드기는 약물전달체의 제조 과정 또는 생체 내 투여 과정에서 단백질 의약의 다른 아미노산 잔기 또는 체내의 다른 단백질 물질 등과 불필요하게 반응할 가능성이 있으므로 이를 사전에 차단하는 것이 바람직할 수 있다.
미반응 알데하이드기를 블로킹하는 물질로는 에틸 카바제이트(ethyl carbazate), 테트라부틸 카바제이트(tetrabutyl carbazate)와 같은 알킬 카바제이트(alkyl carbazate), 아미노에탄올(aminoethanol)과 같은 아미노알콜(aminoalchol)을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 알데하이드기의 보호기로 알려져 있는 아시랄 보호기(acylal protecting group), 아세탈 보호기(acetal protecting group), 케탈 보호기(ketal protecting group) 등을 사용하는 것도 가능하다.
이에 제한되는 것은 아니나, 위와 같은 미반응 알데하이드기의 블로킹 과정은 하기 반응식 5 또는 반응식 6과 같이 수행될 수 있다.
[반응식 5]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000010
[반응식 6]
Figure PCTKR2011009363-appb-I000011
본 발명에 있어서, 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조를 위해 사용되는 히알루론산 또는 그의 염은 이에 제한되는 것은 아니나 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)의 분자량을 가질 수 있다. 상기 범위의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염은 약물의 약효 지속을 위한 약물 전달체의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 히알루론산-알데하이드 유도체 한 분자 당 결합되는 단백질의 분자수는 히알루론산-알데하이드 유도체와 반응시키는 단백질 수용액의 농도에 따라 조절할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트에서 단백질은 히알루론산-알데하이드 유도체 한 분자 당 1 내지 20개 분자가 결합되어 있을 수 있다. 상기와 같은 범위 내의 분자수의 단백질이 결합된 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 원하는 약효 지속 시간을 나타낼 수 있으며 간 조직으로의 전달 특성이 좋아 간질환 치료제로 응용이 가능하다.
본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 단백질 의약의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 상기 단백질 의약은 본 발명의 방법에 쉽게 적용할 수 있도록 수용성인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질약효의 장기 지속성 확보가 필요한 단백질 의약이라면 어떠한 것이라도 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 단백질은 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, GCSFs(granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulatingfactors), 인터루킨-1 알파, 인터루킨-1 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRHII(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드일 수 있다.
본 발명은 또한 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체가 단백질의 N-말단과 결합되어 있는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제공한다.
본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 앞서 설명한 방법에 의해 제조될 수도 있지만, 이와는 다른 방법으로 제조된 것도 모두 포함하는 것으로 의도된다.
하기 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체와 결합된 단백질은 생접합율이 95%에 이를 뿐만 아니라 안정성이 우수하고, 고분자의 결합에 의해 단백질의 입체 구조가 영향을 받지 않으며, 단백질 의약의 약효 지속성이 매우 우수한 확인되었다. 따라서, 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질의 약물 전달 시스템을 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 히알루론산의 리셉터와 바인딩 하는 카르복실기를 남겨둔 채 링 구조를 오픈하여 단백질을 컨쥬게이션한 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는, 히알루론산의 간 조직 특이적 전달 특성을 최대화하여 간질환 치료제로의 개발에 다양하게 응용될 수 있다. 또한, 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율을 조절함으로써 히알루론산의 간 표적 지향성을 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 간의 우회가 필요한 약물의 약효 지속성 확보를 위해서도 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질 의약의 생접합율과 약효 지속성이 매우 우수하고, 히알루론산이 단백질의 N-말단과 특이적으로 결합되어 있어 단백질 의약의 활성이 뛰어나다. 또한, 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율을 조절함으로써 히알루론산의 간 표적 지향성을 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 간 질환 치료용 의약뿐만 아니라, 간의 우회가 필요한 의약의 약효 지속성 확보를 위해서도 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질의 약물 전달 시스템을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 (a)는 본 발명의 제조예 1에 따른 방법으로 제조된 치환율별 HA-adehyde-TBC 유도체의 1H-NMR 결과이다. (b)는 본 발명의 제조예 2에 따른 방법으로 제조된 치환율별 HA-adehyde-TBC 유도체의 1H-NMR 결과이다.
도 2는 본 발명의 제조예에 따른 방법으로 제조된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 단백질의 GPC 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 히알루론산-인터페론 컨쥬게이트의 하나의 히알루론산 체인에 포함된 인터페론 분자수 및 단백질 분자수에 따른 생접합 효율을 나타낸 것이다.
도 4는 인터페론 알파와 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 Circular Dichroism (CD) 분석결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파의 활성도 분석 결과를 ELISA assay를 통하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파의 활성도 분석 결과를 daudi cell을 이용한 antiproliferation assay를 통하여 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파의 항암치료 효과를 HepG2 간암세포를 이용한 antiproliferation assay를 통하여 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 일터페론의 human serum 내에서 안정성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 근적외선 형광 염료로 레이블링된 (A) 인터페론 알파 및 (B) 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 꼬리 정맥 주사후의 리얼타임 바이오이미징 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 Pharmacokinetic analysis 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 쥐의 간에서의 항바이러스 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
제조예1: 히알루론산 알데하이드 유도체의 제조
히알루론산 (HA) (MW= 6.4kDa, 35kDa, 100kDa, 230kDa) 10mg/ml의 농도로 물에 녹인 후 소듐 퍼리오데이트 (Sodium periodate)를 단위체당 1 mole배로 첨가하고, 각각 2시간, 6시간, 12시간 동안 빛을 차단한 상태로 반응시켰다. 그런 다음, 상기 용액을 증류수에 대하여 투석하여 정제한 후 3일간 동결건조 시켜 치환율이 다른 히알루론산 알데하이드 유도체(HA-aldehyde 유도체)를 얻었다.
제조예2: 히알루론산 알데하이드 유도체의 제조
히알루론산 (HA) (MW= 6.4kDa, 35kDa, 100kDa, 230kDa) 5mg/ml의 농도로 물에 녹인 후 HA 단위체의 20 mole배 분량의 Adipic Acid Dihydrazide (ADH)를 첨가한 후 HCl로 용액의 pH를 4.8로 맞춘 뒤, 30min 동안 stirring시킨 후 용액에 HA 단위체의 4 mole배의 분량의 N-(3Dimethylaminopropyl)N’thylcarbodiimidehydro chloride (EDC, Mw=191.71)을 첨가한 뒤 각 3분, 2시간 동안 pH를 4.8로 유지하면서 반응을 시킨다. 그런 다음, 상기 용액을 증류수에 대하여 투석하여 정제한 후 3일간 동결건조 시켜 치환율이 다른 HA-ADH 유도체를 얻었다. 만들어진 HA-ADH 유도체를 10mg/ml의 농도로 pH 5.2의 소듐 아세테이트 완충액에 녹인 다음, 도입된 ADH의 10 mole배의 글루타알데하이드를 첨가한 후 24시간동안 반응 시킨다. 그런 다음, 용액을 증류수에 대하여 투석하여 정제한 후 3일간 동결건조 시켜 치환율이 다른 HA-ADH-Aldehyde 유도체를 얻었다.
실험예 1: 히알루론산 알데하이드 유도체의 치환율 분석
제조예 1에 따라 준비된 히알루론산 알데하이드 유도체를 5mg/ml의 농도로 pH 5.2의 소듐 아세테이트 완충액에 녹인 다음, 히알루론산 단위체당 5mole배의 테트라 뷰틸카바자이트(Tetrabutyl carbazate, TBC)와 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaBH3CN)를 첨가하여 24시간 반응 시켰다. 이 용액을 증류수에 대하여 투석한 후 3일간 동결건조하여 1H-NMR (DPX300, Bruker, Germany)으로 알데하이드의 치환율을 분석하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 1에 따른 HA-TBC의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크 외에도, δ = 1.2 ~ 1.4 ppm에 9개의 수소를 나타내는 TBC의 3개의 메틸 피크가 나타났다. 정량분석을 위해 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)로 정했다. 제조예 1에 따른 HA-Aldehyde의 치환율은 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 δ = 1.2 ~ 1.4 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. 이러한 1H-NMR 분석 결과를 통해 히알루론산-알데하이드 유도체의 치환율을 계산해 본 결과 후 소듐 퍼리오데이트와의 반응 시간을 조절하여 10~50%의 치환율을 조절하여 얻을 수 있었다(2h: 10%, 12h:25%, 24h: 45%).
실험예 2: 히알루론산 알데하이드 유도체의 치환율 분석
제조예 2에 따라 준비된 히알루론산 알데하이드 유도체를 5mg/ml의 농도로 pH 5.2의 소듐 아세테이트 완충액에 녹인 다음, 히알루론산 단위체당 5mole배의 테트라 뷰틸카바자이트(Tetrabutyl carbazate, TBC)와 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaBH3CN)를 첨가하여 24시간 반응 시켰다. 이 용액을 증류수에 대하여 투석한 후 3일간 동결건조하여 1H-NMR (DPX300, Bruker, Germany)으로 알데하이드의 치환율을 분석하였다. 그 결과, 도 1-b에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 2에 따른 HA-TBC의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크 외에도, δ = 1.2 ~ 1.4 ppm에 9개의 수소를 나타내는 TBC의 3개의 메틸 피크가 나타났다. 정량분석을 위해 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)로 정했다. 제조예 2에 따른 HA-Aldehyde의 치환율은 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 δ = 1.2 ~ 1.4 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. 이러한 1H-NMR 분석 결과를 통해 히알루론산-알데하이드 유도체의 치환율을 계산해 본 결과 후 도입된ADH의 치환율에 따라 20~70%의 알데하이드 치환율을 조절하여 얻을 수 있었다.
제조예 3: 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질과의 컨쥬게이트의 제조
제조예 1에서 얻어진 히알루론산-알데하이드 유도체를 10mg/ml의 농도로 pH 6의 아세테이트 완충액에 녹인 후 수용액 상태의 인터페론 알파를 히알루론산 1 체인 당 각각 1개, 4개, 6개, 9개가 되도록 첨가하였다. 히알루론산-알데하이드 유도체의 치환율에 따라 알데하이드의 5mole배로 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaBH3CN)를 첨가하여 24시간 동안 반응시켜, 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트 (HA-IFN conjugate)를 얻었다.
히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트 내에 반응하지 않고 남아있는 알데하이드를 블로킹(blocking)하기 위하여 에틸 카바자이트 (ethyl carbazate)를 알데하이드의 5mole배로 넣어준 후 24시간동안 더 반응 시키거나, 아미노 에탄올 (amino ethanol)을 알데하이드의 5mole배로 넣어준 후 pH 8에서 3시간동안 더 반응시켰다. 반응시킨 용액을 pH 7.4의 인산 완충 식염수 (PBS)에 대하여 투석한 후 -70C에 보관하였다. 하기 실험예 3,5,6,7,8,9,10 및 11에서는 모두 히알루론산 1 체인당 6개의 인터페론 알파가 접합된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트를 사용하였다.
실험예 3: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 GPC 분석
제조예 3에 따라 준비된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 GPC 분석을 통해 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 형성을 확인하였다.
HPLC를 사용하여 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 GPC 분석하였다. 분석 조건은 하기와 같다.
GPC 분석 조건
펌프: Waters 1525 binary HPLC pump
흡광도 측정기: Waters 2487 dual λ absorbance detector
샘플러: Waters 717 plus auto-sampler
컬럼: Waters Ultrahydrogel 500 +Waters Ultrahydrogel 250
이동상: PBS at pH 7.4, flow rate는 0.5 mL/min.
측정 파장: 210 nm와 280 nm로 이중 측정(dual detection).
분석 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 280nm의 파장에서 측정하였을 때, 고분자량의 히알루론산의 체류 시간(retention time)인 22분 대에서 피크가 나타나 히알루론산(HA)에 인터페론 알파가 컨쥬게이션 되었음을 확인하였다.
실험예 4: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 정량분석
상기 제조예 3에 따른 HA-인터페론 알파 컨쥬게이트 내의 인터페론 알파 함량은 GPC에서 피크 아래의 면적을 측정해 구하였다. 먼저 증류수에 1 mg/mL의 농도로 인터페론 알파 원액을 준비한 뒤, 희석시켜 인터페론 알파 표준용액을 준비하였다. 상기 실험예 3의 GPC 분석 조건에서 인터페론 알파 표준용액을 분석하여 인터페론 알파 농도에 따른 GPC 피크 아래 면적의 표준곡선 (stnadard curve)를 구하였다. 상기 제조예 3에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트를 같은 조건에서 분석해 얻은 GPC 피크 아래 면적을 표준곡선에 대입해 단백질 함량을 구했다.
분석 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 3에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트 내의 단백질 함량은 feed내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 단백질의 분자수에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. HA 한 분자당 반응시킨 단백질의 분자수를 1, 4, 6, 9개로 변화시켰을 때, HA 한 분자 당 결합한 단백질의 평균 분자수는 1, 4, 6, 9개로 조절 가능했다. 생접합 효율(Bioconjugation efficiency) (%)은 분자수에 상관없이 95% 이상으로 나타났다.
실험예 5: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 CD 분석
인터페론의 농도를 기준으로 하여 (0.25mg/ml) 인터페론 알파 용액과 상기 제조예 3에 따른 히알루로산-인터페론 알파 컨쥬게이트 용액을 이용하여 Circular Dichroism 분석을 하였다. 분석 조건은 하기와 같다.
CD 분석 조건
UV spectrophotometer : JASCO J-715
측정 조건 : 25℃, 200~250 nm, N2 atmosphere
A quartz cuvette : 2 mm path length
Raw data : 0.2 mm intervals with a response time of 1 s.
분석 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 인터페론의 스렉트럼과 히알루론산-인터페론 컨쥬 게이트의 CD의 피크가 일치하는 것으로 보아 인터페론의 2차 구조가 히알루론산과 접합되어도 유지되는 것을 알 수 있다.
실험예 6: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 활성도 분석
ELISA/Bradford assay의 비율을 통하여 히알루론산-인터페론 컨쥬게이트의 활성도를 분석하였다. 먼저, 1mg/ml의 인터페론 알파 용액의 원액을 준비한 뒤, 희석시켜 인터페론 알파 표준용액을 준비하였다. Bradford assay를 이용하여 농도에 따른 흡광도를 측정하여 표준곡선을 구하였다. 상기 제조예 3에 따라 준비된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론을 희석하여 같은 조건에서 Bradford assay로 흡광도를 측정한 후 스탠다드 커브에 대입해 인터페론 알파의 함량을 구했다. 또한 Bradford assay를 찍은 샘플과 표준 용액을 10000배 희석하여 ELISA를 통해 활성도를 가진 인터페론의 함량을 구했다. 그런 다음, ELISA/Bradford assay의 비율을 통하여 히알루론산-인터페론 컨쥬게이트의 활성도를 분석하였다.
분석 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 ELISA/Bradford assay의 비율이 70% 이상으로 나타났다. Bradford assay는 단백질의 리신(lysine)을 측정하는 분석 방법이고 ELISA는 인터페론 알파와 항체와의 결합을 이용하여 정량하는 분석 방법으로 이 비율을 통하여 존재하는 단백질 중에서 70% 이상이 활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.
실험예 7: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 활성도 테스트
인터페론이 존재할 경우 증식을 잘 하지 못하는 세포로 알려져 있는 Human B-lymphoblastoid cell (Daudi cell)을 이용하여 인터페론의 활성도를 테스트하였다.
먼저, 1mg/ml의 인터페론 알파의 원액을 준비한 뒤, 희석시켜 인터페론 알파 표준용액을 준비하였다. Bradford assay를 이용하여 농도에 따른 흡광도를 측정하여 표준곡선을 구하였다. 상기 제조예 3에 따라 준비된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파를 희석하여 같은 조건에서 Bradford assay로 흡광도를 측정한 후 스탠다드 커브에 대입해 인터페론 알파의 함량을 구했다. Daudi cell을 각 표준용액과 희석한 샘플을 포함한 배지에서 5일 동안 인큐베이션한 후 MTS assay를 통하여 Daudi cell의 증식속도를 확인하였다.
분석 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이 인터페론 알파 표준용액에 비하여 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 활성도가 떨어지지만 시중에 판매되는 PEGASYS의 경우와 비슷한 효율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 8: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 항암 효과 분석
간암 세포인 HepG2 세포에 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트를 처리하고, MTT 어세이를 통하여 HepG2 세포의 생존율을 분석함으로써, 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 항암 효과를 시험하였다.
먼저, 1mg/ml의 인터페론 알파의 원액을 준비한 뒤, 희석시켜 인터페론 알파 표준용액을 준비하였다. Bradford assay를 이용하여 농도에 따른 흡광도를 측정하여 표준곡선을 구하였다. 상기 제조예 3에 따라 준비된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파를 희석하여 같은 조건에서 Bradford assay로 흡광도를 측정한 후 스탠다드 커브에 대입해 인터페론 알파의 함량을 구했다. 표준용액과 희석한 샘플을 포함한 각 배지에서 HepG2 세포를 3일 동안 인큐베이션한 후 MTT 어세이를 통하여 HepG2 세포의 생존율을 확인하였다.
분석 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 인터페론 알파 표준용액과 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 항암효과가 비슷한 효과를 보이는 것을 알 수 있다.
실험예 9: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 반감기 분석( Invitro )
IFN와 HA IFN 컨쥬게이트(10%/6)(알데하이드기 치환율이 10% 이며 HA 한 chain 당 6개의 IFN 분자가 결합하고 있는 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트)를 분석 샘플로 사용하여 이들의 반감기를 분석하였다.
위의 샘플을 IFN 농도가 1 mg/mL로 동일하도록 각각 인간 혈청에 용해시켜 37℃에서 120시간 동안 인큐베이션하였다. 정해진 시간이 되었을 때 일부를 샘플링하고, 인간 혈청의 영향을 막기 위해 PBS에 1000배로 희석한 후 냉동시켰다. 각 샘플의 생물학적 활성도는 IFN ELISA 키트와 Daudi 세포를 이용한 MTS 어세이를 사용해 측정하였다.
분석 결과, 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 인터페론 알파는 24시간 내에 빠르게 분해되었다. 하지만 HA-IFN 컨쥬게이트(10%/6)는 120시간 이상으로 반감기가 연장되어, 인터페론에 비해 약 5배 길어진 반감기를 가졌다.
실험예 10: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 인 비보 이미징 및 약리 (PK) 특성 분석 ( Invivo )
HA-IFNα의 전신적인 분포를 조사하기 위하여 인 비보 이미징을 수행하였다. IFNα 및 HA-IFNα 컨쥬게이트(10%/6)를 근적외선 형광(NIRF) 염료로 레이블링하고, Balb/c 마우스의 꼬리정맥에 이를 주사하였다. 주사 30분 및 1시간 후 마우스를 마취하고 형광을 발광 이미지 분석기로 캡처하였다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, NIRF 염료가 레이블링된 HA-IFNα 컨쥬게이트는 타겟 특이적으로 간으로 전달된 반면, NIRF 염료-IFNα는 고루 분포되어 방광에서의 형광을 나타내는 신장 소실에 의해 제거되었다. 이러한 결과는 퀀텀닷을 이용한 HA 유도체의 타겟 특이적 간 전달에 대해 보고한 이전 논문들의 리얼 타임 바이오이미징 결과와 잘 맞아, HA-IFNα 컨쥬게이트의 간질한 치료를 위한 실현가능성을 뒷받침해준다.
한편, SD rat의 꼬리 정맥을 통해 PBS, IFN, HA IFNα 컨쥬게이트(치환도 10%, 25%, 45%)를 각각 투여한 후, 정해진 시간이 되었을 때 꼬리 정맥에서 혈액을 채취해 각 샘플의 혈중농도를 IFN ELISA kit를 사용해 측정하였다.
분석 결과, 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, IFN 혈중농도는 24시간 이전에 baseline으로 떨어졌으나, HA IFNα 컨쥬게이트 (45%/6)의 혈중농도는 4일째에도 baseline으로 떨어지지 않았다.
실험예 11: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 항바이러스 특성 분석 ( InVivo )
2'-5'-oligoadenylate synthetase 1 (OAS 1)은 INFα에 의해 유도되는 항바이러스성 단백질로서 바이러스 감염에 대한 선천적 면역 반응에 참여한다. OAS 1은 이중가닥 RNA의 분해 및 바이러스 복제의 저해에 대해 RNase L을 활성화시키는 2'-5'-oligoadenylate를 합성하는 반응에 대한 효소이다. INFα의 항바이러스 활성은 OAS 1 발현 레벨과 깊은 관계가 있다.
Balb/c 마우스의 꼬리 정맥을 통해 PBS, IFNα, HA IFNα (10%/6), HA IFNα (45%/6) 컨쥬게이트를 각각 투여한 후 (주사량 : 인터페론 기준 0.2mg/kg), 24시간 이후에 쥐의 간을 채취하여 간에서의 2'-5'-oligoadenylate synthetase 1 (OAS 1) level을 웨스턴 블럿을 통하여 정량하였다.
도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, IFNα 보다도 저 치환율의 HA-IFNα 컨쥬게이트의 경우 간으로 전달이 잘되고 체내 잔류시간이 길어지기 때문에 간에서의 항바이러스 역할을 하는 OAS 1 level이 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 고 치환율의 HA-IFNα 컨쥬게이트의 경우 저치환율의 HA-IFNα 컨쥬게이트에 비해서는 간으로의 전달 특성이 떨어지지만 체내 잔류 시간을 늘려 IFNα보다 OAS 1 level이 높아지는 것을 확인하였다.

Claims (25)

  1. 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질의 N-말단과 반응시키는 것을 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 하나 이상의 알데하이드기가 도입되어 있는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격이 개환되어 있고 개환된 환의 말단에 하나 이상의 알데하이드기를 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염을 산화제와 반응시켜 얻은 것인 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 산화제는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격을 개환시켜 하나 이상의 알데하이드기를 형성시킬 수 있는 것인 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 산화제는 퍼리오데이트(periodate)인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서,
    히알루론산 또는 그의 염과 산화제 간의 반응 시간을 조절함으로써 히알루론산 또는 그의 염의 알데하이드기 치환율을 조절하는 것을 포함하는
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 존재하는 카르복실 위치에 알데하이드기가 도입되어 있는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  9. 제 8항에 있어서
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실 그룹을 다이아민 또는 다이하이드라자이드 그룹을 가진 분자와 반응시킨 뒤, 그 유도체를 다이알데하이드 그룹을 가진 분자와 반응시켜 얻은 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 5% 이상 30% 미만의 알데하이드기 치환율을 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 30% 이상 100% 미만의 알데하이드기 치환율을 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 환원적 아미노화(reductive amination)를 유도하는 시약의 존재 하에서 수행되는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 환원적 아미노화를 유도하는 시약은 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyannoborohydride, NaBH3CN)또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride, NaBH(OCOCH3)3)인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 pH 5 내지 7의 완충액 중에서 수행되는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 pH 5.5 내지 6.5의 완충액 중에서 수행되는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  16. 제1항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체에서 단백질의 N-말단과 반응하지 않은 미반응 알데하이드기를 보호기로 블로킹하는 단계를 추가로 포함하는
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  17. 제1항에 있어서,
    히알루론산 또는 그의 염은 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  18. 제1항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체 한 분자 당 결합되는 단백질의 분자수는 1 내지 20개인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, GCSFs(granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulatingfactors), 인터루킨-1 알파, 인터루킨-1 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRHII(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  20. 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체가 단백질의 N-말단과 결합되어 있는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  21. 제20항에 있어서,
    히알루론산 또는 그의 염은 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  22. 제20항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체 한 분자 당 결합되어 있는 단백질의 분자수가 1 내지 20개인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 간 질환의 치료를 위한 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 단백질은 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, GCSFs(granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulatingfactors), 인터루킨-1 알파, 인터루킨-1 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRHII(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 단백질은 인터페론 알파인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
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