KR102277785B1 - 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체 - Google Patents

히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹에 약물을 도입하여 합성한 히알루론산-약물 접합체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 히알루론산-약물 접합체는 히알루론산의 반복 구조의 변형 없이 약물을 접합할 수 있으며, 이를 통해 분해 산물을 간소화할 수 있다.

Description

히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체{Drugs Conjugated with Aldehyde End-Group of Hyaluronic Acid}
본 발명은 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 히알루론산-약물 접합체에 관한 것이다.
히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 이러한 히알루론산은 우수한 생체 적합성을 갖기 때문에 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질, 점안제, 하이드로젤 필러, 주름 개선제, 화장품 등으로 널리 사용되고 있다.
특히, 약물 전달 분야에서 유효성분을 히알루론산에 접합하면 약효 지속 시간을 연장할 수 있고, 히알루론산과 수용체의 상호작용을 통해 간 조직 특이적 전달, 경피 전달 등이 가능하다(특허문헌 1). 따라서, 화학약물 및 펩타이드, 단백질 의약품 등을 접합한 히알루론산 접합체 개발에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
1. 한국등록특허 제10-2014-0104637호
본 발명은 히알루론산 말단에 형성된 알데하이드 그룹를 이용하여 상기 히알루론산 말단에 약물을 접합한 히알루론산-약물 접합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 히알루론산-알데하이드(HA-aldehyde) 유도체를 약물과 반응시키는 단계를 포함하며,
상기 약물은 구조 중에 아민기를 포함하는 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112019105961714-pat00001
상기 화학식 1에서 n은 25 내지 10,000의 정수이고,
A는 알데하이드 그룹을 포함하며, 상기 o 및 p는 각각 1 내지 10의 정수이다.
또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조되는 화합물을 포함하는 히알루론산-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹에 약물을 도입하여 합성한 히알루론산-약물 접합체를 제공한다.
본 발명에 따른 히알루론산-약물 접합체는 기존 접합체와 비교하여 히알루론산 반복 구조의 변형 없이 약물을 접합할 수 있으므로, 히알루론산의 구조를 보존할 수 있으며, 또한 생체조직과 작용이 더 효과적이다. 그리고 구조가 단순하다는 장점을 가지며, 분해 산물의 생성을 간소화할 수 있다.
또한, 접합하는 약물, 즉, 화학약물, 펩타이드 또는 단백질 성분 등에 따라 다양한 질환에 적용 가능하며, 히알루론산에 의한 경피 전달, 간 표적지향 전달 등에 적용 가능하다.
도 1은 히알루론산-펩타이드 접합체의 합성 모식도이다.
도 2는 히알루론산-펩타이드 접합체의 NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 히알루론산-펩타이드 접합체의 GPC 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 히알루론산-펩타이드 접합체 나노입자의 DLS 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 히알루론산-글루타알데하이드 유도체를 이용한 히알루론산-단백질 접합체의 합성 모식도이다.
도 6은 히알루론산-다이아미노부탄 유도체의 NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 히알루론산-글루타알데하이드 유도체의 NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 (a) 100 kDa, (b) 10 kDa, (c) 5 kDa 분자량을 가지는 히알루론산-글루타알데하이드 유도체를 이용한 히알루론산-인터페론(IFN) 접합체의 GPC 분석 결과를 나타낸다.
도 9에서 a는 비교예 1의 접합체(HA-g-ald 200k-6hGH), b 및 c는 10 kDa 분자량을 가지는 히알루론산-인성장호르몬 접합체(HA-b-ald 10k-hGH)의 GPC 분석 결과를 나타낸다. 또한, d는 GPC 분석 결과를 바탕으로 계산된 시간에 따른 인성장호르몬 생접합율 결과를 나타낸다.
도 10은 히알루론산-인성장호르몬 접합체의 NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 비교예 1의 접합체(HA-g-ald 200k-6hGH)와 10 kDa 분자량을 가지는 히알루론산-인성장호르몬 접합체(HA-b-ald 10k-hGH)의 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 비교예 1의 접합체(HA-g-ald 200k-6hGH)와 10 kDa 분자량을 가지는 히알루론산-인성장호르몬 접합체(HA-b-ald 10k-hGH)의 생물학적 활성 분석 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 히알루론산-알데하이드(HA-aldehyde) 유도체를 약물과 반응시키는 단계를 포함하며,
상기 약물은 구조 중에 아민기를 포함하는 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112019105961714-pat00002
이하, 본 발명의 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 히알루론산은 생체 적합성 및 생분해성 특성을 가질 뿐만 아니라 경피 전달 특성을 가지고 있어, 인체에 안전하게 적용할 수 있으며, 항원 단백질을 비롯한 다양한 단백질 의약품 및 화학 의약품의 경피 약물 전달 시스템에 적용 가능하다는 장점을 가진다.
본 발명에서 명시적인 기재가 없는 한, '히알루론산(Hyaluronic acid, HA)'은 하기 일반식 1로 표현되는 반복단위를 갖는 고분자를 지칭하며, 히알루론산의 염 또는 유도체 형태를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
[일반식 1]
Figure 112019105961714-pat00003
상기 일반식 1에서, n은 25 내지 10,000 의 정수일 수 있다.
본 발명에서 '히알루론산 유도체'는 상기 일반식 1의 히알루론산 기본 구조를 기반으로 하여 아민 그룹, 알데하이드 그룹, 바이닐 그룹, 치올 그룹, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 등의 작용기가 도입되어있는 히알루론산의 모든 변형체를 지칭한다. 예를 들어, 상기 히알루론산 유도체로 HA-디아미노부탄(HA-diaminobutane), HA-헥사메틸렌디아민(HA-hexamethylenediamine), HA-알데하이드(HA-aldehyde), HA-아디픽산 디하이드라지드(HA-Adipic Acid Dihydrazide, HA-ADH), HA-2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드(HA-2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride), HA-스페르민(HA-Spermine), HA-스페르미딘(HA-spermidine), HA-SPDP, HA-NHS 등을 사용할 수 있다.
상기 히알루론산은 대부분의 동물에 존재하며 생분해성, 생적합성, 면역반응이 없는 선형적인 다당류의 고분자로서 인체에 안전하게 적용할 수 있다. 히알루론산은 체내에서 분자량에 따라 여러 가지 다른 역할을 수행하기 때문에 여러 가지 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 히알루론산, 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게는 분자량이 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)일 수 있다. 상기 범위의 분자량을 갖는 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 약물 전달을 위한 접합체에 사용되기에 적합하다.
본 발명에 따른 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법은 히알루론산-알데하이드 유도체를 약물과 반응시키는 단계를 포함한다.
본 발명에서 히알루론산-알데하이드 유도체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112019105961714-pat00004
상기 화학식 1에서 n은 25 내지 10,000의 정수일 수 있으며, A는 알데하이드 그룹(group)을 포함할 수 있다. 이때, 상기 o 및 p는 각각 1 내지 10의 정수, 2 내지 8의 정수 또는 2 내지 4의 정수일 수 있다.
일 구체예에서, A는 알데하이드 그룹을 포함하는 작용기로서,
Figure 112019105961714-pat00005
일 수 있다. 일반적으로 히알루론산에서 상기 히알루론산의 말단은 닫힌 링 형태(cyclic form)와 알데하이드를 가지는 열린 링 형태(open-chain form)가 평형을 이루고 있다. 즉, 별도의 화학반응 없이도 히알루론산은 알데하이드 그룹을 포함한다. 따라서, 본 발명에서는 히알루론산을 히알루론산-알데하이드 유도체로서 사용할 수 있다.
일 구체예에서, A는 알데하이드 그룹을 포함하는 작용기로서,
Figure 112019105961714-pat00006
일 수 있다. 약물을 히알루론산 말단 알데하이드 그룹과 직접 접합할 경우, 반응 효율이 낮고, 높은 온도에서 반응을 수행해야 한다. 본 발명에서는 새로운 형태의 알데하이드 그룹을 히알루론산 말단에 도입하여 약물과의 반응 효율이 우수하고, 보다 낮은 온도에서 반응을 수행할 수 있으므로 약물의 변형을 방지할 수 잇다.
이러한 히알루론산-알데하이드 유도체는 합성하여 제조할 수 있다. 구체적으로, (a) 히알루론산을 다이아민과 반응시켜 상기 히알루론산의 말단에 아민기가 형성된 히알루론산-다이아민 유도체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 히알루론산-다이아민 유도체를 다이알데하이드와 반응시켜 히알루론산-알데하이드 유도체를 제조하는 단계를 통해 제조할 수 있다.
단계 (a)는 히알루론산-다이아민 유도체를 제조하는 단계이다. 상기 단계에서 다이아민 중의 하나의 아민 그룹은 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹과 반응하여 히알루론산-다이아민 유도체를 형성할 수 있다. 상세하게는 상기 단계는 히알루론산, 히알루론산의 염 또는 히알루론산의 유도체를 pH 7 내지 9 또는 pH 8 내지 9의 보레이트 완충용액 용해시킨 후, 다이아민을 첨가하여 반응시킬 수 있다.
상기 다이아민의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 에틸렌다이아민, 부틸렌다이아민, 헥사메틸렌다이아민, 펜타에틸렌헥사아민 및 1,5-다이아미노-2-메틸펜탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 다이아민은 히알루론산 단위체 대비 1 내지 20 몰(mole) 배로 사용할 수 있다.
일 구체예에서 상기 반응은 환원제의 존재하에서 수행할 수 있다. 상기 환원제로는 소듐시아노보로하이드라이드(NaBH3CN), 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride) 또는 피콜린 보레인(picoline borane)을 사용할 수 있다. 상기 환원제는 히알루론산 단위체 대비 1 내지 20 몰 배로 사용할 수 있다.
또한, 일 구체예에서 상기 반응은 25 내지 60℃, 또는 25 내지 40℃에서 10 시간 내지 7일 동안 수행할 수 있다.
단계 (b)는 히알루론산-알데하이드 유도체를 제조하는 단계이다. 상기 단계에서 히알루론산-다이아민 유도체의 아민 그룹은 다이알데하이드의 알데하이드 그룹과 반응하여 히알루론산-알데하이드 유도체를 형성할 수 있다. 상기 반응에서 다이알데하이드는 링커로서 다이아민을 매개로 하여 히알루론산에 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹은 다이아민의 아민기와 반응하여, 상기 알데하이드와 이민의 환원 반응(reductive amination)에 의해 이민 결합(imine bond)이 환원된 -C-N- 결합을 형성할 수 있으며, 상기 다이아민에서 결합을 형성하지 않은 아민기는 다이알데하이드의 알데하이드 그룹과 반응하여, 상기 알데하이드와 이민의 환원 반응(reductive amination)에 의해 이민 결합(imine bond)이 환원된 -C-N- 결합을 형성할 수 있다.
상세하게는 상기 단계는 히알루론산-다이아민 유도체를 pH 7 내지 9 또는 pH 8 내지 9의 보레이트 완충용액 용해시킨 후, 다이알데하이드를 첨가하여 반응시킬 수 있다.
상기 다이알데하이드의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 글루타알데하이드, 글리옥살(glyoxal) 및 숙신알데하이드(succinaldehyde)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 다이아민은 유도체의 아민 그룹 대비 1 내지 20 몰(mole) 배로 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 다이알데하이드로 글루타알데하이드를 사용할 경우, 제조되는 히알루론산-알데하이드 유도체를 히알루론산-글루타알데하이드 유도체로 표현할 수 있다.
일 구체예에서 상기 반응은 환원제의 존재하에서 수행할 수 있다. 상기 환원제로는 전술한 환원제를 사용할 수 있으며, 그 함량도 전술한 바와 같다.
또한, 일 구체예에서 상기 반응은 25 내지 40℃, 구체적으로 상온에서 10 시간 내지 3일 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서는 전술한 히알루론산-알데하이드 유도체를 사용하여 히알루론산-약물 접합체를 제조한다. 상기 히알루론산-약물 접합체는 다이알데하이드 매개로 히알루론산 및 약물이 접합되므로, 히알루론산-알데하이드 유도체-약물 접합체로 표현할 수 있다.
상기 접합체는 히알루론산-알데하이드 유도체와 약물을 반응시켜 제조할 수 있으며, 상세하게는 상기 단계는 히알루론산-알데하이드 유도체를 pH 5 내지 7의 완충용액, 바람직하게는 pH 5 내지 6.5의 소듐 아세테이트 완충용액에 용해시킨 후, 약물을 첨가하여 반응시킬 수 있다. 특히, 상기 pH 조건에서 공정을 수행함으로써, 약물, 특히 단백질 내 다른 아민기를 갖는 예를 들어 리신 등과 같은 다른 아미노산과의 반응을 방지할 수 있다. 따라서, 약물의 활성을 최대화한 상태로, 생접합 효율 및 약효 시간을 증대시킬 수 있다.
일 구체예에서 약물의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 화학약물, 면역증강제, 백신, 단백질 약물, 펩타이드 약물, 유전자 치료용 핵산 분자, 화장품용 효능물질 또는 의료용 항체일 수 있다.
상기 단백질 약물은 인성장호르몬, 인터페론알파, 에리스로포에틴(erythropoietin), 트레일(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), 오발부민 또는 인슐린일 수 있다.
본 발명에서는 약물의 종류에 따라, 히알루론산-약물 접합체를 달리 표현할 수 있으며, 예를 들어, 약물로 인성장호르몬을 사용할 경우 히알루론산-인성장호르몬 접합체로 표현할 수 있다.
상기 약물은 그 구조 중에 아민기를 포함할 수 있다. 상기 아민기는 히알루론산-알데하이드 유도체의 말단의 알데하이드 그룹과 반응하여, 알데하이드와 아민의 환원반응(reductive amination)에 의해 이민(imine) 결합이 환원된 -C-N- 결합을 형성할 수 있다. 단백질 약물의 경우 단백질의 N-말단기에는 아민기가 존재하므로 별도의 추가 과정 없이 약물로 사용할 수 있으며, 약물이 아민기를 포함하지 않는 경우, 추가의 공정을 통해 약물 말단에 아민기를 도입할 수 있다.
상기 약물은 히알루론산-알데하이드 유도체 말단의 알데하이드 그룹 대비 1 내지 20 몰(mole) 배로 사용할 수 있다.
일 구체예에서 상기 반응은 환원제의 존재하에서 수행할 수 있다. 상기 환원제로는 전술한 환원제, 즉, 소듐시아노보로하이드라이드(NaBH3CN), 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride) 또는 피콜린 보레인(picoline borane)를 사용할 수 있으며, 그 함량도 전술한 바와 같다.
또한, 일 구체예에서 상기 반응은 25 내지 40℃, 구체적으로 상온에서 10 시간 내지 7일 동안 수행할 수 있다.
일 구체예에서 본 발명에 의해 제조되는 히알루론산-약물 접합체는 상기 접합체 한 분자에 하나의 약물이 결합된 구조를 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 히알루론산-약물 접합체에 관한 것이다.
상기 약물 접합체는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함한다.
[화학식 2]
Figure 112019105961714-pat00007
상기 화학식 2에서 n은 25 내지 10,000의 정수이고,
D는
Figure 112019105961714-pat00008
또는
Figure 112019105961714-pat00009
이며, 이때, 상기 o 및 p는 각각 1 내지 10의 정수, 2 내지 8의 정수 또는 2 내지 4의 정수일 수 있다.
상기 히알루론산-약물 접합체는 인체에 안전하게 적용할 수 있으며, 또한 약물, 특히, 단백질의 특정 아미노산과 반응하여 단백질의 생체 활성도를 최대화한 상태이므로, 생접합 효율이 높고, 약효 시간을 증대할 수 있다. 따라서, 효과적인 경피 전달 제형으로 응용될 수 있다.
한편, 히알루론산은 보습 및 주름 개선을 위하여 화장품에도 다수 포함되어 있는 성분이다. 피부의 표피(epidermis) 세포층에 존재하는 각질세포(keratinocyte) 및 피부 깊숙한 진피(dermis) 층에 존재하는 섬유아세포(fibroblast) 등의 피부세포는 히알루론산의 수용체를 가지고 있어 상기 히알루론산의 농도에 따라 증식이 조절된다. 또한 피부 조직에는 다양한 면역 세포가 존재하고 있어 이를 자극하였을 때 면역 반응 활성화에 기여하므로 보다 강력한 면역반응을 일으킬 수 있는 효과적인 경피 전달용 백신 조성물로 적용될 수 있다. 따라서 이러한 경피 전달 특성이 있는 히알루론산을 이용한 히알루론산-약물 접합체는 피부질환 치료제, 단백질 치료제의 경피 전달 약물제제, 화장품 및 백신 등으로의 응용이 기대된다.
따라서 본 발명은 상기 히알루론산-약물 접합체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약학 조성물, 특히, 경피 전달용 약학 조성물, 피부세포의 재생을 위한 치료제, 화장료 조성물 및 백신 조성물을 제공한다.
상기 치료학적 유효량이란 유리한 효과 또는 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과, 예컨대 질병 상태의 완화, 개선, 안정, 복귀, 진행을 늦추거나 지연시키기에 충분한 양을 의미하며, 이러한 유효량은 1회 또는 그 이상으로 투여될 수 있다.
바람직하게는 상기 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 백신 조성물은 각각 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 화장용으로 허용 가능한 담체, 백신으로 허용 가능한 담체를 더욱 포함할 수 있으며, 이에 사용되는 바람직한 담체 및 그 밖의 첨가제, 부형제, 안정화제 등은 당 분야에서 널리 알려진 것을 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 전술한 본 발명의 제조 방법으로 화학식 2의 히알루론산-약물 접합체를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 히알루론산-약물 접합체를 치료학적 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 히알루론산-약물 접합체의 전달 방법을 제공한다.
상기 약물, 히알루론산, 및 치료학적 유효량 등에 대해서는 앞서 언급한 것을 동일하게 적용하거나, 당업자가 적절히 조정하여 적용할 수 있다.
상기 투여는 바람직하게는 경피 투여일 수 있으며, 상기 대상은 바람직하게는 포유류일 수 있다.
본 발명의 히알루론산-약물 접합체는, 수용액 상에서 접합 반응을 진행할 수 있어, 수용성인 다양한 펩타이드 및 단백질 활성 성분에 적용 가능하고, 생체적합성, 생분해성 고분자인 히알루론산의 경피투과 전달 특성을 유지하여 간편하고 인체에 적용하기 안전한 단백질 치료제, 화장품 및 백신으로의 다양한 응용이 가능하다. 따라서 본 발명의 히알루론산-약물 접합체는 피부질환 치료제, 단백질 치료제의 경피 전달 약물제제, 화장품, 백신 등으로 효과적으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예.
실시예 1. 히알루론산-펩타이드 접합체의 제조
히알루론산-알데하이드 유도체를 사용하여 히알루론산-펩타이드 접합체를 제조하였다.
상기 히알루론산-펩타이드 접합체의 합성 과정을 도 1의 모식도로 나타내었다.
(1) 히알루론산-펩타이드 접합체 제조
히알루론산-알데하이드 유도체 10 mg/ml를 포함하는 히알루론산 수용액에 히알루론산-알데하이드 유도체 중의 알데하이드 그룹의 5 몰 배로 소듐시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 그 후, 상기 수용액과 DMSO에 녹인 펩타이드(anti-Flt1 peptide, GGNQWFI, 농도 5 mg/ml) 용액을 혼합하고, pH 8.5, 37℃의 조건에서 5일 동안 반응시켜 히알루론산-펩타이드 접합체를 제조하였다.
그 후, 증류수로 투석(dialysis)하여 통해 반응하지 않은 펩타이드 및 환원제를 제거하고, 동결건조하여 -20℃에서 보관하였다.
실험예 1. 히알루론산-펩타이드 접합체의 NMR 분석
(1) 방법
실시예 1에서 제조된 동결건조된 히알루론산-펩타이드 접합체를 중수소수에 녹인 후, NMR(DPX300, Bruker, Germany)으로 알데하이드의 치환 여부를 분석하였다.
(2) 결과
NMR 분석 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 펩타이드 픽이 검출된 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 히알루론산 말단의 알데하이드에 펩타이드가 접합된 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 히알루론산-펩타이드 접합체의 GPC 분석
(1) 방법
실시예 1에서 제조된 히알루론산-펩타이드 접합체의 GPC(Gel Permeation Chromatography) 분석을 통해 히알루론산-펩타이드 접합체의 형성을 확인하였다.
구체적으로, HPLC(High performance liquid chromatography)를 사용하여 히알루론산-펩타이드 접합체를 GPC 분석하였으며, 분석 조건은 하기와 같았다.
＜GPC 분석 조건＞
펌프: Waters 1525 binary HPLC pump
흡광도 측정기: Waters 2487 dual λ absorbance detector
샘플러: Waters 717 plus auto-sampler
컬럼: GE Healthcare Superdex Peptide 10/300 GL
이동상: PBS (pH 7.4)
유속: 0.5 mL/min.
측정 파장: 210 nm와 280 nm로 이중 측정(dual detection).
(2) 결과
GPC 분석 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 도 3에 나타난 바와 같이, 히알루론산-펩타이드 접합체의 피크의 검출시간이 펩타이드 단독 대비 앞쪽으로 이동한 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 히알루론산-펩타이드 접합체 합성을 통해 분자 크기가 증가되었음을 확인할 수 있다.
실험예 3. 히알루론산-펩타이드 접합체의 DLS 및 표면 전하 분석
(1) 방법
실시예 1에서 제조된 히알루론산-펩타이드 접합체에서 펩타이드의 소수성 작용으로 인한 나노입자를 형성을 확인하기 위하여, Malvern사의 Zetasizer Nano ZS을 사용하여 DLS(dynamic light scattering) 분석 및 표면 전하 분석을 수행하였다.
(2) 결과
DLS 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 나노입자의 크기는 약 100 nm(98.7 ± 5.3 nm)인 것을 확인할 수 있다. 또한, 접합체의 표면 전하는 -11.7 ± 1.2 mV로 음전하를 띠는 것으로 확인되었다.
실시예 2. 히알루론산-단백질 접합체의 제조
펩타이드 또는 단백질을 히알루론산 말단 알데하이드 그룹과 직접 접합할 경우, 반응 효율이 낮고, 높은 온도에서 5일 동안 반응을 수행해야 하기 때문에 단백질 변성 가능성이 높아지는 문제가 있다. 따라서, 본 실시예 2에서는 다이아민과 글루타알데하이드를 이용하여 보다 쉽게 반응할 수 있는 알데하이드 그룹을 히알루론산 말단에 새롭게 도입하고, 이를 단백질과 반응시켜 히알루론산-단백질 접합체를 제조하였다.
상기 히알루론산-단백질 접합체의 합성 과정을 도 5의 모식도로 나타내었다.
(1) 히알루론산-디아미노부탄 유도체 제조
히알루론산을 pH 8.5 보레이트 완충용액에 녹여 히알루론산의 농도가 10 mg/ml인 히알루론산 용액을 제조하고, 상기 용액에 히알루론산 중의 알데하이드 그룹의 5 몰 배로 환원제인 소듐시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 그 후, 상기 알데하이드 그룹의 10 몰 배로 부틸렌다이아민을 첨가하고 37℃에서 3일 동안 반응시켜 히알루론산-디아미노부탄 유도체를 제조하였다.
상기 제조된 히알루론산-디아미노부탄 유도체를 MWCO 7000 투석막을 이용하여 증류수에 대하여 3일간 투석하고 3일간 동결건조한 후, NMR(DPX300, Bruker, Germany)으로 알데하이드의 치환 여부를 분석하였다.
NMR 분석 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 히알루론산-디아미노부탄 유도체가 합성되었음을 확인할 수 있다.
(2) 히알루론산-글루타알데하이드 유도체 제조
(1)에서 제조된 히알루론산-디아미노부탄 유도체를 pH 8.5 보레이트 완충용액에 녹여 상기 유도체의 농도가 10 mg/ml인 용액을 제조하였다. 상기 용액에 아민 그룹의 10 몰 배로 환원제인 소듐시아노보로하이드라이드를 첨가였다. 그 후, 아민 그룹의 10 몰 배로 글루타알데하이드를 첨가하고, 상온에서 1일 동안 반응시켰다.
상기 제조된 히알루론산-글루타알데하이드 유도체를 MWCO 7000 투석막을 이용하여 증류수에 대하여 3일간 투석하고 3일간 동결건조한 후, NMR(DPX300, Bruker, Germany)으로 분석하였다.
NMR 분석 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 히알루론산-글루타알데하이드 유도체가 합성되었음을 확인할 수 있다.
(3) 히알루론산-단백질 접합체 제조
히알루론산-글루타알데하이드 유도체를 pH 5.5 소듐 아세테이트 완충용액에 녹여 농도가 6 mg/ml인 용액을 제조하였다. 상기 용액에 알데하이드 그룹의 10 몰 배로 환원제인 소듐시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 그 후, 인터페론(IFN) 2 mg/ml와 상온에서 3일 동안 반응시켰다.
실험예 4. 히알루론산-단백질 접합체의 GPC 분석
(1) 방법
GPC(gel permeation chromatography) 분석은 실험예 2와 같은 방법으로 수행하였다.
(2) 결과
GPC 분석 결과를 도 8a 내지 c에 나타내었다. 구체적으로 a는 분자량이 100 kDa, b는 10 kDa, c는 5 kDa인 히알루론산을 사용하여 제조된 히알루론산-글루타알데하이드 유도체를 이용한 접합체의 GPC 분석 결과를 나타낸다.
도 8에 나타난 바와 같이, 인터페론 픽의 검출시간이 앞쪽으로 이동하였고, 이를 통해 접합체 합성을 통해 분자 크기가 증가함을 확인할 수 있다.
또한 GPC를 이용하여 정제하였을 때 반응하지 않은 IFN을 제거하고 히알루론산-IFN 접합체만 분리하여 사용할 수 있다.
실시예 3. 히알루론산-인성장호르몬 접합체의 제조
실시예 2. (2)에서 제조된 히알루론산-글루타알데하이드 유도체를 pH 6.0 소듐 아세테이트 완충용액에 녹여 농도가 6 mg/ml 또는 1.2 mg/ml인 용액을 제조하였다. 상기 용액 각각에 알데하이드 그룹의 10 몰 배로 환원제인 소듐시아노보로하이드라이드(NaBH3CN)를 첨가하였다. 그 후, 2 mg/ml 인성장호르몬(hGH)을 첨가하고 상온에서 4일 동안 반응시켰다.
이를 통해, 히알루론산-글루타알데하이드 유도체와 인성장호르몬의 몰비율이 1:1 또는 5:1인 두 가지의 접합체를 제조하였다.
비교예 1. 히알루론산 링 반복구조 알데하이드 유도체-인성장호르몬 접합체
기존에 보고된 바 있는 히알루론산 링 반복구조 알데하이드 유도체-인성장호르몬 접합체(HA-g-ald 200k-6hGH)를 사용하였다. (J. -A. Yang, E. S. Kim, J. H. Kwon, H. Kim, J. H. Shim, S. H. Yun, K. Y. Choi, S. K. Hahn, "Transdermal Delivery of Hyaluronic Acid - Human Growth Hormone Conjugate", Biomaterials, 33, 5947-5954 (2012).)
실험예 5. 히알루론산-인성장호르몬 접합체의 GPC 분석
(1) 방법
실시예 3에서 제조된 히알루론산-인성장호르몬 접합체를 GPC (gel permeation chromatography)로 분석하였다.
상기 GPC 분석은 실험예 2와 같은 방법으로 수행하였다.
(2) 결과
GPC 분석 결과를 도 9b 및 c에 나타내었다. 구체적으로, 10 kDa 분자량을 가지는 히알루론산을 사용하여 제조된 히알루론산-인성장호르몬 접합체(HA-b-ald 10k-hGH)의 GPC 분석결과로, b 및 c는 각각 인성장호르몬 대비 히알루론산을 5몰 배, 1몰 배 첨가했을 경우를 나타낸다.
본 발명에서는 상기 결과와 비교예 1(도 9a)의 결과를 비교하였다. 상기 분석은 분석장비로 Shimadzu Prominence HPLC system, 컬럼(Ultrahydrogel 500+Ultrahydrogel 1000 연결 컬럼, 이동상: 1x PBS, 유속: 0.4 ml/min, 280 nm에서 흡광도 측정)을 사용하여 수행하였다.
상기 도에 나타난 바와 같이, 접합체 합성 후 인성장호르몬 픽의 검출시간이 앞쪽으로 이동하였고, 접합체 합성을 통해 분자 크기가 증가함을 확인할 수 있다. 또한, GPC 픽 넓이를 계산하여 접합율을 계산하였을 때, 시간에 따라 접합율이 증가함을 확인할 수 있으며, 과량의 히알루론산-글루타알데하이드 유도체를 첨가하였을 경우 생접합율이 증가하고 반응시간이 단축됨을 확인할 수 있다(도 9d, GPC 분석 결과를 바탕으로 계산된 시간에 따른 인성장호르몬 생접합율을 나타냄).
따라서, 하기의 실험예에서는 5 몰 배의 히알루론산-글루타알데하이드 유도체를 사용하여 합성된 히알루론산-글루타알데하이드 접합체로 실험을 수행하였다.
실험예 6. 히알루론산-인성장호르몬 접합체의 NMR 분석
(1) 방법
히알루론산-인성장호르몬 접합체를 동결건조하고, 이를 산화중수소(deuterium oxide)에 용해하여 수소 NMR 분석을 수행하였다(분석장비: Bruker Avance III 400).
(2) 결과
NMR 분석 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 2.0 ppm 부근에서 히알루론산의 아세트아마이도 작용기의 특성픽이 관찰되었으며, 0-1.2 ppm 부근에서 인성장호르몬 특성픽이 관찰된 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 히알루론산 말단에 인성장호르몬이 접합된 것을 확인할 수 있다.
실험예 7. 히알루론산-인성장호르몬 접합체의 ELISA 분석
(1) 방법
인성장호르몬 ELISA 키트(제조사: Roche)를 이용하여 히알루론산-인성장호르몬 접합체 합성 전후에 ELISA로 검출되는 인성장호르몬 농도(항체와 반응하는 인성장호르몬만 검출)를 Bradford assay(제조사: Thermo Fisher)를 이용하여 분석하였다.
(2) 결과
ELISA 분석 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 분석기로 검출되는 단백질 농도(전체 단백질 농도 검출)에 대하여 표준화하였을 때, 약 100%로 계산된 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, 접합체 합성 과정에서 인성장호르몬 변성을 최소화하여 접합체 합성 후에도 인성장호르몬이 합성 전 또는 기존의 히알루론산-인성장호르몬 접합체와 동일하게 항체와 결합할 수 있음을 확인할 수 있다.
실험예 8. 히알루론산-인성장호르몬 접합체의 생물학적 활성 분석
(1) 방법
인성장호르몬 농도에 따른 NB-2-11 세포의 증식 비율은 인성장호르몬의 체외 활성을 측정하는 농도로 사용되어 왔다. 따라서, 96웰 플레이트에 1.5×104/ml의 세포 부유액을 각 웰당 100 μl씩 배양하고, 10-4-103 ng/ml의 인성장호르몬 및 인성장호르몬 접합체를 처리하여 3일 후에 WST assay로 세포 수를 분석하였다.
(2) 결과
생물학적 활성 분석 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 인성장호르몬은 접합체 합성 후에도 NB2-11 세포 증식 활성을 가지는 것을 확인할 수 있다. 상기 도에서 EC50 값은 각각 인성장호르몬, 비교예 1의 접합체, 히알루론산-인성장호르몬 접합체에 대해 0.632 ng/ml, 1.125 ng/ml, 1.850 ng/ml로 측정되었다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 히알루론산-알데하이드(HA-aldehyde) 유도체를 약물과 반응시키는 단계를 포함하며,
    상기 약물은 구조 중에 아민기를 포함하는 것인 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법:

    [화학식 1]
    Figure 112021039884694-pat00010


    상기 화학식 1에서 n은 25 내지 10,000의 정수이고,
    A는
    Figure 112021039884694-pat00031
    이며,
    상기 o 및 p는 각각 1 내지 10의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    히알루론산은 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 히알루론산의 염이며,
    상기 히알루론산의 분자량은 10,000내지 3,000,000 달톤(Da)인 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산을 다이아민과 반응시켜 상기 히알루론산의 말단에 아민기가 형성된 히알루론산-다이아민 유도체를 제조한 후,
    상기 히알루론산-다이아민 유도체를 다이알데하이드와 반응시켜 제조하는 것인 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체와 약물의 반응은 환원제의 존재하에서 수행되며,
    상기 환원제는 소듐시아노보로하이드라이드(NaBH3CN), 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride) 또는 피콜린 보레인(picoline borane)인 것인 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    약물은 화학약물, 면역증강제, 백신, 단백질 약물, 펩타이드 약물, 유전자 치료용 핵산 분자, 화장품용 효능물질 또는 의료용 항체인 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    단백질 약물은 인성장호르몬, 인터페론알파, 에리스로포에틴(erythropoietin), 트레일(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), 오발부민 또는 인슐린인 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서,
    히알루론산-약물 접합체 한 분자에 하나의 약물이 결합된 것인 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 히알루론산-약물 접합체:

    [화학식 2]
    Figure 112021039884694-pat00014


    상기 화학식 2에서 n은 25 내지 10,000의 정수이고,
    D는
    Figure 112021039884694-pat00016
    이며, drug는 약물이고, 상기 o 및 p는 각각 1 내지 10의 정수이다.

  11. 삭제
  12. 삭제
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