KR101306765B1

KR101306765B1 - 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드공중합으로 이루어지는 블록공중합체 및 이를 이용한 치료용 약물을 담지한 고분자 담지체

Info

Publication number: KR101306765B1
Application number: KR1020110018036A
Authority: KR
Inventors: 강대환; 정영일; 정정욱; 김도형
Original assignee: 부산대학교병원; 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2013-09-10
Also published as: KR20120098227A

Abstract

본 발명은 종양조직 또는 암세포의 표적에 보다 선택적으로 작용하여 약물방출 조절이 이루어져 부작용이 적고 약물방출조절 능력이 보다 향상된 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드공중합체로 이루어지는 블록공중합체 및 치료용 약물을 담지한 고분자 담지체에 관한 것으로, 상기 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블락공중합체(HAbLG)의 내부 핵을 이루는 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 부위에는 치료용 약물인 독소루비신이 담지되어 고분자담지체를 이루도록 하고, 100 내지 500nm 의 크기를 가지는 나노입자로 이루어지도록 한다.
본 발명에 있어서는 친수성이 부가된 변형된 PHO는 인체내에서 생체적합성을 가지고 생분해되므로 약물담지체 고분자로 사용가능하며, 치료용 약물이 담지되어 나노입자형태로 제작되므로 이를 필름형태로 제작하여 스텐트에 코팅하거나 또는 나노섬유로 방사하여 약물방출형 치료용 스텐트 사용가능한 효과가 있다.

Description

히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드공중합으로 이루어지는 블록공중합체 및 이를 이용한 치료용 약물을 담지한 고분자 담지체{drug-incorporated nanoparticles of block copolymer composed of hyaluronic acid and poly(DL-lactide-co-glycolide)}

본 발명은 항암 치료 등을 위한 약물 담지가 가능한 생분해성 고분자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종양조직 또는 암세포의 표적에 보다 선택적으로 작용하여 약물방출 조절이 이루어져 부작용이 적고 약물방출조절 능력이 보다 향상된 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드공중합체로 이루어지는 블록공중합체 및 이를 이용한 치료용 약물을 담지한 고분자 담지체에 관한 것이다.

생명 연장에 대한 욕구, 환경에 대한 관심 증가, 합성 플라스틱의 공해문제, 인공장기 및 의용재료의 수요 증가로 인해 생분해성 고분자에 관한 관심이 날로 증가하고 있다. 이에 생체적합하고 생분해성이 가능한 고분자에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 이런 생분해성 고분자는 천연고분자와 합성고분자로 나누어진다. 생분해성 천연고분자는 키토산, 히아루론산, 플루란, 덱스트란 등이 있으며, 천연고분자이므로 인체 내부에서 부작용이 적고 각각 나름의 장점은 있으나, 이들의 물성이 매우 약하다는 것과 단독으로 치료용 약물을 담지하여 원하는 소정의 목적을 달성하기 어려운 단점이 있다.

이에 반해 생분해성을 지닌 대표적인 합성고분자는 미국 FDA의 승인을 받은 poly(lactide) (PLA), poly(glycolide) (PGA)와 이들의 공중합체인 poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)등이 있다. 천연고분자에 비해 합성고분자는 개선된 물성을 지니고 있고, 치료용 약물을 담지하기에는 용이하나 표적세포 또는 조직에 선택적으로 작용을 일으키는 능력이 부족하여 정상세포 또는 정상조직에도 영향을 미치는 문제점이 있다.

따라서 이러한 부작용이 없고 인체조직내에서 목표로 하는 특정세포 또는 조직에서만 치료용 약물의 전달 및 방출이 이루어지도록 다양한 형태의 고분자합성 및 변형이 시도되고 있다.

따라서 본 발명은 상기 요구에 부응하기 위하여 고안된 것으로서, 항암제 전달시 표적으로 하는 암세포 또는 종양조직으로 표적분자 역할을 수행하는 히아루론산과 치료용 약물을 충분히 담지하고 생분해성 있는 합성고분자를 블록공중합 시켜 인체 조직내에서 보다 적합한 치료용 약물을 담지할 수 있는 고분자 블락공중합체를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 블락공중합체에 독소루비신과 같은 항암제를 담지하고 나노입자 형태로 만들어 약물방출 조절이 이루어지는 고분자 담지체로 이용하고자 하는 다른 목적도 있다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태에 따르면, 히아루론산의 말단을 아민기로 변형하여 형성되는 히아루론산-아민(HA-NH₂)과, 말단기가 하이드록실숙시미드(NHS)로 활성화된 폴리락타이드글리코라이드-하이드록실숙시미드(PLGA-NHS)를 공유결합시켜 형성되는 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드공중합으로 이루어지는 블록공중합체(HAbLG)를 제공하는데 그 기술적 특징이 있다.

그리고 바람직 하기로는, 상기 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블락공중합체(HAbLG)의 내부 핵을 이루는 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 부위에는 치료용 약물이 담지되어 고분자담지체를 이루도록 한다. 상기 치료용 약물은 독소루비신이도록 하고, 상기 고분자담지체는 100 내지 500nm 의 크기를 가지는 나노입자로 이루어지도록 한다.

또한, 상기 고분자담지체는, 필름형상으로 이루어지도록 하거나, 방사용액으로 제조하여 방사노즐을 통해 방사시켜 제조되는 나노섬유로 이루어지도록 한다.

본 발명에 있어서는 친수성이 부가된 변형된 PHO는 인체내에서 생체적합성을 가지고 생분해되므로 약물담지체 고분자로 사용가능한 효과가 있다.

또한, 치료용 약물이 담지되어 나노입자형태로 제작되므로 이를 필름형태로 제작하여 스텐트에 코팅하거나 또는 나노섬유로 방사하여 약물방출형 치료용 스텐트 사용가능한 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 의한 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA)의 블락공중합체 합성과정을 나타낸 도.
도 2는 본 발명에 의한 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 블락공중합체의 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도.
도 3은 본 발명에 의한 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 블락공중합체를 이용하여 제조된 나노입자의 투과전자 현미경 사진을 보인 도.
도 4는 본 발명에 의한 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 블락공중합체의 다양한 농도에서 파이렌 형광 여기 스펙트럼을 보인 도.
도 5는 본 발명에 의한 독소루비신이 담지된 고분자담지체 나노입자의 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도.
도 6은 본 발명에 의한 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 블락공중합체 나노입자에 의한 in vitro에서 약물의 방출 경향을 보인 도.
도 7은 본 발명에 의한 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 블락공중합체 나노입자의 담도암세포인 HCT116세포에 대한 세포독성 효과를 나타낸 도.
도 8은 CD44 수용체를 차단 혹은 차단하지 않은 담도암세포인 HCT116세포를 본 발명에 의한 독소루비신이 담지된 고분자담지체 나노입자를 처리하여 CLSM으로 관찰한 결과를 나타낸 도.
도 9는 도8의 결과를 flow cytomwter로 양적으로 분석한 결과를 나타낸 도.

기본적으로 본 발명은 특정 암세포의 표적분자로 작용하는 물질을 이용하여 치료용 약물을 담지할 수 있는 고분자물질을 합성하여 상승의 작용을 일으키도록 하는데 그 주안점이 있다. 따라서 암세포의 표적분자로 이용할 수 있는 고분자의 선택과 이를 이용한 적합한 구조를 가지는 고분자물질의 합성 그리고 합성된 이러한 물질의 실 효용가치를 알아보아야 한다. 이하 자세히 설명하기로 한다.

1. 암세포 표적분자로 이용할 고분자의 선택

선형 다당류인 히아루론산 (Hyaluronic acid, HA)는 독특한 다당류 구성 단위인 D-glucuronic acid 와 N-acetyl-D-glucosamine 단위체가 반복되는 구조이며, 세포 외 기질(extracellular matrix)의 글리코tm아미노글리칸 (glycosaminoglycan) 구성요소 중 하나이다. HA는 세포부착, 성장, 이동에서 핵심적인 역할을 담당하기 때문에 세포운동성, 염증 반응, 상처치유 그리고 암세포의 침투와 전이의 신호 분자로 알려져 있다. 장간막에 발생한 암세포에서 히아루론산이 과발현되기 때문에, HA는 암세포의 확산, 이동, 침투, 전이에 대한 matrix역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 암세포의 히아루론산 수용체인 CD44와 RHAMM의 발현은 세포 이동과 침투에 밀접하게 연관되어있다. 즉, 악성의 암세포는 HA가 많은 환경으로 침투한다. 이런 관점에서, 많은 연구자들이 히아루론산을 항암제의 전달 시 암세포 표적 분자로 사용하였다. 침투적이고 전이적인 암세포에서 CD44가 과발현되기 때문에 HA와 항암제, 그리고 고분자의 결합체는 수용체 매개를 통해 이러한 암세포의 수용체를 표적으로 할 수 있다. 게다가 히아루론산 의 생체적합성, 생분해성, 면역을 유도하지 않는 성질 때문에 히아루론산은 우수한 생체 삽입 물질로 여겨 진다. 그러므로 히아루론산은 강력한 항암제 전달체 후보 중 하나로 본 발명자들이 선택하였다.

2. 약물담지용 고분자물질

소수성을 지닌 다당류, 블록 공중합체, 그라프트 공중합체와 같은 양친매성 거대분자는 표적 약물 전달 시스템을 위해 광범위하게 연구된다. 이 고분자들은 자가조립의 특징으로 인해 나노 구조 약물에 주로 사용된다. 즉, 고분자의 소수성 도메인은 약물을 포함하는 고체-core 부분을 형성한다. 이는 고분자의 소수성 도메인과 항암제 사이의 소수성 상호작용에 의해 형성되며, 반면 친수성 도메인은 나노입자의 외피 (outershell) 부분을 형성하게 된다. 그 중, 블록 공중합체는 주로 독특한 구조와 친수성 부분과 연관된 표적 도달 능력 때문에 암세포 표적 항암제를 위한 나노 약물 (약제, 의약품)으로 고려된다. Jeong et al. 과 Suo et al.에 의해galactose-tagged poly(ethylene glycol)-based 블록 공중합체 가 간암세포를 표적 인식한다는 것이 보고 된 바 있다. 그러므로 블록 공중합체에 기초를 두고 있는 나노입자는 소수성 약물의 용해성 증가, 능동 또는 수동 표적 메커니즘을 통해 표적 장소에 약물의 전달, 사용되는 약물의 양을 감소 시킬 수 있으며 예기치 않은 부작용을 피할 수 있는 이상적인 약물 전달체로서 고려된다.

이 연구를 위해 우리는 낮은 분자량의 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드 (poly(DL-lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA))를 사용하여 히아루론산 기반의 블록 공중합체(HAbLG로 명명)가 본 발명자들이 원하는 약물 담지용 고분자 물질로 선정하였다. 그리고, 치료용 약물로는 항암제인 독소루비신(doxorubicin)을 사용하고, 이러한 독소루비신이 함유된 core-shell 형태의 나노입자를 만들었다. 이 경우 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 공중합체에서의 히아루론산은 친수성을 갖는 외부막을 형성 하며 이 부분은 암세포 표적을 위한 이상적인 역할을 담당하며 폴리락타이드글리코라이드는 약물을 담지하는 역할을 할 것으로 기대된다. 본 발명자들은 블락공중합체(HAbLG)를 나노입자로 만들어 물리적 특성과 그것의 암세포 표적능력을 in vitro 에서 암세포 CD44가 과발현 되는 인간 대장암세포인 HCT116세포를 사용하여 테스트하였다. 이하 자세히 설명하기로 한다.

실시예

1. 재료

히아루론산 (분자량: 7,460 달톤)은 LIFECORE BIOMEDICAL (Chaska, Minesota, USA)에서 구입하였다. 트리에틸아민(Triethylamine (TEA)), 독소루비신(doxorubicin) HCl, 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 헥사메틸렌 디아민(hexamethylene diamine (HMDA)),와 티아졸 블루 테트라졸리움 브로마이드(thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT))는 Sigma Chem. Co. (St.Louis, USA)에서 구입하였다. 디사이클로헥실 카르보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide (DCC)) 와 하이드록시 숙시이미드(N-hydroxysuccimide (NHS))는 Aldrich Chemical Co. USA에서 구입하였다. 투석막은 (MWCO) of 2,000, 8,000, and 12,000 g/mol 은 Spectra/Pro^TM Membranes에서 구입하였다. 디클로로메탄(Dichloromethane (DCM)) 과 디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide (DMSO)) 는 HPLC grade 또는 extra-pure grade를 사용하였다. 폴리락타이드글리코라이드(Poly(DL-lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA-5005, M.W. = 5,000 g/mol)) 는 Wako Pure Chemicals Co. (Osaka, Japan)에서 구입하였다. PLGA의 분자량은 이전에 GPC를 사용하여 분석하였다. PLGA의 the weight average M.W., number average M.W., polydispersity of PLGA는 각각 4,920, 4,780, 1.029이다.

2. 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA)를 공유결합시켜 블록 공중합체(HAbLG) 합성

도 1은 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 블록 공중합체 합성과정을 나타낸 도이다. 도시된 바와 같이, 히아루론산의 말단을 아민기로 변형하는 과정 (히아루론산-아민, HA-NH₂)과 PLGA-NHS를 히아루론산-아민에 공유결합시켜 블록 공중합체를 합성하는 과정이 나타나 있다. 통상적으로 다당류들은 한개의 환원말단을 가지고있기 때문에 HA의 환원말단은 sodium cyanoborohydride로 처리하여 알데히드기로 변형한 후, 히아루론산의 말단을 아민기로 만들기위해 과량의 HMDA를 첨가하였다. 그리고 반응물을 증류수에 투석하여 미반응한 HMDA를 제거하고 동결건조하여 히아루론산아민을 얻었다. 히아루론산 아민을 핵자기 공명분광기로 분석한 결과에 따르면, HA특이적 피크는 1.9, 3.0~3.8과 4.2~4.8 ppm에서 관찰되어진다. HMDA의 peaks 는 1.3, 1.6, 2.8~2,9mmp에서 관찰되었다. HMDA의 결합 수율은 91%이상임을 알 수 잇었다. 히아루론산 아민과 폴리락타이드 글리콜라이드의 공유결합을 위해 DCC와 NHS를 PLGA에 처리하여 NHS로 활성화된 PLGA (PLGA-NHS)를 합성하였다. PLGA-NHS와 히아루론산아민을 공유결합시켜 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 공중합체를 합성하였다. 반응이 되지 않은 HA의 제거를 위해 반응물을 투석막(MWCO: 12,000 g/mol)을 사용하여 증류수로 투석하여 정제하였고 반응되지 않은 PLGA를 제거하기 위해 copolymer를 디클로로메탄에 침전시켜 정제하였다. 이러한 과정을 좀 더 상세히 설명하면,

아미노화 된 HA를 Maruyama 등에 의해 보고된 방법을 변형하여 준비했다. HA 400mg을 물과 DMSO가 3:7로 혼합된 용매 10ml에 녹인 뒤 sodium cyanoborohydride를 과량 첨가하였다. 이 혼합물을 24시간 동안 상온에서 혼합한 뒤 10 배의 hexamethylene diamine을 첨가하고 24시간 동안 상온에서 혼합하였다. 그 후, 반응물을 투석막 (MWCO, 2000g/mol)에 넣고 이틀 동안 탈이온수로 투석하였다. 투석된 용액은 3일 동안 동결 건조 한 다음 핵자기 공명 분광장비를 이용하여 아민의 결합 수율을 측정하였다.

N-hydroxysuccimide PLGA (PLGA-NHS)는 아래의 방법으로 준비하였다. 500 mg 의 PLGA를 dichloromethane에 녹인 뒤 1.5 배의 DCC와 NHS를 첨가하였다. 이 용액을 6시간동안 혼합하였고 반응물을 필터하여 부산물을 제거하였다. 사용된 용매는 압력감소아래에서 제거되었고 고체는 메탄올로 3번 세척한 후 하루 동안 진공상태로 건조되었다.

HAbLG copolymer를 합성하는 동안, 아미노화 된 HA 150 mg과 PLGA 100mg을 dry DMSO에 녹였다. 이 용액을 상온의 질소가스가 포함된 대기에서 2일 동안 혼합하였다. 그 후, 반응물을 탈이온화된 물을 이용하여 침전시키고 이 용액은 MWCO가 12000g/mol인 투석막을 이용하여 투석하였다. 반응하지 않은 HA와 유기용매를 제거하기 위해 용액을 2일 동안 탈이온화된 물에 투석한 다음 3일 동안 동결건조한 결과 하얀 고체를 얻었다. 이 산물에 디클로로메탄(dichloromethane)을 첨가하여 반응이 이루어지지 않은 PLGA를 녹여 제거 한 뒤 침전물을 필터로 수집하였다. 이 과정을 3번 반복하였다. 이렇게 얻은 한얀색 고체 결과물을 진공상태에서 3일 동안 건조하였다. 최종생성물의 수율은 78 % (w/w)이며 다음 식으로부터 계산 되었다. 생성물의 수율 (%, w/w) = [(최종산물의 무게)/(아미노화 된 HA + PLGA-NHS의 무게)]×100.

3. 히아루론산(HA)과 폴리락타이드글리코라이드(PLGA)의 공유결합에 의해 합성된 블록 공중합체(HAbLG)의 스펙트럼을 이용한 확인

도 2는 상기합성과정에서 합성된 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체(HAbLG)의 수소 핵자기 공명 스펙트럼이다. 도시된 바와 같이, 1,6번 위치의 폴리락타이드글리코라이드 특성 피크와 2,3,4,5번의 히아루론산의 특성피크가 모두 얻어진 것으로 보아 성공적으로 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체가 합성되었음을 알 수 있었다. 또한 도면에 나타난 바와 같이 1.9ppm에서의 (히아루론산의 2번 위치) 히아루론산의 특성피크와 폴리락타이드글리코라이드 의 특성 피크인 (폴리락타이드글리코라이드의 1번 위치의 메틸렌) 1.18 ppm에서의 피크비를 이용하여 상대적인 분바량을 구했으며 블록공중합체에서 히아루론산의 분자량은 폴리락타이드글리코라이드의 분자량(weight average M.W. 4,920 g/mol)을 기초로 계산한 결과 약 6,800 g/mol로 나왔으며 이는 제조업체의 결과와 거의 대동소이함을 알 수 있었다. 결국 이결과는 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 공중합체가 성공적으로 합성된 것을 확인한 것이다.

4.히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체(HAbLG)를 이용한 나노입자의 제조 및 분석

히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체를 이용하여 상기의 디메칠술폭사이드(DMSO)에 녹이고 입자 크기(concentration: 1 mg/ml)를 결정하기 위해서 샘플용액은 투석방법을 통해 준비하였다. 나노입자 용매 한 방울을 copper grid위가 코팅된 탄소 필름에 올려놓는다. Phosphotungstic acid (0.05 % (w/w))를 음성 염색에 사용하였다. 나노입자의 관찰은 80 kV에서 측정하였다. 나노입자의 모양 (형태)은 주사 전자 현미경을 사용하여 분석하였고(TEM, JEOL JEM-2000 FX Ⅱ, Japan). 나노입자의 크기는dynamic laser scattering (DLS-7000, Otsuka Electonics Co. Japan)로 측정되었다. 도 3에서 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체를 이용하여 나노입자를 제조하여 투과전자현미경으로 측정한 결과를 나타낸 도를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 둥근 구형의 형태를 가지고 200nm이하의 크기를 가진 나노입자가 관찰되었으며, 투과전자현미경으로 관찰된 나노입자의 크기는 아래 표1에서 보여준 입자크기 수치와 대동소이하였다.

표 1. Characterization of DOX-incorporated self-assembled nanoparticles of HA-b-PLGA

이러한 결과는 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체가 수용액환경에서 나노입자를 형성할 수 있음을 보여 보여주며, 이는 본 발명자들이 원하는 크기 모양을 충족하였다.

한편, 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체(HAbLG)는 양친매성 속성을 가지고 있기 때문에 수용액 환경에서 자가 조립에 의해 나노입자가 형성될 수 있다. 수용액에서 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체의 명확한 자가 조립을 하는것인지 확인하기 위하여 소수성 형광표지로 사용되는 파이렌 (pyrene)을 사용하여 임계자가조립 농도 (critical association concentration, CAC)를 구하였다. 도 4는 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체의 다양한 농도에서 파이렌의 형광 여기 스펙트럼을 도시한 것이다. 도시된 바와 같이, 파이렌의 형광강도는 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체의 농도가 증가됨에 따라 (그림 4(a)) 점차 증가되었고, 이는 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체가 수용액에서 자가 조립에 의해 나노입자를 형성하는 것을 증명하는 것이다. 또한, 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체의 농도 증가함에 따라 여기 스펙트럼의 적색편이 (red shift)가 관찰되었다. 이러한 결과는 파이렌이 나노입자의 소수성 중심부 속으로 녹아들어 가는 것을 증명하며 이 또한 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체가 수용액에서 자가조립방법으로 나노입자를 형성함을 증명한다. 임계자가조립농도 값을 측정하기 위해 I₃₃₆/I₃₃₃ 에서의 파이렌의 여기 스펙트럼에 대한 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체 농도를 log c로 나타낸 값을 그림4(b)의 도시하였다. 교차지역에서의 평면 지역과 sigmoid 변화가 낮은 농도에서의 평면지역과 농도가 높아짐에 따라 강도가 점차 증가하는 영역의 교차점에서 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체 임계자가조립농도 값을 얻을 수 있었으며 약 0.0158g/l로 밝혀졌다. 따라서 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체의 나노입자는 수용액 환경에서 자가조립과정으로 형성되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 제조된 나노파티클의 특징을 살펴보기 위하여 DMSO 또는 D₂O를 사용하여 500 MHz 핵자기공명분광기로 분석하였다. (500 MHz Superconducting FT-NMR Spectrometer, Unity-Inova 500). 분석한 결과에 따르면, HAbLG의 나노입자는 D₂O에서 재구성시켰을 때, 핵자기 공명 분광법에 의해 오직 HA 고유의 peak만 발견되었으며, 반면 DMSO에서 재구성 한 경우 HA와 PLGA의 특정 peak 모두 관찰되었다. 이와 같은 결과는 HAbLG 나노입자(naoparticles)은 친수성인 HA이 바깥껍질에 (outershell)에 존재하며 소수성인 PLGA는 고체로 내부-코어에 존재함을 시사한다. 따라서 본 발명자들이 예측한 대로 외피의 HA는 암세포의 표적분자로서의 역할을 수행하고, 내피의 소수성인 PLGA는 충분한 약물담지체로서의 역할을 수행할 수 있게 된다.

5. 독소루비신(DOX)가 담지된 HAbLG 나노입자의 준비

항암 치료용 약물인 독소루비신(DOX)가 담지된 HAbLG 나노입자를 다음에 따라 준비했다. 40 mg의 HAbLG 블록 공중합체를 4 ml의 H₂O/DMSO (1/3, v/v) 용매에 녹였다. 5 또는 10 mg 의 DOX를 1 ml의 DMSO에 두 배 농도비의 TEA와 각각 녹인 뒤 이 용액들을 HAbLG 용액에 첨가하였다. 이 혼합용액을 1시간 동안 혼합 후 15ml의 탈이온수에 떨어뜨려 나노입자의 형태가 되도록 하였다 (10분간). 사용된 유기 용매는 투석막 (8,000 g/mol)을 사용하여 탈이온수에서 최소 하루 동안 투석하여 제거하였다. 탈이온수는 1-2시간 마다 교환하여 투석을 진행하였다. 그 후 최종용액을 분석 또는 동결건조에 사용하였다.

빈 HAbLG 나노입자는 DOX가 없는 상태에서 같은 방법으로 준비하였다.

약물의 봉입률을 확인하기 위해, 5 mg의 DOX가 담지된 나노입자를 10 ml의 H₂O/DMSO (2/8, v/v) 에 녹인 후 DMSO에 100배 희석하였다. DOX의 농도는UV-spectrophotometer (UV spectrophotometer 1201, Shimadzu Co. Japan) 를 이용하여 479 nm에서 측정하였다.

빈 HAbLG 나노입자가 대조군으로 사용되었다.

약물 함량= [(나노입자내의 약물 무게)/( 나노입자의 무게)]×100

봉입률= [(나노입자 내에 남아 있는 약물의 무게)/(초기 약물의 첨가량)] ×100

상기와 같은 방법으로 실험한 결과에 따르면, 독소루비신 (Doxorubicin, DOX) 항암제는 HAbLG 공중합체로 되어있는 나노입자에 담지 되어있으며 약 67% 이상의 봉입률을 보였다. 표 1은 약물의 함량과 독소루비신이 담지된 나노입자의 크기를 보여준다. 약물의 함량은 약물의 주입량의 증가에 따라 증가하는 반면 담지효율은 약물의 주입량의 증가에 따라 감소하였다. 입자의 크기와 제타전위는 약물의 함량이 증가함에 따라 점차 증가되어 졌다. 즉, DOX를 함유한 나노입자의 크기는 약물의 함유량이 증가할수록 함께 증가하는 경향을 보였으며, 그 크기는 약 400nm 이하의 크기를 가져 나노입자로서의 물성을 충분히 달성할 수 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체의 나노입자는 그 속성으로 인해 내핵-외피 (inner-core-outershell)구조로 이루어졌음을 기확인되었다. 즉 친수성인 히아루론산부분은 나노 입자의 외피부분을 이루고 소수성인 폴리락타이드글리코라이드공중합체는 나노입자의 내부 핵을 구성한다. 또한 소수성 항암제인 독소루비신은 소수성 상호작용으로 인해 나노입자 속에 담지 될 것이라 우리는 예측하였다. 실지 본 발명자들이 원하는대로 독소루비신은 소수성 부분인 내부 핵속에서 PLGA부분과 결합되어 있는지 확인하였다. 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체 나노입자의 내핵외피구조를 증명하기 위해 수소 핵자기공명장치를 사용하였으며, 도 5는 독소루비신이 담지된 나노입자의 핵자기 공명 스펙트럼을 보여준다. 디메칠술폭사이드 용매에 녹였을 때 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드 각각의 특성 피크가 1 ppm으로부터 5 ppm사이에서 관찰되었으며 DOX의 특정한 peak는 7.6 ppm~8.0 ppm에서 관찰되었다. 그러나 나노입자가 수용액 (D₂O) 에 분주되었을 때 폴리락타이드글리코라이드와 독소루비신의 특정 피크가 사라졌으며 히아루론산 피크만 관찰되었다. 이 결과는 히아루론산- 폴리락타이드글리코라이드 나노입자가 히아루론산으로 구성된 친수성 외피와 폴리락타이드글리코라이드로 구성된 소수성 내핵으로 구성되어 있었으며 독소루비신은 나노입자의 내부에 담지되어 있다는 것을 증명한다.

6. in vitro 에서 약물 방출 연구

In vitro에서 HAbLG 나노입자로터 DOX의 방출경향을 측정 하였다. 5mg 의 DOX가 담지된 나노파티클을 5 ml의 phosphate-buffered saline (PBS, 0.1 M, pH 7.4)에서 재구성 되었고, 이 용액은 투석막 (MWCO: 8,000 g/mol)을 사용하여 투석하였다. 이 투석 막은 95ml의 PBS가 담긴 200ml 병에 집어 넣은 뒤, 회전 배양기를 이용하여 37^oC에서 100rpm으로 혼합하였다. 용액 전체를 약물의 농도 측정을 위해 특정 시간 간격으로 수거 하였고 약물의 포화를 막기 위해 신선한 PBS로 교체했다. PBS에서 방출된 DOX의 농도는 UV-spectrophotometer (UV spectrophotometer 1201, Shimadzu Co. Japan) 에서 479 nm로 측정하였다. 도 6은 in vitro에서 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체 나노입자부터 약물의 방출을 도시한 것이다.

도시된 바와 같이, 초기 과다방출이 12시간 까지 관찰되었으며 그 후 4일 동안 일정한 속도로 서서히 방출되었다. 약물의 함량이 더 높을 경우 더 천천히 약물이 방출되었으며 이는 소수성 약물이 더 높은 약물함량에서 일반적으로 나노입자의 내핵에서 결정화 되기 때문에 느려지는 것으로 사료된다. 이러한 결과로부터 본 발명에 의한 독소루비신이 담지된 HAbLG 블락공중합체는 약물방출 조절기능이 충분함을 알 수 있다.

7. in vitro 세포 독성 확인

DOX가 담지된 나노파티클의 항암효과를 평가하기 위해 HCT116 세포 (human colon carcinoma cell line)를 10% fetal bovine serum (5% CO₂ at 37^oC)가 포함된 RPMI-1640에 배지에서 배양하였다. 암세포의 생장 억제는 MTT cell proliferation assay로 측정하였다. HCT116 세포를 1×10⁴ 세포 수로 96-well plates에 심어 CO₂ incubator (5% CO₂ at 37^oC)에서 밤새 배양 하였다. 암세포의 HA receptor (CD44)를 차단하기 위해 나노파티클첨가 1시간 전에 10배 높은 농도의 HA를 배양한 암세포에 처리하였다. 그 후, 약물전달체를 사용하지 않은 자유로운 상태의 DOX, DOX가 담지된 nanoparticle과 약물이 함유되지 않은 빈 나노파티클을 96-well plate에 첨가하였다. 대조군으로는 0.5% v/v DMSO가 사용되었다. 하루 동안 배양한 뒤, 30 ul의 MTT (5 mg/ml) 용액을 96-well plates에 첨가하고 4시간 동안 배양 하였다. 생성된 formazan 결정을 DMSO에 녹인 후 microplate reader (Molecular device Co. U.S.A.)를 사용하여 흡광도 (560 nm-test/630 nm-reference)를 측정하였다. 약물 농도는 8개의 wells 의 평균값으로 얻어졌다. 오직 살아있는 세포만이 MTT를 formazan으로 전환시키기 때문에 formazan의 양은 살아있는 세포의 수와 비례한다. 약물 처리한 세포의 흡광도 결과는 대조군과 비교하여 백분율로 표시하였다.

독소루비신이 담지된 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록 공중합체 나노입자의 항암활성의 관찰을 위해 CD44가 과발현 되는 인간 대장암세포인 HCT-116을 사용하였다. HCT116 세포의 CD44수용체의 차단을 위해서는 10배 양의 히아루론산으로 처리하여 차단하였다. 나노입자가 CD44 수용체를 통하여 암세포 안으로 들어 갈수 있는지 없는 지와 암세포의 생장을 저해하는지를 관찰하였다.

도 7은 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체 나노입자의 HCT116세포에 대한 세포독성 효과를 도시한 것이다. 그림에서 보는 바와 같이 나노입자는 독소루비신 자체와 거의 유사한 세포독성 효과를 보였다. 그러나 암세포의 CD44 수용체를 과량의 히아루론산으로 차단했을 때, 암세포의 생장은 독소루비신 또는 차단하지 않은 나노입자보다 유의하게 높은 세포 생존율을 보였다. 이 결과는 나노입자가 암세포 내로 수용체가 매개된 식세포작용 (receptor-mediated endocytosis)로 들어가는 것을 의미하고 암세포의 생장을 억제하는 것으로 나타내었다.

8. 수용체 매개 내포 작용을 통한 HCT116 cells에서의 나노파티클의 흡수 암세포를 관찰하기 위해, HCT116 세포를 cover-glass에 심고 CO₂ incubator (5% CO₂ at 37^oC)에서 밤새 배양하였다. 나노파티클을 처리하기 한 시간 전에 암세포의 HA 수용체(CD44)를 막기 위해 10배 높은 HA를 처리하였다. 그 후 암세포에 나노파티클을 첨가하고 1시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그런 다음 세포를 PBS (pH 7.4, 0.1 M)로 세척하고 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)를 처리하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고 부동화 용액 (immobilization solution, IMMU-MOUNT, Thermo Electron Corporation, Pittsburgh, PA 15275, USA)으로 고정하였다. 이 세포들은 공초점 레이저 현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM, TCS-SP2; Leica,Wetzlar, Germany)으로 관찰 하였다. 나노파티클의 수용체 매개 내포작용을 통한 흡수를 평가하기 위해 암세포를 6 well plate에 1×10⁶ cells/well 이 되도록 심는다. 나노파티클을 첨가하기 전에 암세포의 HA 수용체 (CD44)를 차단하기 위해 10배 많은 HA를 첨가하였다. 그 후, 나노파티클을 암세포에 첨가하고 1시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 후 세포를 PBS (pH 7.4, 0.1 M)에서 세척한 다음 트립신을 처리하여 세포를 수거한다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척한 다음 흐름 세포 분석기 (flow cytometer analysis, FACScan)로 분석한다. 여기 파장을 488nm로 발광파장을 522nm으로 사용하여 DOX 형광 강도를 측정하였다.

도 8은 CD44 수용체를 차단하거나 혹은 차단하지 않은 HCT116 세포를 독소루비신이 담지된 나노입자로 처리하여 CLSM으로 관찰한 결과이다. 독소루비신이 함유된 나노입자를 암세포에 처리하였을 때 암세포는 강하게 붉은 색을 발현하며 이는 나노입자가 성공적으로 세포내로 들어가는 것을 의미한다. 그러나 암세포의 CD44 수용체를 과량의 히아루론산으로 차단한 했을 때는 매우 약한 붉은 색을 발현했다. 이러한 결과는 독소루비신을 담지한 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드블록 공중합체 나노입자가 CD44수용체를 인지하여 세포내로 들어간 것을 증명되었다.

도 9는 이러한 결과를 flow cytometer로 양적으로 분석한 결과이다. 독소루비신이 담지된 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드블록 공중합체 나노입자를 HCT116세포에 처리하였을 때 암세포의 형광감도가 명확히 증가하는 것을 보여 주었다. 그러나 CD44수용체를 차단한 결과 형광강도가 감소하는 것으로 나타났다 (그림9(b)). 이러한 결과는 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드블록 공중합체 나노입자가 HCT116 세포 내로 CD44수용체를 인지하여 선택적으로 세포 내로 들어간다는 것을 의미하며 이는 곧 독소루비신이 담지된 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체 나노입자가 암세포만을 선택하여 공격할 수 있는 표적성 나노항암제임을 말해준다.

9. 독소루비신이 담지된 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체나노입자의 활용

이상에서 설명한 바와 같이, 독소루비신 약물이 담지된 HAbLS 블락공중합체 나노입자는 500nm 이하의 크기를 가지므로 적은 사이즈를 가지므로 이러한 나노입자 자체를 항암치료제로 사용 가능할 것이다.

또한 이러한 나노입자를 이용하여 약물방출 조절형 치료용 스텐트에 이용할 수도 있을 것이다. 이하에서는 이를 이용한 스텐트 제작과정을 간략히 설명하기로 한다.

먼저, 본 발명에 의래 약물이 담지된 블락공중합체 나노입자를 전기방사가 가능한 농도로 물(H2O), 에탄올, DMAc(dimethyl acetamide), DMF(N,N-dimethylformamide), NMP(N-methyl-2-pyrrolidinone), DMSO(dimethyl sulfoxide) 등과 같은 적당한 용매에 용해하여 방사용액을 제조한다. 이때 방사용액은 이렇게 제조된 방사용액은 나노섬유의 제조시에는 섬유상 구조를 형성하기 위해 방사용액(고분자와 약물이 담지된 혼합용액)의 농도를 3~60중량%로 제조하여 섬유의 모폴러지(morphology)를 제어하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 제조된 방사용액을 이용하여 스텐트상에 직접 방사하여 스텐트의 표면에 나노섬유가 코팅되도록 하는것이 가능할 것이다.

또는, 별도의 집전판을 구비하여 나노섬유 웹(부직포 형태)을 먼저 제조하고, 상기 나노섬유 웹을 금속튜브상 스텐트에 접착시는 공정 예를 들면, 생분해성 글루나 물리적인 방법등을 이용하여 스텐트상에 나노섬유가 부착되도록 하여 제조할 수 있다.

상기와 달리 나노입자를 이용하여 필름형태의 막으로 제조할 수도 있을 것이다. 이러한 필름형태의 막을 제조하여 스텐트의 외면에 접착시킴으로써 약물방출조절형 치료용 스텐트의 제작도 가능할 것이다.

그리고, " 본 연구는 보건복지부 보건의료연구개발사업의 지원에 의하여 이루어진 것임을 밝힙니다. (과제 고유번호 : A091047) "

Claims

히아루론산(hyaluronic acid, HA)과 폴리락타이드글리코라이드(poly(DL-lactide-co-glycolide, PLGA)를 블락공중합시켜 친수성인 히아루론산이 외피를 형성하고 소수성인 폴리락타이드글리코라이드가 내부핵을 이루는 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블락공중합체(HAbLG)를 특징으로 하는 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드공중합으로 이루어지는 블록공중합체.
제 1항에 있어서,
상기 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블락공중합체(HAbLG)는,
히아루론산의 말단을 아민기로 변형하여 형성되는 히아루론산-아민(HA-NH₂)과, 말단기가 하이드록실숙시미드(NHS)로 활성화된 폴리락타이드글리코라이드-하이드록실숙시미드(PLGA-NHS)를 공유결합시켜 형성되는 것을 특징으로 하는 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드공중합으로 이루어지는 블록공중합체.
삭제
히아루론산(hyaluronic acid, HA)과 폴리락타이드글리코라이드(poly(DL-lactide-co-glycolide, PLGA)를 블락공중합시켜 친수성인 히아루론산이 외피를 형성하고 소수성인 폴리락타이드글리코라이드가 내부핵을 이루는 히아루론산-폴리락타이드글리코라이드 블락공중합체(HAbLG)에서 내부 핵을 이루는 폴리락타이드글리코라이드(PLGA) 부위에는 독소루비신이 담지되어 고분자담지체를 이루는 것을 특징으로 하는 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체를 이용한 치료용 약물을 담지한 고분자 담지체.
제 4항에 있어서,
상기 고분자담지체는 100 내지 400nm의 크기를 가지는 나노입자로 이루어짐을 특징으로 하는 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체를 이용한 치료용 약물을 담지한 고분자 담지체.
제 5항에 있어서, 상기 고분자담지체는,
필름형상으로 이루어짐을 특징으로 하는 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체를 이용한 치료용 약물을 담지한 고분자 담지체.
제 5항에 있어서, 상기 고분자담지체는,
방사용액으로 제조하여 방사노즐을 통해 방사시켜 제조되는 나노섬유로 이루어지는 것을 특징으로 하는 히아루론산과 폴리락타이드글리코라이드 블록공중합체를 이용한 치료용 약물을 담지한 고분자 담지체.