KR101467076B1

KR101467076B1 - 히알루론산-메토트렉세이트 접합체를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101467076B1
Application number: KR1020130018322A
Authority: KR
Inventors: 박재형; 신정민; 고혜원; 한화승; 조동규; 김설희; 정봉열; 이종오
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2013-02-20
Publication date: 2014-12-02
Also published as: KR20140104637A

Abstract

본 발명의 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 메토트렉세이트를 4-디메틸아미노피리딘 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 존재 하에 히알루론산과 반응시키는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법 및 하기 화학식 1로 표시되는 히알루론산-메토트렉세이트 접합체에 관한 것이다.
[화학식 1]

본 발명의 HA-MTX 접합체는 산성에서 에스테르 결합이 가수분해되어 MTX를 방출할 수 있으므로, 별도의 효소 등을 요구하지 않고 정맥주사에 의해 전신투여하여도 정상조직보다 낮은 관절염 환부에서 선택적으로 약물을 방출하므로 부작용을 최소화하면서 효과적인 관절염 치료제로 사용될 수 있다.

Description

히알루론산-메토트렉세이트 접합체를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법{A pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis comprising hyaluronic acid-methotrexate conjugate and a method for preparation thereof}

본 발명의 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 메토트렉세이트를 4-디메틸아미노피리딘 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 존재 하에 히알루론산과 반응시키는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법 및 하기 화학식 1로 표시되는 히알루론산-메토트렉세이트 접합체에 관한 것이다.

[화학식 1]

관절염은 인간이 겪는 가장 고통스러운 질환의 하나로서 특히 무릎의 퇴행성 관절염은 통증은 물론 보행에 지장을 초래하여 일상생활에 장애를 준다. 관절염은 관절에 염증이 있는 것을 말하며, 세균에 의한 유균성 관절염과 세균과 무관한 무균성 관절염이 있다. 관절염의 종류는 무려 100여 가지가 넘으며, 이들 중 가장 흔한 것이 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 통풍성 관절염, 루푸스, 통풍 등이다. 우리나라 국민 1천명 중 47명이 관절염을 앓고 있는 것으로 조사되어 전국적으로 총 190만 여명이 관절염으로 고통받는 것으로 나타났다. 장기적인 활동장애를 초래하는 주요 원인 질환으로서 관절염은 미국에서는 65세 이상 노인의 활동장애의 가장 큰 원인으로 지적되고 있다. 우리나라에서도 관절염은 중풍에 이어 장기 활동 장애의 주요 원인 질환으로 나타나고 있는 실정이다. 또한 여성이 남성보다 관절염으로 고통받는 비율이 높은 것으로 알려져 있으며, 퇴행성 관절염은 노화가 주된 원인인 것으로 알려져 있다. 60대와 70대 여성의 경우 관절염을 앓는 사람이 인구 1000명 당 각각 304명 및 344명으로 매우 높은 비율을 나타내고 있다.

이러한 관절염의 치료를 위하여, 류마티스 관절염의 경우 휴식, 유발요인의 제거, 음식 및 영양소의 공급, 부목고정 등의 일반적인 보존요법 외에, 소염진통제, 스테로이드제제, 금(gold)요법, 스테로이드의 국소주입, 면역억제요법 등의 약물요법, 수술요법 및 관절을 너무 무리하게 움직이지 않는 한도 내에서 적절한 물리 운동요법 등을 수행할 수 있다. 한편 퇴행성 관절염의 경우는 적절한 운동 및 재활치료, 소염진통제, 부신피질호르몬제, 연골보호제, 관절내 윤활제 등을 투여하는 약물치료 또는 수술요법을 수행할 수 있다.

상기 관절염의 치료에 사용되는 약물들은 통증과 부종을 감소시키고 질병의 진행을 늦추는 역할을 한다. 그러나 이들 관절염 치료제의 부작용으로는 위장관계 장애가 있는데, 이는 속이 쓰리고 거북하다거나 설사를 하거나 변비가 생기는 형태로 나타나며 장기복용시 위궤양 및 출혈이 생길 수 있다. 위장관 부작용 발생률을 높이는 원인으로는 65세 이상의 고령, 궤양, 출혈의 기왕력, 스테로이드나 항응고제의 병용, 흡연이나 음주 등이 있다. 이러한 부작용을 줄이기 위해서는 약 복용 후 몸의 상태를 관찰하고, 위장관계 부작용이 발생했을 경우에는 즉시 복용을 중단하고 담당의사와 상의해야 하며, 위장관계 부작용이 적은 약(선택적 소염제, COX-2 저해제)으로 변경해야 한다. 상기 열거한 고위험군 환자의 경우 약물 선택에 특히 신중을 기해야 하며, 일반의약품 진통제를 함부로 복용하지 말아야 한다.

현재 임상에 적용하고 있는 관절염 치료제는 비스테로이드성 항염제인 메토트렉세이트(methotrexate; MTX), 히드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 오라노핀(auranofin) 등의 항류마티스제(disease-modifying antirheumatic drug; DMARD)인 저분자 의약품들과 TNF-α 저해제로서 개발된 에타너셉트(Etanercept; 상품명 엔브렐, Enbrel), 인플릭시맙(Infliximab; 상품명 레미케이드, Remicade), 아달리무맙(Adalimumab; 휴미라, Humira) 등의 단백질 의약품이 주를 이루고 있다. 상기 메토트렉세이트는 원래 항암제로 개발된 의약품이나, 현재는 관절염 치료제로도 사용되고 있다. 그러나, 정상세포에 대한 독성으로 인해 장기적으로 사용하면 부작용이 심해 결국 50% 이상의 환자가 치료에 실패한 것으로 보고되고 있다.

따라서, 상기한 바와 같은 정상세포에 대한 부작용은 줄이면서 치료효과는 높이기 위해서는 메토트렉세이트와 같은 약물을 환부에 선택적으로 전달할 수 있는 수단 및 방법에 대한 연구가 필수적이다.

이에 약물의 효과적인 전달을 위해 생분해성이 뛰어난 생체적합성 고분자이면서 CD44 수용체와 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 히알루론산과의 접합체를 제조하고자 하는 노력이 시도되고 있다. 상기 히알루론산은 생체 내에 자연적으로 존재하는 천연 다당류 고분자이므로 생체 독성이 없으며, 이와 특이적으로 결합하는 CD44는 관절염 부위에 과발현하는 것으로 알려져 있어 환부에 선택적으로 약물을 전달하는데 적합한 물질로 여겨진다. 이러한 노력의 일환으로 Claudia Sorbi 등은 히알루론산염의 히드록시기를 염소로 치환하여 반응성을 높인 후 MTX와 반응시키는 2단계의 반응을 통해 히알루론산에 메토트렉세이트가 연결된 접합체를 제조하였다(Carbohydrate Research, 2009, 344: 91-97). 그러나 상기 접합체는 메토트렉세이트 이외에 여전히 반응성이 높은 염소치환기를 10 내지 20% 포함하고 있어 안정성이 떨어질 수 있다. 또한 2단계의 반응을 거치므로 수율이 30% 수준에 밖에 이르지 못한다. 또 다른 노력의 일환으로 Akie Homma 등은 히알루론산에 폴리펩타이드와 링커를 통해 메토트렉세이트를 결합시킨 복합체를 제조하였다(Bioorg. Med. Chem., 2009, 17: 4647-4656; Bioorg. Med. Chem., 2010, 18: 1062-1075). 그러나 상기 복합체의 경우 환부에서 분해되어 약물을 방출하기 위해서는 도입된 폴리펩타이드에 특이적으로 작용하는 효소를 필요로 한다. 한편, 제조과정에 있어서도 특정 효소에 의해 특이적으로 인식되어 분해될 수 있는 폴리펩타이드를 제조하기 위해서는 합성하고자 하는 폴리펩타이드 서열에 해당하는 아미노산을 하나씩 차례로 결합시키는 번거로운 과정을 거쳐야 한다. 따라서, 상기 복합체를 제조하기 위해서 적어도 3 내지 4단계의 반응을 거쳐야 하며, 각 단계의 수율은 8 내지 99.8% 수준이므로, 전체 반응을 통한 수율은 20%를 초과하기 어렵다.

이에 본 발명자들은 관절염 환부에 메토트렉세이트를 선택적으로 전달하고 방출하여 전신투여하여도 타 장기에 대한 부작용이 발생할 확률은 낮추면서도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있는 약물 접합체를 제조하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; DMAP)와 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCC)를 이용한 에스테르화 반응에 의해 원스텝으로 직접 메토트렉세이트가 히알루론산에 결합된 약물 접합체를 높은 수율로 제조할 수 있으며, 상기 제조된 히알루론산-메토트렉세이트 접합체는 pH-민감성을 나타내어 정상조직보다 pH가 낮은 관절염 환부에서 가수분해에 의해 선택적으로 약물을 방출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 하나의 목적은 메토트렉세이트를 4-디메틸아미노피리딘 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 존재 하에 히알루론산과 반응시키는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 히알루론산-메토트렉세이트 접합체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 p 및 q는 각 반복단위의 몰분율을 의미하며,

p/(p+q)는 0.02 내지 0.10의 범위에 있는, 각각 독립적으로 1 이상의 정수이다.

본 발명의 용어 "관절염"은 하나 또는 그 이상의 관절에서의 염증과 관련된 관절장애의 하나의 형태로서, 100종이 넘는 다른 형태로 존재한다. 가장 일반적인 형태는 퇴행성 관절질환인 골관절염(osteoarthritis)으로 관절에서의 외상, 관절의 감염 또는 노화의 결과로 발병한다. 다른 형태의 관절염으로는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선 관절염(psoriatic arthritis) 및 루푸스(lupus) 등의 관련 자가면역질환이 있다. 화농성 관절염(septic arthritis)은 관절감염에 의해 유발된다. 관절염 환자의 주된 증상은 관절통증이다. 통증은 지속적이며 영향을 받는 관절에 국소화되어 있을 수 있다. 관절염으로부터의 통증은 관절주위에 발생하는 염증, 질환으로부터 관절에 미치는 손상, 일상적인 관절의 마모, 뻣뻣하고 고통스러운 관절에 대한 강제적인 움직임에 의해 야기되는 근육 긴장 및 피로에 의해 야기된다.

상기 관절염은 골관절염, 류마티스 관절염, 통풍(gout), 루푸스, 가성통풍(pseudo-gout), 화농성 관절염, 강직척추염(ankylosing spondylitis), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis) 또는 스틸병(Still's disease)일 수 있다.

바람직하게 상기 화합물은 pH 6.8에서 가수분해에 의해 60% 이상의 메토트렉세이트(methotrexate; MTX)를 방출할 수 있다(도 1). 관절염 부위는 정상적인 조직보다 낮은 pH의 환경을 제공하는 것으로 알려져 있다. 특히 일반적으로 관절염 부위의 pH는 6.8 정도인 것으로 알려져 있다. 따라서 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 화합물은 주로 선택적으로 pH 6.8 정도의 관절염 환부에서 60%의 이상의 메토트렉세이트를 방출할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 관절염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 관절염의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 희렴 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 정상 조직에서 보다 pH가 낮은 관절염 부위에서 선택적으로 가수분해되어 약물을 방출할 수 있으므로, 바람직하게 본 발명의 화합물은 주사제로 제제화하여 전신투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 용어 "개체"란 관절염이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직하게 본 발명의 조성물은 고형분을 기준으로 1일 0.0001 내지 100 mg/체중 kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/체중 kg으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

따라서, 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 치료방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "개체"란 상기한 바와 같이 관절염이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 관절염 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 2의 메토트렉세이트를 4-디메틸아미노피리딘 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 존재 하에 하기 화학식 3의 히알루론산과 반응시키는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 m, p 및 q는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이다.

본 발명에 사용된 화합물 "4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; DMAP)"은 (CH₃)₂NC₅H₄N의 화학식을 갖는 피리딘 유도체로 무색의 고체이며 무수물(anhydrides)과의 에스테르화(esterification) 반응, 베이리스-힐만 반응(Baylis-Hillman reaction), 수소규소화 반응(hydrosilylations), 트리틸화 반응(tritylation), 슈테글리히 재배열(Steglich rearrangement), β-락탐의 스타우딩거 합성(Staudinger synthesis of β-lactams) 등의 다양한 반응에 친핵성 촉매로 유용하게 사용된다. 또한 슈테글리히 에스테르화(Steglich esterification) 반응에 촉매로 사용된다.

본 발명에 사용된 화합물 "N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCC)"는 C₁₃H₂₂N₂의 화학식을 갖는 유기화합물로 인공펩티드합성에서 아미노산 커플링에 주로 사용된다. 표준조건 하에서 짙은 단내를 갖는 흰색 결정형으로 존재한다. 녹는 점이 낮아 액체로 존재하므로 취급이 용이하다. 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란, 아세토니트릴 및 디메틸포름아미드와 같은 용매에 매우 잘 녹지만, 물에는 녹지 않는다. 슈테글리히 에스테르화 반응에 커플링제(coupling aggent)로 사용된다.

상기한 바와 같이 DMAP와 DCC는 함께 슈테글리히 에스테르화 반응에 사용될 수 있다. 상기 슈테글리히 에스테르화 반응은 커플링제로서 DMAP, 촉매로서 DCC를 사용하는 일종의 에스테르화 반응이다. 상기 반응은 일반적으로 실온에서 수행될 수 있다. 또한 유기용매 상에서 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 유기용매의 비제한적인 예는 포름아미드, 디메틸술폭사이드 및 디클로로메탄 등이 있으며, 이들을 혼합하여 사용할 수도 있다. 반응 조건이 마일드하여 예컨대, 민감한 1,4-디히드록시벤조산의 에스테르와 같이 다른 방법을 통해 제조할 수 없는 에스테르를 획득할 수 있다.

상기 반응에 사용하는 MTX에 대한 DCC 및 DMAP의 몰비율은 1: 3 내지 5 : 3 내지 5인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 본 발명에 따른 접합체의 제조방법은 슈테글리히 에스테르화 반응을 이용하여 원스텝으로 히알루론산에 메토트렉세이트를 결합시키는 방법이므로, 반응수율이 높아 70%를 초과한다. 반면, Claudia Sorbi 등에 의해 제시된 히알루론산염의 히드록시기를 염소로 치환하여 반응성을 높인 후 MTX와 반응시키는 히알루론산-메토트렉세이트 접합체의 제조방법(Carbohydrate Research, 2009, 344: 91-97)이나, Akie Homma 등에 의해 제시된 특정 효소에 의해 분해 가능한 폴리펩타이드를 합성한 후 링커를 결합시키고 양말단에 각각 히알루론산과 메토트렉세이트를 결합시키는 복합체의 제조방법(Bioorg. Med. Chem., 2009, 17: 4647-4656; Bioorg. Med. Chem., 2010, 18: 1062-1075)은 각각 2단계 및 최소 3 내지 4단계의 반응을 거치므로 수율이 30% 내외이거나 20%를 넘기 어렵다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 히알루론산-메토트렉세이트 고분자 접합체를 제공한다.

[화학식 1]

상기 p 및 q는 각 반복단위의 몰분율을 의미하며,

본 발명의 용어 "접합체(conjugate)"는 두 가지 이상의 화합물이 서로 연결된 화합물을 의미한다. 상기 연결은 비공유결합 또는 공유결합에 의해 달성될 수 있으나, 바람직하게 본 발명의 접합체는 히알루론산의 히드록시기에 메토트렉세이트가 카르복시산을 통해 에스테르화 결합을 형성함으로써 견고하게 공유결합으로 연결된 것일 수 있다. 이때, HA 단량체에 대한 MTX의 비율은 바람직하게 2 내지 10 몰%일 수 있다. 이는 상기 p 및 q의 정의에 반영되어 있다. 상기 HA에 대한 MTX의 비율은 에스테르화 반응에 사용하는 HA와 MTX의 비율을 달리함으로써 조절할 수 있다. 예컨대, 접합체에 결합된 MTX의 양을 2배로 증가시키고자 하는 경우, 동일한 양의 HA와 반응시키는 MTX의 양을 2배로 증가시킴으로써 달성할 수 있다.

바람직하게 본 발명에 따른 고분자 접합체는 10,000 내지 1,000,000의 중량평균 분자량(Mw)을 가질 수 있다. 보다 바람직하게 100,000 내지 500,000의 중량평균 분자량(Mw)을 가질 수 있다.

바람직하게 본 발명에 따른 접합체는 pH-민감성 접합체로, 산성용액에서 가수분해에 의해 에스테르 결합이 분해되면서 약물인 MTX를 방출할 수 있다. 상기 약물의 방출속도 및 누적방출량은 pH가 감소할수록 증가한다. 바람직하게 본 발명의 접합체는 pH 6.8에서 60% 이상 가수분해되어 약물을 방출할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 HA-MTX 접합체는 공유결합에 의해 약물이 연결되어 있고 pH에 따라 생리적 pH인 7.4 보다 낮은 관절염 환부의 일반적인 pH인 6.8에서 선택적으로 약물을 다량 방출할 수 있으므로, 정맥주사를 통해 전신투여를 하더라도 다른 장기에 축적되는 부작용은 최소화하면서 효과적으로 관절염을 치료할 수 있다. 반면, 전술한 Claudia Sorbi 등의 방법으로 제조한 접합체는 여전히 10 내지 20%의 반응성이 높은 염소치환기를 포함하고 불안정하며, Akie Homma 등의 방법으로 제조한 폴리펩티드와 링커를 통해 연결된 히알루론산-메토트렉세이트 복합체는 분해되어 약물을 방출하기 위해서 효소작용을 필요로 한다는 단점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 히알루론산-메토트렉세이트 접합체의 pH에 따른 약물방출기전을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 히알루론산, 메토트렉세이트 및 히알루론산, 메토트렉세이트 및 히알루론산-메토트렉세이트의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 히알루론산, 메토트렉세이트 및 히알루론산-메토트렉세이트의 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 히알루론산-메토트렉세이트의 pH에 따른 누적 약물 방출량의 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 히알루론산-메토트렉세이트의 대식세포 표적화를 나타낸 광학 및 형광현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 관절염 동물모델의 제조 및 이를 이용한 동물실험 스케줄을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 7은 체외 형광측정을 통한 약물의 체내 축적위치를 나타낸 것이다.
도 8은 형광측정을 통한 전신투여시 각 조직에 대한 약물축적정도를 나타낸 것이다.
도 9는 관절염 동물모델에서 비히클(식염수), MTX 또는 HA-MTX 투여군의 시간에 따른 평균 임상점수를 나타낸 것이다.
도 10은 대조군(정상 마우스) 및 비히클, MTX 또는 HA-MTX 투여군의 족부종 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 대조군 및 비히클, MTX 또는 HA-MTX 투여군의 무릎관절의 염증정도를 확인하기 위한 조직학적 분석결과를 나타낸 것이다.
도 12는 대조군 및 관절염 동물모델의 무릎관절에서 히알루론산-메토트렉세이트 접합체의 축적 정도와 위치, 및 CD44의 발현 위치와 정도를 나타낸 것이다.
도 13은 대조군 및 비히클, MTX 또는 HA-MTX 투여군의 혈청 내 염증유발 사이토카인의 발현정도를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 히알루론산- 메토트렉세이트 접합체의 제조

히알루론산(hyaluronic acid; HA) 100 mg(0.264 mmol)을 포름아미드(formamide)에 용해시키고, 메토트렉세이트(methotrexate; MTX) 84 mg(0.184 mmol)는 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide)에 용해시켰다. 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; DMAP)과 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCC)를 상기 메토트렉세이트 용액에 첨가하고 30분 동안 교반하여 혼합하였다. 상기 혼합용액에 히알루론산 용액을 적가한 후 빛을 차단하고 상온에서 24시간 동안 교반하였다. MTX, DCC 및 DMAP의 양을 달리하여 두 가지 조건으로 실험하였으며, 각각의 실험조건은 하기 표 1에 나타내었다.

시료	MTX	DCC	DMAP
HA-MTX2	28 mg(0.061 mmol)	51 mg(0.246 mmol)	30 mg(0.246 mmol)
HA-MTX6	84 mg(0.184 mmol)	152 mg(0.737 mmol)	90 mg(0.737 mmol)

반응용액을 2일 동안 과량의 증류수로 투석하고 약 10분간 3000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 분리하여 0.8 마이크로 필터로 여과한 후 여과된 용액을 동결건조하였다. UV/Vis 분광광도계(Optizen 3220UV, Mecasys Co., Ltd., Daejeon, Korea)를 이용하여 303 nm에서 관찰되는 MTX의 특징적인 피크를 이용하여 HA에 결합된 MTX의 양을 결정하였다. 그 결과, HA-MTX2는 MTX가 2 몰% 결합된 것을, HA-MTX6은 6 몰% 결합된 것을 확인하였다.

상기 제조된 시료 중 HA-MTX6을 D₂O와 DMSOd₆ 혼합용액(1:1 부피비)에 녹이고, 500 MHz ¹H NMR(unity inova 500 MHz, VARIAN, USA)을 이용하여 상기 접합체의 화학구조를 동정하였다.

비교를 위하여 히알루론산과 메토트렉세이트도 상기 혼합용매에 녹여 ¹H NMR을 측정하고, 도 2에 나타내었다. 그 결과 메토트렉세이트에서만 관찰되는 방향족 양성자(6.8 ppm ~ 8 ppm) 및 히알루론산에서 관찰되는 양성자(3 ~ 4 ppm) 피크가 HA-MTX 접합체에 대한 스펙트럼에서 관찰되었다. 이로부터 히알루론산과 메토트렉세이트가 결합된 접합체가 형성되었음을 확인하였다.

실험예 1: HA - MTX 접합체의 분광학적 특성분석

상기 실시예 1에서 제조한 HA-MTX 접합체의 분광학적 특성을 분석하기 위하여 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 다양한 파장대에서 히알루론산, 메토트렉세이트 및 HA-MTX 접합체의 흡광도를 측정하여, 도 3에 나타내었다. 그 결과, 히알루론산에 대한 스펙트럼에서는 나타나지 않았던 303 nm 부근의 메토트렉세이트의 특성 흡수피크가 HA-MTX 접합체에서도 관찰되는 것을 확인하였다. 따라서, 메토트렉세이트가 히알루론산에 성공적으로 결합하였음을 확인하였다.

실험예 2: HA - MTX 접합체로부터 MTX 의 방출 거동 실험

pH의 변화가 약물 방출 거동에 미치는 영향을 분석하기 위하여, in vitro 약물 방출 거동 실험을 수행하였다. 실시예 1에서 제조한 HA-MTX6을 인산완충용액(pH 7.4)에 분산시켰다. 상기 용액을 셀룰로오스 멤브레인 튜브(MWCO=3500 Da)에 옮겼다. 이후, 3가지 각기 다른 pH의 완충용액(pH 7.4 인산완충용액, pH 6.8 인산완충용액 및 pH 5.0 아세트산완충용액)에 상기 멤브레인 튜브를 넣고 각각을 37℃에서 100 rpm으로 교반하였다. 완충용액을 일정한 시간 간격으로 교체해 주고, 303 nm에서 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 자유 메토트렉세이트의 농도를 측정하였다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다. 정상적인 조직과 유사한 pH 7.4에서 보다 낮은 pH 6.8 및 5.0에서 현저히 많은 양의 MTX를 방출하는 것을 확인하였다. 예컨대, 일반적인 관절염 부위의 pH인 6.8에서 HA-MTX는 6시간 이내에 총 50% 이상의 MTX를 방출하는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 HA-MTX 접합체는 약산성의 관절염 환부에서 선택적으로 MTX를 방출할 수 있음을 시사한다.

실험예 3: HA - MTX 접합체의 대식세포 특이적 표적화

본 발명에 따른 HA-MTX 접합체가 관절부위에서 염증반응을 매개하는 주된 면역세포인 대식세포에 특이적으로 섭취되는지 확인하였다.

대식세포주인 RAW264.7 세포에 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS) 100 ng/ml을 48시간 동안 처리하여(도면 상에 처리군을 (+)로, 비처리군을 (-)로 표기) 대식세포의 활성을 유도하였다. 상기 세포에 Cy5.5로 표지한 HA-MTX 접합체(30 μg/ml)를 3시간 동안 처리하여 세포 내 형광량을 공초점 현미경으로 관찰하였다. 비교군으로 과량의 HA(5 mg/ml)를 1시간 전처리한 후 상기한 바와 같이 HA-MTX를 처리하여 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 세포에 비해 LPS를 처리한 세포에 상당량의 HA-MTX가 관찰되었다. 한편 형광표지하지 않은 HA로 전처리하여 HA 수용체를 포화시킨 경우 세포의 HA-MTX 접합체 섭취가 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 HA-MTX 접합체가 활성화된 대식세포에서 발현이 증가된 HA 수용체를 통해 염증반응을 매개하는 대식세포를 표적화할 수 있음을 시사한다.

실험예 4: 질병 동물모델을 이용한 HA - MTX 로부터 방출된 MTX 의 생체 내 거동 분포 실험

본 발명에 따른 HA-MTX 접합체의 생체 내 분포 거동을 확인하기 위하여 질병을 유발한 동물모델을 이용하였다. 관절염 동물모델을 제조하기 위하여 마우스에 콜라겐으로 관절염을 유도한 후, 정상 마우스(WT)와 상기 관절염 마우스 모델(CIA)에 조영제를 표지한 HA-MTX 접합체를 동시에 정맥투여하고, 일정 시간 간격으로 생체 내 영상화 시스템(in vivo imaging system; ART Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada)을 이용하여 생체 내 조영제의 분포를 확인하였다. 구체적으로 0일에 제2형 콜라겐과 CFA(complete Freund's adjuvant)으로 1차 면역시키고, 21일에 제2형 콜라겐과 IFA(incomplete Freund's adjuvant)으로 2차 면역시켜 관절염(collagen type II induced arthritis; CIA)을 유발하였다(도 6). 상기 관절염을 유발한 동물모델에 조영제로써 Cy5.5를 표지한 HA-MTX를 정맥투여하였다. 투여 전(pre)과 투여 후 1 내지 48시간까지 수 시간 간격으로 전신에 대한 Cy5.5 형광 이미지를 체외(ex vivo)에서 촬영하였다. 획득한 영상 및 형광세기를 수치화하여 작성한 그래프를 도 7에 나타내었다. 비교를 위해 관절염을 유발하지 않은 정상 마우스에 Cy5.5를 표지한 HA-MTX를 투여하여 형광을 측정하였다. 형광 영상에 나타난 바와 같이, 관절염 모델 및 정상 마우스 모두 관절부분에 형광물질이 축적되는 것을 확인할 수 있었으며, 관절염 모델의 경우 관절에서 현저히 높은 형광세기를 나타냄을 확인하였다.

또한 41 내지 49일(약물투여 시작 후 20 내지 28일 후)에는 마우스를 치사시켜 장기를 적출하고 각 장기에서 Cy5.5의 형광을 측정하여 각 장기에 대한 MTX의 잔류량을 확인하였다. 적출한 각 장기의 형광 이미지를 도 8에 나타내었다. 상기 전신 형광 이미지 실험에서와 동일하게 비교군으로는 HA-MTX를 투여한 정상 마우스를 사용하였으며 대조군으로는 약물을 투여하지 않은 비처리 관절염 동물모델을 사용하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 투여한 HA-MTX는 정상 및 관절염 모델 모두에서 간 및 신장에 비슷한 수준으로 축적되었으며, 특히 관절염 모델은 무릎에 현저히 높은 수준으로 축적되는 것을 확인하였다. 이는 관절염 병변 부위에 HA-MTX 접합체가 선택적으로 축적됨을 시사한다.

실험예 5: 관절염 동물모델에 대한 HA - MTX 접합체의 치료효과

본 발명에 따른 HA-MTX 접합체의 생체 내에서의 관절염 치료효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 4와 동일한 방법으로 관절염 동물모델을 제조하여 사용하였다.

21일에 2차 콜라겐으로 면역시켜 관절염을 유도한 마우스 동물모델에 3 또는 4일 간격으로 일주일에 2회 식염수, MTX 및 HA-MTX6을 정맥주사하였다. 상기 약물은 2가지 다른 양(0.5 mg/kg 및 2.5 mg/kg)으로 투여하였다.

시간에 따른 임상점수를 도 9에 나타내었으며, 발의 두께를 측정하여 도 10에 나타내었다.

도 9에 따르면, MTX와 HA-MTX를 동일한 농도로 처리한 경우, 두 가지 농도 모두에서 HA-MTX를 처리한 경우의 임상점수가 MTX를 처리한 경우보다 3점 이상 낮은 것으로 확인되었다. 이는 같은 농도의 약물이라도 HA-MTX의 경우 보다 효율적으로 환부에 전달되어 치료효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.

도 10에는 21일간 약물을 투여한 후 관절염의 증상 중 하나인 족부종 정도를 확인하기 위하여 아무런 처리를 하지 않은 정상 마우스(대조군) 및 비히클, MTX 또는 HA-MTX를 투여한 관절염 동물모델의 발 두께를 측정하여 그래프와 사진으로 나타내었다. HA-MTX를 처리한 경우 2.5 mg/kg으로 투여한 경우뿐만 아니라 0.5 mg/kg만 투여한 경우에도 대조군에 가까운 발 두께를 나타냄을 확인할 수 있었다. 한편, 관절염 동물모델에 비히클로써 식염수를 투여한 경우 족부종이 가장 심하였으며, MTX를 투여한 경우 약간의 증상완화가 관찰되었다. 즉, 이러한 결과는 HA-MTX 접합체를 투여하는 경우, MTX를 단독으로 투여하는 경우보다 현저하게 증가된 관절염 치료효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.

실험예 6: 무릎관절 염증완화에 대한 조직학적 분석

본 발명에 따른 HA-MTX 접합체가 무릎관절 염증정도에 미치는 영향을 확인하기 위하여 조직학적 분석을 수행하였다. 실험예 5에서 사용한 류마티스 관절염 동물모델을 치사시킨 후 무릎관절을 적출하였다. 적출한 무릎관절은 10% NBF(neutral buffered formalin)에 고정하였다. 고정한 무릎관절은 탈회용액(decalcifying solution lite, Sigma)을 이용하여 석회질을 제거하고 파라핀 블록으로 제조하였다. 제조된 파라핀 블록 관절 조직을 5 μm 두께의 절편으로 만들고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 류마티스 관절염 동물모델의 비히클 투여군은 무릎관절의 염증반응에 의한 염증세포의 유입, 윤활액 염증 및 연골침식이 현저히 높은 비율로 발생하는 것이 확인되었다. 반면, MTX 투여군에서는 상기 현상이 개선되었으며, HA-MTX(0.5 mg/kg 또는 2.5 mg/kg)를 투여한 군에서는 비히클 또는 MTX 투여군에 비해 상기 증상들이 현저히 개선되었음을 확인하였다. HA-MTX 투여군은 육안 소견으로도 정상 마우스인 대조군과 유사한 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 11 상부).

실험예 7: 관절염 동물모델에서 분자표적화에 대한 공초점 형광현미경 분석

본 발명에 따른 HA-MTX 접합체의 관절염 부위에 특이적으로 축적되는 현상이 HA 수용체인 CD44에 의한 표적화로 인한 것인지 확인하기 위하여, 상기 실험예 4에서 사용한 정상 마우스(WT)와 관절염 마우스 모델(CIA)에 Cy5.5를 표지한 HA-MTX 접합체를 정맥투여하고, 48시간 후에 무릎관절을 적출하였다. 적출한 무릎관절은 상기 실험예 6에 개시된 바와 같이 10% NBF로 고정한 후 석회질을 제거하고 파라핀 블록으로 제조하여 5 μm 두께의 절편으로 만들었다. 상기 절편시료를 CD44에 대한 항체로 염색하고 이를 알렉사 488(녹색형광)로 표지하여 공초점 형광현미경으로 관찰하였다. 음성대조군으로는 근육조직 절편을 사용하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, WT와는 달리 CIA에서 CD44의 발현이 증가하고 HA-MTX 접합체의 축적이 증가한 것을 확인하였다. 이는 HA-MTX가 CD44를 통해 관절염 부위를 표적화함을 시사한다.

실험예 8: 염증성 사이토카인 방출에 대한 HA - MTX 접합체의 영향

본 발명에 따른 HA-MTX 접합체의 염증성 사이토카인 방출에 대한 영향을 확인하였다. 구체적으로 상기 실험예 5에서 사용한 류마티스 관절염 동물모델의 HA-MTX 접합체의 관절염 치료효과 확인실험 후 동일한 동물모델로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 13000 rpm에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 마우스 사이토카인 패널 멀티플렉스(Mouse Cytokine Panel MultiPlex, Millipore, MPXMCYTO-70K-08, USA)를 이용하여 분리한 혈청 중의 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, INF-γ 및 IL-12)을 정량하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 류마티스 관절염 동물모델에서 혈청 염증성 사이토카인 농도가 급격히 상승하였으나(WT 대비 비히클), HA-MTX 접합체 투여군에서 현저히 감소하여 정상과 유사한 수준을 유지하는 것을 확인하였다.

Claims

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하기 화학식 2의 메토트렉세이트를 4-디메틸아미노피리딘 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 존재 하에 하기 화학식 3의 히알루론산과 반응시키는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 m, p 및 q는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이며, m=p+q이다.
제5항에 있어서,
상기 메토트렉세이트에 대한 4-디메틸아미노피리딘 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드의 몰비율은 1: 3 내지 5 : 3 내지 5인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 pH 6.8에서 가수분해에 의해 60% 이상의 메토트렉세이트를 방출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 관절염의 예방 또는 치료활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
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