KR100957125B1 - 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체 및 그의 제조방법 - Google Patents

생체 고분자와 난용성 물질의 접합체 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 친수성 고분자 물질간의 수소결합을 방해하여 다양한 유기용매 상에 상기 친수성 고분자 물질을 가용화시키고, 상기 가용화된 친수성 고분자 물질을 다양한 난용성 물질과 접합시켜 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체에 관한 것으로, 본 발명에 의한 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체는 수용액 내에서 자기조합되어 나노크기의 마이셀(micelles)을 형성하기 때문에, 상기 마이셀이 세포 특이적 치료제로 이용될 수 있다.
생체 고분자, 폴리(에틸렌글리콜), 유기용매, 난용성 물질, 마이셀

Description

생체 고분자와 난용성 물질의 접합체 및 그의 제조방법{Complex of biopolymers and insoluble biomolecules, and manufacturing method thereof}
본 발명은 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 친수성 고분자 물질간의 수소결합을 방해하여 다양한 유기용매 상에 상기 친수성 고분자 물질을 가용화시키고, 상기 가용화된 친수성 고분자 물질을 다양한 난용성 물질과 접합시켜 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체에 관한 것이다.
파클리탁셀(paclitaxel)은 본래 태평양 주목(Taxus brevifolia)의 껍질에서 분리 추출되는 강력한 항암성 약물로서, 튜불린(tubulin) 조합체를 안정된 마이크로튜블(microtubules)로 전환 촉진하는 항-세포분열 활성이 있음은 널리 알려진 사실이다.
파클리탁셀은 고분자화된 마이크로튜블의 해중합작용을 방지하여 세포 순환 주기의 지연형 G2/M 위상에서 일어나는 세포 복제를 억제한다. 파클리탁셀은 항암성 약물로서 탁월한 잠재적 능력을 보였지만, 수용해도가 낮아 암 치료 분야에서의 광범위한 이용은 제한되어 왔다.
현재 임상적 제형, 예를 들면, 크레모포어 EL과 에탄올에 파클리탁셀이 50:50 비율로 배합된 혼합물인 탁솔(Taxol)® 약물의 수용해도를 개선함으로써 전신투여에 이용하고 있으나, 과민증, 신경독성, 신경장애 등 상기 크레모포어 EL의 다양한 부작용에 관하여 다수의 연구가 보고되었다(Onetto, N.; Grechko J., Overview of taxol safety, J. Natl . Cancer Inst. Monogr . 1993, 15, 131. ; Mazzo, D.; Denis, P., Compatibility of docetaxel and paclitaxel in intravenous solutions with polyvinyl chloride infusion materials, Am . J. Health Sys . Pharm . 1997, 54, 566. ; Gregory R.; Delisa, A.F., Paclitaxel: a new antineoplastic agent for refractory ovarian cander, Clin . Pharm . 1993, 12, 401.).
심각한 부작용을 극복하기 위한 종래의 시도 중에는 각종 담체, 예를 들어, 고분자 접합체, 리포좀, 고분자 마이셀, 에멀전 및 나노구체 등에 파클리탁셀을 함입하여 제형화하는 방법도 포함된다(Crosasso P.; Cattel, L., Preparation, characterization and properites of sterically stabilized paclitaxel-containing liposomes, J. Controlled Release 2000, 63, 19. ; Bae, K.H.; Lee, Y.; Park, T.G., Oil-encapsulating PEO-PPO-PEO Shell Crosslinked Nanocapsules for Target-specific Delivery of Paclitaxel, Biomacromolecules 2007, 8, 650. ; Tarr, B.D.; Sambandan, T.G.; Yalkowsky, S.H., A new parenteral emulsion for the administration of taxol, Pharm . Res . 1987, 4, 162. ; Dordunoo, S.K.; Burt, H.M., Taxol encapsulation in poly(ε-caprolactone) microspheres, Cancer Chemother. Pharmacol . 1995, 36, 279).
이들 중에서 약물-고분자 접합체는, 종래의 고분자형 나노크기 담체와 뚜렷이 구분되는 장점으로서 고(高) 약물함량, 우수한 수용해도, 체내 약물 반감기 연장, 및 항암 효과의 개선 등을 나타낸다.
약물 접합에 널리 이용되어 온 것은 수용해성 합성 고분자이지만, 고유의 세포 특이적 결합능을 가진 자연 발생 고분자도 타겟 특이적 약물 담체로서 탁월한 능력을 갖는다. 예를 들어, 히알루론산(HA)은 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산으로 구성된 자연 발생 다당류로서, CD44 및 RHAMM 같은 세포 특이적 표면 마커에 대해 강력한 친화성을 나타낸다.
상기 HA는 ECM의 안정화 및 조직화, 세포 접착성 및 자가 이동성(motility)의 조절, 또한 세포 증식 및 분화의 조정 등과 같은 생물학적 기능에 중요한 역할을 한다. HA는 또한 여러 종류의 종양에서 신생혈관 생성에 밀접하게 관련하며, 이 경우 HA 수용체(CD44 및 RHAMM)가 종양 표면에서 과발현한다. 따라서, 높은 전이활성을 갖는 악성세포는 종종 개선된 HA 결합 및 흡수력을 보여준다. 이에 따라, HA와 그의 유도체는 다양한 치료제를 위한 타겟 특이적 약물 전달 매개체로 광범위하게 사용되어 왔다.
HA의 화학적 변성 및 접합은 카르복실기, 히드록실기 및 환원성 말단 같은 HA의 반응성 관능기를 이용하여 수용액 내에서 이루어졌다 (Luo, Y.; Prestwich, G.D., Hyaluronic acid-N-hydroxysuccinimide: A useful intermediate for bioconjugation, Bioconjugate Chem . 2001, 12, 1085. ; Zhang, M., James, S.P., Synthesis and properties of melt-processable hyaluronan esters, J. Mat. Sci. 2005, 40, 2937. ; Ruhela, D.; Szoka, F.C., Efficient synthesis of an aldehyde functionalized hyaluronic acid and its application in the preparation of hyaluronan-lipid conjugates, Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1360.).
그러나, 유기용매에 대한 극단적인 난용성 때문에 HA를 소수성 고분자, 약물 및 지질에 대한 접착은 제한된다.
상술한 문제를 극복하기 위해서, 다양한 가용화 방법을 활용하여 통상의 용매에 용해된 HA 및 소수성 반응물의 균질한 혼합물을 수득했다. 예를 들어, 유기용매와 물의 혼합물(예, DMSO/H2O 또는 DMF/H2O)을 HA와 파클리탁셀의 공용해(co-dissolving)에 이용하였다(Luo, Y.; Prestwich, G.D., Synthesis and selective cytotoxicity of a hyaluronic acid-antitumor bioconjugate, Bioconjugate chem . 1999, 10, 755.).
후속의 변성과정에 필요한 극성 유기용매에서의 HA의 용해도를 개선하기 위해, HA/암모늄염 착염은 다음이온성 HA를 지방족 4가 암모늄 화합물로 침전시켜 제조하였다(Zhang, M.; James, S.P., Silylation of hyaluronan to improve hydrophobicity and reactivity for improved processing and derivatization, Polymer 2005, 46, 3639.).
그러나, 이러한 방법들은 물/유기용매 혼합상에서의 접합에 아민 및 카르복실기를 모두 필요로 한다는 점과, 생 의학 및 약물 전달 분야에 적절하지 않은 환경적 세포독성 암모늄 계면활성제를 활용하는 점 등의 제약이 있었다.
상기한 바와 같이, 친수성 생체고분자 물질 등은 대부분 강한 수소결합을 가지기 때문에, 물을 제외한 유기용매상에는 잘 가용화 되지 않는 문제점을 지니고 있는 바, 고분자 물질간의 수소결합을 방해하여 다양한 유기용매상에 친수성 고분자 물질을 가용화시켜, 상기와 같이 가용화된 친수성 고분자 물질을 다양한 난용성 약물이나 지방산 그리고 합성 고분자 물질과 접합시킬 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 절실히 대두되어 왔다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 친수성 고분자 물질간의 수소결합을 방해하여 다양한 유기용매 상에 상기 친수성 고분자 물질을 가용화시키고, 상기 가용화된 친수성 고분자 물질을 다양한 난용성 물질과 접합시켜 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체를 제조하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 방법에 의해 제조된 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a)친수성 생체 고분자의 염류를 제거하고, 수용액상에서 상기 염이 제거된 친수성 생체 고분자를 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 고분자와 혼합하여 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 형성하여 동결건조시키고, 상기 동결건조된 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 유기용매에 가용화시키는 단계; (b)상기 유기용매에 가용화된 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜)의 나노복합체 용액을 커플링제의 존재하에 반응시켜 생체 고분자를 활성화하는 단계; 및 (c)상기 생체 고분자가 활성화된 용액에 유기용매에 용해시킨 난용성 물질을 첨가하여 반응시키는 단계; 를 포함하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기의 방법에 의해 제조된 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체를 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체는 수용액 내에서 자기조합되어 나노크기의 마이셀(micelles)을 형성하므로, 상기 마이셀로부터 유리된 난용성 물질은 pH-의존성 분해반응을 지니고, 생체 고분자 수용체 결핍 세포보다 생체 고분자 수용체 과발현 암세포에 대해 더욱 현저한 세포독성 효과를 나타낼 수 있기 때문에, 상기 마이셀이 세포 특이적 치료제로 이용될 수 있는 잇점을 지니고 있다.
현재까지 난용성 약물 등과 같은 난용성 물질의 접합은 유기용매상에서 주로 이루어져 왔는데, 히알루론산, DNA, RNA, 다당류(polysaccharide) 등과 같은 친수성 생체고분자 물질과 난용성 물질 약물의 접합은 두 물질이 모두 가용화 할 수 있는 용매를 찾아야 하기 때문에 그 어려움이 크다. 특히 이런 경우, 다양한 용매를 혼합하여 사용하는데, 대표적인 예로서, 디메틸설폭사이드(DMSO)와 디메틸포름아마이드(DMF)를 1:1 비율로 수용액과 혼합하여 반응을 시켰다.
하지만 물이 있는 반응의 경우, 다양한 생체접합이나 합성이 불가능하기 때문에, 유기용매상에서 상기 친수성 생체고분자 물질을 가용화시켜 유기용매상에서 난용성 물질과 접합시킬 필요가 있다.
친수성 생체고분자 물질 등은 대부분 강한 수소결합을 가지기 때문에, 물을 제외한 유기용매상에는 가용화 되지 않는다.
과거에, 본 연구자들은 나노크기 착염을 형성함으로써 생체적합성 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)을 이용한 유기용매 내에서의 DNA 가용화 방법에 대해 발표한 바 있다 Mok, H.; Park, T.G., PEG-assited DNA solubilization in organic solvents for preparing cytosol specifically degradable PEG/DNA nanogels, Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1369.).
PEG는 유기용매에 각종 생체 거대분자를 용해 및 안정화하는데 널리 이용되었다. PEG는 수소결합 공여자와 수용체의 양쪽 역할을 할 수 있기 때문에, 유기용매에 대한 PEG의 첨가는 상호 및 내부-수소결합에 의해 HA/PEG 나노-착염의 형성을 촉진할 수 있다는 가설을 세은 바 있다.
따라서, 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)를 이용하여 고분자 물질간의 수소결합을 방해하면 다양한 유기용매상에 친수성 고분자물질을 가용화시킬 수 있으며, 특히 상기와 같이 가용화된 친수성 고분자 물질을 다양한 난용성 약물이나 지방산 그리고 합성 고분자 물질과 접합시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 하나의 양상은 (a)친수성 생체 고분자의 염류를 제거하고, 수용액상에서 상기 염이 제거된 친수성 생체 고분자를 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 고분자와 혼합하여 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 형성하여 동 결건조시키고, 상기 동결건조된 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 유기용매에 가용화시키는 단계; (b)상기 유기용매에 가용화된 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜)의 나노복합체 용액을 커플링제의 존재하에 반응시켜 생체 고분자를 활성화하는 단계; 및 (c)상기 생체 고분자가 활성화된 용액에 유기용매에 용해시킨 난용성 물질을 첨가하여 반응시키는 단계; 를 포함하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법에서 상기 친수성 생체고분자는 유전자, 히알루론산이나 헤파린과 같은 탄수화물 계통의 다당류, 단백질 및 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 제조방법에서, 상기 친수성 생체 고분자의 염류는 투석 또는 에탄올 침전으로 제거할 수 있다.
본 발명에 의한 제조방법에서, 상기 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 고분자는 하이드록실기를 가진 폴리(에틸렌글리콜), 알킬기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)(alkyl modified PEG), 아민기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)(amine modified PEG), 티올기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)(thiol modified PEG), 카르복실기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜) (carboxyl modified PEG), 아크릴기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)(acryl modified PEG), 선형 폴리(에틸렌글리콜)(linear PEG) 및 가지상의 폴리(에틸렌글리콜)(branched PEG)로 이루어진 군에서 선택된 1종이거나 이들의 복합체를 사용할 수 있는데, 상기 알킬기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)의 예로는 디메틸 폴리(에틸렌글리콜)(dimethyl PEG) 등을 들 수 있다.
본 발명에 의한 제조방법에서, 상기 유전자는 DNA, 플라스미드 유전자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 RNA로 이루어진 군에서 선택된 1종이거나, 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
상기에서 친수성 생체고분자 중의 히알루론산은 모든 분자량의 히알루론산 및 그의 유도체를 포함할 수 있고, 상기 헤파린은 다양한 분자량의 헤파린 및 그의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 제조방법에서, 친수성 고분자를 용해시키는 상기 유기용매로는 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 아세톤, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아마이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤, 아세토나이트릴, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종이나, 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 제조방법에서, 상기 (a) 단계의 친수성 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 고분자의 혼합비는 1 : 1 내지 1: 1,000 (w/w), 바람직하게는 1: 1 내지 1: 10(w/w), 보다 바람직하게는 1: 5 (w/w)의 범위에서 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 제조방법에서, 상기 (b) 단계의 커플링제로는 상기 생체 고분자의 카르복실기를 활성화시켜 상기 난용성 약물과 산분해형 에스테르 결합반응 또는 아마이드 결합반응을 일으킬 수 있는 작용기를 갖는 화합물이라면 제한없이 사용될 수 있는데, 구체적으로는 이미드기와 아미노기가 활성화된 카복실기를 오랜 기간 동안 안정화하여 높은 접합 수율을 보이는 점에서, 이미드기를 갖는 화합물 및 아미노기를 갖는 화합물에서 선택된 1종 또는 2종인 것이 바람직하다. 상기 이미드기를 갖는 화합물과 아미노기를 갖는 화합물이 동시에 사용되는 경우에는 활성화된 카복실기의 안정화를 위하는 점에서, 상기 이미드기를 갖는 화합물 : 아미노기를 갖는 화합물의 몰비가 1 : 0.5~3.0인 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는 상기 이미드기를 갖는 화합물이 1,3-디시클로헥실카보디이미드(DCC)이고, 상기 아미노기를 갖는 화합물이 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)인 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 제조방법에서, 상기 (c) 단계에서 상기 생체 고분자에 대한 난용성 물질의 첨가량이 0.01~30%(w/w)인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
본 발명에 의한 제조방법에서, 상기 (c) 단계의 난용성 물질로는 수용액에 잘 분산되지 않거나, 침전되는 특성을 갖는 물질이라면 제한없이 사용될 수 있는데, 난용성 약물, 난용성 생분해성 고분자, 난용성 지질 등을 예로 들 수 있다.
구체적으로 상기 난용성 약물로는 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 및 다우노마이신(daunomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 난용성 항암제; 항바이러스제; 스테로이드계 소염제(steroidal anti-inflammatory drugs); 항생제; 항진균제; 비타민; 프로스타사이클린(prostacyclin); 항대사제; 축동제(mitotics); 아드레날린 길항제(adrenaline antagonist); 항경련제; 항불안제; 정온제; 항우울제; 마취제; 진통제; 동화성 스테로이드제; 면역 억제제; 면역 촉진제; 또는 이들의 혼합물 등을 예로 들 수 있다.
또한 상기 난용성 생분해성 고분자로는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트코글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 디카르복실산계 지방족 폴리에스테르(PBsA), 폴리 에테르아미드, 폴리 에스테르우레탄 등을 예로 들 수 있다.
상기 난용성 지질로는 지방산(fatty acid)과 인지질(phospholipid) 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에 의한 제조방법에서, 산분해성 에스테르 반응을 억제하기 위하여 상기 (c) 단계에서 무수 N2의 존재하에 난용성 물질을 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 제조방법은 상기 (c) 단계에 의해 수득한 반응용액을 투석처리하여 미반응 난용성 물질 및 미반응 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 제거하는 (d) 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 (d) 단계 후에 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체를 수거하여 동결건조하는 (e) 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기의 방법에 의해 제조된 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체에 관한 것이다.
본 발명에 의한 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체는 수용액 내에서 자기조합되어 나노크기의 마이셀(micelles)을 형성하기 때문에, 상기 마이셀로부터 유리된 난용성 물질은 pH-의존성 분해반응을 지니고, 생체 고분자 수용체 결핍 세포보다 생체 고분자 수용체 과발현 암세포에 대해 더욱 현저한 세포독성 효과를 나타낼 수 있으며, 이는 상기 마이셀이 세포 특이적 치료제로 이용될 수 있는 가능성이 있음을 보여주는 것이다. 상기에서 마이셀(micelles)이라 함은 고분자 화합물을 구성하는 미세한 결정을 의미한다.
상기 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체에서 상기 생체고분자로는 유전자, 히알루론산이나 헤파린과 같은 탄수화물 계통의 다당류, 단백질, 펩타이드 등을 예로 들 수 있다.
상기 난용성 물질은 난용성 약물, 난용성 생분해성 고분자 또는 난용성 지질로서, 구체적으로 상기 난용성 약물로는 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 및 다우노마이신(daunomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 난용성 항암제; 항바이러스제; 스테로이드계 소염제(steroidal anti-inflammatory drugs); 항생제; 항진균제; 비타민; 프로스타사이클린(prostacyclin); 항대사제; 축동제(mitotics); 아드레날린 길항제(adrenaline antagonist); 항경련제; 항불안 제; 정온제; 항우울제; 마취제; 진통제; 동화성 스테로이드제; 면역 억제제; 면역 촉진제; 또는 이들의 혼합물 등을 예로 들 수 있다.
또한 상기 난용성 생분해성 고분자로는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트코글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 디카르복실산계 지방족 폴리에스테르 (PBsA), 폴리 에테르아미드, 폴리 에스테르우레탄 등을 예로 들 수 있다.
상기 난용성 지질로는 지방산 (fatty acid) 과 인지질 (phospholipid) 등을 예로 들 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 실시예 4 (HA/dmPEG 착염의 조제 및 상기 착염의 가용화 처리)
Lifecore Biomedical사(Chaska, MN)에서 구입한 1g의 히알루론산(HA) 나트륨염(MW: 17kDa)을 100ml의 탈염수에 용해하고, 24시간 동안 투석한 후(MWCO: 1kDa) 동결건조하여 탈염시켰다.
도 1에서 보는 바와 같이, 상기 탈염 HA와 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO)에서 구입한 폴리에틸렌글리콜디메틸에테르(dmPEG; MW: 2000Da)의 중량비가 각각 0.5 (실시예 1), 1 (실시예 2), 5 (실시예 3) 및 10 (실시예 4)으로 된 탈염 HA와 dmPEG의 혼합물을 25ml의 탈염수에 가했다. 용액을 잘 저어준 다음, 동결건조시켜 무수 HA/dmPEG 착염을 수득하였다.
총 600mg의 동결 건조된 HA/dmPEG 착염을 무수 N2 존재하에 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO)에서 구입한 5ml의 무수 디메틸설폭사이드 (anhydrous DMSO)에 첨가하였다. 상기 용액을 80℃에서 2시간 동안 강하게 교반시켜 무수 DMSO에 가용화된 HA/dmPEG 나노 복합체(HA/dmPEG nano-complex in DMSO)를 제조하였다.
실시예 5 내지 8 (HA-파클리탁셀 접합체의 제조)
도 1에서 보는 바와 같이, 상기 dmPEG/HA의 중량비가 5인 600mg의 HA/dmPEG 혼합물에 각각 0.5, 1.0, 3.0 및 3.0 몰비의 1,3-디시클로헥실카보디이미드(DCC)/4-디메틸아미노피리딘(DMAP)를 첨가하면서 5ml의 무수 DMSO에 용해시켰다.
상기 용액을 1시간 동안 교반하여 HA의 카르복실기를 활성화한 다음, 하기 표 1과 같이, TCI사(Tokyo, Japan)에서 구입한 상이한 양(10 및 20mg)의 파클리탁셀(paclitaxel)을 1ml의 무수 DMSO에 용해한 뒤, 무수 N2의 존재하에 주사기를 이용하여 상기의 용액에 천천히 첨가시켰다.
표 1. HA-파클리탁셀의 접합
실시예 HA (mg) -COOH 에 대한 DCC/DMAP 몰비 파클리탁셀 공급량 (mg) 접합체 내의 파클리탁셀의 양(mg) 파클리탁셀 접합수율 (%) 파클리탁셀 함량 (w/w %)
5 100 0.5 10 1.18±0.03 11.8 1.17
6 100 1.0 10 3.26±0.05 32.6 3.16
7 100 3.0 10 5.96±0.08 59.6 5.62
8 100 3.0 20 12.16±0.16 60.8 10.84
상기 혼합물을 다시 40℃에서 2일간 교반시켜 얻은 용액을 투석막(분자량 커오프(MWCO) : 3500Da)을 사용하여 DMSO에 대해 1일간 및 탈염수에 대해 3일간 투석처리하여 미반응 파클리탁셀 및 dmPEG를 제거하였다. HA-파클리탁셀 접합체를 수거하여 3일간 동결건조시켜 HA-파클리탁셀 접합체를 제조하였다.
도 1을 참조하면, 파클리탁셀의 히드록실기는 커플링제인 DCC/DMAP에 의해 카르복실기에 직접 접합되어 결과로 얻어지는 HA-파클리탁셀 접합체는 산분해성 에스테르 결합을 함유함을 알 수 있다. 본 발명에서 디메틸-PEG(dmPEG)는, HA-파클리탁셀 접합 과정에서 히드록실기 말단 PEG가 HA에 접합하는 부적절한 현상을 피하기 위하여, 디히드록실-PEG 대신 DMSO에 대한 HA 가용화에 이용하였다.
실시예 9 내지 12 (HA-PLGA 접합체의 제조)
HA-파클리탁셀 접합체에서 사용된 것과 같이, 상기 dmPEG/HA의 중량비가 5 인 600mg의 HA/dmPEG 혼합물에 3.0 몰비의 1,3-디시클로헥실카보디이미드(DCC)/4-디메틸아미노피리딘(DMAP)를 첨가하면서 5 ml의 무수 DMSO에 용해시켰다.
상기 용액에, 하기 표 2과 같이, Waco사(Tokyo, Japan)에서 구입한 상이한 양의 폴리락트코글리콜산 (PLGA: 분자량 5000 Da)을 1ml의 무수 DMSO에 용해한 뒤, 무수 N2 존재하에 주사기를 이용하여 상기의 용액에 천천히 첨가시켰다.
상기 혼합물을 40℃에서 2일간 교반시켜 얻은 용액을 투석막(분자량 커오프(MWCO) : 3500Da)을 사용하여 DMSO에 대해 1일간 및 탈염수에 대해 3일간 투석처리하여 미반응 폴리락트코글리콜산 및 dmPEG를 제거하였다.
HA-PLGA 접합체를 수거하여 3일간 동결건조시켜 HA-PLGA 접합체를 제조하였다.
표 2. HA-PLGA의 접합
실시예 HA (mg) -COOH 에 대한 DCC/DMAP 몰비 PLGA공급량 (mg) 접합체 내의 PLGA의 양(mg) PLGA 접합률 (%)
9 100 3.0 62.5 23.8±2.2 1.90
10 100 3.0 125 56.1±1.6 4.49
11 100 3.0 250 83.6±2.4 6.69
12 100 3.0 500 217±3.8 17.36
실험예 1 (DMSO에서의 HA/dmPEG 착염의 가용성 확인)
상기 실시예 1 내지 4에서 가용화된 HA/dmPEG 착염의 가용성을 확인하기 위하여, 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용하여 400nm에서 투과율을 측정하고, dmPEG 첨가량에 대한 함수로서 DMSO에서의 HA/dmPEG 착염의 가용성을 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 DMSO 용액의 투과율을 dmPEG/HA 중량비의 함수로서 나타낸 것으로서, 삽입부는 화살표가 가리키는 부분을 찍은 것으로 dmPEG/HA 혼합물을 함유하는 DMSO 용액의 사진을 나타낸 것이다.
Int . Pharm . Res . 동적 광산란 기술로 측정했을 때 HA/dmPEG 착염의 크기는 DMSO 내에서 120±6.3nm으로 매우 작아 가시광을 산란시키지 않으며, 따라서 균질하고 맑은 용액을 얻게 됨을 알 수 있다.
실험예 2 (HA-파클리탁셀의 1H-NMR 스펙트럼 분석)
상기 실시예 5 내지 8에서 제조한 4개의 상이한 HA-파클리탁셀 접합체를 D2O 및 DMSO-d6를 이용하여 Bruker 400 MHz NMR 분광계(Bruker, Germany)를 통해 수득하여 1H-NMR 스펙트럼을 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.
이때, HA에 접합된 파클리탁셀의 양은 역상 컬럼(Waters Spherisorb ODS2: 4.6mm ID×250mm)을 이용하는 HPLC(1100 series, Agilent Technologies, Palo Alto, USA)로 측정하였고, 아세토니트릴/물(50/50 부피비)로 구성된 이동상(相)은 0.8ml/min의 유속으로 이동시켰으며, 용리 정점은 227nm에서 관측하였다.
도 3을 참조하면, D2O 의 경우, 강한 아세틸(-NHCOC H 3 ) 정점은 3.0 내지 4.0ppm의 글루코시드 H(10H) 및 4.30 내지 4.40ppm의 아노머(anormeric) H(2H)와 함께 1.86ppm으로 존재하였다. 이에 반해, 방향족 고리내의 다중선(multiplet) (6.75 내지 7.05ppm 및 7.85 내지 8.15ppm) 같이 파클리탁셀의 특성화 정점은 최소 화되었다.
DMSO-d6를 용매로 사용한 경우, 파클리탁셀의 특성화 정점은 1.86ppm에서의 HA 특이적 아세틸 정점 및 4.33ppm에서의 환원된 아노머 H(2H)가 사라진 것에 반하여, 1H-NMR 스펙트럼에서 뚜렷이 나타났다. 파클리탁셀 특이적 정점이 1H-NMR에서 관측되긴 했어도 파클리탁셀 및 아세틸 정점의 차단 및 탈-차단은 HA 상에 접합된 파클리탁셀을 평가하기 어렵게 만들었다.
HA-파클리탁셀 접합체를 수용액에서 배양한 경우, 파클리탁셀 간의 소수성 상호작용에 의해 파클리탁셀의 응집이 유도되고, 그렇지 않으면 상기 접합체는 유기용매에 자유 노출되었을 것으로 추측할 수 있다.
따라서, 파클리탁셀의 접합량 및 각 시료의 수율을 아세토니트릴과 수성 공용매의 50:50 혼합물을 이용하여 HPLC로 측정하고, 그 결과를 상기 표 1에 요약하였다.
DCC/DMAP의 몰단위 잉여량이 증가하면 HA-파클리탁셀의 접합수율은 약 30%에 도달하였고, 접합량이 가장 큰 파클리탁셀 접합 시료는 10% 파클리탁셀 함량(중량%)을 초과하는 것으로 나타났다. 상기 데이터는 DCC/DMAP의 공급비가 HA-파클리탁셀 접합에서 임계변수임을 입증한다.
실험예 3 (수용액 내의 자가조합된 HA-파클리탁셀 접합체 마이셀의 특성화)
수용액 내에 형성된 HA-파클리탁셀 접합체 마이셀은 동적 광산란 장비(Zeta- Plus, Brookhaven, NY)를 사용하여 이들의 수력학적 직경을 측정함으로써 특성화하였다.
1H-NMR 결과로부터, HA-파클리탁셀 접합체에서 파클리탁셀 응집이 검출되었고 이들 응집체의 크기는 DLS로 측정하였다(도 4의 A 참조).
크기 측정은 25℃의 탈염수 내에서 접합된 HA-파클리탁셀의 농도가 5.0mg/ml일 때 6회(n=6) 실시하였다. 나노크기의 HA-파클리탁셀 마이셀은 또한 원자간력 현미경법(AFM) 및 투과전자 현미경법(TEM)을 통해 육안으로 관찰하였다. AFM 영상에서, 100㎕의 HA-파클리탁셀 용액(5.0mg/ml)은 투명한 운모면 위에 존재하며 하룻밤 지나자 공기 건조되어 사라졌다. 이 영상은 스캔영역이 5×5㎛ 인 비접촉 방식의 PSIA XE-100 AFM 시스템(Santa Clara, CA)을 이용하여 얻었다.
TEM 영상에서, HA-파클리탁셀 마이셀은 Zeiss Omega 912 투과전자 현미경(TEM)(Carl Zeiss, Germany)으로 분석하였다. TEM 시료는 20㎕의 HA-파클리탁셀 용액(5.0mg/ml)을 탄소막이 구비된 300 메쉬의 쿠퍼 TEM 그리드(grid) 위에 침착시켜 제작했고 이를 실온에서 공기 건조시켰다. HA-파클리탁셀 접합체의 임계응집농도(CAC)는 상술한 소수성 형광 탐침자인 피렌을 이용하여 계산했다.
탈염수에 용해 제조된 피렌 원액(Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO)을 6.0×10-7M의 농도로 준비하였다. 0.1㎍/ml 내지 1mg/ml 범위에서 상이한 양의 HA-파클리탁셀 접합체를 피렌 원액에 용해시켰다. 390nm의 방출파장에서, 피렌이 함유된 HA-파클리탁셀 마이셀의 여기 스펙트럼은 형광분광광도계(Shimadzu, Japan)로 관측 한 결과를 도 4에 나타내었다.
HA-파클리탁셀을 함유하는 가장 큰 파클리탁셀(시료 #4)은 196±9.6nm의 평균직경 및 좁은 직경분포를 나타내었다. 나노입자 형성은 양쪽성 공중합체, 예를 들면, 플루로닉 공중합체, PEGI-PLGA 및, 소수성 상호작용을 거쳐 양쪽성 분자의 자기조합 결과로 나온 PLGA 그래프트 폴리(L-리신) 등에서 관측되었다.
육안으로 관찰한 HA-파클리탁셀 나노입자에 대해 AFM 및 TEM 영상을 얻었다(도 4의 B 및 4의 C 참조). AFM 영상에서, 원형 HA-파클리탁셀 나노입자는 232±28.2nm (n=30)의 평균직경을 갖는 것으로 관찰되었으며, 이는 DLS 측정 결과와 일치한다.
또한 TEM 영상은 HA-파클리탁셀 나노입자의 원형 형태와 크기 (183±17.8nm, n=30)에 대한 정보를 제공하였다. 수용액에서의 HA-파클리탁셀의 나노-응집에 대한 추가 연구는 HA-파클리탁셀의 임계응집농도를 소수성 형광 탐침자인 피렌을 이용하여 측정함으로써 달성하였다. 피렌은 양쪽성 공중합체로 구성된 마이셀의 내강(lumen) 속에 존재할 수 있으며, 수용액 내의 공중합체 농도에 따라 응집으로 인한 방출개선(AIEE)을 나타낸다는 사실이 종래에 공지되어 있다. 실험 과정에서 여기 스펙트럼을 측정했고 피렌의 I 339 /I 334 강도비를 평가했다(도 4의 D 참조).
HA-파클리탁셀의 농도 증가와 관련하여 형광 강도의 증가 및 피렌의 적색 이동을 관측하였다. 강도비(I 339 / I 334 ) 그래프에서, CAC값은 7.8㎍/ml로 계산되었다.
실험예 4 (HA-파클리탁셀 접합체 마이셀로부터 파클리탁셀의 pH-의존형 방출효과)
HA-파클리탁셀 접합체를 10mg/ml 농도의 탈염수에 첨가했다. 시료 용액은 0.1M NaOH 또는 HCl을 이용하여 pH 1, 3, 5, 및 7로 각각 조정하였다. 37℃에서 1시간 동안 천천히 혼합한 후, 이 용액을 0.45㎛의 주사기 필터로 여과하였다.
접합체로부터 분해된 파클리탁셀의 양을 상술한 바와 같이 굴절지수(RI) 검출기(RI-71, Shodex, Japan)를 이용하여 관측한 결과를 도 5에 나타내었다.
본 발명에서는 산분해형 에스테르 결합을 이용하였므로, HA-파클리탁셀 나노입자로부터 파클리탁셀의 pH 의존형 방출이 특히 우려의 대상이었다. 4가지 상이한 pH 조건에서 1시간 배양한 후, 파클리탁셀 방출량을 관측하였다. HA-파클리탁셀 및 파클리탁셀의 신호를 각각 구분하기 위하여, 역상 컬럼을 RI 검출기와 함께 사용했다.
역상 컬럼에서 나온 용출액은 HA-파클리탁셀과 파클리탁셀의 소수성에 따라 우수한 정점 분리능력을 나타내는 것으로 확인되었는데, 도 5를 참조하면, HA-파클리탁셀과 파클리탁셀의 정점 분리는 산성 pH에서 개시되며 파클리탁셀 방출량은 배양 pH에 의존성을 보여주었다.
다른 한편, pH 7.0에서는 HA-파클리탁셀의 단일 정점만 검출되었다. 또한, HA-파클리탁셀 정점의 좌측 이동은 파클리탁셀의 방출이 증가했을 때 관찰되었다. HA-파클리탁셀의 소수성은 파클리탁셀의 분해가 진행되면서 감소하기 시작했다.
이러한 pH 의존형 방출은, 암 주위의 국소적으로 낮은 pH 조건에서 일어나는 파클리탁셀 방출이 급감하고 파클리탁셀의 엔도소멀 방출이 촉진됨으로써, 암세포의 파클리탁셀 흡수력을 개선함을 알 수 있다.
실험예 5 (HA-파클리탁셀 접합체 마이셀의 시험관내 항암 활성)
HCT-116 및 MCF-7 세포를 CD44 과발현 암세포주로 이용하여, 시험관내 세포특이적 타겟이 된 HA-파클리탁셀 접합체 마이셀의 전달이동을 확인하였다. NIH-3T3 세포는 CD44 결핍 세포주로 이용하였다.
세포를 96-웰 플레이트에 웰당 세포수 1×104 개의 밀도로 깔고, 10% (부피 백분율) 태아소 혈청을 보충한 RPMI 배지 안에서 37℃ 온도로 24시간 동안 증식시켰다. HA-파클리탁셀 접합체 마이셀의 세포독성은 37℃에서 2일간 상이한 농도의 HA-파클리탁셀 접합체로 세포를 처리하여 평가했다. 비교를 위해, 별도로 탁솔®을제조하여 양성 대조군으로 이용하였다. 세포 생존율은 Dojindo 라이브러리(Kumamoto, Japan)에서 구입한 CCK-8 세포 생존율 분석 키트로 측정하였다.
DNA 단편화 같은 세포사멸의 발생은 공초점 레이저 현미경(LSM 510, Carl-Zeiss Inc., USA) 및 유동 세포측정기(FACSCalibur, USA)로 관찰하였다. HCT-116 세포를 1.0×105세포/ml의 밀도로 챔버 슬라이드에 깔고, 1㎍/ml의 파클리탁셀 당량농도를 가진 탁솔® 제형 혹은 HA-파클리탁셀 마이셀 제형으로 37℃에서 24시간 동안 처리하였다.
세포를 1% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO)에서 구입한 요오드화 프로포듐(PI) 염색액 (PBS 에 용해된 0.25mg/mL PI 및 0.1mg/mL RNase A 함유)을 이용하여 1×106 세포/ml의 농도로 37℃에서 30분간 배양하였다.
염색된 세포는 공초점 현미경을 이용하여 543nm의 여기 파장에서 육안으로 관찰했다. 유동 세포 분석에서 염색된 세포를 수거하여 pH 7.4인 1.5ml의 PBS에 재현탁했다. 각 핵의 PI 형광성은 CELLQUEST 소프트웨어(PharMingen, USA)를 이용하여 분석하였다.
도 6은 3개의 상이한 세포주로서, (A) HCT-116, (B) MCF-7 및 (C) NIH-373에 대한 HA-파클리탁셀 및 탁솔® 시험관내 세포독성을 나타낸 것으로서, 수용체에 의해 조정되는 HA-파클리탁셀 나노입자의 흡수력을 나타내기 위해 3개의 상이한 세포주를 선택하였다.
도 6을 참조하면, HA-파클리탁셀 나노입자는 HCT-116 및 MCF-7에 대해 효과적인 세포독성을 나타낸 반면, NIH-3T3에서는 세포독성 감소가 관측되었다. 측정된 데이터는 HCT-116 및 MCF-7 등의 CD44 과발현 세포주가 HA-파클리탁셀 나노입자를 선별적으로 흡수함으로써, HA-파클리탁셀 나노입자가 0.1㎍/ml 이하의 낮은 약물농도에서도 고 세포독성(IC50)을 나타낸다는 사실을 보여주었다.
HA-파클리탁셀 나노입자의 세포사멸-유발 효과를 확인하기 위하여, 공초점 현미경법 및 유동 세포분석을 통해 HCT-116 세포에 대해 좀더 상세히 연구하였는 데, 도 7은 (A) 대조군, (B) 탁솔® 및 (C) HA-파클리탁셀로 각각 처리한 PI 염색된 HCT-116 세포의 공초점 영상을 나타낸다. 또한 (D) 대조군, (E) 탁솔® 및 (F) HA-파클리탁셀이 HCT-116 세포에 미치는 세포사멸 영향의 FACS 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이때, 파클리탁셀 제형은 모두 1㎍/ml의 파클리탁셀 당량을 함유하는데, DNA 단편화 같은 세포핵의 형태 변화를 요오드화 프로포듐(PI) 염색을 거쳐 육안으로 관찰함으로써, 파클리탁셀에 의해 유발된 아포토시스 세포사멸을 확인하였다.
도 7을 참조하면, HCT-116 세포를 파클리탁셀을 함유하지 않은 대조군 제형(20㎍/ml의 HA)으로 처리한 경우 세포사멸이 없었으므로, 핵 속에서 강력한 적색 형광성을 균일하게 검출하였다(도 7의 A 참조). 이와 대조적으로, 탁솔®이나 HA-파클리탁셀 나노입자로 배양한 후의 HCT-116 세포는 세포핵을 밀도가 크고 작은 입자로 분할 및 단편화 하는 등, 세포사멸의 뚜렷한 증거를 나타내었다(도 7의 B 참조).
내인성 핵분해효소의 활성화는 염색체 DNA를 올리고누클레오좀 단편으로 분할하는 세포사멸 과정과 관련이 있는 것으로 짐작할 수 있다. 세포사멸의 정도는 유동 세포측정법에 의해 정량적으로 분석하였다. 파클리탁셀의 세포독성적 활성은 주로 스핀들 형성 및 세포분할에 필요한 고분자화된 마이크로튜블 상에서의 이들의 안정화 효과에 기인하므로, 파클리탁셀은 G2/M 위상의 세포주기 정지(arrest) 및 마지막에는 세포사멸 메커니즘을 거친 세포죽음을 유발하는 것으로 입증되었다.
도 7의 D 내지 F를 참조하면, HA-파클리탁셀 나노입자는 대조군(16.12%) 및 탁솔® 31.17%)과 비교하여 G2/M 세포집단의 현저한 증가(64.94%)를 유도함을 알 수 있다. 이러한 결과는 HA-파클리탁셀 나노입자가 CD44 과발현 세포에 용이하게 흡수되고 세포사멸-유발 효과를 크게 개선한다는 사실을 입증한다.
마지막으로, HA-파클리탁셀 나노입자를 파클리탁셀 담체로 이용하면, 암세포를 수동적 및 능동적으로 타겟화하는 장점을 겸비하게 됨을 알 수 있다.
실험예 6 (HA-PLGA 의 1H-NMR 스펙트럼 및 FT-IR 분석)
상기 실시예 11 에서 제조한 HA-PLGA 접합체를 D2O 및 DMSO-d6를 이용하여 Bruker 400 MHz NMR 분광계(Bruker, Germany)를 통해 수득하여 1H-NMR 스펙트럼을 분석한 결과를 도 8의 A 에 나타내었다.
도 8의 A를 참조하면, D2O 의 경우, 강한 아세틸(-NHCOC H 3 ) 정점은 3.0 내지 4.0ppm의 글루코시드 H(10H) 및 4.30 내지 4.40ppm의 아노머(anormeric) H(2H)와 함께 1.86ppm으로 존재하였다. 이에 반해, PLGA의 특성화 정점은 (4.88 내지 5.22 ppm) 최소화되었다.
DMSO-d6를 용매로 사용한 경우, PLGA의 특성화 정점은 1.86ppm에서의 HA 특이적 아세틸 정점 및 4.33ppm에서의 환원된 아노머 H(2H)가 사라진 것에 반하여, 1H-NMR 스펙트럼에서 뚜렷이 나타났다.
HA-PLGA 접합체를 수용액에서 배양한 경우, PLGA 간의 소수성 상호작용에 의해 PLGA의 응집이 유도되고, 그렇지 않으면 상기 접합체는 유기용매에 자유 노출되었을 것으로 추측할 수 있다.
FT-IR 을 이용하여 HA-PLGA 의 접합여부를 또한 확인하여 도 8의 B에 나타내었다. 각각 HA 와 PLGA 는 특성적인 정점을 보이는데, HA의 경우 넓은 범위의 수산화기 (2800~3800 cm-1)를 보이며, PLGA의 경우 C=O (2900 cm-1)와 C-H (1800 cm-1) 특성의 정점을 보이는 것을 알 수 있다.
HA-PLGA의 경우 HA와 PLGA의 특성 정점을 고루 보여주는 것을 확인할 수 있으며, 이로서 HA-PLGA의 접합 여부를 측정할 수 있다.
실험예 7 (수용액 내의 자가조합된 HA-PLGA 접합체 마이셀의 특성화)
상기 실시예 11 에서 제작된 HA-PLGA 접합체 마이셀을 동적 광산란 장비(Zeta-Plus, Brookhaven, NY)를 사용하여 수용액 내에서 이들의 수력학적 직경을 측정함으로써 특성화하였다.
1H-NMR 결과로부터, HA-PLGA 접합체에서 PLGA 응집이 검출되었고 이들 응집체의 크기는 DLS로 측정하였다.
크기 측정은 25℃의 탈염수 내에서 접합된 HA-PLGA의 농도가 2.0 mg/ml일 때 6회(n=6) 실시하였다. 측정된 수력학적 직경은 약 150~300 나노미터 크기였다. 또한 나노크기의 HA-PLGA 마이셀은 원자간력 현미경법(AFM) 및 투과전자 현미경법(TEM)을 통해 육안으로 관찰하였다. AFM 영상에서, 100㎕의 HA-PLGA 용액 (2.0mg/ml)은 투명한 운모면 위에 존재하며 하룻밤 지나자 공기 건조되어 사라졌다. 이 영상은 스캔영역이 3×3㎛ 인 비접촉 방식의 PSIA XE-100 AFM 시스템(Santa Clara, CA)을 이용하여 얻었다.
TEM 영상에서, HA-PLGA 마이셀은 Zeiss Omega 912 투과전자 현미경(TEM)(Carl Zeiss, Germany)으로 분석하였다. TEM 시료는 20㎕의 HA-PLGA 용액 (2.0mg/ml)을 탄소막이 구비된 300 메쉬의 쿠퍼 TEM 그리드(grid) 위에 침착시켜 제작하였고, 이를 실온에서 공기 건조시켰다. HA-PLGA 접합체의 임계응집농도(CAC)는 상술한 소수성 형광 탐침자인 피렌을 이용하여 계산하였다.
탈염수에 용해 제조된 피렌 원액(Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO)을 6.0×10-7M의 농도로 준비하였다. 0.1㎍/ml 내지 1mg/ml 범위에서 상이한 양의 HA-PLGA 접합체를 피렌 원액에 용해시켰다. 390nm의 방출파장에서, 피렌이 함유된 HA-PLGA 마이셀의 여기 스펙트럼은 형광분광광도계(Shimadzu, Japan)로 관측한 결과를 도 9에 나타내었다.
육안으로 관찰한 HA-PLGA 나노입자에 대해 AFM 및 TEM 영상을 얻었다(도 10의 A 및 B 참조). 상기 도 10의 A(AFM 영상)에서, 원형 HA-PLGA 나노입자는 282±20.8nm (n=30)의 평균직경을 갖는 것으로 관찰되었으며, 이는 DLS 측정 결과와 일 치하였다.
또한 TEM 영상은 HA-PLGA 나노입자의 원형 형태와 크기 (243±27.8nm n=30)에 대한 정보를 제공하였다. 수용액에서의 HA-PLGA의 나노-응집에 대한 추가 연구는 HA-PLGA의 임계응집농도를 소수성 형광 탐침자인 피렌을 이용하여 측정함으로써 달성하였다.
피렌은 양쪽성 공중합체로 구성된 마이셀의 내강(lumen) 속에 존재할 수 있으며, 수용액 내의 공중합체 농도에 따라 응집으로 인한 방출개선(AIEE)을 나타낸다는 사실이 종래에 공지되어 있다. 실험 과정에서 여기 스펙트럼을 측정했고 피렌의 I 339 / I 334 강도비를 평가하였다.
HA-PLGA의 농도 증가와 관련하여 형광 강도의 증가 및 피렌의 적색 이동을 관측하였다. 강도비(I 339 / I 334 ) 그래프에서, CAC값은 14.8㎍/ml로 계산되었다.
실험예 8 (HA-PLGA 접합체 마이셀의 항암 물질 전달체로서의 활용)
HCT-116 세포를 CD44 과발현 암세포주로 이용하여, 시험관내 세포특이적 타겟이 된 HA-PLGA 접합체 마이셀의 항암 물질 전달이동을 확인하였다.
HA-PLGA 접합체 마이셀에 항암 물질을 첨가하기 위해서, HA-PLGA 와 독소루비신(doxorubicin) 을 DMSO 상에 녹인 후, 증류수에서 투석 함으로서 항암 물질이 HA-PLGA 접합체 마이셀의 내강(lumen) 속에 존재하도록 하였다. 이때 약물의 첨가 수율은 약 30% 로 확인 되었다.
세포를 96-웰 플레이트에 웰당 세포수 1×104 개의 밀도로 깔고, 10% (부피 백분율) 태아소 혈청을 보충한 RPMI 배지 안에서 37℃ 온도로 24시간 동안 증식시켰다.
항암제가 첨가된 HA-PLGA 접합체 마이셀의 세포독성은 37℃에서 2일간 상이한 농도의 HA-PLGA 접합체로 세포를 처리하여 평가하였다. 비교를 위해, 별도로 수용액에 녹여진 독소루비신을 제조하여 양성 대조군으로 이용하였다. 세포 생존율은 Dojindo 라이브러리(Kumamoto, Japan)에서 구입한 CCK-8 세포 생존율 분석 키트로 측정하였다.
HA-PLGA에 함유된 항암제의 세포 특이적 흡수는 공초점 레이저 현미경(LSM 510, Carl-Zeiss Inc., USA) 및 유동 세포측정기(FACSCalibur, USA)로 관찰하였다. HCT-116 세포를 1.0×105세포/ml의 밀도로 챔버 슬라이드에 깔고, 1㎍/ml의 독소루비신 당량농도를 가진 용액과 혹은 HA-PLGA 마이셀 제형으로 37℃에서 각 30분 혹은 2시간 동안 처리하였다.
세포를 1% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 공초점 현미경을 이용하여 543nm의 여기 파장에서 육안으로 관찰하였다. 유동 세포 분석에서 고정된 세포를 수거하여 pH 7.4인 1.5ml의 PBS에 재현탁하였다. 각 시료의 형광성은 CELLQUEST 소프트웨어(PharMingen, USA)를 이용하여 분석하였다.
도 11은 HCT-116 세포주를 이용하여 HA-PLGA 접합체 마이셀의 항암 물질 전달체로서의 효과를 나타낸 것으로서, 수용액 상으로 전달되는 독소루비신에 비해 독소루비신이 함유된 HA-PLGA 나노입자의 흡수력이 뛰어남을 보여주었다.
도 11을 참조하면, 항암제가 함유된 HA-PLGA 나노입자는 HCT-116에 효과적인 세포독성을 나타내며, 특히 수용액상의 독소루비신 보다 낮은 농도에서 더 뛰어난 세포 독성을 보여 줌으로써, 낮은 약물농도에서도 고 세포독성(IC50)을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있다.
항암제가 함유된 HA-PLGA 나노입자의 약물전달 효과를 확인하기 위하여, 공초점 현미경법 및 유동 세포분석을 통해 HCT-116 세포에 대해 좀더 상세히 연구하였는데, 도 12은 세포에 2 시간 약물 처리된 (A) 독소루비신, (B) 독소루비신이 함유된 HA-PLGA, 및 30분간 약물 처리된 (C) 독소루비신, (B) 독소루비신이 함유된 HA-PLGA 세포의 공초점 영상을 나타낸다.
도 12를 참조하면, 2 시간 동안 약물을 처리했을 경우 독소루비신과 독소루비신이 함유된 HA-PLGA 두 경우 다 많은 양의 약물이 세포 내로 전달 되었음을 확인 할 수 있다. 하지만 30 분간 약물을 처리 했을 경우, 독소루비신이 함유된 HA-PLGA의 경우에만 약물이 세포 내로 전달되는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 HCT-116 세포가 독소루비신에 약물 거부 반응 (MDR)을 일으키는 것을 확인 할 수 있으며, HA-PLGA를 약물 전달체로 사용할 경우 이 거부 반응이 줄어드는 것을 알 수 있었다.
도 13은 HA 특이적인 약물 전달을 확인하기 위해서 HA가 첨가된 경우와 그렇지 않을 경우에서의 약물 전달의 차이점을 FACS로 분석한 후 그래프로 나타낸 것이 다. 이때, 독소루비신 제형은 모두 1㎍/ml의 독소루비신 당량을 함유하는데, 세포 내에 증가된 약물의 양 관찰함으로써, 항암제가 함유된 HA-PLGA의한 약물 전달을 확인하였다.
도 13을 참조하면, HCT-116 세포를 독소루비신이 함유된 HA-PLGA를 처리했을 경우, 수용액상 HA를 함유하지 않은 제형과 함유한 제형 사이에 다른 결과가 나오는 것을 확인 할 수 있다.
상기와 같은 결과는 HA-PLGA 나노입자가 CD44 과발현 세포에 용이하게 흡수되지만 수용액상에 HA를 첨가할 경우 경쟁적 저해(competitive inhibition)가 일어나서 약물 전달 효율이 떨어짐을 보여주는 것으로서, HA-PLGA 나노입자가 HA와 CD44 간의 리간드 수용체 반응을 통해 세포 내로 유입된다는 사실을 입증해 주는 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법은 다양한 유기용매상에서 친수성 생체고분자 물질을 가용화할 수 있고, 상기와 같이 가용화 된 친수성 고분자 물질을 다양한 소수성 약물, 지방산 또는 합성 고분자 물질과 접합시킬 수 있기 때문에, 제약산업, 식품산업 등 화학관련 산업분야에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 80℃에서 2시간 동안 혼합한 후의 HA/dmPEG 가용화된 DMSO의 투과율을 dmPEG 첨가량에 대한 함수로서 나타낸 그래프,
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 8에 의한 HA-파클리탁셀 접합체의 접합 반응도,
도 3은 (A) D2O 및 (B) DMSO-d6에 용해된 HA-파클리탁셀의 1H-NMR 스펙트럼,
도 4는 (A) DLS로 HA-파클리탁셀 나노입자를 측정한 결과; (B) AFM 및 (C) TEM로 각각 찍은 HA-파클리탁셀 나노입자의 영상; 및 (D) 피렌을 이용하여 임계응집농도(CAC)를 측정한 것으로서 I 339 및 I 334 사이의 강도비를 로그농도의 함수로 나타낸 그래프,
도 5는 상이한 배양 pH에서 1시간 동안 HA-파클리탁셀 나노입자로부터 방출된 파클리탁셀의 HPLC 측정 결과,
도 6은 3개의 상이한 세포주로서, (A) HCT-116, (B) MCF-7 및 (C) NIH-373에 대한 HA-파클리탁셀 및 탁솔® 시험관내 세포독성을 나타낸 그래프,
도 7은 (A) 대조군, (B) 탁솔 및 (C) HA-파클리탁셀로 각각 처리한 PI 염색된 HCT-116 세포의 공초점 영상, 또한 (D) 대조군, (E) 탁솔® 및 (F) HA-파클리탁셀이 HCT-116 세포에 미치는 세포사멸 영향의 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프,.
도 8은 본 발명의 실시예 11에서 제조한 HA-PLGA의 구조를 분석한 결과로서, (A)는 HA-PLGA의 1H-NMR 분석 스펙트럼, (B) 는 HA-PLGA의 FT-IR 분석 스펙트럼,
도 9는 피렌을 이용하여 임계응집농도(CAC)를 측정한 것으로서, I 339 및 I 334 사이의 강도비를 로그농도의 함수로 나타낸 그래프,
도 10은 (A) AFM 및 (B) TEM로 각각 찍은 HA-PLGA 나노입자의 영상,
도 11은 HCT-116에 대한 독소루비신 함유된 HA-PLGA 나노입자 및 독소루비신의 시험관내 세포독성을 나타낸 그래프,
도 12는 HCT-116 세포를 (A) 독소루비신, (B) 독소루비신이 함유된 HA-PLGA 나노입자를 2 시간 동안 처리 및 (C) 독소루비신, (D) 독소루비신이 함유된 HA-PLGA 나노입자를 30분 동안 처리 한 후의 공초점 영상,
도 13은 독소루비신이 함유된 HA-PLGA 나노 입자가 수용액 상에 HA가 있을 때, HCT-116 세포에 흡수되는 영향의 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프 (파랑색: HA-PLGA 나노입자; 빨강색: 독소루비신)이다.

Claims (26)

  1. (a). 친수성 생체 고분자의 염류를 제거하고, 수용액상에서 상기 염이 제거된 친수성 생체 고분자를 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 고분자와 혼합하여 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 형성하여 동결건조시키고, 상기 동결건조된 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 유기용매에 가용화시키는 단계;
    (b). 상기 유기용매에 가용화된 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜)의 나노복합체 용액을 커플링제의 존재하에 반응시켜 생체 고분자를 활성화하는 단계; 및
    (c). 상기 생체 고분자가 활성화된 용액에 유기용매에 용해시킨 난용성 물질을 첨가하여 반응시키는 단계; 를 포함하되,
    상기 친수성 생체 고분자가 히알루론산이고, 상기 난용성 물질이 난용성 약물 또는 난용성 생분해성 고분자인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 친수성 생체 고분자의 염류는 투석 또는 에탄올 침전으로 제거하는 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방 법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 고분자는 하이드록실기를 가진 폴리(에틸렌글리콜), 알킬기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)(alkyl modified PEG), 아민기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)(amine modified PEG), 티올기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)(thiol modified PEG), 카르복실기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜) (carboxyl modified PEG), 아크릴기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)(acryl modified PEG), 선형 폴리(에틸렌글리콜)(linear PEG) 및 가지상의 폴리(에틸렌글리콜)(branched PEG)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 알킬기로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)이 디메틸 폴리(에틸렌글리콜)(dimethyl PEG)인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 유기용매가 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 아세톤, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아마이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤, 아세토나이트릴, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 친수성 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 고분자의 혼합비가 1 : 1 내지 1,000 : 1 (w/w)인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 커플링제는 상기 생체 고분자의 카르복실기를 활성화시켜 상기 난용성 물질과 산분해형 에스테르 결합반응 또는 아마이드 결합반응을 일으킬 수 있는 작용기를 갖는 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 커플링제가 이미드기를 갖는 화합물 및 아미노기를 갖는 화합물에서 선택된 1종 또는 2종인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 이미드기를 갖는 화합물이 1,3-디시클로헥실카보디이미드(DCC)이고, 상기 아미노기를 갖는 화합물이 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 커플링제가 상기 이미드기를 갖는 화합물 : 아미노기를 갖는 화합물의 몰비가 1 : 0.5~3.0인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 생체 고분자에 대한 난용성 약물의 첨가량이 0.01~30 %(w/w)인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 제 1항에 있어서, 상기 난용성 약물이 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 및 다우노마이신(daunomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 난용성 항암제; 항바이러스제; 스테로이드계 소염제(steroidal anti-inflammatory drugs); 항생제; 항진균제; 비타민; 프로스타사이클린(prostacyclin); 항대사제; 축동제(mitotics); 아드레날린 길항제(adrenaline antagonist); 항경련제; 항불안제; 정온제; 항우울제; 마취제; 진통제; 동화성 스테로이드제; 면역 억제제 및 면역 촉진제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 난용성 생분해성 고분자가 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트코글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤 (PCL), 디카르복실산계 지방족 폴리에스테르(PBsA), 폴리 에테르아미드 및 폴리 에스테르우레탄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  17. 삭제
  18. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 무수 N2의 존재하에 난용성 약물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계에 의해 수득한 반응용액을 투석처리하여 미반응 난용성 약물 및 미반응 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 제거하는 (d) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 (d) 단계 후에 생체 고분자와 난용성 약물의 접합체를 수거하여 동결건조하는 (e) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체의 제조방법.
  21. (a). 친수성 생체 고분자의 염류를 제거하고, 수용액상에서 상기 염이 제거된 친수성 생체 고분자를 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 고분자와 혼합하여 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 형성하여 동결건조시키고, 상기 동결건조된 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜) 복합체를 유기용매에 가용화시키는 단계;
    (b). 상기 유기용매에 가용화된 생체 고분자와 생분해성 폴리(에틸렌글리콜)의 나노복합체 용액을 커플링제의 존재하에 반응시켜 생체 고분자를 활성화하는 단계; 및
    (c). 상기 생체 고분자가 활성화된 용액에 유기용매에 용해시킨 난용성 물질을 첨가하여 반응시키는 단계; 를 포함하되,
    상기 친수성 생체 고분자가 히알루론산이고, 상기 난용성 물질이 난용성 생분해성 고분자인 것을 특징으로 하는 히알루론산과 난용성 생분해성 고분자 접합체의 제조방법에 의해 제조된 히알루론산과 난용성 생분해성 고분자의 접합체.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제 21항에 있어서, 상기 난용성 생분해성 고분자가 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트코글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤 (PCL), 디카르복실산계 지방족 폴리에스테르 (PBsA), 폴리 에테르아미드 및 폴리 에스테르우레탄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 히알루론산과 난용성 생분해성 고분자의 접합체.
  26. 삭제
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101467076B1 (ko) * 2013-02-20 2014-12-02 성균관대학교산학협력단 히알루론산-메토트렉세이트 접합체를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010127271A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Intezyne Technologies, Incorporated Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer
US8524784B2 (en) 2009-04-30 2013-09-03 Intezyne Technologies, Incorporated Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer
WO2015188838A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 University Of Copenhagen Self-assembling structures
GB201418068D0 (en) 2014-10-13 2014-11-26 Cambridge Entpr Ltd Polymer
EP3297636B1 (en) * 2015-06-19 2021-02-17 Syn-Nat Products Enterprise LLC Pharmaceutical composition of carboplatin based co-crystals and use thereof
CN112126056B (zh) * 2019-06-24 2022-11-29 徐州医科大学 一种杯[4]芳烃类衍生物及其制备与应用
CN113797351B (zh) * 2021-09-30 2023-10-27 大连民族大学 一步法合成pH响应型的靶向透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100289074B1 (ko) 1998-02-04 2001-07-12 김윤 난용성약물함유시스템
KR20020041712A (ko) * 2000-11-28 2002-06-03 윤덕용 생분해성 고분자와 항암제의 접합체를 이용한 서방형미셀제제의 제조방법
KR100416242B1 (ko) 1999-12-22 2004-01-31 주식회사 삼양사 약물전달체용 생분해성 블록 공중합체의 액체 조성물 및이의 제조방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7767806B2 (en) * 2003-09-08 2010-08-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hyaluronic acid modification products and drug carriers using them

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100289074B1 (ko) 1998-02-04 2001-07-12 김윤 난용성약물함유시스템
KR100416242B1 (ko) 1999-12-22 2004-01-31 주식회사 삼양사 약물전달체용 생분해성 블록 공중합체의 액체 조성물 및이의 제조방법
KR20020041712A (ko) * 2000-11-28 2002-06-03 윤덕용 생분해성 고분자와 항암제의 접합체를 이용한 서방형미셀제제의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문 Neoplasia, Vol.9, No.6 (2007)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101467076B1 (ko) * 2013-02-20 2014-12-02 성균관대학교산학협력단 히알루론산-메토트렉세이트 접합체를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법

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