CN112126056B - 一种杯[4]芳烃类衍生物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种杯[4]芳烃类衍生物及其制备与应用，所述杯[4]芳烃类衍生物，如式(I)所示，其中，R1为长链烷烃，
Figure DDA0002105120950000011
本发明所述的杯[4]芳烃类衍生物兼具抗肿瘤活性和载药能力的双功能。

Description

一种杯[4]芳烃类衍生物及其制备与应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物载体领域，具体涉及一种结构新颖的杯[4]芳烃类衍生物以及该化合物的制备方法及在载药方面的应用。
背景技术
恶性肿瘤是当前严重威胁人类健康的重要疾病之一，国际癌症研究机构最近报告称，2018年，全球预计新增癌症病例将达到1810万例，因癌症死亡人数达到960万。临床上，传统化疗依然是癌症治疗的主要手段。传统化疗药物虽能有效杀死癌细胞，但对健康组织也会产生影响，易引起各种并发症。此外，其临床应用还会受到一些因素如溶解性差，长循环能力差，生物利用度低，缺乏特异性等的制约。使用药物递送系统递送药物，是缓解甚至解决这些问题的有效方法。因此，开发药物递送系统一直是药学领域的热点之一。良好的药物载体大多都具备提高药效、降低或清除毒副作用，增加难溶性药物的水溶性，掩盖药物的特殊气味等功能。
杯芳烃(Calixarene)是一类由多个苯酚单元和甲醛在碱性条件下缩合而成的环状低聚物，因其锥式构象酷似希腊圣杯而得名。杯芳烃具有易于修饰的上、下缘和大小可调的富电子空腔，并且大多有规则的几何形状和高对称性。自问世以来，杯芳烃就受到了研究人员的广泛关注。其特殊的三维结构容易和离子形成稳定的配合物，在过去的几十年中，杯芳烃主要应用于离子识别领域。近年来，随着对杯芳烃衍生物研究的不断深入，其应用领域也在不断拓展。从非生物领域的催化反应，重金属回收，到生物领域的蛋白质识别，模拟酶，DNA识别等。由于杯芳烃类衍生物已经被证明具有非常好的生物相容性和低细胞毒性[21]，杯芳烃在药学领域的应用前景十分广阔，越来越多的研究人员把目光聚焦到了杯芳烃的药学应用。下式1为对叔丁基杯[4]芳烃的结构。
Figure BDA0002105120930000011
迄今为止，杯芳烃在药学领域主要有两大类应用:其一，是将杯芳烃作为其他药物的递送平台。例如，通过杯芳烃独特的立体结构，使其与客体药物形成稳定的主客体复合物，或者通过一些两亲性杯芳烃衍生物的自组装行为，将药物包封到杯芳烃自组装所形成的纳米颗粒中。其二，是以杯芳烃为母体骨架，通过在其上下缘引入活性药效团，将杯芳烃设计成药物。例如，在杯芳烃上引入具有抗肿瘤活性的药效团，开发新型超分子抗肿瘤药物。
然而，在现有研究中，杯芳烃在药学领域的两大应用模式，相对独立，即作为药物载体的杯芳烃类衍生物本身并不具备药理活性，而作为药物的杯芳烃其也不具备载药能力。即现有的杯芳烃类衍生物，在药学方面的应用上，只有单一载药能力或者单一的生物活性，没有充分利用杯芳烃在药学方面的应用潜力。但是，杯芳烃本身具有结合两种应用模式的潜力。
发明内容
本发明目的之一在于以杯[4]芳烃为母体骨架，开发一种兼具抗肿瘤活性和载药能力的双功能的两亲性杯[4]芳烃类衍生物，其可以通过自组装形成胶束来包裹药物，例如阿霉素(DOX)。
本发明的目的之二是提供上述杯[4]芳烃类衍生物的制备方法。
本发明的目的之三是提供上述杯[4]芳烃类衍生物在载药方面的应用。
本发明的目的通过以下技术手段实现：
一种杯[4]芳烃类衍生物，如式(I)所示：
Figure BDA0002105120930000021
其中，R1为长链烷烃，
Figure BDA0002105120930000022
在一种优选方案中，R1为C1～C15的烷基，更优选的，R1为C1～C10的直链烷基。
在一种优选方案中，R2为聚乙二醇400～聚乙二醇2000，更优选的，R2为聚乙二醇500～聚乙二醇1000。
在一种具体实施方案中，R1为己基，R2为PEG550。
本发明还提供式(I)所示杯[4]芳烃类衍生物的制备方法，
Figure BDA0002105120930000031
本发明还提供式(I)所述杯[4]芳烃类衍生物在载药方面的应用。
本发明还提供式(I)所述杯[4]芳烃类衍生物为材料制备的杯芳烃载药胶束。
本发明还提供所述杯芳烃载药胶束的制备方法，包括如下步骤：
a.将式(I)所述的杯[4]芳烃类衍生物溶于有机溶剂得溶液B；
b.取二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸(DSPE-PEG2000-FA)和抗癌药物A，加入至溶液B中，混合均匀得溶液C；
c.将溶液C用蒸馏水透析，离心，将上清液冷冻干燥，得杯芳烃载药胶束。
步骤a中式(I)所述的杯[4]芳烃类衍生物与有机溶剂的质量体积没有特别要求，能够实现溶解即可。
步骤a中的有机溶剂可以为本领域常规的非质子极性溶剂，在一种实施例中，所述的有机溶剂优选为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或丙酮。
在一种实施例中，步骤b所获得的溶液C中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与杯[4]芳烃类衍生物的质量比为1：8～12，优选为1:10。
在一种实施例中，步骤b所获得的溶液C中，抗癌药物A与杯[4]芳烃类衍生物的质量比为1：3～8，优选为1:5。
本发明步骤b中所用的抗癌药物A可以为本领域常用脂溶性且非水溶性的药物，或者难溶性药物的水溶性盐，例如阿霉素盐酸盐、紫杉醇，长春新碱，依托泊苷；当选择脂溶性且非水溶性的药物的时候，可以直接按照步骤b的操作加入到溶液B中，当选择难溶性药物的水溶性盐时，需要称取难溶性药物的水溶性盐溶于水中，加碱调节pH至7～7.6，过滤干燥得到抗癌药物A。进一步的，用于调节pH的碱可以为本领域常用的有机碱或无机碱，例如，在一种实施方式中，所述的碱为三乙胺、二氮杂二环、氢氧化钠或碳酸氢钠。过滤干燥方式没有特别的要求，可以为本领域常规的干燥方法。
本发明步骤c中将溶液C用蒸馏水透析可以除去有机溶剂和其他的一些杂质，在一种优选的实施方式中，透析时间为20～28h，透析过程优选的需要避光。
本发明步骤c中的离心和冷冻干燥可选用本领域的常规方法，在一种优选的实施方式中，离心转速为7000～10000r/min，优选为8000r/min。
除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：
“烷基”表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-15”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括15个碳原子)。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-10个碳原子的直链烷基，例如甲基、乙基、丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。烷基可以是取代的或未取代的。当是取代的烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基，它们独立地优选自以下的基团：卤素、羟基、低级烷氧基。
本发明所述的有益效果：
本发明的一种具有生物活性的两亲性杯芳烃衍生物，其具有抗肿瘤活性和载药能力的双重功能。上缘选择聚乙二醇作为亲水基团，可以减少载体与血浆中各种蛋白的结合，提高载体在体内的长循环时间。并且，由于聚乙二醇侧链通过酰胺键与杯芳烃母体相连，其具有一定的pH响应性，在酸性条件下能够迅速释放药物。制备所得的芳烃载药胶束粒径较小，具有EPR效应，可通过渗透和滞留，被动富集于肿瘤部位。此外，DSPE-PEG2000-FA的引入，使载体具备了主动靶向某些叶酸受体过表达的肿瘤细胞的功能。而且本发明的制备方法简单环保，只需通过透析法即可在水介质中制备载药纳米胶束，有广阔的应用前景。
附图说明
图1为CA的1H NMR谱图；
图2载药前后胶束的TEM形态(A为载药前的胶束形态，B为载药后的胶束形态)；
图3不同pH条件下的药物释放曲线(A图为DOX的标准曲线；B图为载药载体在含有3％十二烷基硫酸钠的0.15mol/L PBS缓冲液(pH 6.5和pH 7.4)中的药物释放曲线)；
图4 FA-CA-DOX胶束的粒径变化(4℃，pH7.4的0.15M PBS缓冲液中)；
图5 HeLa对不同载体的摄取效果；
图6不同摄取抑制剂对载体入胞效果的抑制作用；
图7空白载体和化合物7对不同肿瘤细胞系的抑制活性；
图8 FA-CA-DOX、CA-DOX和游离DOX对HepG2细胞的抑制活性；
图9空白载体和化合物7对HUVEC细胞的细胞毒性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容做进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于下述各实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1化合物CA的合成
Figure BDA0002105120930000061
①化合物2的合成
将叔丁基杯[4]芳烃(450mg,1.06mmol)，苯(4.5mL)，冰乙酸(3.6mL)混合于50mL反应瓶中，搅拌，冰盐浴降至-10℃。向溶液中逐滴缓慢滴加浓硝酸(0.82mL，12.3mmol)，加完撤去冰浴，室温搅拌过夜。反应液从白色混悬液变为黄色混悬液，TLC跟踪反应至结束。过滤，滤饼依次用苯、水、乙醇、乙醚各5mL洗涤，收集并向其中加入氯仿5mL，加热煮沸，除去未反应原料，烘干得产物，称重480mg，产率74.92％。
化合物2(p-tetra-nitro-calix[4]arene)：淡黄色固体，m.p.＞200℃,1H NMR:(DMSO-d6,400MHz)δ8.18(s,8H),4.26(s,4H),3.74(s,4H)；13C NMR:(DMSO-d6,100MHz)δ162.91,138.70,130.04,125.19,31.08；HRMS(ESI)Calcd for C28H20N4O12([M+NH4]+):622.1421,found:622.1394.
②化合物3的合成
将化合物2(2.002g，3.3mmol)溶解至无水DMF(30mL)中，冰浴降温至0℃。取60％NaH(1.601g，40mmol)，分批加入至反应瓶中，搅拌10min，升温至90℃，继续反应30min。取碘己烷(1.86mL，10.2mmol)，逐滴加入至反应瓶中，90℃搅拌过夜反应。TLC监测，24h后反应结束，用乙酸乙酯-饱和食盐水体系萃取反应液，收集有机层，减压干燥除去溶剂，通过柱层析分离产物(洗脱液极性：DCM：PE＝2:1)，得产物1.66g，产率65.30％。
化合物3(5,11,17,23-tetra-nitro-25,27-bis-hexyloxy-26,28-diol calix[4]arene)：淡黄色固体，m.p.＞200℃,1H NMR:(CDCl3,400MHz)δ8.72(s,2H),8.17(s,4H),7.85(s,4H),4.34(d,J＝13.6Hz,4H),4.11(t,J＝6.8Hz,4H),3.65(d,J＝14Hz,4H),2.13-2.06(m,4H),1.74-1.66(m,4H),1.51-1.38(m,8H),0.96(t,J＝7.6Hz,6H)；13C NMR:(CDCl3,100MHz)δ159.01,156.91,145.23,140.55,133.43,126.93,125.29,78.26,31.62,31.44,30.01,25.61,22.66,14.13；HRMS(ESI)Calcd for C40H44N4O12([M+Na]+):795.2853,found:795.2872.
③化合物4的合成
化合物3(1.52g，2mmol)于60mL DMF溶解，冰浴降温至0℃。取，分批加入60％NaH(1.22g，23mmol)至反应瓶中，搅拌10min后，升温至90℃，继续搅拌30min。取KI(2.54g，15.3mmol)，氯乙酸甲酯(3.33g，30.6mmol)依次加入至反应瓶中，90℃搅拌过夜反应。TLC监测，16h后反应结束，用乙酸乙酯-饱和食盐水体系萃取反应液，收集有机层，减压干燥除去溶剂通过柱层析分离产物(洗脱液极性：PE:EA＝3:1)，得产物1.12g，产率61.84％。
化合物4(5,11,17,23-tetra-nitro-25,27-bis-hexyloxy-26,28-bis-methoxyl-carbonylmeth oxyl-calix[4]arene)：淡黄色固体，m.p.＞200℃，1H NMR:(CDCl3,400MHz)δ8.27(s,2H),8.11(s,2H),7.99(d,J＝2.8Hz,2H),7.13(d,J＝2.4Hz,2H),4.65(s,2H),4.42(d,J＝14.8Hz,3H),4.06(s,3H),3.95(s,2H),3.88(s,2H),3.79-3.77(m,2H),3.75-3.73(m,2H),3.67(s,2H),3.61(s,3H),3.40(d,J＝14.8Hz,2H),1.90-1.97(m,4H),1.49-1.56(m,4H),1.38-1.45(m,8H),0.94(t,J＝7.2z,6H)；13C NMR:(CDCl3,100MHz)δ169.09,168.17,160.89,160.11,142.95,136.29,134.63,134.10,132.20,126.19,125.46,124.83,124.01,76.17,70.97,67.80,53.39,51.76,34.67,31.81,30.48,25.94,22.62,14.11；HRMS(ESI)Calcd for C46H52N4O16([M+Na]+):939.3276,found:939.3301.
④化合物5的合成
化合物4(1.02g，1.1mmol)，乙醇胺(2.32g，38mmol)置于反应瓶中，加入无水乙醇25mL，甲苯25mL，混匀，油浴加热至80℃，TLC监测反应，10h后反应结束。减压蒸馏除去反应溶剂，用二氯甲烷复溶，加水萃取，除去过量乙醇胺，收集有机层，减压干燥得产物656mg，产率60.65％。
化合物5(5,11,17,23-tetra-nitro-25,27-bis-hexyloxy-26,28-bis-[N-(2-hydro-xy-ethyl)a minocarbonylmethoxyl]-calix[4]arene)：淡黄色固体，m.p.＞200℃，1H NMR:(DMSO-d6,400MHz)δ8.33(s,2H),8.21(s,2H),8.04(d,J＝2.8Hz,2H),7.57(t,J＝5.6Hz,1H),7.34(t,J＝5.6Hz,1H),7.18(d,J＝2.8Hz),4.686-4.623(m,2H),4.42-4.36(m,4H),4.13(d,J＝13.6Hz,2H),4.00(s,2Hz),3.95-3.82(m,4Hz),3.61(d,J＝14.4H z,2H),3.39-3.35(m,2H),3.32(t,J＝7.2Hz,2H),3.249-3.205(m,2H),3.174-3.128(m,2H),3.02-3.2.97(m,2H),1.87-1.80(m,4H),1.45-1.40(m,4H),1.36-1.31(m,8H),0.89(t,J＝7.6Hz,6H)；13C NMR:(CDCl3,100MHz)δ168.31,160.78,142.71,135.85,134.89,134.61,132.62,126.44,125.53,124.35,123.56,72.62,71.06,62.90,61.71,42.02,34.87,31.62,30.25,25.71,22.59,14.05；HRMS(ESI)Calcd for C48H58N6O16([M+Na]+):997.3807,found:997.3816.
⑤化合物6的合成
化合物6(650mg，0.67mmol)，加入10mL乙醇溶解，加入Pd/C 130mg至反应瓶中，缓慢升温至80℃搅拌10min。分批滴入80％水合肼(1.657mL)，回流反应过夜。T LC监测反应，16h后反应结束，过滤除去Pd/C，将滤液滴入水中，析出白色固体，过滤，得产物450mg，收率78.43％。
化合物6(5,11,17,23-tetra-amino-25,27-bis-hexyloxy-26,28-bis-[N-(2-hydroxyethyl)ami nocarbonylmethoxyl]-calix[4]arene)，白色固体，m.p.＞200℃,1HNMR:(DMSO-d6,400MHz)δ8.45(s,1H),6.48(s,2H),6.42(d,J＝6.4Hz,1H),6.34(s,2H),6.11(d,J＝2Hz,2H),5.99(d,J＝2.4Hz,2H),5.43(t,J＝5.2Hz,1H),4.88(t,J＝4.8Hz,1H),4.75-4.65(m,8H),4.25(s,4H),3.93-3.85(m,4H),3.79-3.71(m,4H),3.61-3.54(m,4H),3.46-3.41(m,4H),3.08-2.03(m,2H),2.90-2.82(m,2H),1.61-1.54(m,4H),1.30-1.17(m,12H),0.86(t,J＝6.4Hz,6H)；13C NMR:(CD3OD,100MHz)δ167.93,149.28,143.40,137.80,136.44,135.49,135.36,117.98,117.58,117.46,116.73,75.92,72.72,68.45,61.19,42.96,39.19,32.98,31.80,30.90,26.90,23.80,14.46；HRMS(ESI)Calcd forC48H66N6O8([M+Na]+):877.4840,found:877.4852.
⑥CA的合成
化合物6(100mg，0.11mmol)加入5mL THF和1mL DMF混匀。取DIPEA 130μL加入至反应瓶中，继续向其中加入溶于5mL THF中的mPEG550-NHS(300mg，0.5mmol)，室温搅拌反应过夜。TLC监测反应。24h反应结束。将反应液置于3000kDa的透析袋中，以1000mL纯水透析24h，取透析液冷冻干燥，得淡黄色产物284mg。
CA的1H NMR谱图如图1所示，其中，0.9–1.7ppm为下缘己基链中-CH2CH2CH2CH2CH3的H原子的化学位移；3.00-4.10ppm出现的多重吸收峰包含了PEG550中-OC H2CH2-以及原有的Ar-CH2-Ar及下缘-CONHCH2CH2-和-COCH2的化学位移；5.90-7.50ppm归属于分子中苯环上H的化学位移；9.00ppm处出现的吸收峰归属于反应后生成的PEG550-CONH-Ar；原先在4.50ppm处出现的归属于NH2-Ar的吸收峰消失，这说明上缘四个-NH2全部参加了反应。这些结果表明，成功合成了化合物CA。
实施例2：杯芳烃载药胶束的制备
①称取阿霉素盐酸盐(DOX)20mg溶于10ml蒸馏中，室温下，缓慢滴加三乙胺调节pH到7.4左右。经过滤干燥得到阿霉素固体粉末。
②称取化合物CA 20mg，溶于2mL DMSO中，搅拌使之充分溶解。
③称取DOX 4mg，DSPE-PEG2000-FA 2mg将其置于②中的DMSO溶液中，充分混匀并搅拌溶解。
④将DMSO溶液装入透析袋(MWCO:1000Da)中，以1000mL蒸馏水为透析外液透析24h(每隔12h换水)，除去DMSO和其他杂质。
⑤收集透析液，5000r/min离心，除去未包载的DOX沉淀，即得载药胶束FA-CA-DOX溶液，冻干保存。
实施例3：杯芳烃载药胶束的表征
①采用TEM(Tecnai G2 Spirit Twin)测定载药胶束FA-CA-DOX的形态。
样品制备方法：取适量CA浓度为1mg/mL的载药胶束和空白胶束溶液滴加到铜网上，静置10min后，用滤纸将多余溶液吸走，取适量4％醋酸双氧铀滴到铜网上，静置2min，用滤纸将多余溶液吸走，在室温条件下使铜网自然晾干后检测。TEM下观察，如图2所示，胶束呈球形，载药后粒径有所增大。
②粒径、Zeta电位、多分散指数和载药量
将载药胶束FA-CA-DOX和空白胶束FA-CA用PBS(pH7.4,0.05mol/L)稀释至1mg/mL，在25℃下，用纳米粒度-Zeta电位测定仪测定粒径、Zeta电位和多分散指数。
取载药胶束FA-CA-DOX的冻干粉10mg，溶于8ml DMSO中，用酶标仪测定490nm处的吸光度，按DOX标准曲线计算DOX的含量。载药量(DLC)的计算公式如下：
Figure BDA0002105120930000101
表1 FA-CA和FA-CA-DOX的粒径、Zeta电位、多分散指数和载药量(n＝3)
Figure BDA0002105120930000102
a.多分散指数.
b.通过酶标仪在490nm波长下所测结果；“-”表示无结果。
通过表1可见，所得胶束的平均粒径在80nm左右，该尺寸的纳米粒子可以通过EPR效应被动富集于肿瘤部位，具有被动靶向性。另外，载药量达到6.85％左右，已经满足递药需求。
③不同pH条件下体外药物释放
DOX标准曲线的建立：
取DOX适量，用甲醇溶解，分别稀释成0.3mg/L、1.5mg/L、3mg/L、4.5mg/L、6mg/L、7.5mg/L、9mg/L、10.5mg/L、12mg/L、13.5mg/L、15mg/L待测液，过0.22μm滤膜后，高效液相色谱仪(HPLC)进样测定，以DOX色谱峰面积对DOX浓度作图，绘制标准曲线。HPLC参数：色谱柱：Agilent TC-C18(4.6×250mm，5μm)，检测波长：254nm，流动相：乙腈：水(1:1)，流速1mL/min，进样量20μL，柱温37℃。
体外药物释放曲线的测定：
取载药胶束FA-CA-DOX冻干粉适量，用0.15mol/L，pH 7.4的PBS缓冲液分散，取1mLFA-CA-DOX溶液置于透析袋(MWCO:10KDa)内。将透析袋浸没于装有5mL不同pH(pH6.5，pH7.4)的0.15mol/L PBS缓冲液(含3％SDS)的玻璃瓶中，每组三个平行样。将准备好的样品置于37℃恒温振荡器中，以100rpm的速率振动。在预定取样时间取透析外液5mL，过0.22μm滤膜后，HPLC进样测定，同时向瓶中补充5mL新鲜缓冲液。以不同pH下的累积释放率对时间作图，绘制载药胶束的体外释放曲线。
如图3所示，生理pH条件下，48h药物释放了约20％；而在pH 6.5的微酸性环境中48h的累计药物释放量可至85％，远大于pH 7.4条件下的释放量。此结果表明本研究所制备的杯芳烃胶束具有一定的pH响应性，在微酸性条件下(接近肿瘤部位pH)，会迅速释放所载药物。
④稳定性研究
取新制FA-CA-DOX，置于4℃冰箱保存，在预定时间分别取1mL，用纳米粒度-Zeta电位测定仪测定其粒径，考察粒径随贮存时间的变化情况，以确定FA-CA-DOX的稳定性。
结果如图4所示，在4℃保存48h，载药胶束的粒径变化不大，说明FA-CA胶束在体外具有良好的稳定性。
实施例4：细胞摄取行为研究
①定性细胞摄取研究
用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-异硫氰酸荧光素(DSPE-PEG2000-FITC)标记载体后，在倒置荧光显微镜下观察共孵育4h后，HeLa细胞对载体的摄取效果。
结果如图5所示，HeLa细胞可以在4h内充分摄取载药载体。另外，叶酸分子的引入，使细胞摄取载体的速率明显提高，这一现象可能与叶酸-叶酸受体的相互作用有关。
②细胞摄取机制研究
采用加入摄取抑制剂的方式，观察细胞摄取变化，初步探究细胞对载体的摄取机制。所选抑制剂主要包括：叠氮化钠(ATP抑制剂)、秋水仙碱(微管抑制剂)、盐酸氯丙嗪(网格蛋白抑制剂)、制霉菌素(小窝蛋白抑制剂)、叶酸。
FA-CA-DOX样品溶液的配制：
取FA-CA-DOX冻干粉末适量，用pH7.4的PBS溶解，再用细胞培养基稀释至100μg/mL(以DOX计)。
抑制剂的配制
用细胞培养基配制各抑制剂至标准浓度(盐酸氯丙嗪10μg/mL、叠氮化钠1mg/mL、秋水仙碱50μg/mL、制霉菌素6μg/mL、叶酸10μg/mL)
测定方法：
细胞培养24h后，除去96孔板内细胞培养基，以3孔为一组，每组加入100μL含有不同摄取抑制剂的培养基溶液，与细胞共孵育2h后，除去一半板内含有抑制剂的培养基，加入100μL配制好的样品(FA-CA-DOX)溶液。在37℃，5％CO2条件下共孵育4h后，除去上清液，用RIPA裂解液裂解细胞，用酶标仪在490nm波长下检测吸光度，比较各组细胞药物摄取的差别，平行重复3次。
如图6所示，结果表明，本发明所制备的载体，其被细胞摄取的过程与微管蛋白、网格蛋白和叶酸受体有密切联系。
实施例5：抗肿瘤活性与安全性研究
SRB法：细胞以含10％胎牛血清的培养液培养，使细胞一直处于对数生长期。细胞接种于96孔培养板，密度1-5×10 4/ml。37℃，5％CO2培养箱预培养24小时，药物设5－7个浓度，每个浓度设3个复孔，连续作用72小时。药物作用结束后，用三氯乙酸(TCA)固定细胞，清洗后加入SRB工作液，洗涤，用Tris base溶解与蛋白结合的SRB，SPECTRAmax 190细胞标仪515nm波长下测定每个小孔的OD值。空白对照孔加20μl培养液。根据OD值，计算细胞生长抑制率：
抑制率(％)＝(对照组OD值-用药组OD值)/对照组OD值×100％
相关结果见图7、图8、图9和表2：首先，空白载体和前体化合物7分别与不同种类的肿瘤细胞共孵育培养72h后，各组均展现出了剂量依赖的细胞毒性，随着给药浓度的不断提高，细胞毒性不断增强。说明本发明所制备的杯芳烃衍生物具备较好的抗肿瘤效果。其次，不同浓度的载药载体与HepG2细胞共孵育72小时后，对肿瘤细胞的抑制活性明显优于游离药物DOX，这说明载药后，DOX的药效得到了提高。对DOX和空白载体的相互作用指数进行计算，发现在中低浓度下，DOX与空白载体存在抗肿瘤的协同作用。最后，我们发现25μM的空白载体与前体化合物7在与HUVEC细胞共孵育72h后，并未影响HUVEC细胞的细胞活性，说明本发明中的载体材料具有良好的安全性。
Table 2空白载体和DOX的相互作用
Figure BDA0002105120930000121
a.CDI＝AB/(A+B),其中，A和B是单独使用每种药物时的细胞活性，AB是两种药物组合时的细胞活性。当CDI<1时，两种药物具有协同作用，CDI＝1，两种药物具有叠加效应，当CDI>1时，两种药物具有拮抗作用。

Claims (16)

1.式(I)所示杯[4]芳烃类衍生物：
Figure FDA0003890684000000011
其中，R1为C1～C15的烷基，R2为聚乙二醇400～聚乙二醇2000。
2.根据权利要求1所述的杯[4]芳烃类衍生物，其特征在于，R1为C1～C10的直链烷基。
3.根据权利要求1所述的杯[4]芳烃类衍生物，其特征在于，R2为聚乙二醇500～聚乙二醇1000。
4.根据权利要求1所述的杯[4]芳烃类衍生物，其特征在于，R1为己基，R2为PEG550。
5.权利要求1所述的杯[4]芳烃类衍生物的制备方法，
Figure FDA0003890684000000012
6.权利要求1所述的杯[4]芳烃类衍生物在载药方面的应用。
7.权利要求1所述的杯[4]芳烃类衍生物为材料制备的杯芳烃载药胶束。
8.权利要求7所述的杯芳烃载药胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将式(I)所述的杯[4]芳烃类衍生物溶于有机溶剂得溶液B；
b.取二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸和抗癌药物A，加入至溶液B中，混合均匀得溶液C；
c.将溶液C用蒸馏水透析，离心，将上清液冷冻干燥，得杯芳烃载药胶束。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤a中有机溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或丙酮；步骤b所获得的溶液C中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与杯[4]芳烃类衍生物的质量比为1：8～12；步骤b所获得的溶液C中，固体粉末A与杯[4]芳烃类衍生物的质量比为1：3～8；步骤c中透析时间为20～28h；离心转速为7000～10000r/min。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤b所获得的溶液C中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸与杯[4]芳烃类衍生物的质量比为1:10。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤b所获得的溶液C中，固体粉末A与杯[4]芳烃类衍生物的质量比为1:5。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤c透析过程需要避光。
13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，离心转速为8000r/min。
14.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤b中所用的抗癌药物A为脂溶性且非水溶性的药物，或者难溶性药物的水溶性盐；当选择难溶性药物的水溶性盐时，需要称取难溶性药物的水溶性盐溶于水中，加碱调节pH至7～7.6，过滤干燥得到抗癌药物A。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤b中所用的抗癌药物A为阿霉素、紫杉醇、长春新碱或依托泊苷。
16.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，用于调节pH的碱为三乙胺、二氮杂二环、氢氧化钠或碳酸氢钠。
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