WO2013060919A1 - Sintesis controlada de poliglutamatos con baja polidispersidad y arquitecturas versátiles - Google Patents

Sintesis controlada de poliglutamatos con baja polidispersidad y arquitecturas versátiles Download PDF

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WO2013060919A1
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María Jesús VICENT DOCÓN
Matthias BARZ
Fabiana CANAL
Inmaculada CONEJOS SÁNCHEZ
Aroa DURO CASTAÑO
Richard Mark ENGLAND
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Fundación De La Comunidad Valenciana "Centro De Investigaciones Principe Felípe"
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Definitions

  • the present invention relates to the control of the polymerization of ⁇ -amino acid N-carboxyanhydrides (NCAs) through the use of non-nucleophilic salts in order to obtain highly versatile polymer architectures, with low polydispersity indices, (homopolymers, diblock polymers, triblock or multiblock systems), as well as processes for preparing them and their use in pharmaceutical compositions and / or as an image diagnostic agent.
  • NCAs ⁇ -amino acid N-carboxyanhydrides
  • An ideal polymer to be used as a carrier in the transport of drugs or agent for the diagnosis of image should be characterized by having (i) biodegradability or a suitable molecular weight that prevents its progressive accumulation in vivo, (ii) low polydispersity, so that ensure an acceptable homogeneity of the final system allowing to adjust its pharmacokinetic properties; (iii) elevated time of residence in the body, to prolong the action of the conjugate or allow its distribution and accumulation in the desired compartments of the body (therefore, high molecular weights are preferred) and (iv) in the case of protein conjugation , a single reactive group to avoid crosslinking reactions, while in the case of conjugation of small drugs, it is preferable that the carrier contains several reactive groups that allow modulating and optimizing the drug load (multivalence).
  • Ring-opening polymerization (ROP of the English acronym “ring-opening polymerization") of amino acid N-carboxyanhydrides (NCAs) is the broadest and most commonly applied polymerization technique to obtain multi-scale polypeptide-based block polypeptides and block copolymers. Although the polymers obtained are less defined than the peptides produced by a natural organism, this polymerization method allows access to polymer architectures that are above the possibilities of nature.In addition, the ring opening of NCAs already It has been used in several applications within different fields of science. These applications range from the development of drug transport systems or molecular imaging agents to 2 "6 surface coating materials
  • polyglutamic acid PGA
  • paclitaxel Opaxio®
  • the polymer-drug conjugate is in the clinical phase 11, 7 9 which demonstrates the importance of the NCAs polymerization method for the preparation of defined synthetic polypeptides.
  • Polyglutamic acid is a promising material for the design of nanomedicines due to its high biocompatibility, multivalence and its in vivo degradability mediated by thiol proteases (Cathepsin B). 10-1 1
  • HMDS hexamethyldisilazane amines
  • the anion generated in the NCA is nucleophilic enough to initiate the oligomerization of NCAs.
  • the NCA-N-aminoacyl derivatives formed in the process can both be added to the propagation chain and carry out self-condensation processes, the latter producing high molecular weights at high to high monomer conversions. Because the primary amines can act as nucleophiles and as bases, the polymerization process will always oscillate between both mechanisms, "normal amine” and "activated monomer”.
  • Knobler et al 31, 32 avoid the mechanism of the "activated monomer” with the simple addition of an acid, so as to induce the reprotonation of the eventually formed NCAs.
  • These authors investigated the stoichiometric reaction between NCAs and the hydrochloric salts of primary amines for the preparation of aminoacyl derivatives.
  • Schlaad et al Used this method to prepare hybrid copolymers of a defined nature based on polystyrene. twenty-one
  • NAM 1 100 77 41 0.38 3 77 20.3 25.4 1.2
  • the object of the present invention is to increase the degree of polymerization (GP), obtain structural versatility and decrease the polydispersibility index (IPD) of the polypeptides obtained by polymerization of N-carboxyanhydrides of amino acids (NCAs).
  • the present invention provides a method of obtaining polyglutamates in which a non-nucleophilic anion such as tetrafluoroborane is used.
  • a non-nucleophilic anion such as tetrafluoroborane is used.
  • side reactions based on the nucleophilic character of the counterion have been effectively suppressed.
  • control over the terminal groups of the polymer has been increased, allowing the synthesis of homopolymers, diblock polymers, triblock or multiblock systems with a wide variety of molecular weights, varying both the number of side chains and the functional groups introduced therein.
  • FIGURE 1 1 H-NMR spectrum of y-benzyl L-glutamate N-Carboxyanhydride (NCA).
  • FIGURE 2 1 H-NMR spectrum of the polymerizations made with the n-butyl tetrafluoroborane salts at different proportions of the ratio [M] / [1] in DMF.
  • FIGURE 3 Representation of the ratio [M] / [l] against the Mn obtained by GPC.
  • FIGURE 4 Elution diagrams obtained by GPC of several polyglutamates with different molecular weights.
  • FIGURE 6 1 H-NMR spectrum of a PGA derivative modified with propargilamine.
  • FIGURE 7 1 H-NMR spectrum of a PGA derivative modified with oligoEG-azide groups.
  • FIGURE 8 1 H-NMR spectrum of a copolymer resulting from the coupling between PGA-propargilamine with NH 2 PEG (2) N 3 .
  • Confocal microscopy in vivo in HeLa cells at different incubation times (5 min, 30 min, 1 h, 2 h and 5 h). The images correspond to the internalization of TB-OG (green) in the presence of lipid membrane marker (red) at 1 h and 5 h.
  • FIGURE 11 B Cellular internalization kinetics with synthesized triblocks marked with Oregon green. Confocal microscopy in vivo in HUVEC cells with TB-OG200_TP at 2h incubation. Lysosomal marker Dextran Texas Red (red).
  • FIGURE 12A Measures of serum fluorescence by spectrofluorimeter at the different slaughter times of the animal and the subsequent treatments of the serum: direct measurement of the serum ((1), measurement of the supernatant after homogenization with HCI0 4 (M), measured after washing the pellet with methanol (II) and measuring after washing the pellet with acetonitrile ( ⁇ ).
  • FIGURE 12B Fluorescence measurements of the different homogenated organs (liver, kidney, intestine, spleen, brain, muscle, cerebellum and lung) after 4 and 24 hours post injection.
  • FIGURE 13 Image obtained using IVIS®Spectrum. DB100-Cy5.5 4h monitoring after injection. Renal elimination of the polymeric carrier. (A) Dorsal position (B) Ventral position.
  • FIGURE 14A Magnetic resonance imaging of the rat's head before injection of compound TB800-DTPA / Gd
  • FIGURE 14B Magnetic resonance imaging of the rat's head after injection of compound TB800-DTPA / Gd.
  • a first aspect of the present invention is focused on providing a methodology for obtaining a controlled polymerization of N-carboxyanhydrides of ⁇ -amino acids through the use of non-nucleophilic salts, specifically with the tetrafloruroborane ammonium salt. Said method is represented by the general formula detailed below:
  • ammonium tetrafluoroborane salts can be prepared by a simple methodology that includes the reaction of the corresponding amine with the HBF 4 OEt 2 tetrafluoroboric acid complex, followed by a simple purification process and subsequent storage without detecting decomposition or impurities in the product final.
  • Another aspect of the present invention relates to the different di- or tri-block systems, which have an additional point of conjugation with a suitable functional group to allow a specific subsequent connection.
  • the general structure of the di- and tri- blocks is described below:
  • R1 represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids), ethylene glycol (EG) of different molecular weights including polyethylene glycol (PEG, from 100 to 20000g / mol).
  • EG polyethylene glycol
  • R2 represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids), ethylene glycol (EG) of different molecular weights including polyethylene glycol (PEG, from 100 to 20000g / mol), PEG-thiol, PEG-4TP.
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • amino acids such as lysine, arginine, imidazole and histidine, cysteine and secondary and tertiary amino groups.
  • x represents units of monomers included in definition R1 from 1 to 500 and represents the number of modified glutamic units with the R3 group in the polymer, from 1 to 500 z represents the number of unmodified glutamic units in the polymer, from 1 to 1000 p represents monomer units included in definition R3, from 1 to 500
  • R2 and R3 can be used for the conjugation of bioactive agents (including low molecular weight drugs, peptides, proteins, antibodies), near infrared fluorescent probes, coordination complexes for MRI, PET and SPECT probes.
  • bioactive agents including low molecular weight drugs, peptides, proteins, antibodies
  • near infrared fluorescent probes including near infrared fluorescent probes, coordination complexes for MRI, PET and SPECT probes.
  • treatment includes treatment, prevention and control of such condition and the term “pharmaceutically acceptable” as used herein refers to those compounds, compositions and / or pharmaceutical forms. which are, within the scope of the medical criteria, suitable for use in contact with the tissues of humans and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response or other problem or complication, in accordance with a reasonable risk / benefit ratio.
  • R represents the n-butylamine group
  • R1 represents m-PEG
  • R2 represents PEG which optionally possesses a functional terminal group (including -OH, -SH, -SS-4TP, any derivative -S- protected, -NH 2 , alkyne, azide, or maleimide).
  • R3 may be represented by EG-alkyne, EG-azide, alkyl, optionally substituted. Also R3 it may represent- (CH 2 ) 2-phenyl optionally substituted with one or more halogen substituents, and in another embodiment R3 represents coordination complexes, such as Gd-DTPA or Ga-DOTA, Tc-DTPA, Cu-polyamine.
  • polyglutamic acid includes the poly-L-glutamic and / or poly-D-glutamic varieties, and in another embodiment of the invention the polyglutamic acid is poly-L-glutamic acid.
  • the present invention relates to the process of preparing the new compounds described above, their derivatives, analogs, tautomeric forms, stereoisomers, polymorphs, their pharmaceutically acceptable or solvated salts thereof.
  • the polymers of the present invention are carriers designed for the transport and administration of drugs and / or agents for molecular imaging techniques. Therefore, they are useful tools for the diagnosis, treatment or prevention of pathologies depending on the conjugate load.
  • the polymers and their conjugates derived by the present invention can be administered in the form of any pharmaceutical formulation.
  • the pharmaceutical formulation will depend on the nature of the active compound and its route of administration. Any route of administration may be used, for example, oral, oral, pulmonary, topical, parenteral (including subcutaneous, intramuscular and intravenous), transdermal, ocular (ophthalmic), inhalation, intranasal, optical, transmucosal, implant or rectal administration. .
  • Injectable preparations for parenteral administration comprise sterile solutions, suspensions or emulsions in oily or aqueous vehicles and may contain adjuvants, such as suspending, stabilizing or tonicity agents or dispersing agents.
  • the compounds can also be formulated for topical application. Formulations include creams, lotions, gels, powders, solutions, shampoo preparations, oral paste, mouthwash preparations and patches, in which the compound is dissolved or dispersed in suitable excipients.
  • the pharmaceutical composition is in the form of nanospheres, microparticles and nanoparticles.
  • NCA y-benzyl L-glutamate
  • NCAs ⁇ -amino acid N-carboxyanhydrides
  • Leuchs method is based on the delation of halides of N-alkoxycarbonyl amino acids to form NCAs.
  • Fuchs-Farthinge method involving the direct phosgenation of unprotected ⁇ -amino acids, as detailed in the diagram below.
  • Phosgene could have been used in the reaction, however it would provide a lack of stoichiometric control and in addition the excessive use of phosgene produces the generation of contaminants such as hydrochloric salts of the amino acid chlorides formed by the cleavage of the NCA ring by HCI, which It can be phosgenated in a second step to give rise to ⁇ -isocyanate acid chlorides. Both by-products are critical in the polymerization of NCAs and give rise to wide molecular weight or even multimodal distributions.
  • the mechanism of the reaction involves the direct phosgenation of unprotected a-amino acids. Delation takes place through the formation of N-chloroformyl amino acid intermediates and the subsequent loss of a second HCI molecule results in NCA.
  • the reaction generates 2 equivalents of HCI per NCA molecule.
  • HCI can initiate self-degradation of the NCA monomer.
  • limonene has been incorporated into the reaction conditions to neutralize the HCI by addition to the double bonds of the molecule. Amines or other strong bases cannot be used because they would attack the monomer formed, leading to its decomposition.
  • limonene (almost non-nucleophilic / basic) acts as an HCI neutralizer.
  • the following scheme shows the mechanism of action of limonene.
  • limonene (1 1.6 mL, 71.66 mmol, 1 Eq) was added to the suspension, continuing stirring before adding the corresponding amounts of diphosgene (5.2 mL, 8.5g, 43 mmol, 0.6 Eq) dissolved in THF (10 mL, anhydrous) by an addition funnel over a period of 10 minutes.
  • the reaction was allowed to stir for 2 hours at 60 ° C with constant purging of Ar, resulting in a completely clear solution.
  • the reaction mixture was bubbled with Ar to remove the remaining HCI for 2 hours, while the Ar outlet was directly connected to a 1 M solution of NaOH to neutralize the gas.
  • reaction volume was concentrated to a quarter of the original volume and 32 mL of ethyl acetate was added.
  • the reaction content was precipitated in cold hexane (200 mL) to give rise to a white precipitate that was isolated by filtration and washed with cold hexane.
  • the solid was recrystallized from toluene (50 mL, anhydrous) and THF (30 mL, anhydrous), under an inert atmosphere (N 2 or Ar) using a round bottom flask with two 250 mL mouths fitted with a magnetic stirrer, a column of reflux and an argon outlet and inlet, inducing crystallization by dropwise addition of cold hexane (27 mL).
  • the solution was stored for one hour at 4 ° C and then at -20 ° C overnight. Finally, the white crystals formed were filtered under conditions of inert atmosphere using Schlenk techniques and stored at -20 ° C.
  • N-Butylamine 200 mg, 2.7 mmol was dissolved in 1 ml_ of diethyl ether, and 442 mg (2.7 mmol) of tetrafluoroboric acid complex, HBF 4 . Et 2 0, were added to the solution to result in the formation of a white solid in almost quantitative yield.
  • the product was filtered and recrystallized twice from ethyl acetate. Subsequently, the product was dried under high vacuum and stored at -20 ° C. Yield: 80-90%.
  • MeO-PEG (2000) -amine (600 mg, 0.3 mmol, 1892 g / mol) was dissolved in 2 ml_ of THF and 53.4 mg (0.3 mmol, 45 ⁇ _) of the tetrafluoroboric acid complex, HBF 4 , was added to the solution. Et 2 0, resulting in the formation of a slightly yellow salt in quantitative performance. After removing the solvent, the product was dried under high vacuum and stored at -20 ° C.
  • the white solid was dissolved in 5 ml of the corresponding freshly distilled solvent.
  • the initiator was added and the reaction mixture was allowed to stir at 40 ° C in an oil bath for 3 days under conditions of inert atmosphere. After three days of reaction, the solution was precipitated in 40 ml_ of cold ether resulting in a white solid in suspension that was centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes. After removing the supernatant, the solid was suspended in milliQ water and lyophilized.
  • Points were taken for the construction of polymerization kinetics at following times: 14, 22, 38, 46, 70, and 96 hours, for precipitation of the polymers in diethyl ether three times, lyophilization of the sample in water, and analysis of the molecular weight by GPC eluting with DMF / LiBr.
  • table 3 shows some results obtained in different polymerizations with several initiators based on salts of BF4-, two of them are small initiators, such as n-butylammonium tetrafluoroborane or neopentylammonium, which give rise to homopolymers of glutamate, and a macroinitiator based on methoxypolyethylene glycol of molecular weight close to 2,000 and PDI: 1.03, giving rise to hybrid copolymers diblock PEG-poly (y-benzyl glutamates).
  • small initiators such as n-butylammonium tetrafluoroborane or neopentylammonium, which give rise to homopolymers of glutamate, and a macroinitiator based on methoxypolyethylene glycol of molecular weight close to 2,000 and PDI: 1.03, giving rise to hybrid copolymers diblock PEG-poly (y-benzyl glutamates).
  • the neopentilamonium initiator was used by replacing that of n-butylamine in order to facilitate the characterization of the polymer by 1 H-NMR thanks to a better allocation of the resulting degree of polymerization. This is due to the presence of 9 chemically equivalent protons in the initiator (those belonging to the three methyl groups) which leads to an increase in the sensitivity of the polymer characterization by H-NMR.
  • P polymer; [M] / [l]: Initiator monomer ratio; DP: degree of polymerization (% of [M] / [l];) Mw: average molecular weight by weight; Mn: number average molecular weight; PDI: polydispersity index (ratio Mw / Mn that provides a measure of dispersion D) and DP has been calculated as follows:
  • NCA polymerizations polymerization in DMF with tetrafluoroborane n-butylammonium, neopentylammonium and mPeg (2000) ammonium initiators at 40 ° C.
  • n represents the number of y-benzyl glutamate units in the polymer, from 1 to 1000 The amounts commonly used for each polymerization are between 0.5-1 gram of monomer.
  • the first is the use of an acid medium such as HBr / TFA, the second using sodium hydroxide in a mixture of THF / water at low temperature and the third, the use of hydrogen reduction atmosphere with Pd (OH) 2 / C as a catalyst
  • the three methods resulted in the complete deprotection of the benzyl groups, however, the last option is restricted to polyglutamates of molecular weight less than 10 kDa and also requires the removal of the catalyst which leads to low yields.
  • the polymers were characterized by 1 H-NMR and by polarimetry until constant ⁇ values of -0.6 were achieved.
  • the triblock (TB) systems of the present invention were obtained by the reaction between the PEG-PGA diblock (DB), previously obtained using n-PEG (2000) in its ammonium tetrafluoroborane salt as initiator, and a functionalized PEG derivative with an activated carboxyl group such as-NHS.
  • DB PEG-PGA diblock
  • n-PEG (2000) in its ammonium tetrafluoroborane salt as initiator
  • a functionalized PEG derivative with an activated carboxyl group such as-NHS.
  • X represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids)
  • m represents the number of ethylene glycol units in the PEG polymer fragment used as the first block, from 1 to 500
  • n represents the number of y-benzyl glutamate units of the peptide block.
  • 1 to 1000 p represents the number of ethylene glycol units in the PEG polymer fragment of the third block, from 1 to 500
  • TB50 was dissolved in 5-7mL of trifluoroacetic acid (TFA). After complete dissolution, HBr 48% w / v in acetic acid was added to the reaction flask. The mixture was left under stirring for 16 hours. Then, the polymer was precipitated on cold diethyl ether. After 2h at -20 ° C, the precipitated polymer was recovered after centrifuging the mixture at 4000rpm for 1 minute at 4 ° C. The unprotected triblock (TBd) was stored after being dried under vacuum.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the compound was dissolved in an equivalent amount of 1 M NaHC0 3 and distilled H 2 0.
  • the solution was purified by size exclusion chromatography (SEC, Sephadex G25) using distilled H 2 0 as eluent. 50 fractions of 3ml_ each were collected (with the exception of the first and second aliquots of 10ml_ each). The fractions were lyophilized and subsequently analyzed by 1 H-NMR in D 2 0.
  • the synthesis of the triblock or diblock is carried out by conjugating a bifunctional PEG unit.
  • PEG-PGA or n-BuPGA are obtained by reacting the NCA-L-Glu-OBn monomer with the MeO-PEG-NH 3 BF 4 or nBuBF 4 initiator, respectively.
  • the obtained diblock is in its protected form and the protective groups -OBn are eliminated in the previous step to the introduction of the new polymer block.
  • This second PEG block is a bifunctional derivative COOH-PEG-SH whose terminal groups are activated for the final obtaining of NHS-PEG-SS-4TP. This double activation, prior to the conjugation step to the polypeptide block, is carried out to ensure high yields and avoid cross-linking reactions.
  • This last block gives the final structure of the TB (or of the DB in the case of nBuPGA) an additional point of semi-metallic conjugation capable of providing specific and selective conjugations to the activated activated functional group, by means of the formation of disulfide bridges.
  • X represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids)
  • m represents the number of ethylene glycol units in the PEG polymer fragment used as the first block, from 1 to 500 n represents the number of y-benzyl glutamate units of the peptide block, from 1 to 1000
  • p represents the number of ethylene glycol units in the PEG polymer fragment of the third block from 1 to 500 In a 50ml_ round bottom flask, 1 g of DB previously unprotected
  • the pH of the mixture was adjusted to 8.0 with DIEA (1.5ml_ in this example) and left under stirring at room temperature and inert atmosphere for 72h.
  • n represents an alkyl group, for example n-butylamine, neopentyl amine; a carbon chain (saturated and / or unsaturated) with and without the presence of electronegative atoms (ie O in PEG-NH2)
  • X represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids).
  • n represents the number of y-benzyl glutamate units of the peptide block, from 1 to 1000
  • the functional group -SS-4TP will allow, in both TB and DB-SS-4TP, the subsequent conjugation of active ligands including peptides, proteins or antibodies via a disulfide bridge bond.
  • R1 represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids), ethylene glycol (EG) of different molecular weights including polyethylene glycol (PEG, from 100 to 20000g / mol).
  • EG polyethylene glycol
  • R2 represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids), ethylene glycol (EG) of different molecular weights including polyethylene glycol (PEG, from 100 to 20000g / mol), PEG-thiol, PEG-4TP.
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • amino acids such as lysine, arginine, imidazole and histidine, cysteine? and secondary and tertiary amino groups.
  • the solution was purified by SEC (Sephadex G25 / PD10) using ddH 2 0 as eluent
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • R2 represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids), ethylene glycol (EG) of different molecular weights including polyethylene glycol (PEG, from 100 to 20000g / mol), PEG-thiol, PEG-4TP.
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • amino acids such as lysine, arginine, imidazole and histidine, cysteine? and secondary and tertiary amino groups.
  • x represents units of monomers included in definition R1 of 1 at 500 and represents the number of modified glutamic units with the group R3 in the polymer, from 1 to 500 z represents the number of unmodified glutamic units in the polymer, from 1 to 1000 p represents monomer units included in definition R3 , from 1 to 500
  • Post-polymerization modification can represent an attractive approach to the synthesis of functional polymers, overcoming the limitations in many controlled polymerization techniques, the incompatibility of the presence of various functional groups in many controlled polymerization techniques. Due to all the advantages set forth in the methodology described above for the polymerization of NCAs, a post-polymerization modification process of the well-defined polymers obtained in the various polymerizations was subsequently carried out with a view to incorporating functionalities for specific conjugations a posteriori.
  • PEGylation is a technique well known as the process of covalent introduction of PEG polymer chains to another molecule, usually a drug or a therapeutic protein.
  • Covalent binding of PEG to a therapeutic drug or protein can "mask" the agent by hiding it from the host's immune system (reducing immunogenicity and antigenicity), increasing the hydrodynamic radius of the corresponding agent (size in solution), which prolongs its circulation time reducing renal excretion.
  • PEGylation can also provide water solubility of hydrophobic drugs and proteins.
  • the introduction of PEG units in the polymer chain will not only allow us to introduce a PEG spacer between the polymer and the corresponding bioactive agent, but can also modify in vivo behavior, biodistribution and therapeutic application.
  • the modification with azide and alkyne groups was chosen in order to obtain suitable functional groups for conjugation through click chemistry of various bioactive agents with all the benefits that this type of conjugation chemistry offers.
  • the product was purified or by ultrafiltration (using a 3000 molecular weight size membrane) or SEC (size exclusion chromatography) through a G25 sephadex column.
  • the product can be purified by acid / base precipitation. After lyophilizing the sample in any of the cases, an amorphous white solid was obtained.
  • This activated ester subsequently reacts with the corresponding amine.
  • the reaction scheme is shown below.
  • n represents the number of glutamic units, from 1 to 1000 x represents the number of glutamic units modified with propargilamine, from 1 to 1000
  • This method is based on the fact that PGA is insoluble in water when it is protonated as a carboxylic acid, and is completely soluble when it is forming the sodium salt. Therefore, since all reaction by-products are soluble in water, the polymer can be purified by precipitation in acidic water (pH ⁇ 3-4) and redisolution by basification with a solution of sodium bicarbonate. The process is repeated three times to give rise to a white polymer after lyophilizing the sample.
  • the content of alkyne groups in the polymer was determined by integrating the corresponding propargilamine signals in the 1 H-NMR spectrum in deuterated water compared to the corresponding PGA signals. Specifically, the peak at 3.81 ppm corresponds to the two protons of the CH 2 groups of the propargilamine residue and the signal at 2.48 ppm corresponds to the acetylenic proton of the propargilamine residue in the polymer.
  • the% substitution in each polymer can be calculated.
  • Figure 6 is attached as an example of 1 H-NMR. Different polymers with different degrees of substitution were synthesized. The degree of substitution according to the H-NMR signals was approximately 60% of that expected by the added equivalents. The results are summarized in the table below.
  • the resulting molecular weight was calculated taking into account the% units of glutamic acid (GA).
  • n represents the number of glutamic units
  • 1 to 1000 x represents the number of glutamic units modified with ethylene glycol, from 1 to 1000
  • the molecular weight of the resulting copolymers was calculated based on the molecular weight of the oligoethylene glycol units in each case. PEGylation of PGA.
  • n represents the number of glutamic units
  • 1 to 1000 x represents the number of glutamic units modified with Ethylene Glycol 1 to 1000
  • n represents the number of glutamic units
  • 1 to 1000 x represents the number of glutamic units modified with proparglamine, 1 to 1000
  • n represents the number of glutamic units
  • 1 to 1000 x represents the number of glutamic units modified with Ethylene Glycol 1000
  • Gadolinium / gallium complexes such as Gd-DTPA, Ga-DOTA or its derivatives are routinely used as contrast agents in the MRI (MRI, Magnetic Resonance Imaging) or PET (PET, Positron Emission Tomography) technique, respectively .
  • the percentage of Gd or Ga introduced depends directly on the number of glutamic units of the peptide block.
  • complexing units such as DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) or DOTA (1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-1, 4,7, 10-teraacetic acid).
  • the carboxyl groups of the PGA are functionalized with a monoprotected diamine, in order to have an available NH 2 group (after deprotection) for the formation of amide bonds with the DTPA dianhydride or DOTA.
  • Monoprotected di-amine prevents cross-linking processes.
  • the percentage of Gd or Ga can be easily optimized depending on the needs of the analysis equipment.
  • R1 represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids), ethylene glycol ( EG) of different molecular weights including polyethylene glycol (PEG, from 100 to 20000g / mol).
  • R2 represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids), ethylene glycol (EG) of different molecular weights including polyethylene glycol (PEG, from 100 to 20000g / mol), PEG-thiol, PEG-4TP.
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • amino acids such as lysine, arginine, imidazole and histidine, cysteine? and secondary and tertiary amino groups.
  • x represents units of monomers included in definition R1 of 1 at 500 and represents the number of modified glutamic units with the group R3 in the polymer, from 1 to 500 z represents the number of unmodified glutamic units in the polymer, from 1 to 1000 p represents monomer units included in definition R3 , from 1 to 500
  • Gadolinium ion chelation (Gd 3+ )
  • a ratio (1: 1) DTPA: GdCI 3 was used for complexation with the gadolinium ion.
  • reaction mixture was lyophilized and the residue obtained was redissolved in ddH 2 0 to purify it by Sephadex G25 chromatographic column using ddH 2 0 as eluent. 50 fractions of 2ml_ were collected.
  • x represents the number of monomer units included in definition R1, from 1 to 500 and represents the number of glutamic units modified with the group R3 in the polymer, from 1 to 1000 z represents the number of glutamic units unmodified in the polymer, from 1 to 1000 q represents the number of glutamic units modified with DTPA, from 1 to 1000 p represents the number of monomer units included in definition R2, from 1 to 500 ⁇ ⁇ ⁇ represents the number of theoretical glutamic units in the polymer, from 1 to 1000
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • R2 represents an alkyl group, defined C-terminal junction point (alkyne, azide, thiols, halides, activated thiols, alkenes, activated esters, activated alcohols, protected aminos, maleimido groups, acetals, activated carboxylic acids), ethylene glycol (EG) of different molecular weights including polyethylene glycol (PEG, from 100 to 20000g / mol), PEG-thiol, PEG-4TP.
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • EG ethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • amino acids such as lysine, arginine, imidazole and histidine, cysteine? and secondary and tertiary amino groups.
  • x represents units of monomers included in definition R1 of 1 at 500 and represents the number of glutamic units modified with the R3 group in the polymer, from 1 to 500 z represents the number of unmodified glutamic units in the polymer, from 1 to 1000 p represents monomer units included in definition R3 , from 1 to 500
  • the DOTA-NH 2 derivative (tert-butyl 2,2 ' , 2 " - (10- (2- (2-aminoethylamino) -2oxoethyl) -1, 4,7-tetrazacyclododecane-1, 4,7-triyl ) triacetate (eq. depending on the derivatization required 0.02-0.1 eq. 614.82 / mol) was dissolved in DMF anh and added dropwise on the activated polymer. The pH was adjusted to 8 with EA DI.
  • carboxyl groups are normally protected, for example as tert-butyl. These carboxyls are deprotected before complexing 68 Ga in a CH 2 CI 2 / TFA mixture (3: 2, v / v) under stirring for 15 h at room temperature or in a TFA / H 2 0 / TIS mixture (95 : 2.5: 2.5 v / v) for 3 hours at room temperature.
  • the conjugate was isolated by precipitation in excess of cold diethyl ether, washed and dried in vacuo. Quantitative performance The complete deprotection was ratified by NMR- 1 H.
  • the MTT assay measures cell proliferation as well as reducing cell viability when metabolic events lead to apoptosis or necrosis. It can also be used to assess the survival rate of a given cell line when it is incubated in the presence of xenobiotic compounds.
  • the reduction of tetrazolium salts is accepted as a reliable way to analyze cell proliferation.
  • Yellow tetrazolium MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5 diphenyltetrazolium bromide) is reduced by metabolically active cells and results in intracellular formation of purple formazan that can be measured spectrophotometrically after solubilization with DMSO .
  • the MTT assay in this invention was used to evaluate the toxicity of the compounds at different concentrations.
  • the reaction is monitored by TLC, once the polymer is finished it is purified by SEC (PD10 columns, Sephadex) and the fluorescent charge is determined with the fluorimeter (quantification of crude oil and purified polymer fluorescence).
  • TB10 was outside the detection limits of the system so TB-OG50, TB-OG100 and TB-OG200 were analyzed.
  • Cellular internalization studies were carried out in the presence of leupeptin (thiol protease inhibitor) to prevent degradation of the polymeric carrier.
  • TB200 shows a faster internalization reaching stabilization before 5h.
  • TB200 shows an increase in fluorescence associated with short times, in particular, at 30 min indicating a possible mixture of cellular internalization mechanisms (energy dependent (i.e. endocytosis) + energy independent (i.e. diffusion)).
  • the polymers were dissolved in PBS buffer at pH 5.5, 6.5 and 7.5 at a concentration of 3mg / mL. The solutions were incubated at 37 ° C, aliquots of 100uL were taken at different times that were frozen for later analysis.
  • rat / mouse blood volume was centrifuged at 12000rpm for 10 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant (plasma) was separated from the pellet (or cellular button) obtained and used to dissolve the polymers at a concentration of 3mg / mL.
  • the solutions were incubated at 37 ° C and 100uL aliquots were taken at different times that were frozen for later analysis.
  • the polymers were dissolved in 20mM sodium acetate buffer pH 6.0 at a concentration of 3mg / mL, in the presence of 2mM EDTA, 5mM DTT and 6.25 cathepsin B units (dissolved in acetate buffer). The solutions were incubated at 37 ° C and 100uL aliquots were taken at different times that were frozen for later analysis. In vivo biodistribution studies
  • the work with animals was carried out in accordance with local legislation and with the approval of the Ethical Committee of Animal Welfare of the IPPC and in accordance with current European legislation.
  • the animals were kept respecting the 12h wake / sleep cycle and controlling the environmental conditions of temperature and humidity, and water and food were supplied.
  • OG Oregon Green
  • ex vivo analyzes of homopolypeptide, di- and tri-block accumulation were carried out in the different organs of the model in vivo (Wistar rats) by high-efficiency liquid chromatography (High Presured Liquid Chromatography , HPLC) and fluorescence spectrophotometer.
  • HPLC High Presured Liquid Chromatography
  • fluorescence spectrophotometer fluorescence spectrophotometer.
  • the experiment carried out with TB200 labeled with OG is detailed below.
  • One rat was injected intravenously with 14mg / ml_ of TB200 labeled with OG. The animal was sacrificed after 4h (experiment with TBO-4h nomenclature); a second rat was injected intravenously with the same amount of compound being sacrificed after 24h (experiment with TBO-24h nomenclature).
  • a rat was injected intravenously with 14mg / ml_ of unlabeled TB200 and was sacrificed after 4h (experiment with nomenclature TB-4h).
  • the organs to be analyzed were brain, cerebellum, heart, liver, kidney, bladder, stomach, intestine and muscle tissue. Each was treated with a lysis solution composed of 40% EtOH / 6% HCIO 4 (4mL per gram of tissue). The sample was then homogenized with Ultraturrax (approx. 1 min, 13000rpm). The suspension was centrifuged for 60min at 4000g at 4 ° C, recovering the supernatant for subsequent analysis. The serum followed a similar treatment: after centrifuging the blood, the supernatant was collected and he added the same volume of the perchloric acid solution. After centrifuging the sample (10min, 12000rpm, 4 ° C), the supernatant was collected for further analysis.
  • the pellets obtained were subjected to ultrasound for 1 h after adding 2 ml_ ddH 2 0 and 1 ml_ of a 1 M NaHC0 3 solution. The samples were then centrifuged with the previously named conditions and the supernatant was stored for analysis.
  • the plasma fluorescence ( Figure 12A) was quantified with a spectrofluorimeter: directly, after treatment with the perchloric mixture, after washing with methanol of the pellet obtained in the previous treatment and after washing with acetonitrile of the same pellet.
  • the graphs in Figure 12 show that the starting fluorescence in the plasma is lost after treatment with the perchloric mixture. This conclusion makes it possible for TBO to precipitate together with the other proteins present in the plasma (it is possible that this polymeric species forms aggregates with the plasma proteins).
  • the pellet was washed with a solution of sodium bicarbonate as previously detailed in the protocol described for the tissues, in order to obtain the sodium salt from the tribloque and solubilize it in the aqueous phase for later analysis by fluorescence measurement. Biodistribution studies by fluorescent marking. Use of Cyane5.5 (Cy5.5) as a probe.
  • the mareaje of the polymers was carried out with a fluorescent probe with near-infrared emission and high tissue penetrability, Cyane5.5 (Cy5.5, Aexc. 675 nm, Aem 694 nm ).
  • the in vivo study was performed in nude nude Foxl n nu / nu mice.
  • fluorescence images were taken in vivo and ex vivo ex vivo (from the organs removed) using the Xenogen IVIS® Spectrum optical imaging platform. This system allows the visualization, monitoring and quantification of both cellular and genetic activities within a living organism in real time, through bioluminescence or fluorescence, as well as ex vivo organs or in vitro assays.
  • Magnetic Resonance Imaging is a non-invasive and non-ionizing technique that uses the phenomenon of magnetic resonance to obtain information about the structure and composition of the analyzed body. It constitutes a unique tool for contrasts between tissues, being able to distinguish between healthy and diseased tissues.
  • contrast agents in MRI is justified when it is not possible to change the inherent contrast of the tissue to obtain greater precision in the images. These agents are based on changes in the longitudinal (T1) and transverse (T2) relaxation times of water protons and / or the magnetic susceptibility of water of the tissues where they accumulate.
  • An MRI contrast agent is characterized by having para- or superpara-magnetic properties and is generally divided into two components: the metal ion with magnetic properties whose free form is toxic to the organism, and a chelator that in addition to preventing toxicity of the previous one, will allow to adjust the pharmacokinetics of the product according to the interests.
  • gadolinium metal has been used as a contrast agent because of its paramagnetic properties, which increase the relaxation time T1 of water protons.
  • the hydrogen nucleus seems to be the best target since of all the nuclei present in the tissues it is the one that produces the greatest NMR signal, and for generating the best contrast between the tissues since it provides several ways to manipulate the contrast of the final image.
  • PET Positron Emission Tomography
  • 68 Ga gallium metal
  • DAA complexation needs
  • this radiotracer is described as the most suitable for neuroendocrine tumors due to the recognition of somatostatins.
  • the monitoring has been carried out in a PET-CT device. PET-CT equipment has the great advantage that in case of diagnostic doubt, direct anatomical correlation is possible.
  • N-carboxyanhydride (NCA) polymerization by variation of reaction temperature and pressure. 2, 1322-1330

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Abstract

La presente invención se refiere al control de la polimerización de N- carboxianhídridos de α-aminoácidos (NCAs) a través del uso de sales no nucleofílicas con la finalidad de obtener arquitecturas poliméricas altamente versátiles, con bajos índices de polidispersidad, (homopolimeros, polímeros dibloque, tribloque o sistemas multibloque), así como a procesos para la preparación de los mismos y su utilización en composiciones farmacéuticas. Concretamente se refiere a la obtención de poliglutamatos funcionales con estructura definida, peso molecular ajustable y baja polidispersidad (D = Mw / Mn <1.3) mediante la polimerización de apertura de anillo de N-carboxianhídridos. Asimismo, los grupos ácido de la cadena polimérica de los poliglutamatos se pueden activar con 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolina permitiendo la introducción de diversas funcionalidades por "modificación post- polimerización" formándose diferentes grupos reactivos en las cadenas laterales del polímero. Los restos reactivos, tales como azidas, maleimidas, tioles, alquinos (lineales o cíclicos) ofrecen la oportunidad de conjugación específica,útiles para fármacos, unidades dirigentes o marcadores. Además, esta estrategia de funcionalización se ha utilizado también como mecanismo de PEGilación de poliglutamatos, reduciendo las posibles interacciones producidas por la carga de los grupos carboxilo, y por tanto, permitiendo ajustar las propiedades farmacológicas de cada caso para su uso en fármacos o agentes de imagen molecular con aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico.

Description

SINTESIS CONTROLADA DE POLIGLUTAMATOS CON BAJA
POLIDISPERSIDAD Y ARQUITECTURAS VERSÁTILES
SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al control de la polimerización de N- carboxianhídridos de α-aminoácidos (NCAs) a través del uso de sales no nucleofílicas con la finalidad de obtener arquitecturas poliméricas altamente versátiles, con bajos índices de polidispersidad, (homopolimeros, polímeros dibloque, tribloque o sistemas multibloque), así como a procesos para la preparación de los mismos y su utilización en composiciones farmacéuticas y/o como agente para el diagnóstico de imagen.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Un polímero ideal para ser usado como portador en el transporte de fármacos o agente para el diagnóstico de imagen debe caracterizarse por poseer (i) biodegradabilidad o un peso molecular adecuado que evite su acumulación progresiva in vivo, (ii) baja polidispersidad, de manera que asegure una homogeneidad aceptable del sistema final permitiendo ajusfar las propiedades farmacocinéticas del mismo; (iii) tiempoelevado de residencia en el cuerpo, para prolongar la acción del conjugado o permitir su distribución y acumulación en los compartimentos deseados del cuerpo (por lo tanto, se prefieren pesos moleculares elevados) y (iv) en el caso de conjugación de proteínas, un único grupo reactivo para evitar reacciones de entrecruzamiento ("crosslinking'), mientras que para el caso de conjugación de fármacos pequeños, es preferible que el portador contenga varios grupos reactivos que permitan modular y optimizar la carga del fármaco (multivalencia).
Debido a su naturaleza implícita, los polímeros presentan diversos retos a la hora de su desarrollo farmacológico. Un fármaco manufacturado debe ser homogéneo y estar compuesto por una única especie definida. Por el contrario, todos los polímeros sintéticos son inherentemente heterogéneos y, como macromoléculas pueden presentar diversos desafíos en su caracterización. El control exhaustivo de parámetros cruciales como el peso molecular, la polidispersidad, la localización de las cargas o el balance hidrofobia-hidrofilia es un requisito para modular la biodistribución, el destino final, la actividad biológica y la toxicidad.1 ,2 El peso molecular medio se expresa en términos de "peso molecular promedio, en peso" (Mw) y "peso molecular promedio en número" (Mn), y el cociente Mw/Mn proporciona una medida de la dispersidad D.
Por lo tanto, existe un creciente interés y una necesidad en el desarrollo de metodologías para la obtención desistemas poliméricos biodegradables con mayores pesos moleculares, controlando la homogeneidad de los mismos en el proceso, y permitiendo un alto grado de versatilidad para ser posteriormente implementados en diversas necesidades clínicas.
La polimerización por apertura de anillo (ROP del acrónimo inglés "ring-opening polymerisation') de N-carboxianhídridos de aminoácidos (NCAs) es la técnica de polimerización más amplia y comúnmente aplicada para obtener polipéptidos y copolímeros de bloque basados en polipéptidos en escala multigramo. A pesar de que los polímeros obtenidos son menos definidos que los péptidos producidos por un organismo natural, este método de polimerización permite el acceso a arquitecturas poliméricas que están por encima de las posibilidades de la naturaleza. Además, la apertura de anillo de NCAs ya ha sido empleada en varias aplicaciones dentro de diferentes campos de la ciencia. Dichas aplicaciones van desde el desarrollo de sistemas de transporte de fármacos o agentes moleculares de imagen a materiales para recubrimiento de superficies2"6
Como ejemplo prominente del uso de polimerización de NCAs debe mencionarse el conjugado de ácido poliglutámico (PGA) y paclitaxel (Opaxio®, formalmente Xyotax, PPX, CT-2103). El conjugado polímero-fármaco se encuentra en fase clínical 11 ,7 9lo que pone de manifiesto la importancia del método de polimerización de NCAs para la preparación de polipéptidos sintéticos definidos. El ácido poliglutámico es un material prometedor para el diseño de nanomedicinas debido a su elevada biocompatibilidad, multivalencia y a su degradabilidad in vivo mediada por tiol proteasas (Catepsina B).10-1 1
Desde el punto de vista histórico, la polimerización de NCAs es un método relativamente antiguo ya que fue descubierto por Leuch al inicio del siglo XX.12"14 Desde entonces, se han estudiado y publicado diferentes metodologías de polimerización.15" 17Hasta el momento las aproximaciones químicas más prometedoras se basan en la iniciación de NCAs purificados con aminas primarias combinado con el uso de técnicas de alto vacío, 18"20 el uso de sales hidroclóricas de amonio como iniciadores,21 catalizadores basados en metales pesados22"24 o hexametildisilazanos (HMDS).25"26
Sin embargo, la mayoría de estos métodos poseen limitaciones para la síntesis de polipéptidos bien definidos. Por ejemplo, las aminas hexametildisilazanos (HMDS) son sensibles a reacciones de hidrólisis, y los catalizadores basados en metales pesados deben eliminarse posteriormente a la polimerización siempre que se pretenda una aplicación biomédica. Además, la eliminación de dichos metales es tediosa por lo que generalmente es incompleta.
La iniciación normal basada en el uso de aminas primarias proporciona en la mayoría de los casos un control reducido debido al propio proceso de polimerización. Existen reacciones secundarias que interfieren en el proceso de polimerización, especialmente cuando se requieren elevados grados de polimerización o arquitecturas complejas. En general, los poliglutamatos con un peso molecular en el rango entre algunos miles y 50.000 g/mol e índices de polidispersidad (I PDs) de 1 .2 a 1.5 se encuentran descritos en literatura17 I PDs superiores se atribuyen con toda probabilidad al hecho de que la polimerización de NCAs sufre de la presencia de reacciones secundarias. La más importante de ellas es la que se conoce como proceso del "monómero activado" ("Activated Monomer",) que tiene lugar por la desprotonación de una molécula de monómero NCA. El anión generado en el NCA es lo suficientemente nucleofílico como para iniciar la oligomerización de NCAs. Los N-aminoacil NCA derivados formados en el proceso pueden tanto añadirse a la cadena en propagación como llevar a cabo procesos de autocondensación, estos últimos produciendo elevados pesos moleculares a elevados a elevadas conversiones de monómero. Debido a que las aminas primarias pueden actuar como nucleófilos y como bases, el proceso de polimerización oscilará siempre entre ambos mecanismos, "amina normal" y "monómero activado".
Una estrategia para obtener polipéptidos más definidos es la disminución de la temperatura de reacción, debido a que ello implica la disminución/supresión de diversas reacciones secundarias, sin embargo, ello implica un aumento de los tiempos de reacción de entre 2 a 4 veces, conllevando también una disminución en el rendimiento.27"29Sin embargo, para la producción de polímeros de bloque (di-, tri- o multibloque), la polimerización de NCAs debe proceder preferentemente con altas conversiones vía mecanismo de amina normal; es decir, iniciación nucleofílica de la polimerización de manera que los polímeros resultantes estén provistos de grupos terminales bien definidos. El control sobre los grupos terminales poliméricos es esencial en la metodología de síntesis de arquitecturas multibloque.30
Knobler y colaboradores31 ,32 evitan el mecanismo del "monómero activado" con la simple adición de un ácido, de manera que se induzca la reprotonación de los eventualmente formados NCAs. Estos autores investigaron la reacción estequiométrica entre NCAs y las sales hidroclóricas de aminas primarias para la preparación de derivados aminoacilos. Schlaad y colaboradores usaron este método para preparar copolímeros híbridos de naturaleza definida basados en poliestireno.21
La principal desventaja de esta aproximación es el hecho de que el ion cloruro como tal puede actuar como nucleofilo o como base, desprotonando el monómero NCA y por lo tanto, dando lugar a reacciones secundarias.
Para comprobar el alcance de varias de las metodologías descritas en la literatura hasta el momento, como el uso de aminas primarias como iniciadores y el método desarrollado por Schlaad, se llevaron a cabo varios experimentos en nuestro laboratorio, cuyos resultados se muestran a continuación.
Tablal . Comparación entre la aproximación basada en el uso de aminas primarias como método de polimerización de NCAs y la técnica de polimerización de Schlaad
[M]/[l DP DP [M] t Rdto Mn Mw PDI
Iniciador P
Cale. lH- Mol/ reacción (%) KDa KDa
NAM 1 100 77 41 0.38 3 77 20.3 25.4 1.2
2 400 300 59 0.38 3 75 22.4 31.9 1.4
^NH2 3 1600 1328 60 0.38 3 83 20.5 28.3 1.4
Schlaad 4 100 60 36 0.38 3 60 4.4 5.6 1.3
5 400 288 55 0.38 3 72 18.1 27.2 1.5
6 1600 1168 90 0.38 3 73 20.7 31.2 1.5 P:polímero, [M]/[l]: Cociente Monómero-lniciador; DP: Grado de polimerización (% of [M]/[l];) Mw: peso molecular medio en peso; Mn: peso molecular medio en número PDI: índice de la polidispersidad (cociente Mw/Mn que proporciona una medida de la dispersidad D).
ΓΛ/1
a) Calculado usando DP = -k—r» conv
Como muestra la tabla 1 , aunque ambos métodos son fáciles de aplicar sin necesidad de equipamiento complicado o síntesis complejas, ambos son inútiles cuando se requieren grados de polimerización superiores a 100. Ello pone de manifiesto la necesidad de un mecanismo diferente, lo que supone la base de la presente invención. OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es aumentar el grado de polimerización (GP), obtener una versatilidad estructural y disminuir el índice de polidispersabilidad (IPD) de los polipéptidos obtenidos mediante la polimerización de N-carboxianhídridos de a- aminoácidos (NCAs).
Por lo tanto, la presente invención proporciona un método de obtención de poliglutamatos en el que se utiliza un anión no nucleofílico como el tetrafluoroborano. De este modo, las reacciones secundarias basadas en el carácter nucleofílico del contranión han sido suprimidas de manera eficaz. Así, ha aumentado el control sobre los grupos terminales del polímero, permitiendo la síntesis de homopolímeros, polímeros dibloque, tribloque o sistemas multibloque con una gran variedad de pesos moleculares, variando tanto el número de cadenas laterales como los grupos funcionales introducidos en las mismas.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1 : Espectro de 1 H-RMN del y-bencil L-glutamato N-Carboxianhídrido (NCA). FIGURA 2: Espectro de 1 H-RMN de las polimerizaciones realizados con las sales de n- butil tetrafluoroborano a diferentes proporciones del cociente [M]/[l] en DMF.
FIGURA 3: Representación del cociente [M]/[l] frente al Mn obtenido por GPC.
FIGURA 4: Diagramas de elución obtenidos por GPC de varios poliglutamatos con diferentes pesos moleculares. FIGURA 5: Espectro de 1 H-RMN del ácido n-butil-a-poliglutámico correspondientes al lote de escalado de 5 gramos tras la desprotección. DP=252 como se confirma por RMN.
FIGURA 6: Espectro de 1 H-RMN de un derivado del PGA modificado con propargilamina.
FIGURA 7: Espectro de 1 H-RMN de un derivado del PGA modificado con grupos oligoEG-azidas.
FIGURA 8: Espectro de 1 H-RMN de un copolímero resultante del acoplamiento entre PGA-propargilamina con NH2PEG(2)N3.
FIGURA 9A: Evaluación de la Viabilidad celular por MTT de TB400 [P: 35 donde X=OMe o S-S-4TP] y TB800 [P: 36 donde X=OMe o S-S-4TP] en células HUVEC a diferentes tiempos de incubación.
FIGURA 9B: Evaluación de la viabilidad celular por MTT de TB200 [P: 34 donde X=OMe o S-S-4TP] en células HUVEC y HeLa a diferentes tiempos de incubación.
FIGURA 10A: Cinética de internalización celular con los tribloques sintetizados y marcados con oregon green (TB-OG50 [P: 41 donde R^= MeO-PEG2000, R2=-NH- PEG2000-OMe, R3=ONa], TB-OG100 [P: 42 donde R^ MeO-PEG2000, R2=-NH- PEG2000-OMe, R3=ONa], y TB-OG200[P: 43 donde R^ MeO-PEG2000, R2=-NH- PEG2000-OMe, R3=ONa]). Estudios mediante citometría de flujo a 37°C y a 4°C (inhibición de mecanismos de internalización celular dependientes de energía como endocitosis).
FIGURA 10B: Cinética de internalización celular con los tribloques sintetizados y marcados con oregon green (TB-OG50 [P: 41 donde R^= MeO-PEG2000, R2=-NH- PEG2000-OMe, R3=ONa], TB-OG100 [P: 42 donde R^ MeO-PEG2000, R2=-NH- PEG2000-OMe, R3=ONa], y TB-OG200[P: 43 donde R^ MeO-PEG2000, R2=-NH- PEG2000-OMe, R3=ONa]). Microscopía Confocal in vivo en células HeLa a diferentes tiempos de incubación (5 min, 30 min, 1 h, 2h y 5h). Las imágenes corresponden a la internalización de TB-OG (verde) en presencia de marcador de membrana lipídica (rojo) a 1 h y 5h.
FIGURA 11 A. Cinética de internalización celular con los tribloques sintetizados y marcados con oregon green. Estudios mediante citometría de flujo a 37°C y a 4°C (inhibición de mecanismos de internalización celular dependientes de energía como endocitosis) (TB-OG200_4TP [P: 43 donde R,= MeO-PEG2000, R2=-NH-PEG3000-S-S-4TP, R3=ONa], TB-OG400_4TP [P: 44 donde
Figure imgf000009_0001
MeO-PEG2000, R2=-NH-PEG3000-S-S-4TP, R3=ONa]).
FIGURA 11 B. Cinética de internalización celular con los tribloques sintetizados y marcados con oregon green. Microscopía confocal in vivo en células HUVEC con TB-OG200_TP a 2h de incubación. Marcador lisosomal Dextran Texas Red (rojo).
FIGURA 12A: Medidas de fluorescencia del suero mediante especrofluorímetro a los diferentes tiempos de sacrificio del animal y los consecuentes tratamientos del suero: medida directa del suero ((1) , medida del sobrenadante tras la homogenización con HCI04 (M), medida tras el lavado del pellet con metanol (II) y medida tras el lavado del pellet con acetonitrilo (■).
FIGURA 12B. Medidas de la fluorescencia de los distintos órganos homogenados (hígado, riñon, intestino, bazo, cerebro, músculo, cerebelo y pulmón) tras 4 y 24h post injección. TB=TB200 [P:34 donde X=-S-S-4TP], TBO 4= TB-OG200_4TP [P: 43 donde R!= MeO-PEG2000, R2=-NH-PEG3000-S-S-4TP, R3=ONa], (4h), TBO 24= TB- OG200_4TP [P: 43 donde R^ MeO-PEG2000, R2=-NH-PEG3000-S-S-4TP, R3=ONa], (24h).
FIGURA 13. Imagen obtenida mediante IVIS®Spectrum. Monitorización del DB100- Cy5.5 4h después de la inyección. Eliminación vía renal del portador polimérico. (A) Posición dorsal (B) Posición ventral.
FIGURA 14A: Imagen por resonancia magnética de la cabeza de la rata antes de la inyección del compuesto TB800-DTPA/Gd
FIGURA 14B: Imagen por resonancia magnética de la cabeza de la rata después de la inyección del compuesto TB800-DTPA/Gd. FIGURA 15. Imagen obtenida mediante PET/CT. Monitorización del PGA-DOTA Ga (50.5 μθί). (A) Estructura del PGA-DOTA-68Ga utilizado en este ejemplo. Corte sagital 18 min después de administración i.v., adquisición imagen 60 min. Eliminación vía renal del portador polimérico. (B) Corte sagital, ventral y dorsal.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la presente invención se centra en suministrar una metodología para la obtención de una polimerización controlada de N-carboxianhidridos de α-aminoácidos mediante el uso de sales no nucleofílicas, concretamente con la sal de tetrafloruroborano de amonio. Dicho método se representa por la fórmula general que se detalla a continuación:
Figure imgf000010_0001
representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles activados, etc.), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 10000g/mol). representa el número de unidades de y-benzylglutamato en el polímero en el rango de 1 a 1000 unidades Las sales de tetrafluoroborano de amonio pueden ser preparadas mediante una metodología simple que incluye la reacción de la correspondiente amina con el complejo de ácido tetrafluorobórico HBF4OEt2, seguida de un sencillo proceso de purificación y posterior almacenaje sin detectar descomposición o impurezas en el producto final.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a los diferentes sistemas di- o tri-bloques, los cuales poseen un punto adicional de conjugación con un grupo funcional adecuado para permitir una posterior conexión específica. La estructura general de los di- y tri- bloques se describe a continuación:
Figure imgf000011_0001
donde
R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol).
R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol), PEG-tiol, PEG-4TP. R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ((alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16); aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína y grupos amino secundarios y terciarios. x representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500 y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500 z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000 p representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500
R2 y R3 pueden ser utilizados para la conjugación de agentes bioactivos (incluyendo fármacos de bajo peso molecular, péptidos, proteínas, anticuerpos), sondas fluorescentes del infrarrojo cercano, complejos de coordinación para MRI , PET y sondas SPECT.
Tal como se usa en la presente patente, la expresión "tratamiento" incluye tratamiento, prevención y control de tal estado y la expresión "farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento se refiere a aquellos compuestos, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una razón riesgo/beneficio razonable.
En distintas realizaciones particulares de la invención R representa el grupo n- butilamina, R1 representa el m-PEG, R2 representa PEG que opcionalmente posee un grupo terminal funcional (incluyendo -OH, -SH,-S-S-4TP, cualquier derivado -S- protegido, -NH2, alquino, azida, o maleimida). En distintas realizaciones R3 puede estar representado por EG-alquino, EG-azida, alquilo, opcionalmente sustituido. También R3 puede representar-(CH2)2-fenilo opcionalmente sustituido con uno ó más sustituyentes halógenos, y en otra realización R3 representa complejos de coordinación, como por ejemplo Gd-DTPA ó Ga-DOTA, Tc-DTPA, Cu-poliamina.
En el conjugado polímero-fármaco, el ácido poliglutámico incluye las variedades poli-L-glutámico y/o poli-D-glutámico, y en otra realización de la invención el ácido poliglutámico es el ácido poli-L-glutámico.
De la misma forma, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de las realizaciones mencionadas.
Así, la presente invención se refiere al proceso de preparación de los nuevos compuestos descritos anteriormente, sus derivados, análogos, formas tautoméricas, esteroisómeros, polimorfos, sus sales farmacéuticamente aceptables o solvatados de los mismos.
Los polímeros de la presente invención son portadores diseñados para el transporte y la administración de fármacos y/o agentes para técnicas de imagen molecular. Por lo tanto, son herramientas útiles para el diagnóstico, tratamiento o prevención de patologías dependiendo de la carga conjugada.
Los polímeros y sus conjugados derivados mediante la presente invención, pueden administrarse en forma de cualquier formulación farmacéutica. La formulación farmacéutica dependerá de la naturaleza del compuesto activo y su ruta de administración. Puede usarse cualquier vía de administración, por ejemplo, la administración oral, bucal, pulmonar, tópica, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular e intravenosa), transdérmica, ocular (oftálmica), por inhalación, intranasal, óptica, transmucosal, con implante o rectal.
Las preparaciones inyectables para la administración parenteral comprenden disoluciones, suspensiones o emulsiones estériles en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener coadyuvantes, tales como agentes de suspensión, estabilización o tonicidad o agentes dispersantes. Los compuestos también pueden formularse para su aplicación tópica. Las formulaciones incluyen cremas, lociones, geles, polvos, disoluciones, preparaciones de champú, pasta oral, preparaciones de colutorio y parches, en los que el compuesto se disuelve o dispersa en excipientes adecuados. En una realización de la invención, la composición farmacéutica está en forma de nanoesferas, micropartículas y nanopartículas.
EXPERIMENTACIÓN Y EJEMPLOS
Síntesis de N-carboxianhídrido de y-bencil L-glutamato (NCA) a partir de ácido y- bencil ester-L-glutámico y difosgeno usando limoneno para neutralizar el HCI liberado.
La síntesis de N-carboxianhídridos de α-aminoacidos (NCAs) se puede dividir en dos grupos dependiendo de la naturaleza del sustrato aminoácido. El primer método se conoce como método de Leuchs y está basado en la delación de haluros de N- alcoxicarbonil aminoácidos para formar NCAs. El segundo se conoce como método Fuchs-Farthinge involucra la fosgenación directa de α-aminoácidos desprotegidos, como se detalla en el esquema inferior.
Figure imgf000014_0001
El protocolo se ha adaptado de N.M.B Smeets et al. "A Scalable Synthesis of L- Leucine-N-carboxyanhydre". Organic Process Research & Development 2005, 9, 757- 763, una variación del método Fuchs-Farthing. Además, se han introducido algunas variaciones, como la eliminación del fosgeno o HCI remanente, mediante un flujo de nitrógeno con anterioridad a la precipitación, seguido de recristalización y filtración bajo condiciones de atmósfera inerte mediante el uso de tubos deSchlenk para evitar impurezas y aumentar la estabilidad del producto una vez almacenado. Se podría haber usado fosgeno en la reacción, sin embargo ello proporcionaría una falta de control estequiométrico y además el uso excesivo de fosgeno produce la generación de contaminantes como sales hidroclóricas de los cloruros de aminoácido formados por la escisión del anillo de NCA por HCI, que puede ser fosgenado en un segundo paso para dar lugar a cloruros de ácido α-isocianato. Ambos subproductos son críticos en la polimerización de NCAs y dan lugar a distribuciones anchas de peso molecular o incluso multimodales.
Por ello se eligió la utilización del líquido triclorometil cloroformato (difosgeno) que se descompone con la temperatura proporcionando fosgeno, por lo que puede obtenerse fácilmente un control estequiométrico en este caso. Debido a que el difosgeno necesita ser descompuesto térmicamente en el medio de reacción, se requieren temperaturas superioresen esta variación, en comparación con el método clásico de Fuchs-Farthing (40-50°C).
El mecanismo de la reacción implica la fosgenación directa de a-aminoácidos desprotegidos. La delación tiene lugar a través de la formación de intermedios N- cloroformil aminoácidos y la posterior pérdida de una segunda molécula de HCI da lugar al NCA. La reacción genera 2 equivalentes de HCI por molécula de NCA. El HCI, como se ha mencionado anteriormente, puede iniciar la autodegradación del monómero NCA. En esta invención, se ha incorporado el limoneno a las condiciones de reacción para neutralizar el HCI por adición a los dobles enlaces de la molécula. No se pueden utilizar aminas u otras bases fuertes debido a que atacarían al monómero formado, dando lugar a su descomposición. Por el contrario, el limoneno (casi no nucleofílico/básico) actúa como un neutralizador de HCI. En el siguiente esquema se muestra el mecanismo de acción del limoneno.
Figure imgf000016_0001
La ausencia de HCI en los NCAs purificados se confirma mediante el uso de una disolución de nitrato de plata. La presencia de HCI puede ser identificada mediante la precipitación de cloruro de plata cuando se añaden unas gotas de una disolución 1 M de AgN03 sobre una disolución de monómero. La pureza del monómero es un criterio indispensable a la hora de asegurar su almacenamiento a largo plazo. Para comprobarlo se realizaron estudios de estabilidad del monómero en diferentes condiciones de almacenamiento. Los resultados se muestran en la tabla siguiente donde el símbolo "—"significa que el monómero se encontró polimerizado/ descompuesto y el "+" que el monómero se encontraba estable.
Tabla 2. Estudio de estabilidad de NCAs en diferentes condiciones de almacenamiento.
Tiempo de almacenamiento (días)
acenamiento lili wm mm m mm mm m ■i
T.A
T.A/Ar
4°C
4°C/Ar ·;·/-
-23°C
-23°C/Ar
T.A: Temperatura ambiente
Por lo tanto, se estableció en el protocolo estándar el almacenamiento del monómero a temperatura de -23°C y condiciones de atmósfera inerte.
Método experimental: En un matraz de fondo redondo de dos bocas, provisto de un agitador magnético, una columna de reflujo, un embudo de adición compensada y una entrada y salida de argón, se añadió H-L-Glu(OBzl)-OH(17g, 71 .66 mmol). El sistema se purgó con Ar durante 5 minutos. Posteriormente se añadió THF (120 mL, anhidro) y la mezcla se calentó a 60°C. A continuación, se añadió limoneno (1 1.6 mL, 71 .66 mmol, 1 Eq) a la suspensión, continuando la agitación antes de añadir las cantidades correspondientes de difosgeno (5.2 mL, 8.5g, 43 mmol, 0.6 Eq) disuelto en THF (10 mL, anhidro) mediante un embudo de adición durante un periodo de 10 minutos. La reacción se dejó agitar durante 2 horas a 60°C con constante purga de Ar, dando lugar a una disolución completamente clara. La mezcla de reacción se burbujeó con Ar para eliminar el HCI remanente durante 2 horas, mientras que la salida de Ar se conectó directamente a una disolución 1 M de NaOH para neutralizar el gas. Posteriormente, el volumen de la reacción se concentró a un cuarto de la mitad del volumen original y se añadieron 32 mL de acetato de etilo. El contenido de la reacción se precipitó en hexano frío (200 mL) para dar lugar a un precipitado blanco que se aisló por filtración y se lavó con hexano frío.
El sólido se recristalizó en tolueno (50 mL, anhidro) y THF (30 mL, anhidro), bajo atmósfera inerte (N2 o Ar) usando un matraz de fondo redondo de dos bocas de 250 mL provisto de un agitador magnético, una columna de reflujo y una salida y entrada de argón, induciendo la cristalización mediante la adición gota a gota de hexano frío (27 mL). La solución se almacenó durante una hora a 4°C y posteriormente a -20°C durante una noche. Finalmente, los cristales blancos formados se filtraron bajo condiciones de atmósfera inerte usando técnicas Schlenk y fueron almacenados a -20°C.
Para asegurar que el HCI residual se ha eliminado por completo, 2-4 mg de NCA se disolvieron en 0.5 mL de THF y fueron añadidos a una 1 mL de una disolución 1 M de nitrato de plata, sin que se produzca ningún precipitado. Cuando los iones Ag+ y Cl~ coinciden en disolución dan lugar a la formación de la sal insoluble AgCI, que puede ser fácilmente detectada. Otro control se basa en el chequeo de la solubilidad en THF ya que mientras que el monómero es completamente soluble en THF, y se puede apreciar una ligera turbidez en la disolución si no está completamente libre de hexano (dicha turbidez debe desaparecer al calentar), una clara precipitación se observa si hay presencia de material de partida (no solubles en TH F). Rendimientos: 70-80 %. Punto de fusión: 93.4°C. Fórmula molecular: Ci3H13N05. Bencil 3-(2,5-dioxooxazol-4-il)propanoato. Peso Molecular: 263.25 g/mol 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.29 (m, 5H), 6.84 (s, 1 H), 5.07 (s, 2H), 4.32 (t, J = 6.2 Hz, 1 H), 2.52 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.31 - 1.94 (m, 2H). El espectro de 1 H -RM N del producto puro se adjunta en la Figura 1.
Método general para la preparación de sales de BF4 1. Síntesis de la sal tetrafluoroborano de n-butilamonio
Se disolvió n-butilamina (200 mg, 2.7 mmol) en 1 ml_ de dietil éter, y 442 mg (2.7 mmol) de complejo del ácido tetrafluoroborico, HBF4. Et20, se añadieron a la disolución para dar lugar a la formación de un sólido blanco en rendimiento casi cuantitativo. El producto se filtró y recristalizó dos veces de acetato de etilo. Posteriormente, el producto se secó a alto vacío y se almacenó a -20°C. Rendimiento: 80-90%. 1 H NMR (300 MHz, DMSO) δ 7.58 (s, 3H), 2.84 - 2.71 (m, 2H), 1.56 - 1.43 (m, 2H), 1.39 - 1 .25 (m, 2H), 0.89 (t, J = 7.3 Hz, 3H). 13C-NMR (300 MHz, DMSO-d6 ) δ = 38.64, 29.09, 19.08, 13.49. EA: C: 29.61 % (cale : 29.85%), H: 7.27% (cale: 7.51 %), N: 8.60% (cale: 8.70%).
2. Síntesis de la sal tetrafluoroborano de neopentilamonio
A 5 mi (5.59 g, 36.74 mmol) del complejo del ácido tetrafluoroborico, HBF4(Et20), se añadieron 4.31 mi (3.20 g, 36.74 mmol) de neopentilamina. La adición resultó en la formación de un precipitado blanco. Tras eliminación del disolvente el sólido se recristalizó dos veces de acetato de etilo y lavado con ciclohexano. Finalmente, el producto se secó a vacío. Rendimiento: 80-90% de sólido blanco. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 7.58 (s, 3H), 2.63 (s, 2H), 0.93 (s, 9H), 13C NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 49.94, 30.21 , 26.78 EA: C: 34.35% (cale : 34.43%), H: 7.99% (cale : 8.06%), N: 8,07% (cale: 8.00%). 3. Síntesis de la sal tetrafluoroborano de metoxipolietilenglicolamonio
MeO-PEG(2000)-amina (600mg, 0.3 mmol, 1892 g/mol) se disolvió en 2 ml_ de THF y se añadió a la disolución 53.4 mg (0.3 mmol, 45 μΙ_) del complejo del ácido tetrafluoroborico, HBF4. Et20, dando lugar a la formación de una sal ligeramente amarilla en rendimiento cuantitativo. Tras eliminar el disolvente el producto se secó bajo alto vacío y se almacenó a -20°C. Rendimiento: 80-90% .1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d6):5 (ppm): 7.69 (s, 3H), 3.78 - 3.70 (m, 2H), 3.52 (d, J = 5.4 Hz, 139H), 3.47 - 3.39 (m, 6H), 3.24 (s, 3H), 3.06 - 2.91 (m, 2H). Procedimiento general para la polimerización de NCAs. Síntesis de poli-y-bencil-L- glutamato bajo condiciones de atmósfera inerte usando técnicas Schlenk.
Bencil L-Glutamato NCA (0,5g, 1 ,9 mmol, Mw=264 g/mol) se añadió a un Schlenk provisto con un agitador magnético, un tapón y se purgó 3 veces con ciclos vacío/argón, bajo un flujo de Ar. El sólido blanco se disolvió en 5 ml_ del correspondiente disolvente recién destilado. Acto seguido, se añadió el iniciador y la mezcla de reacción se dejó agitando a 40°C en un baño de aceite durante 3 días bajo condiciones de atmósfera inerte. Tras tres días de reacción, la disolución se precipitó en 40 ml_ de éter frío dando lugar a un sólido blanco en suspensión que se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos. Tras eliminar el sobrenadante, el sólido se suspendió en agua milliQ y se liofilizó.
1 H NMR (300 MHz, DMF-d7) δ 8.58 (s, 1 H), 7.42 (s, 5H), 5.19 (s, 2H), 4.21 (s, 1 H), 2.81 (s, 2H), 2.45 (s, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMF-d7) δ 175.94 (s), 172.26 (s), 162.77 - 162.18 (m), 161.98 (s), 136.76 (s), 128.87 - 127.75 (m), 66.05 (s), 57.13 (s), 35.41 - 34.17 (m), 32.48 (s) , 30.84, 30.30 - 29.04 (m), 27.28 (s), 25.99 (s). *Nota: Las correspondientes señales del iniciador dependen del iniciador usado en cada caso: n-butilamonio, neopentilamonio, metoxietilenglicolamonio.
Cinética de polimerización NCA.
y-bencil L-glutamato N-carboxianhidrido (0.6g, 2.27 mmol, Mw=264 g/mol) se disolvió previamente en 6 mL de DMF previamente destilado. El contenido se repartió en 6 Schlenk provistos de un agitador magnético y un tapón en bajo condiciones de atmósfera inerte. Posteriormente, se preparó una disolución en DMF, del iniciador y la cantidad correspondiente del mismo se añadió a cada Schlenk. Las mezclas de reacción se dejaron agitando durante 4 días a 40°C en un baño de aceite bajo condiciones de atmósfera inerte a presión constante. Se tomaron puntos para la construcción de la cinética de polimerización a tiempos siguientes: 14, 22, 38, 46, 70, y 96 horas, por precipitación de los polímeros en éter dietílico tres veces, liofilización de la muestra en agua, y análisis del peso molecular por GPC eluyendo con DMF/LiBr.
Como ejemplo, en la tabla 3 (a continuación) se muestran algunos resultados obtenidos en diferentes polimerizaciones con varios iniciadores basados en sales de BF4-, dos de ellos son iniciadores pequeños, como tetrafluoroborano de n-butilamonio o neopentilamonio.que dan lugar a homopolímeros de glutamato, y un macroiniciador basado en metoxipolietilenglicol de peso molecular cercano a 2.000 y PDI: 1.03, dando lugar a copolímeros híbridos dibloque PEG-poli(y-bencil-glutamatos). El iniciador neopentilamonio se usó remplazando al de n-butilamina para así facilitar la caracterización del polímero por 1 H-NMR gracias a una mejor asignación del grado de polimerización resultante. Esto se debe a la presencia de 9 protones químicamente equivalentes en el iniciador (los pertenecientes a los tres grupos metilo) lo que conlleva un aumento en la sensibilidad de la caracterización del polímero por H-RMN.
Tabla 3:
P: polímero; [M]/[l]: cociente monómero Iniciador; DP: grado de polimerización (% of [M]/[l];) Mw: peso molecular medio en peso; Mn: peso molecular medio en número; PDI: índice de polidispersidad (cociente Mw/Mn que proporciona una medida de dispersidad D) y DP se ha calculado de la forma siguiente:
ΓΛ/1
£> » = -L_= l- »conv
P]
Tabla 3. Polimerizaciones de NCA: polimerización en DMF con iniciadores tetrafluoborano de n-butilamonio, neopentilamonio y mPeg(2000)amonio a 40°C.
DP
[M]/ DP i [C] t Rto Mn Mw PD
Iniciador P
[1] (ca|C., H" M (d) (%) KDa KDa 1
NMR
7 50 32 29 0.38 3 64 6.7 7.4 1.1
8 100 64 60 0.38 3 64 13.8 15.2 1.1
9 200 126 107 0.38 3 63 16.1 17.7 1.2
-^^-^NH2.HBF4 10 300 147 143 0.38 3 49 20.7 23.5 1.1
11 400 288 212 0.38 3 72 31.6 37.9 1.2
12 800 424 - 0.38 3 53 48.4 63.0 1.2
13 1600 816 - 0.38 6 51 94.4 112.2 1.2
14 50 40 43 0.38 3 80 7.1 8.6 1.2
15 100 81 0.38 3 81 14.4 18.7 1.2
^>^NH2.HBF4
16 200 176 105 0.38 3 88 17.86 22.31 1.2
17 1200 960 - 0.38 3 80 156.5 191.1 1.2
18 50 36 38 0.38 3 73 7.0 9.4 1.2 nv ^ NH2. HBF4 19 100 81 79 0.38 3 81 13.9 18.1 1.2
20 200 160 148 0.38 3 80 18.4 24.7 1.2
Se adjuntan en la Figura 2, los espectro de 1 H-RMN de las polimerizaciones realizados con las sales de n-butil tetrafluoroborano a diferentes proporciones del cociente [M]/[l] en DMF; Figura 3 la representación del cociente [M]/[l] frente al Mn obtenido por GPC y Figura 4 diagramas de elución obtenidos por GPC de varios poliglutamatos con diferentes pesos moleculares.
Con DMF como disolvente se obtuvieron muestras monomodales con polidispersidades de bajas a muy bajas en todos los casos usando la técnica de polimerización de NCA basada en el uso de sales de BF4-. Siguiendo con el proceso de optimización, el efecto de la temperatura también se estudió. A temperatura baja (4°C) algunas de las reacciones secundarias se suprimen pero se aumenta significativamente el tiempo de reacción. Temperaturas altas (60-80°C) resultaron en reacciones ligeramente coloreadas (60°C) o en reacciones muy amarillentas (80°C) debido a la descomposición de DMF en dimetilamina y la rotura del grupo protector a temperaturas elevadas que produce alcohol bencílico que es de color amarillento. Como alternativa se han utilizado otros disolvente, en particular 1 ,3-Dimetil-2-imidazolidinona (DMI) que puede ser utilizado debido a su mejor estabilidad si se compara con DMF a altas temperaturas o en reacciones más largas dando de igual modo polidispersidades bajas. En conclusión, con el uso de temperaturas superiores a 60°C no se lograron buenos resultados en cuanto al control en la polimerización. Por otro lado, cuando se aplican bajas temperaturas, manteniendo como tiempo de reacción 3 días, se obtienen rendimientos relativamente bajos. Así, se estableció como temperatura idónea 40°C con DMF o entre 5-40°C con DMI . Parámetros como la concentración en el medio de reacción se optimizaron del mismo modo, estableciéndose como óptima 0.38 M con respecto al monómero en el caso de DMF. Se requiere trabajar dentro de un cierto rango de concentraciones para evitar polímeros menos definidos
Para comprobar si la metodología propuesta es aplicable a cualquier tipo de iniciador, se probaron diferentes iniciadores basados en sales de BF4 como propargil- NH3BF4 y N3EG(2) NH3BF4. El uso de estas sales como iniciadores permite el acceso a polímeros con grupos alquino y azida en el extremo C-terminal del polímero que podrían usarse para una posterior bioconjugación. La siguiente tabla resume los resultados obtenidos con los diferentes iniciadores usados. Tabla 4. Polimerización NCA con diferentes sales de tetrafluoroborano como iniciadores a 40°C durante 3 días en DMF como disolvente y relación [monomero/iniciador]=200
Figure imgf000023_0001
Nota: en el caso de los iniciadores EG, y propargilamina, el grado de polimerización DP no se puede extraer del espectro de 1 H-NMR debido a solapamiento de señales con la señal del agua.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
n representa el número de unidades de y-bencil-glutamato en el polímero, de 1 a 1000 Las cantidades usadas habitualmente para cada polimerización se encuentran entre 0,5-1 gramo de monómero. Para validar la posibilidad de una aplicación industrial de la reacción y teniendo en cuenta que el ácido poliglutámico es la base polimérica de varios conjugados polímero-fármaco, la síntesis se escaló. Por ello, una vez que todos los anteriores resultados preliminares se evaluaron, la reacción se escaló cuatro veces, a 5 gramos, utilizando las condiciones optimizadas. En todos los casos, las PDI de los polímeros obtenidos estuvieron en el rango de 1.2-1.3 con rendimientos de reacción de entre 80-90% y pesos moleculares Mn: 31.47 KDa, PDI: 1.26, ([M]/[l]=333); Mn:26.06 KDa, PDI: 1.27, ([M]/[l]=300); Mn: 15.23 KDa PDI: 1.18 ([M]/[l]=200) and Mn: 7.08 KDa PDI: 1.19, ([M]/[l]=50) respectivamente como fueron determinados por GPC. En la Figura 5 se incluye espectro de 1 H-RMN del ácido n-butil-a-poliglutámico correspondientes al lote de escaldo de 5 gramos tras la desprotección. DP=252 como se confirma por RMN.
Métodos generales para la desprotección de poli(Y-bencil-L-glutamatos)
Se estudiaron tres metodologías para la eliminación de los grupos bencilo protectores. La primera consiste en el uso de un medio ácido como HBr/TFA, la segunda utilizando hidróxido sódico en una mezcla de THF/agua a baja temperatura y la tercera, el uso de atmósfera de reducción de hidrógeno con Pd(OH)2/C como catalizador. Los tres métodos dieron lugar a la completa desprotección de los grupos bencilo, sin embargo, la última opción está restringida a poliglutamatos de peso molecular menos de 10 kDa y además requiere de la eliminación del catalizador lo que conlleva a rendimientos bajos. Los polímeros fueron caracterizados mediante 1 H-NMR y por polarimetría hasta conseguir valores de α constantes de -0.6.
Desproteccion de Poli(Y-bencil-L-glutamato) con HBr en ácido trifluoroacético:
Se disolvieron 100 mg (0.0035 mmol, Mw: 28251 g/mol) de poli(Y-bencil-L-glutamato) en 3 mL en ácido trifluoroacético (TFA) en un matraz de fondo redondo provisto con un tapón y un agitador magnético. Posteriormente, se añadieron 150 mg de HBr 48% (0.91 mmol, 2 equivalentes por grupo carboxilo), y la mezcla anaranjada se dejó agitar durante 5-8 horas. Posteriormente, el producto se precipitó en un gran exceso de dietil-éter dando lugar a un sólido blanco que fue centrifugado y lavado tres veces con dietil-éter. Después, el producto se purificó por precipitación ácido-base (NaHC03 /HCI 6M), y se dializó en agua para dar lugar a formar la sal sódica del poliglutámico. Finalmente, para obtener la forma ácida, el producto se precipitó a pH 3 mediante la adición de algunas gotas de HCI 6M. Rendimiento: cuantitativo. 1 H-RMN (300 MHz, D20) δ: 4.31-4.26 (m, 1 H), 2.38-2.14 (m, 2H) 2.10-1.80 (m, 2H)
Desprotección de poli(Y-bencil-L-glutamatos) con NaOH en THF/H20 Se disolvieron 100 mg (0.456 mmol) de poli(Y-bencil-L-glutamato) en 7 mL de THF a 4°C. Seguidamente se añadió gota a gota hidróxido sódico (27.36 mg, 0.684 mmol) disuleto en H20 (1 mL) a 4°C sobre la solución del polímero agitada vigorosamente y se dejó durante 16h. La solución se neutralizó con ácido acético, se evaporó el THF a vacío y el polímero resultante fue purificado directamente mediante dialysis. Rendimiento: cuantitativo. 1 H-RMN (300 MHz, D20) δ: 4.31-4.26 (m, 1 H), 2.38-2.14 (m, 2H) 2.10-1.80 (m, 2H)
Desprotección de poli(Y-bencil-L-glutamatos) reduciendo con Pd(OH)2 sobre carbón en DMF: Se disolvieron 100 mg (0.456) de poli(Y-bencil-L-glutamato) en 15 mL de DMF absoluto, en un matraz de fondo redondo provisto de un septum y una agitador magnético. Seguidamente se añadió paladio sobre carbónactivo al matraz que se purgó después con N2, y posteriormente con H2. La reacción se dejó agitando a temperatura ambiente durante dos días en atmósfera inerte proporcionada por un globo de hidrógeno. El producto se precipitó sobre un gran exceso de éter que tras centrifugación y eliminación del sobrenadante mediante percolado en celita, se eluyó con agua ácida a pH=3 (jer¡n9a Y filtro). Como resultado, se obtuvo ácido poliglutámico como polvo blanco. Rendimiento: 40%.
Arquitecturas versátiles (Polímeros dibloques tribloques y multibloque). Síntesis de tribloques (TBs) protegidos con grupos bencilo PEG-PGA-PEG:
Los sistemas tribloque (TB) de la presente invención fueron obtenidos mediante la reacción entre los dibloques (DB) PEG-PGA, previamente obtenidos utilizando n- PEG(2000) en su sal de tetrafluoroborano de amonio como iniciador, y un derivado de PEG funcionalizado con un grupo carboxilo activado como-NHS. El método general se detalla a continuación:
Figure imgf000027_0001
donde:
X representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados) m representa el número de unidades de etilenglicol en el fragmento polimérico PEG utilizado como primer bloque, de 1 a 500 n representa el número de unidades de y-bencil glutamato del bloque peptidico. 1 a 1000 p representa el número de unidades de etilenglicol en el fragmento polimérico PEG del tercer bloque, de 1 a 500
Para la obtención de TB50: se disolvieron 750 mg (0.058 mmol, Mw= 12854 g/mol) de DB50 en CH2CI2 anhidro, el pH de la disolución fue ajustado a 8.0 con DIEA y a continuación se añadieron al matraz de reacción 209 mg (0.104 mmol, Mw= 2007 g/mol) de mPEG-NHS. La reacción se dejó bajo agitación toda la noche. Después, el producto fue purificado mediante extracciones: primero con una disolución de NaOH 0.1 N, seguida de una extracción con cloruro sódico y finalmente con HCI 0.1 N. La fase orgánica fue recogida, secada sobre S04Na2, filtrada y concentrada mediante vacío. La solución concentrada fue precipitada sobre dietiléter frío. Tras 2h a -20°C, el polímero precipitado fue filtrado, lavado y secado a vacío. Siguiendo el mismo método se obtuvieron también TB100, TB200, TB400 y TB800, con las cantidades y rendimientos que se muestran en la tabla 5 siguiente: ncal:
Figure imgf000028_0001
Tabla 5:
Figure imgf000028_0002
Los productos obtenidos con el procedimiento de síntesis general detallado previamente fueron caracterizados mediante cromatografía de permeacion en gel (GPC) y resonancia magnética nuclear 1 H-NMR en CDCI3.
Posteriormente, TB50 fue disuelto en 5-7mL de ácido trifluoroacético (TFA). Tras su completa disolución, HBr 48% w/v en ácido acético fue añadido al matraz de reacción. La mezcla se dejó bajo agitación durante 16 horas. A continuación, el polímero fue precipitado sobre dietiléter frío. Tras 2h a -20°C, el polímero precipitado fue recuperado tras centrifugar la mezcla a 4000rpm durante l Ominutos a 4°C. El tribloque desprotegido (TBd) fue almacenado tras ser secado a vacío.
Figure imgf000029_0001
200 30
400 31
800 32
Tabla 6:
Figure imgf000029_0002
Los productos obtenidos con el procedimiento de desprotección general detallado previamente fueron caracterizados mediante cromatografía de permeabilidad en gel (GPC) y resonancia magnética nuclear 1 H-NMR en DMSO-d6.
Finalmente y con objeto de obtener la forma del TB soluble en disolución acuosa, el compuesto fue disuelto en una cantidad equivalente de NaHC03 1 M y H20 destilada. Tras solubilizar el polímero, la disolución fue purificada mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SEC, Sephadex G25) utilizando H20 destilada como eluyente. Se recogieron 50 fracciones de 3ml_ cada una (a excepción de la primera y la segunda alícuotas, de 10ml_ cada una). Las fracciones se liofilizaron y posteriormente se analizaron por 1 H-NMR en D20. En el caso de añadir un grupo funcional opcional en el extremo del segundo bloque de PEG, la síntesis del tribloque o del dibloque se lleva a cabo mediante la conjugación de una unidad de PEG bifuncional.
Como se cita anteriormente, PEG-PGA o n-BuPGA se obtienen mediante la reacción del monómero NCA-L-Glu-OBn con el iniciador MeO-PEG-NH3BF4ó nBuBF4, respectivamente. Variando la proporción inicial entre PEG iniciador: monómero, es posible obtener dibloques con diferentes unidades de ácido glutámico (como por ejemplo, n= 100, 200, 400 o 800).
El dibloque obtenido se encuentra en su forma protegida y los grupos protectores -OBn son eliminados en el paso previo a la introducción del nuevo bloque polimérico. Este segundo bloque de PEG es una derivado bifuncional COOH-PEG-SH cuyos grupos terminales se activan para la obtención final de NHS-PEG-SS-4TP. Esta doble activación, previa al paso de conjugación al bloque polipeptídico, se realiza para asegurar rendimientos elevados y evitar reacciones de entrecruzamiento. Este último bloque confiere a la estructura final del TB (o del DB en el caso de nBuPGA) un punto adicional de conjugación semitelequélica capaz de proporcionar conjugaciones específicas y selectivas al grupo funcional activado introducido, mediante la formación de puentes disulfuro.
Protocolo experimental detallado
Síntesis de PEG-PGAn-PEG4TP (TB)
Figure imgf000030_0001
donde: X representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados) m representa el número de unidades de etilenglicol en el fragmento polimérico PEG utilizado como primer bloque, de 1 a 500 n representa el número de unidades de y-bencil glutamato del bloque peptídico, de 1 a 1000 p representa el número de unidades de etilenglicol en el fragmento polimérico PEG del tercer bloque de 1 a 500 En un matraz de fondo redondo de 50ml_, 1 g de DB previamente desprotegido
(como ejemplo, n=200 unidades de GA; 1eq, MW=27692g/mol) se disolvió en 20ml_ de DMF anhidro y el sistema se purgó con N2. En un vial, 1.3 eq de NHS-PEG-SS-4TP (163.4 mg; MW=3480 g/mol) se disolvieron en 3ml_ de DMF anhidro y se purgó con N2 antes de añadirlo al matraz de reacción. El pH de la mezcla se ajustó a 8.0 con DIEA (1.5ml_ en este ejemplo) y se dejó bajo agitación a temperatura ambiente y atmósfera inerte durante 72h. A continuación, se evaporó el disolvente a presión reducida y el residuo se redisolvió en el mínimo volumen de NaHC03 1 M y se purificó mediante SEC (Sephadex G25, ddH20).Se recolectaron 50 fracciones de 2ml_ cada una (a excepción de la primera y la segunda alícuota con 10ml_ cada una). Las fracciones se liofilizaron y se analizaron por 1 H-NMR en D20. 1 H-RMN. (CDCI3, 300 ΜΗζ):δ: 2.8-2.9 (4H, t, J=6.3 Hz, Η6),δ: 3.3-3.8 (m, H3,4,5), δ: 7.4 (4H, d, J=4.5 Hz, H2,2), δ: 8.4 (4H, d, J=4.5 Hz, Η Α).
Para confirmar el porcentaje de grupos 4TP introducidos en la conjugación, se realizaron ensayos espectrofotométricos, uno de cuantificación directa (liberación del grupo 4TP) y otro de cuantificación indirecta (ensayo Ellman). El producto se almacenó para posteriores análisis y conjugaciones. Rendimiento: 35%, activación 90%, tal y como se muestra en la siguiente Tabla 7.
Tabla 7. 4TP
Rto.
Producto P t (d) activación
(%)
(%)
PEG-PGA100-PEG4TP TB100 33 3 - -
PEG-PGA20o-PEG4TP TB200 34 3 90 35
PEG-PGA40o-PEG4TP TB400 35
3 - -
PEG-PGA800-PEG4TP TB800 36 3 - -
Figure imgf000032_0001
400 35
800 36
Síntesis de nBuPGAn-PEG4TP (DB) El método general utilizado para la síntesis de dibloques se detalla a continuación:
Figure imgf000032_0002
donde: representa un grupo alquilo, por ejemplo n-butilamina, neopentil amina; una cadena carbonada (saturada y/o insaturada) con y sin presencia de átomos electronegativos (i.e. O en PEG-NH2) X representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados). n representa el número de unidades de y-bencil glutamato del bloque peptídico, de 1 a 1000
En un matraz de fondo redondo de 50ml_, 100mg de homopolímero desprotegido nBu-PGA con 200unidades de ácido glutámico (1g, 25857g/mol) se disolvió en 8ml_ DMF anhidro a temperatura ambiente y el sistema se purgó con N2. En un vial, 1.5 eq de NHS-PEG-SS-4TP (17 mg; 3357 g/mol) se disolvieron en 2ml_ DMF anhidro y se purgó con N2 antes de añadirlo al matraz de reacción. El pH de la mezcla se ajustó a 8.0 con DIEA y se dejó bajo agitación a temperatura ambiente y atmósfera inerte durante 72h. A continuación, se evaporó el disolvente a presión reducida y el residuo se redisolvió en el mínimo volumen de NaHC03 1 M y se purificó mediante SEC (Sephadex G25, ddH20). Se recolectaron 50 fracciones de 2ml_ cada una (a excepción de la primera y la segunda alícuota con 10ml_ cada una). Las fracciones se liofilizaron y se analizaron por 1 H-NMR en D20. Para confirmar el porcentaje de grupos 4TP introducidos en la conjugación, se realizaron ensayos espectrofotométricos, uno de cuantificación directa (liberación del grupo 4TP) como indirecta (ensayo Ellman). El producto se almacenó para posteriores análisis y conjugaciones. Rendimiento=64%, activación 90%, tal y como se muestra en la Tabla 8.
Tabla 8:
4TP Rto
Producto P t (d) activación
(%) (%) nBuPGA100-PEG4TP DB100 37 3 90 64 nBuPGA20o-PEG4TP DB200 38 - - - nBuPGA40o-PEG4TP DB400 39 - - - nBuPGA800-PEG4TP DB800 40 - - -
Figure imgf000034_0001
400 39 800 40
El grupo funcional -SS-4TP permitirá, tanto en TB como en DB-SS-4TP, la subsecuente conjugación de ligandos activos incluyendo péptidos, proteínas o anticuerpos mediante un enlace por puente disulfuro.
Química de bioconjugación.
Método general para etiquetado con Oregon Green cadaverina.
Figure imgf000035_0001
donde:
R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol).
R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol), PEG-tiol, PEG-4TP.
R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ((alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16); aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína? y grupos amino secundarios y terciarios. representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500 representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500 representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000 representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500
En un matraz de fondo redondo de dos bocas, se disolvieron 29mg de ácido poliglutámico (0.225 mmol GA, 1 eq) en 1 .5ml_ de DMF anhidro bajo flujo continuo de N2. Se añadieron a la reacción 1.12μΙ_ de N. N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) (0.85mg, 0.00674mmol, d=0.806 g/ml, Mw=126g/mol, 0.03eq) y tras 5 minutos de agitación, se añadió 1 mg (0.00674mmol, Mw=135, 1 g/mo,l 0.03eq) de hidroxibenzotriazol (HOBt) sólido. La reacción se dejó bajo agitación durante 10minutos y después se añadió 1 mg (2,01 - 10"3mmol, Mw=496,47g/mol, 0.0089eq) de Oregon Green cadaverina. El pH se ajustó a 8.0 con DI EA (100uL aprox.). La mezcla se dejó bajo agitación durante toda la noche protegida de la luz y bajo atmósfera inerte. Finalmente, el disolvente se evaporó bajo presión reducida y el residuo se disolvió en 300uL de agua y 50uL de NaHC03 1 M. La disolución se purificó mediante SEC (Sephadex G25/PD10) utilizando ddH20 como eluyente. La carga de OG se determinó por espectroscopia de fluorescencia (Aex=485nm, Aem=535nm) monitorizando la señal de cada fracción de la columna. Eficiencia general de etiquetado: 80-90%. Rendimiento de la reacción: 80-85%.
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
donde: representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ásteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol).
R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol), PEG-tiol, PEG-4TP.
R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ((alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16); aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína? y grupos amino secundarios y terciarios. x representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500 y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500 z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000 p representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500
En un matraz de fondo redondo de dos bocas, 59.6mg de DB200 (0.355mmol COOH) se disolvieron en 8ml_ de ddH20 y se dejó bajo agitación. En un vial aparte, se disolvieron 3.8mg de Cy5.5-NH2 (1.8% mol, Mw=588.36g/mol) en 13ml_ de ddH20 que posteriormente se añadieron a la reacción. A continuación 2.9mg de DMTMM HCI (Mw= 276.72g/mol, 1.5eq) se añadieron a la reacción. La mezcla se dejó bajo agitación 48h protegida de la luz a temperatura ambiente y bajo atmósfera inerte. La reacción se monitorizó por cromatografía de capa fina (metanol:ácido acético). Finalmente, el disolvente se evaporó bajo presión reducida y el residuo se disolvió en 300uL de agua y se purificó mediante SEC (Sephadex G25/PD10) utilizando H20 destilada como eluyente. La carga de Cy5. se determinó mediante fluorímetro (Aexc. 598 nm.Aem 655 nm) monitorizando la señal de cada fracción de la columna. Eficiencia general de etiquetado: 90.86% (1.63%mol Cy5.5). Rendimiento de la reacción: 60%. Modificación post-polimerización de bloque polipeptídico de ácido poliglutámico (PGA) mediante química ácido-base.
La modificación post-polimerización puede representar una aproximación atractiva para la síntesis de polímeros funcionales superando las limitaciones en muchas técnicas de polimerización controlada, la incompatibilidad de la presencia de diversos grupos funcionales en muchas técnicas de polimerización controlada. Debido a todas las ventajas expuestas en la metodología descrita anteriormente para la polimerización de NCAs, posteriormente se llevó a cabo un proceso de exploración de la modificación post-polimerización de los polímeros bien definidos obtenidos en las diversas polimerizaciones con vistas a la incorporación de funcionalidades para conjugaciones específicas a posteriori.
Para ello se llevó a cabo tanto PEGilación de PGA como la incorporación de propargilamina y aminoPEG-azidas. Por un lado, la PEGilación es una técnica bien conocida como el proceso de introducción covalente de cadenas poliméricas de PEG a otra molécula, normalmente un fármaco o una proteína terapéutica. La unión covalente de PEG a un fármaco o proteína terapéutica puede "enmascarar" al agente ocultándolo del sistema inmune del huésped (reduciendo inmunogenicidad y antigenicidad), aumenta el radio hidrodinámico del correspondiente agente (tamaño en disolución), lo que prolonga su tiempo de circulación reduciendo la excreción renal. La PEGilación puede también proporcionar solubilidad en agua de fármacos hidrofóbicos y proteínas. Por lo tanto, la introducción de unidades de PEG en la cadena polimérica no solo nos permitirá la introducción de un espaciador de PEG entre el polímero y el correspondiente agente bioactivo, sino que también puede modificar el comportamiento in vivo, la biodistribución y la aplicación terapéutica. Por otro lado, la modificación con grupos azida y alquino se eligió con la finalidad de obtener grupos funcionales adecuados para conjugación a través de química click de diversos agentes bioactivos con todos los beneficios que este tipo de química de conjugación ofrece. Método general para las técnicas de modificación post-polimerización.
En un matraz de fondo redondo provisto de un agitador magnético y un tapón de vidrio, se suspendieron 200 mg de ácido poliglutámico (1.55 mmol de unidades de ácido glutámico) en 10 mL de agua milliQ. Posteriormente, se añadieron 128,7 mg de DMTMMCI- disuelto en 5 mL de agua milliQ. Tras 10 minutos de reacción se añadió la cantidad (0,93 mmol 0.6 eq) de la correspondiente amina y el pH de la reacción se ajustó a 8 mediante la adición de algunas gotas de una disolución 1 M de NaHC03. La reacción se dejó agitar durante una noche a temperatura ambiente. Posteriormente, debido a que todos los subproductos son solubles en agua, el producto se purificó o por ultrafiltración (utilizando una membrana de tamaño de peso molecular 3000) o SEC (cromatografía por exclusión de tamaño) a través de columna de sephadex G25. Alternativamente el producto puede purificarse por precipitación acido/base. Tras liofilizar la muestra en cualquiera de los casos, se obtuvo un sólido blanco amorfo.
Rendimiento: 80-90%. 1 H-NMR PGA modificado con propargilamina (300 MHz, D20) δ: 4.30 - 4.02 (m, 1 H), 3.81 (s)*, 2.48 (s)*, 2.35 -2.02 (m, 2H), 2.01- 1 .65 (m, 2H). 1 H-NMR PGA modificado con PEG-azida (300 MHz, D20) δ: 4.28 - 4.07 (m, 1 H), 3.65 - 3.51 (m)*, 3.48 (t, J = 5.6 Hz)*, 3.40 - 3.30 (m)*, 3.25 (d, J = 4.9 Hz)*, 2.29 -2.00(m, 2H), 1.98 - 1.65 (m, 2H). 1 H-NMR PGA modificado con PEG-oMe (300 MHz, D20) δ: 4.33-4.19 (m, 1 H), 3.95 - 3.78 (m)*, 3.77 - 3.49 (m)*, 3.34 (s)*, 2.41 - 1.76 (m, 4H)
*EI número de protones correspondiente a las integrales marcadas con * depende del porcentaje de funcionalización en el polímero.
Modificación post-polimerización con propargilamina.
La modificación post-polimerización de PGA con propargilamina se llevó a cabo según lo descrito por "K. Thompson, S. Michelsen. J. Poly. Sci. : Part A: Poly. Chem. 2006, 44, 126-136" con ligeras modificaciones. La activación de los grupos carboxílicos de la cadena del polímero PGA se llevó a cabo mediante el uso del cloruro de 4-(4,6- Dimetoxi-1 ,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolina (DMTMMCI")- Posteriormente, se añadió propargilamina al medio de reacción dando lugar al correspondiente polímero modificado con grupos alquino. El mecanismo de acción de DMTMMCI- se muestra posteriormente y consiste en la formación del correspondiente éster activado con liberación de 4-metilmorfolina en un primer paso. Este éster activado reacciona posteriormente con la correspondiente amina. Para ello es necesario ajustar el pH de la mezcla de reacción a 8, de manera que se favorece el carácter nucleofílico de la amina (a pH inferior la amina se encontraría protonada careciendo del mismo). Se muestra a continuación el esquema de reacción.
Figure imgf000041_0001
Donde n representa el número de unidades de glutámico, de 1 a 1000 x representa el número de unidades de glutámico modificadas con propargilamina, de 1 a 1000
La reacción se dejó proceder durante 16 horas. Tras ello, se testaron diferentes procesos de purificación del producto resultante. a) Uno de ellos se basa en la precipitación acido/base del polímero de PGA.
Este método tiene su fundamento en el hecho de que PGA es insoluble en agua cuando se encuentra protonado como ácido carboxílico, y es completamente soluble cuando se encuentra formando la sal sódica. Por lo tanto, puesto que todos los subproductos de reacción son solubles en agua, el polímero puede purificarse por precipitación en agua ácida (pH~3-4) y redisolución por basificación con una disolución de bicarbonato sódico. El proceso se repite tres veces para dar lugar a un polímero blanco tras liofilizar la muestra.
b) Ultrafiltración, usando una membrana con corte de peso molecular de
3.000 dio lugar también al compuesto puro tras liofilizar la muestra. c) El uso de columnas sephadex G25 de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) también se probó para la purificación del correspondiente producto dando lugar a una correcta separación por peso molecular. El compuesto se obtuvo puro en las primeras fracciones tras liofilizar la muestra. En todos los casos el producto se obtuvo puro con rendimientos comparables de entorno al 80 %. Debe ser mencionado que el método de ultrafiltración es preferible cuando se preparan grandes cantidades del compuesto y Sephadex G25 (columnas comerciales PD10) son preferibles cuando se preparan pequeñas cantidades de producto. Sin embargo, los tres métodos son completamente válidos como ha sido comprobado en este trabajo. Una vez purificado, el contenido de grupos alquino en el polímero se determinó mediante la integración de las correspondientes señales de propargilamina en el espectro de 1 H-NMR en agua deuterada en comparación con las correspondientes señales de PGA. En concreto, el pico situado a 3.81 ppm se corresponde con los dos protones de los grupos CH2 del residuo de propargilamina y la señal a 2.48 ppm se corresponde con el protón acetilénico del residuo de propargilamina en el polímero. Así, en comparación con las señales correspondientes al polímero de PGA puede calcularse el % de sustitución en cada polímero. Como ejemplo de 1 H-RMN se adjunta la Figura 6. Se sintetizaron diferentes polímeros con diferentes grados de sustitución. El grado de sustitución de acuerdo a las señales de H-RMN fue de aproximadamente un 60% del esperado por los equivalentes añadidos. Los resultados se encuentran resumidos en la tabla inferior.
Tabla 9: Polímeros modificados con grupos alquino.
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El peso molecular resultante se calculó teniendo en cuenta el % de unidades de ácido glutámico (GA).
Modificación Post-polimerización conNH2-PEG(2)-N3 y NH2-PEG(6)-N3.
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Donde n representa el número de unidades de glutámico, 1 a 1000 x representa el número de unidades de glutámico modificadas con Etilenglicol, de 1 a 1000
Se siguió el mismo procedimiento descrito anteriormente para la incorporación de unidades oligoetilenglicol azida en la cadena polimérica de PGA. Una vez purificados los polímeros modificados, el contenido de oligoetilenglicol en los mismos se determinó a través de la integración de las correspondientes señales de etilenglicol en el espectro de 1 H-NMR registrado en agua deuterada. En comparación con las señales de PGA. En concreto, los picos a desplazamientos químicos 3.26, 3.35 y 3.48 ppm se corresponden con los protones CH2 cercanos al grupo amida y azida. La señal mayor a 3.55 ppm se corresponde con los grupos CH2 localizados en el interior de la cadena de oligoetilenglicol más un triplete exterior correspondiente a dos protones CH2. La integral de esta última señal varía en función de si la modificación se realiza con EG2 (dos unidades de etilenglicol en el interior de la cadena, lo que se corresponde con 10 protones) o si es EG6 (en cuyo caso se correspondería con 50 protones). Por lo tanto, el % de sustitución en cada polímero fue calculada de igual forma, comparando las integrales correspondientes a los grupos EG con las señales de PGA. Como ejemplo de espectro de 1 H-RMN véase la Figura 7.
Se sintetizaron diferentes polímeros con diversos grados de sustitución. El grado de sustitución de acuerdo con el espectro de 1 H-RMN fue de aproximadamente un 70-80% del valor teórico esperado cuando se pretendía bajo grado de sustitución, y alrededor de un 60% cuando se pretendía una sustitución superior. Los resultados se encuentran resumidos en la tabla inferior.
Tabla 10. Poliglutamatos modificados con unidades oligoEG azida
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El peso molecular de los copolímeros resultantes se calculó en base al peso molecular de las unidades de oligoetilenglicol en cada caso. PEGilacion de PGA.
Se sintetizaron diferentes polímeros con diferente grado de PEGilacion en la cadena lateral con la finalidad de estudiar las diferentes propiedades físico-químicas que dicha PEGilacion puede aportar a las arquitecturas de ácido poliglutámico. Para dicho propósito se utilizó metoxioligoetilenglicol amina siguiendo el protocolo descrito anteriormente para la modificación post-polimerización del polímero con unidades de etilenglicol (en este caso sin grupo funcional azida). El conjunto de polímeros sintetizados se encuentra resumido en la tabla inferior.
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Donde n representa el número de unidades de glutámico, 1 a 1000 x representa el número de unidades de glutámico modificadas con Etilenglicol 1 a 1000
Tabla H .Poliglutamatos modificados con metoxioligoEG
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Modificación post-polimerización por Química Click
Acoplamientos modelo por Química Click
En un matraz de dos bocas de fondo redondo provisto de un agitador magnético, 1 equivalente de copolímero (PGA y EG(2)N3, EG(6)N3 o propargilamina en cada caso) en forma de sal sódica se disolvió en agua milliQ. Posteriormente, se añadió la correspondiente cantidad para la introducción del porcentaje deseado del correspondiente compuesto azida/alquino en su caso en DMF absoluto. Posteriormente, se añadió cinco equivalentes de ascorbato sódico (Mw=198.1 1 g/mol) en disolución de agua milliQ. Tras ello, la mezcla se desgasificó mediante dos ciclos de congelaciony descongelación a vacío. Posteriormente, se añadió un equivalente de CuS04 (Mw= 249.68 g/mol) (pesado bajo atmósfera de N2) a la mezcla de reacción cuya proporción final de mezcla de disolventes debe DMF/H20 4: 1. La mezcla completa se volvió a desgasificar con un ciclo más de congelación y descongelación a vacío y se dejó reaccionar bajo atmósfera de N2 en un baño de aceite durante 40 °C durante tres días, protegida de la luz.
Figure imgf000048_0001
Donde n representa el número de unidades de glutámico, 1 a 1000 x representa el número de unidades de glutámico modificadas con propargilamina, 1 a 1000
Tabla 12. Condiciones de reacción y resultados de las reacciones modelo de acoplamiento por click chemistry entre PGA modificado con grupos alquino y oligoEG- azidas.
Sistema Eq. por
Experimento Disolvente Eficacia.
°c catalítico unidad
CuS04/Ascorb
H20 40 ato sódico 3 (20%) 88 %
(0.3/0.5)
CuSCVAscorb
H20 40 ato sódico 6 (40%) 97 %
(1/5)
CuSCVAscorb
DMF/
ato
40 6 (40%) 48 % sódico(0.3/0.5
H20
)
DMF/ CuSCVAscorb
40 ato sódico 2 (9%) 67 % H20 (1/5)
CuSCVAscorb
6 H20 40 ato sódico 6 (40%) 96 %
(1/5)
Figure imgf000050_0001
Donde n representa el número de unidades de glutámico, 1 a 1000 x representa el número de unidades de glutámico modificadas con Etilenglicol 1000
Tabla 13: Condiciones de reacción y resultados de las reacciones modelo de acoplamiento por click chemistry entre PGA modificado con grupos oligoEG-azidas y propargilamina
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000051_0001
De los resultados obtenidos pueden establecerse las siguientes conclusiones: -Las condiciones óptimas de reacción en disolución acuosa son: el uso del sistema catalítico CuS04/ Ascorbato sódico (1/5) a 40 °C dando lugar a una eficacia de conjugación de 96-97%.
-El uso de mezclas DMF/H20 (4: 1) con CuS04/Ascorbato sódico (1/5) como catalizador permite la posibilidad de conjugación moléculas hidrofóbicas (péptidos/fármacos) no solubles en agua. La eficacia de conjugación es siempre inferior cuando se usan mezclas DMF/H20 pero es aceptable y predecible. Como ejemplo de análisis de resultados por 1H-RMN se adjunta la Figura 8.
Modificación de post-polimerización mediante enlaces amida
Conjugación de DTPA/DOTA
Los complejos de gadolinio/galio como por ejemplo Gd-DTPA, Ga-DOTA o sus derivados se emplean de manera habitual como agentes de contraste en la técnica MRI (MRI, Magnetic Resonance Imaging) o PET (PET, Positrón Emission Tomography), respectivamente. El porcentaje de Gd o Ga introducido depende directamente del número de unidades de glutámico del bloque peptídico. Para su complejación es necesario introducir unidades complejantes, como el DTPA (ácido dietilentriaminopentacético) o DOTA (1 ,4,7,10-tetraazaciclododecano-1 ,4,7, 10-ácido teraacético). Los grupos carboxilo del PGA se funcionalizan con una diamina monoprotegida, con el objetivo de tener un grupo NH2 disponible (tras la desprotección) para la formación de enlaces amida con el DTPA dianhidrido o DOTA. La di-amina monoprotegida evita procesos de entrecruzamiento.
Teniendo en cuenta que el número de unidades de glutámico puede modularse en la síntesis de partida, el porcentaje de Gd o Ga puede ser optimizado fácilmente dependiendo de las necesidades del equipo de análisis. El acoplamiento de la diamina a los grupos carboxilos del tribloque, seguido de la conjugación del agente quelante DTPA/DOTA para la final complejación de gadolinio, fue realizado siguiendo el protocolo detallado a continuación, obteniendo porcentajes de diamina injertada variables.
Tras obtener el TB en su forma soluble en DMF (previa precipitación mediante adición de ácido hasta pH=4) se procede a la conjugación detallada a continuación.
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donde: R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol). R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol), PEG-tiol, PEG-4TP.
R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ((alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16); aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína? y grupos amino secundarios y terciarios. x representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500 y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500 z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000 p representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500
TB200 (34.5mg; 31044g/ml, 1.1 1 - 10"6mol) se disolvió en 5ml_ de DMS anhidro a temperatura ambiente y bajo flujo continuo de N2. Tras su disolución completa, 1 .5eq de DIC fueron añadidos (d=0.806 g/ml, Mw=126g/mol). Después de 5 minutos en agitación, se añadieron 1.5eq de HOBt (Mw=135, 1 g/mol) como sólido. La reacción se dejó bajo agitación durante 10minutos y después se añadió la diamina mono-protegida: hidrocloruro de 2,2-Fmoc(aminoetoxi)etilamina (59 mg; 362.85 g/ml; 1.62- 10"4 mol; 200 eq). El pH se ajustó a 8.0 con DI EA (300uL aprox.). La mezcla se dejó bajo agitación durante 24h bajo atmósfera inerte. La reacción fue monitorizada por cromatografía de capa fina (TLC). Finalmente, el disolvente se evaporó bajo presión reducida y la diamina monoprotegida no reaccionada se eliminó mediante el lavado del residuo con 8-10mL de una mezcla cloroformo:acetona (4: 1) y se cuantificó por espectrofotómetro (Fmoc, 290nm). La subsecuente desprotección de la diamina se llevó a cabo en DMF:piperidina (4: 1) a temperatura ambiente, atmósfera inerte durante 1 h. De nuevo, el disolvente se evaporó bajo presión reducida y el Fmoc liberado fue separado del producto mediante lavados con la mezcla cloroformo: acetona (4:1). Dicha mezcla fue evaporada y el residuo se utilizó para cuantificar de forma directa la cantidad de grupos NH2 introducidos en el polímero (Fmoc, 290nm). El producto fue secado y almacenado para su posterior uso.
Quelación del ion Gadolinio (Gd3+)
Para la complejación con el ion gadolinio, se empleó una proporción (1 : 1) DTPA:GdCI3. El producto TB200 funcionalizado con DTPA se resuspendió en 5ml_ de PBS 1 M pH=7.4 bajo agitación a temperatura ambiente. GdCI3 (263.61 g/mol, 1.14- 10"4 mmol) se disolvió en ddH20 (concentración=100mg/ml_) y se añadió gota a gota a la reacción. Tras cada adición se comprobó el pH, manteniéndolo constante a 7. Tras 4 h de reacción, se comprobó mediante el indicador 4-(2-piridilazo)resorcinol si existía gadolinio libre en el medio. El viraje de amarillo a naranja denota la existencia de ligando libre.
Tras comprobar la ausencia de ligando libre, la mezcla de reacción se liofilizó y el residuo obtenido se redisolvio en ddH20 para proceder a su purificación por columna cromatográfica Sephadex G25 utilizando ddH20 como eluyente. Se recogieron 50 fracciones de 2ml_. El producto obtenido (TB-DTPA/Gd), será caracterizado por absorción atómica cuantificar la cantidad de gadolinio complejada. Rendimiento=50%.
Figure imgf000055_0001
x representa el número de unidades de monomero incluido en definición R1 , de 1 a 500 y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 1000 z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000 q representa el número de unidades de glutámico modificadas con DTPA, de 1 a 1000 p representa el número de unidades de monomero incluido en definición R2, de 1 a 500 η^ι representa el número de unidades de glutámico teóricas en el polímero, de 1 a 1000 En el caso de DOTA-Ga, tras obtener el polyglutamato en su forma soluble en DMF (previa precipitación mediante adición de ácido hasta pH=4) se procede a la conjugación detallada a continuación que permite la obtención de la siguiente familia de derivados PGA-DOTA.
Figure imgf000056_0001
representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol).
R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol), PEG-tiol, PEG-4TP.
R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ((alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16); aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína? y grupos amino secundarios y terciarios. x representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500 y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500 z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000 p representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500 En un matraz de fondo redondo, se pesó PGA (1 eq, average MW GA unit=129g/mol) y el sistema fue purgado con una corriente continua de nitrógeno. El polímero se disolvió en 20 ml_ DMF anh, posteriormente DIC ( 1.5eq, 0.836g/cm3, 126.20g/mol) se introdujo en la reacción y 5 min después HOBt (1.5eq, 135.10g/mol) tamién fue añadido como sólido. A los 10min, el derivado DOTA-NH2 (tert-butyl 2,2',2"-(10-(2- (2aminoethylamino)-2oxoethyl)-1 ,4,7-tetrazacyclododecane-1 ,4,7-triyl)triacetate (eq. dependiendo de la derivatizacion requerida 0.02-0.1 eq. 614.82/mol) se disolvió en DMF anh y fue añadido gota a gota sobre el polímero activado. El pH se ajustó a 8 con DI EA. Después de 48 h agitando a temperature ambiente la solución se concentró a vacío. El conjugado se purificó por precipitación en un exceso de acetona. Después de a centrifugación (2600rpm, 4°C, 10min) un sólido ligeramente amarillento fue recogido y secado a vacío. El percentage de DOTA en el polímero fue determinado por análisis NMR-1 H (D20) (entre 2-10 mol%).
Alternativamente, en un matraz de fondo redondo DB200 (0.7166mmol, 1eq, average MW GA unit (salt form) =171.31g/mol) se disolvió en 5ml_ ddH20. A continuación, DMTMM CI (0.0717mmol, 0.115eq, 0.836g/cm3, 126.20g/mol) se añadió a la reacción y después de 10min, DOTA-NH2 (para 1 1.5%mol, 0.0717mmol, 0.115eq, 614.82/mol) previamente disuelto en anh. DMF (1 ml_) se añadió gota a gota a la reacción. El pH se ajustó a 8 con DIEA. Después de 48 h agitando a temperature ambiente la solución se concentró a vacío. El conjugado se purificó por precipitación en un exceso de acetona. Después de a centrifugación (2600rpm, 4°C, 10min) un sólido ligeramente amarillento fue recogido y secado a vacío. El porcentage de DOTA en el polímero fue determinado por análisis NMR-1 H (D20) (entre 2-12 mol%). Rendimiento de la reacción >70%.
Para evitar reacciones de entrecruzamiento, los grupos carboxilo están normalmente protegidos, por ejemplo como ter-butilo. Estos carboxilos son desprotegidos antes de la complejación de 68Ga en una mezcla CH2CI2 /TFA (3:2, v/v) en agitación durante 15 h a temperatura ambiente o en en una mezcla TFA/H20/TIS (95:2.5:2.5 v/v) durante 3h a temperature ambiente. EL conjugado se aisló mediante precipitación en exceso de éter dietílico frío, fue lavado y secado a vacío. Rendimiento cuantitativo. La completa desprotección se ratificó por NMR-1 H.
Toxicidad y recuperación celular a través del ensayo de MTT
El ensayo de MTT mide la proliferación celular así como la reducción de la viabilidad celular cuando acontecimientos metabólicos conducen a apoptosis o necrosis. También puede usarse para evaluar la tasa de supervivencia de una línea celular dada cuando se incuba en presencia de compuestos xenobióticos. La reducción de sales de tetrazolio se acepta como una manera fiable de analizar la proliferación celular. El MTT de tetrazolio amarillo (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5 difeniltetrazolio) se reduce por células metabólicamente activas y da como resultado la formación intracelular de formazán púrpura que puede medirse espectrofotométricamente tras la solubilización con DMSO. Se usó el ensayo de MTT en esta invención para evaluar la toxicidad de los compuestos a diferentes concentraciones. Para analizar su posible alteración de la viabilidad celular, se añadieron los compuestos a las líneas celulares HeLa y HUVEC a diferentes concentraciones y se incubaron hasta 72h. Los resultados se muestran en las Figuras 9A y 9B. En la figura 9A se puede observar como para los compuestos TB400 [P: 35 donde X=OMe o S-S-4TP] y TB800 [P: 36 donde X=OMe o S-S-4TP] la viabilidad celular es superior al 80 % tras 24 y 72 horas de incubación en células HUVEC. En la figura 9B se muestra la comparación en términos de viabilidad celular del compuesto TB200 [P: 34 donde X=OMe o S-S-4TP], en diferentes líneas celulares (HUVEC y HeLa) a diferentes tiempos de incubación.
Estudios de internalización celular
Se ha estudiado de forma comparativa los polímeros sintetizados con diferente Mw y conformación en solución en células HeLa y HUVEC. Se han utilizado técnicas de citometría de flujo (Figura 2A) y microscopía confocal de fluorescencia de célula viva (Figura 2Ab) con polímeros marcados fluorescentemente con oregon green (OG- cadaverine). El polímero sintetizado con los grupos -COOH desprotegidos (P-COOH, 1 equiv.) se disuelve en DMF anhidro bajo atmósfera de N2, posteriormente el fluoróforo (OG-NH2 0.1 equiv.) en DMF anhidro se añade junto con trietilamina (hasta pH 8). La reacción se monitoriza por TLC, una vez finalizada el polímero se purifica mediante SEC (columnas PD10, Sephadex) y la carga fluorescente se determina con el fluorímetro (cuantificación de fluorescencia del crudo y del polímero purificado). TB10 se halló fuera de los límites de detección del sistema por tanto TB-OG50, TB-OG100 y TB-OG200 fueron analizados. Los estudios de internalización celular se llevaron a cabo en presencia de leupeptina (inhibidor de tiol proteasas) para evitar la degradación del portador polimérico.
En células HeLa, mientras que TB50 y TB100 presentaron un aumento lineal de la fluorescencia asociada a célula, TB200 muestra una más rápida internalización llegando a estabilizarse antes de las 5h. Además, a 4°C TB200 presenta un aumento de fluorescencia asociada a tiempos cortos, en particular, a 30 min indicando una posible mezcla de mecanismos de internalización celular (dependientes de energía (i.e. endocitosis) + independiente de energía (i.e. difusión)). Esta observación se corrobora con las gráficas e imágenes de microscopía confocal mostradas en la Figuras 10A, 10B.
Este mecanismo mixto de internalización no se observa en células HUVEC para ninguno de los polímeros analizados (Figura 1 1A y 1 1 B). Las células HUVEC internalizan los TB mediante endocitosis (colocalización lisosomal Figura 1 1 B) y además su capacidad de internalización es mucho mayor que la observada en HeLa para los mismos compuestos (comparación Figura 10A y 1 1 A). Todos los experimentos se realizaron con los mismos equivalentes de OG en todos los casos. Las imágenes obtenidas utilizando un marcador lipídico de membrana, demuestran también que estos polímeros no se asocian a membrana plasmática y son casi cuantitativamente internalizados (Figura 10B)
Estudios de degradación en tampón a diferentes valores de pH, en plasma y en presencia de catepsina B
Para evaluar la biodegradabilidad tanto hidrolítica como enzimática de los nuevos polímeros sintetizados se llevaron a cabo distintos estudios de estabilidad detallados a continuación. Todas las muestras tomadas fueron analizadas mediante HPLC y GPC.
Degradación a distintos pH
Los polímeros fueron disueltos en tampón PBS a pH 5.5, 6.5 y 7.5 a una concentración de 3mg/mL. Las disoluciones fueron incubadas a 37°C, se tomaron alícuotas de 100uL a distintos tiempos que fueron congeladas para su posterior análisis.
Degradación en plasma
Para obtener plasma sanguíneo, un volumen de sangre recientemente obtenida de rata/ratón se centrifugó a 12000rpm durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante (plasma) se separó del pellet(o botón celular) obtenido y se utilizó para disolver los polímeros a una concentración de 3mg/mL. Las disoluciones fueron incubadas a 37°C y se tomaron alícuotas de 100uL a distintos tiempos que fueron congeladas para su posterior análisis.
Degradación enzimática (catepsina B)
Los polímeros fueron disueltos en tampón de acetato sódico 20mM pH 6.0 a una concentración de 3mg/mL, en presencia de EDTA 2mM, DTT 5mM y 6.25 unidades de catepsina B (disueltas en tampón acetato). Las disoluciones fueron incubadas a 37°C y se tomaron alícuotas de 100uL a distintos tiempos que fueron congeladas para su posterior análisis. Estudios de biodistribución In vivo
El trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con la legislación local y con la aprobación del Comité Ético del Bienestar Animal del CIPF y de acuerdo con la legislación europea vigente. Los animales se mantuvieron respetando el ciclo de vigilia/sueño de 12h y controlando las condiciones ambientales de temperatura y humedad, y se les suministró agua y comida.
Estudios de biodistribución mediante mareaje fluorescente. Utilización de Oregon Green (OG) como sonda. Para el estudio de la biodistribución, se llevaron a cabo análisis ex vivo de la acumulación de los homopolipéptidos, di- y tri-bloques en los distintos órganos del modelo in vivo (ratas Wistar) mediante cromatografía líquida de alta eficacia (High Presured Liquid Chromatography, HPLC) y espectrofotómetro de fluorescencia. Como ejemplo preliminar de la presente invención se detalla a continuación el experimento realizado con TB200 marcado con OG.
Una rata fue inyectada vía intravenosa con 14mg/ml_ de TB200 etiquetado con OG. El animal fue sacrificado tras 4h (experimento con nomenclatura TBO-4h); una segunda rata fue inyectada vía intravenosa con la misma cantidad de compuesto siendo sacrificada tras 24h (experimento con nomenclatura TBO-24h). Como experimento control, una rata fue inyectada vía intravenosa con 14mg/ml_ de TB200 sin etiquetar y fue sacrificada tras 4h (experimento con nomenclatura TB-4h).
Inmediatamente tras el sacrificio, se recolectó la sangre y los órganos se pesaron siendo rápidamente congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80°C. Los órganos a analizar fueron cerebro, cerebelo, corazón, hígado, riñon, vejiga, estómago, intestino y tejido muscular. Cada uno fue tratado con una solución de lisis compuesta por 40%EtOH/6%HCIO4 (4mL por gramo de tejido). A continuación se homogeneizó la muestra con Ultraturrax (aprox. 1 min, 13000rpm). La suspensión se centrifugó durante 60min a 4000g a 4°C, recuperando el sobrenadante para el posterior análisis. El suero siguió un tratamiento similar: tras centrifugar la sangre, el sobrenadante se recolectó y se le añadió el mismo volumen de la disolución de ácido perclórico. Tras centrifugar la muestra (10min, 12000rpm, 4°C), se recogió el sobrenadante para su posterior análisis.
Para mejorar la extracción del polímero de la mezcla, los pellets obtenidos se sometieron a ultrasonidos durante 1 h tras añadir 2ml_ ddH20 y 1 ml_ de una solución 1 M NaHC03. Después se centrifugaron las muestras con las condiciones nombradas previamente y el sobrenadante se guardó para analizarlo.
Tras la observación de la sensibilidad del OG al pH del medio (la fluorescencia disminuye notablemente en pH ácido), después del tratamiento con la solución de ácido perclórico los sobrenadantes fueron neutralizados con NaOH, liofilizados y redisueltos en 1 ml_ de PBS pH=8 para el posterior análisis.
Todas las muestras obtenidas tanto de tejidos como de suero, (sobrenadantes de los tratamientos con la mezcla perclórica, sobrenadantes de la mezcla perclórica basificados y sobrenadantes del tratamiento con C03HNa fueron estudiadas mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y espectrofotometro de fluorescencia. Los resultados preliminares del presente análisis se muestran en los gráficos de las Figura 12A y 12B.
La fluorescencia en plasma (Figura 12A) fue cuantificada con un espectrofluorímetro: directamente, tras el tratamiento con la mezcla perclórica, tras el lavado con metanol del pellet obtenido en el anterior tratamiento y tras el lavado con acetonitrilo del mismo pellet. En los gráficos de la Figura 12 se observa que la fluorescencia de partida en el plasma se pierde tras el tratamiento con la mezcla perclórica. Esta conclusión hace posible que el TBO precipite junto con las otras proteínas presentes en el plasma (es posible que esta especie polimérica forme agregados con las proteínas plasmáticas). Debido a este hecho, el pellet fue lavado con una disolución de bicarbonato sódico como se ha detallado previamente en el protocolo descrito para los tejidos, con el objetivo de obtener la sal sódica del tribloque y solubilizarla en la fase acuosa para su posterior análisis mediante la medida de la fluorescencia. Estudios de biodistribución mediante mareaje fluorescente. Utilización de Cyane5.5 (Cy5.5) como sonda.
De forma paralela al estudio de biodistribución descrito previamente, el mareaje de los polímeros se llevó a cabo con una sonda fluorescente con emisión cercana al infrarrojo y elevada penetrabilidad en tejido, Cyane5.5 (Cy5.5, Aexc. 675 nm, Aem 694 nm). El estudio in vivo se realizó en ratones atímicos nude Foxl n nu/nu. Tras la inyección intravenosa de los compuestos poliméricos marcados con Cy5.5, se tomaron imágenes de fluorescencia in vivo y a posteriori ex vivo (de los órganos extraídos) mediante la plataforma de imagen óptica Xenogen IVIS® Spectrum. Este sistema permite la visualización, seguimiento y cuantificación de actividades tanto celulares como genéticas dentro de un organismo vivo a tiempo real, mediante bioluminiscencia o fluorescencia, así como de órganos ex vivo o ensayos in vitro.
En este estudio se utilizó la metodología de análisis de la fluorescencia descrita anteriormente para el caso del mareaje fluorescente con OG. Como ejemplo preliminar de la presente invención se detalla a continuación el experimento realizado con DB100 etiquetado con Cy5.5. La única excepción es que la sensibilidad de la sonda Cy5.5 al pH no fue la misma que el OG por lo que el lavado de los pellets con NaHC03 1 M no fue necesario ya que no aportaron más datos. Un ejemplo de las imágenes obtenidas se muestra en la Figura 13.
Estudios de biodistribución mediante imagen por resonancia magnética (MRI).
La Imagen por Resonancia Magnética (MRI) es una técnica no invasiva y no ionizante que utiliza el fenómeno de la resonancia magnética para obtener información sobre la estructura y composición el cuerpo analizado. Constituye una herramienta única para contrastes entre tejidos, siendo capaz de distinguir entre tejidos sanos y enfermos.
El uso de agentes de contraste en MRI se justifica cuando no es posible cambiar el contraste inherente del tejido para obtener mayor precisión en las imágenes. Estos agentes se basan en los cambios de los tiempos de relajación longitudinales (T1) y transversales (T2) de los protones del agua y/o en la susceptibilidad magnética del agua de los tejidos donde se acumulan. Un agente de contraste de MRI se caracteriza por poseer propiedades para- o superpara-magnéticas y por norma general se divide en dos componentes: el ión metálico con propiedades magnéticas cuya forma libre es tóxica para el organismo, y un quelante que además de prevenir la toxicidad del anterior, va a permitir ajusfar la farmacocinética del producto según los intereses.
En la presente invención se ha utilizado el metal gadolinio (Gd) como agente de contraste por sus propiedades paramagnéticas, las cuales incrementan el tiempo de relajación T1 de los protones del agua.
Para MRI invivo, el núcleo hidrógeno parece ser el mejor blanco ya que de todos los núcleos presentes en los tejidos es el que produce la mayor señal de RMN, y por generar el mejor contraste entre los tejidos ya que provee varias maneras para manipular el contraste de la imagen final.
Los estudios preliminares in vivo empleando esta técnica fueron llevados a cabo para determinar la biodistribución de los nuevos polímeros mediante otra técnica alternativa a los métodos por fluorescencia previamente descritos en la presente memoria y a su vez comparar cuál de ellos ofrece mejores características para la posterior conjugación a fármaco. Los tribloques (TB200-DTPA y TB800-DTPA) marcados con Gd se inyectaron en ratas por vía intravenosa, administrando una dosis de 0.2mmol Gd3+ por kg animal, y se monitorizaron mediante resonancia magnética por imagen (MRI). Los experimentos fueron realizados en un sistema Bruker Pharmascan (Bruker Medical Gmbh R, Ettlingen, Alemania). El agente de contraste se administró a través de la vena de la cola como un bolo 9minutos después de iniciar la adquisición.
Los resultados del experimento descrito previamente permitieron detectar la presencia de los conjugados en circulación sin observar acumulación en tejidos específicos, como por ejemplo el cerebro (ver la Figura 14). No se observaron efectos de toxicidad. Ambos productos no resultaron tóxicos en los animales, demostrando su biocompatibilidad.
Estudios de biodistribución mediante imagen por tomografía de emisión de positrons (PET) Positrón Emission Tomography (PET) es una técnica para detreminar cuantitativamente la concentración in vivo de compuestos marcados con emisores de positrones. La cantidad que es medida por PET es la concentración regional in vivo de emisores de positrones que incluso permite el estudio de procesos metabólicos. En la presente invención se ha utilizado el metal galio (68Ga) como radioisótopo debido a su tiempo de vida media (68 min) y a sus necesidades de complejación (DOTA). Además este radiotrazador está descrito como el más adecuado para tumores neuroendocrinos por el reconocimiento de somatostatinas. La monitorización se ha llevado a cabo en un equipo PET-CT. Los equipos de PET-CT tienen la gran ventaja de que en caso de duda diagnostic, es possible la correlación anatómica directa.
Estudios preliminaries de biodistribución por PET se han llevado a cabo (Figura 15). Estos estudios permitieron detectar la presencia de los conjugados en circulación sin observar acumulación en tejidos específicos, como por ejemplo el cerebro, hígado, pulmones y una clara eliminación renal (ver la Figura 15). No se observaron efectos de toxicidad en ningún caso estudiado.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de a-aminoácidos(NCAs) caracterizado por utilizarun anión no nucleofílico como iniciador: el tetrafluoroborano, de acuerdo con la siguiente fórmula:
Figure imgf000069_0001
donde:
R representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol). n representa el número de unidades de y-benzylglutamato en el polímero, de 1 a
1000
2. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de a-aminoácidos(NCAs), de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que el tetrafluoroborano es el tetrafluoroborano de amonio.
3. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de a-aminoácidos(NCAs), de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que R es la n-butilamina.
4. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de a-aminoácidos(NCAs), de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el que R es polietilenglicol.
5. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de a-aminoácidos(NCAs), de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, obteniéndose el producto con forma de di-bloque cuya síntesis se muestra en la fórmula siguiente:
Figure imgf000070_0001
Donde R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol) y R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados); etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16); aminoácidos tales comolisina, arginina, imidazol ehistidina, y grupos amino secundarios y terciarios, y x representa el número de unidades de monómero incluido en definición R1 , de 1 a 500 y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 1000 z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000
Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de α-aminoácidos (NCAs), de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, obteniéndose el producto con forma de tri-bloque cuya estructura se muestra en la siguiente fórmula:
Figure imgf000071_0001
Donde
R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol). R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol), PEG-tiol, PEG-4TP.
R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ((alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16); aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína y grupos amino secundarios y terciarios. x representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500 y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500 z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000 p representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500
7. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de α-aminoácidos (NCAs), de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, mediante la reacción entre los dibloques PEG-PGA previamente obtenidos y un derivado de PEG funcionalizado con un grupo carboxilo activado, obteniéndose los sistemas tri-bloque según se muestra en la formula siguiente:
Figure imgf000073_0001
Donde:
R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol).
R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol), PEG-tiol, PEG-4TP.
R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ((alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acétales, ácidos carboxílicos activados), etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16); aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína? y grupos amino secundarios y terciarios. x representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500 y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500 z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000 p representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500
R2 y R3 pueden ser utilizados para la conjugación de agentes bioactivos (incluyendo fármacos de bajo peso molecular, péptidos, proteínas, anticuerpos), sondas fluorescentes del infrarrojo cercano, complejos de coordinación para MRI, PET y sondas SPECT.
8. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de α-aminoácidos (NCAs), de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, en el que una vez obtenido el polímero de poliglutamato, este se modifica introduciendo cadenas de polietilenglicol en la cadena polimérica, con objeto de obtener moléculas que sean capaces de modificar el comportamiento in vivo, la biodistribución y la aplicación terapéutica del correspondiente agente bioactivo.
9. Poliglutamatos obtenidos por el método de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Utilización de los poliglutamatos de la reivindicación 9 como transportadores y administradores de fármacos.
1 1. Utilización de los poliglutamatos de la reivindicación 9 como agentes de diagnóstico por imagen molecular.
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