ES2745745T3 - Polipéptidos entrecruzados autoensamblados en forma de estrella y su uso como transportadores en aplicaciones biomédicas - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de fórmula (I) a continuación, que comprende homopolipéptidos o copolipéptidos aleatorios o de bloque:**Fórmula** o sus sales, solvatos o isómeros, donde: m, m', m'', n, n', n'', o, o' y o son enteros seleccionados independientemente de 0 a 500, en donde al menos uno de ellos es >= 1; R6 a R8, R6' a R8' y R6'' a R8'' son seleccionados independientemente entre H y metilo; I1 a I3 son seleccionados independientemente entre el grupo consistente en H; halógeno; deuterio; y (C1-C20)-alquilo; R2 a R4, R2' a R4' y R2'' a R4'' son seleccionados independientemente entre el grupo consistente en:**Fórmula** X1 y X2 son seleccionados independientemente entre el grupo consistente en H; N; NH2; y Z; X3 y X4 son seleccionados independientemente entre el grupo consistente en H; y Z; y e y' son enteros entre 0 y 3; e y + y' = 2 o 3; y'' e y''' son enteros entre 0 y 2; e y + y' = 1 o 2 Z es seleccionado entre el grupo consistente en H; contraión metálico; contraión inorgánico; y grupo protector de aminoácido; R1, R1' y R1'' son radicales seleccionados independientemente entre el grupo consistente en:**Fórmula** A1, A2, A3 y A4 son radicales seleccionados independientemente entre el grupo definido por R2 a R4, R2' a R4', y R2'' a R4''; L1 es un radical seleccionado independientemente entre el grupo consistente en (C1-C500)-alquilo, en donde uno o más H están opcionalmente sustituidos por: (1) (C3-C30)-cicloalquilo, (2) un radical C derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, cada anillo estando independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, estando los anillos aislados o fusionados y teniendo 3-20 miembros. Cada miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en C, CH, CH2, CO, N y NH, (3) OH, (4) NRaRb, (5) ONRcRd, (6) CN, (7) haluro, (8) SH2, (9) SReRf, (10) N(H)NH2, (11) RgCORh, (12) COORi, (13) CON(Rj)(Rk), (14) RlN(Rm)CON(Rn)2, (15) (C1-C30)-alqueno, (16) (C1-C30)- alquino, (17) N3, (18) RoCH(ORp)(ORq), (19) RrCH(SRs)(SRt), (20) RuBoro(ORv)(ORw), (21) CORx; y en donde uno de más C se reemplaza independientemente por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, aril-(C1-C30)-alquil, NRyRz, CO, O, S, boro, haluro, P y (O-CH2-CH2)B; B es un entero entre 1 y 500; Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; (C1-C30)-alquilo; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)- cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO; Rg, Rl, Ro, Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C1-C30)-alquil; (C1- C30)-alquilfenil; fenil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO; R5, R5' y R5'' son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; y (C1-C500)-alquil, opcionalmente sustituidos por: (1) (C3-C30)-cicloalquil, (2) un radical C derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, cada anillo estando independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, los anillos estando aislados o fusionados y teniendo 3-20 miembros cada miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en C, CH, CH2, CO, N y NH, (3) OH, (4) NRaRb, (5) ONRcRd, (6) CN, (7) haluro, (8) SH2, (9) SReRf, (10) N(H)NH2, (11) RgCORh, (12) COORi, (13) CON(Rj)(Rk), (14) RlN(Rm)CON(Rn)2, (15) (C1-C30)-alqueno, (16) (C1-C30)- alquino, (17) N3, (18) RoCH(ORp)(ORq), (19) RrCH(SRs)(SRt), (20) Ruboro(ORv)(ORw), (21) CORx; y en donde uno de más C se reemplaza independientemente por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, arilo-(C1-C30)-alquilo, NRyRz, CO, O, S, boro, haluro, P y (O-CH2-CH2)B; B es un entero entre 1 y 500; Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; (C1-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)- cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO; Rg, Rl, Ro, Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C1-C30)-alquil; (C1- C30)-alquilfenil; fenil; (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO;

Description

DESCRIPCION
Polipéptidos entrecruzados autoensamblados en forma de estrella y su uso como transportadores en aplicaciones biomédicas
La invención se refiere a derivados polipeptídicos en forma de estrella de tres brazos que son capaces de autoensamblarse para formar estructuras nanométricas globulares que responden a estímulos biológicos con tamaño y forma controlable. Estas construcciones multivalentes presentan la habilidad de desensamblarse bajo condiciones fisiológicas específicas y de unirse a al menos un agente activo para que puedan usarse como transportadores en aplicaciones biomédicas.
Antecedentes de la invención
Se ha dedicado un esfuerzo considerable al desarrollo de arquitecturas poliméricas nuevas y más versátiles con propiedades específicas y predecibles para ser utilizadas como sistemas de administración de fármacos específicos. Estas características deseables en estos materiales incluyen: pesos moleculares ajustables (mayor peso molecular (PM), para mejorar la orientación pasiva por el efecto de retención y permeabilidad mejorada (RPM), estructura y conformación predecibles en solución, menor heterogeneidad y mayor posibilidad de multivalencia. No obstante, el diseño y la síntesis de nuevas construcciones poliméricas de PM relevantes, junto con su caracterización fisicoquímica, estudios conformacionales y, especialmente su potencial para aplicaciones biológicas aún no se han explotado por completo en esta área. Para este objetivo, las arquitecturas basadas en polipéptidos pueden considerarse candidatos adecuados.
Los polipéptidos en estrella son polímeros ramificados, que consisten en varias cadenas lineales enlazadas a un núcleo central. Existen dos estrategias sintéticas principales: La estrategia del núcleo primero (o iniciadores multifuncionales o estrategia divergente) y la estrategia del brazo primero (o el uso de agentes de enlace multifuncionales, o enfoque convergente). Varios polímeros estrella basados en polipéptidos se han sintetizado a lo largo de los años. Por ejemplo, Klok et al. (Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry2001,39, (10), 1572­ 1583) utilizaron derivados de perileno con cuatro grupos amina primarios como iniciadores para obtener poli(gammabencil-L-glutamato) (PBLG) de 4 brazos y poli(epsilon-benciloxicarbonil-L-lisina) (PZLL) y Inoue et al. (Macromolecular Bioscience 2003, 3, (1), 26-33) utilizaron iniciadores hexafuncionales para la síntesis de polímeros en estrella PBLG de 6 brazos, aprovechando las técnicas de polimerización de apertura de anillo (PAA) de N-carboxianhídridos (NCA). Se proporcionan otros ejemplos del trabajo de Aliferis et al. (Macromolecular Symposia 2006, 240, (1), 12-17) quién utilizó 2-(aminometill)-2-metil-1,3-propanodiamina como iniciador trifuncional para la síntesis de polipéptidos estrella de tres brazos en bloque poli(epsilon-carbobenzoxi-L-lisina-Wogue-Y-bencil-L-glutamato), P(BLL-6 -BLG)3 ; o los estudios de Karatzas et al. (Reactive and Functional Polymers 2009, 69, (7), 435-440) en la síntesis del polímero híbrido estrella de 4 brazos utilizando estrellas de PEO de 4 brazos funcionalizadas con aminas primarias en los extremos como iniciadores para la polimerización de gamma-benzil-L-Glutamato NCA (BLG-NCA) y obtener poli(etileno óxido)-bloque-poli(y-benzil-L-glutamato) (PEO-6 -PBLG) entre otros. Además de estos dos enfoques ampliamente utilizados, una última clasificación tiene en cuenta una nueva estrategia sintética. Este enfoque consiste en la reacción de macroiniciadores vivos (MI) (también llamados macromonómeros) con moléculas multifuncionales que actúan como entrecruzantes que dan lugar a arquitecturas en forma de estrella conocidas como polímeros estrella con núcleo entrecruzado (ENE) (Chen et al. Macromolecular Rapid Communications, 2013, 34, 1507)
Una de las propiedades más atractivas, además de sus características reológicas y su carácter termoplástico, es su comportamiento de autoensamblaje que puede promoverse en solución por la presencia de grupos funcionales a lo largo de los brazos de la cadena (en el caso de los homopolímeros) o mediante el uso de disolventes selectivos (en el caso de bloques de estrellas o estrellas de brazos mezclados). Los parámetros estructurales micelares como la concentración micelar crítica (CMC), el número de agregación, las dimensiones del núcleo y la corteza, la concentración general de micelas, así como la termodinámica y la cinética de la micelación de estructuras complejas, como los copolímeros estrella en bloque y los polímeros con brazos heterogéneos, han sido poco investigados en comparación con los análogos lineales. En general, las estructuras en estrella tienen valores de CMC más altos y, en consecuencia, números de agregación más bajos que sus homólogos de copolímeros en bloque lineales.
En general, es bien sabido que la arquitectura macromolecular es un parámetro clave para el ajuste del comportamiento y las propiedades micelares y, por lo tanto, debe considerarse bien para el diseño de nuevos materiales y sus posibles aplicaciones biológicas, en particular como sistemas de administración de fármacos.
Además, a pesar del creciente interés en el desarrollo de polímeros estrella e híbridos basados en péptidos como posibles materiales avanzados para aplicaciones biológicas, sólo recientemente se han explorado como sistemas de administración de fármacos. Por ejemplo, Sulistio et al. (Chem. Commun, 2011, 47, 1151-1153), sintetizaron polímeros estrella con núcleo entrecruzado (ENE) solubles en agua y altamente funcionalizados presentando núcleos degradables sintetizados completamente a partir de aminoácidos que son capaces de encapsular fármacos insolubles en agua. Estos tipos de estrellas fueron capaces de atrapar medicamentos hidrofóbicos, como el fármaco anticancerígeno pirarubicina, a través de interacciones físicas con residuos de pireno del núcleo. Además, debido a la presencia de enlaces disulfuro en el núcleo, las estrellas también podrían escindirse mediante agentes reductivos como el ditiotreitol, produciendo polímeros sensibles a reacciones redox.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a una familia de derivados de polipéptidos en forma de estrella de 3 brazos que consisten en un núcleo central relacionado con 1,3,5-bencenotricarboxamida como iniciador para la polimerización de apertura de anillo de monómeros de N-carboxianhídridos y 3 brazos de polipéptido. Estos sistemas se someten a un proceso de autoensamblaje que produce estructuras en el rango de nanómetros (4-300 nm de radio). Las modificaciones posteriores a la polimerización de los residuos de polipéptidos conducen a la introducción de grupos entrecruzantes convenientes para la estabilización de las nanoestructuras autoensambladas resultantes que pueden funcionalizarse adicionalmente con la introducción de uno o más agentes activos para múltiples aplicaciones en biomedicina.
Un primer aspecto de la presente invención está relacionado con un compuesto de fórmula (I) a continuación, que comprende homo-polipéptidos o copolipéptidos aleatorios o en bloque:
Figure imgf000003_0001
o sus sales, solvatos o isómeros, donde:
m, m', m " n, n', n " o, o ' y o " son enteros independientemente seleccionados entre 0 a 500, dónde al menos uno de ellos es > 1;
R6 a R8, R6' a R8' y R6" a R8- son independientemente seleccionados entre H y metilo;
Ii a I3 son independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en H; halógeno; Deuterio; y (Ci-C20)-alquilo;
cada R2 a R4, R2- a R4-, y R2 " a R4 " representa los residuos secundarios de aminoácidos en el esqueleto polipeptídico obtenido por medio de la ROP de NCA, que son copolipéptidos en bloque o aleatorios, y cada uno de ellos se selecciona independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000004_0001
Xi y X2 son independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en H; N; NH2 ; y Z;
X3 y X4 son independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en H; y Z;
y e y ' son enteros entre 0 y 3; e y y' = 2 o 3;
y " e y ' ' ' son enteros entre 0 y 2 ; e y y ' = 1 o 2
Z se selecciona entre el grupo que consiste en H; contraión metálico; contraión inorgánico; y un grupo protector de aminoácidos. En la presente invención, la expresión "grupo protector de aminoácidos" se refiere a cualquier grupo funcional químico que puede introducirse en el aminoácido de la molécula mediante modificación química para obtener quimioselectividad en una reacción química posterior. Desempeña un papel importante en la síntesis orgánica de varios pasos. El experto en la materia conoce los grupos protectores de aminoácidos, algunos de ellos se detallan en Chem Rev 2009, 109, 2455-2504, incorporada aquí como referencia.
Ri, R r y Rr- son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000004_0002
A1, A2 , A3 y A4 denota los residuos secundarios de aminoácidos, y se seleccionan independientemente del grupo como se define para R2 a R4 , R2 ' a R4 ,y R2" a R4 ";
L1 es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C1-C500)-alquilo, en el que uno o más H está opcionalmente sustituido con: (1) (C3-C30)-cicloalquilo, (2) un C-radical derivado de un sistema de anillo con 1-6 anillos, cada anillo estando independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, los anillos aislados o fusionados que contengan 3-20 miembros, cada miembro independientemente seleccionado del grupo que consiste en C, CH, CH2, CO, N y NH, (3) OH, (4) NRaRb, (5) ONRcRd, (6 ) CN, (7) haluro, (8 ) SH2, (9) SReRf, (10) N(H)NH2, (11) RgCORh, (12) COORi, (13) CON(Rj)(Rk),(14) RlN(Rm)CON(Rn)2,(15) (C1-C30)-alqueno,(16) (C1-C30)-alquino, (17) N3, (18) RoCH(ORp)(ORq), (19) RrCH(SRs)(SRt), (20) RuBoro (ORv)(ORw), (21) CORx; y cuando uno o más C son independientemente reemplazados por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, arilo-(C1-C30)-alquilo, NRyRz,CO, O, S, Boro, haluro, P y (O-CH2-CH2)b;
B es un entero entre 1 y 500;
Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en H; (C1-C30)-alquilo; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, dónde uno o más carbonos son sustituidos opcionalmente por un heteroátomo seleccionado entre el grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO;
Rg, Ri, Ro, Rry Ru son radicales independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en (C1-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil; (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, dónde uno o más carbonos son opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado entre el grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO;
R5 , Rs, y R5" representa el grupo funcional en el extremo N-terminal. R5, Rs- y Rs" son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; y (C1-C500)-alquil, dónde uno o más H es opcionalmente sustituido por: (1) (C3-C30)-cicloalquil, (2) un C-radical derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, cada anillo siendo independientemente saturado, parcialmente saturado o aromático, los anillos pueden estar aislados o fusionados teniendo 3-20 miembros, cada miembro independientemente seleccionado entre el grupo que consiste en C, CH, CH2, CO, N y NH, (3) OH, (4) NRaRb, (5) ONRcRd, (6) CN, (7) haluro, (8) SH2, (9) SReRf, (10) N(H)NH2, (11) RgCORh, (12) COORi, (13) CON(Rj)(Rk),(14) R|N(Rm)CON(Rn)2,(15) (Cr C30)-alqueno,(16) (C1-C30)-alquino, (17) N3, (18) RoCH(ORp)(ORq), (19) RrCH(SRs)(SRt), (20) RuBoro (ORv)(ORw), (21) CORx; y cuando uno o más C son independientemente reemplazados por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, arilo-(C1-C30)-alquilo, NRyRz,CO, O, S, Boro, haluro, P y (O-CH2-CH2)b;
B es un entero entre 1 y 500;
Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales independientemente seleccionados del grupo que consiste H; (C1-C30)-alquilo; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, donde uno o más carbonos se sustituyen opcionalmente por un heteroátomo seleccionado del grupo formado por O; S; F; N; NH; P; y CO;
Rg, R|, Ro, Rry Ru son radicales independientemente seleccionados del grupo formado por (C1-C30)-alquilo; (C1 -C30)-alquilfenil; fenil; (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, donde uno o más carbonos son opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo formado por of O; S; F; N; NH; P; y CO.
En la presente invención, el término "alquilo" se refiere a radicales de cadena hidrocarbonados lineales o ramificados, saturados, parcialmente saturados o insaturados. En la presente invención, el término "cicloalquilo" se refiere a un radical hidrocarbonado cíclico, saturado, insaturado o parcialmente saturado o aromático.
En una representación alternativa, la presente invención se refiere al compuesto de fórmula (I), en donde:
I1, I2 y I3 , son radicales independientemente seleccionados del grupo formado por H; Deuterio; y F;
R5 , R5- y R5-- son idénticos entre ellos, y seleccionados del grupo formado por H; CO-(C1-C20)-alquil; CONH-(C1-C20)-alquil; y piroglutamato.
En una representación alternativa, la presente invención también se refiere al compuesto de fórmula (I) como se define en cualquiera de las representaciones anteriores, en donde:
R2=R2 =R2--, R3=R3 =R3--, y R4=R4 =R4--, y cada uno de ellos es independientemente seleccionado del grupo formado por:
Figure imgf000005_0001
X1 y X2 es independientemente seleccionado del grupo formado por H; N; -NH2 ; y Z;
y e y' son enteros entre 0 y 3; e y y' = 2 o 3;
Ri=Ri =Ri" se selecciona entre los siguientes grupos:
Figure imgf000006_0001
Ai, A2, A3 y A4 muestra los residuos laterales de aminoácidos hidrofóbicos y se seleccionan del siguiente grupo o combinaciones de los mismos:
Figure imgf000006_0002
Li se define como en cualquiera de las representaciones anteriores.
En una representación particular de cualquiera de las representaciones anteriores, m, m', m '', n, n', n '', o, o ' y o son números enteros seleccionados independientemente entre 0 a 500, donde al menos uno de ellos es > 1.
En una expresión particular de cualquiera de las representaciones anteriores, la cadena principal polipeptídica del compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la invención se selecciona del grupo que consiste en: arginina, ornitina, lisina, sarcosina y serina.
En otra expresión de cualquiera de las representaciones anteriores, el esqueleto polipeptídico del compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la invención es un polipéptido de dos bloques seleccionado del grupo que consiste en: serina-sarcosina, serina-lisina, glutámico- serina, serina-ornitina, serina-arginina, lisina-sarcosina, sarcosinaornitina, sarcosina-arginina, ornitina-arginina, glutámico-ornitina, glutámico-arginina, glutámico-lisina, glutámicosarcosina, fenilalanina-glutámico, y fenilalanina-lisina, fenilalanina-ornitina, fenilalanina-arginina, fenilalaninasarcosina y serina-fenilalanina.
En una representación particular, la cadena principal del polipéptido del compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la invención es poliglutamato como se representa a continuación:
Figure imgf000006_0003
o sus sales, solvatos o isómeros, dónde:
m es un entero seleccionado entre 1 y 500;
Z es seleccionado del grupo formado por H; contraión metálico; contraión inorgánico; y un grupo protector de aminoácidos;
R1 es seleccionado entre los siguientes grupos:
Figure imgf000007_0001
A1, A2 , A3 y A4 denotan los residuos secundarios de aminoácidos hidrofóbicos y se seleccionan de los siguientes grupos o combinaciones de los mismos:
Figure imgf000007_0002
L1 representa un espaciador seleccionado de los siguientes grupos:
Figure imgf000007_0003
" " " W ' N - h y -
p, q, r, s, t, u, v, y w, son enteros seleccionados de y 1 a 300 respectivamente;
y, el enlace que une estos grupos al resto de la molécula.
En una representación particular, el radical R1 del compuesto de la anterior representación particular se selecciona entre los siguientes grupos:
Figure imgf000007_0004
El segundo aspecto de la invención se refiere a un compuesto que comprende homopolipéptidos o copolipéptidos aleatorios o en bloque de fórmula (II) a continuación:
Figure imgf000008_0001
o sus sales, solvatos o isómeros, dónde:
Ri a R8, Ii a I3, n, y o, son definidos en la primera expresión
m es un número entero entre 2-500;
x es un número desde 0.01*m a 0.5*m;
R2 ” es un radical seleccionado entre los grupos consistentes en:
Figure imgf000008_0002
Xi es H;
y es 0 o 1 ;
CL es un radical seleccionado del grupo que consiste en un alquilo (C1-C500), en el que uno o más H está opcionalmente sustituido con: (1 ) cicloalquilo (C3-C30), (2) un radical C derivado de un sistema de anillos con 1 - 6 anillos, cada anillo está independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, los anillos aislados o fusionados tienen 3-20 miembros, cada miembro seleccionado independientemente del grupo formado por C, CH, CH2 , CO, N y NH, (3) OH, (4) NRaRb, (5) ONRcRd, (6 ) CN, (7) haluro, (8 ) SH2, (9) SReRf, (10) N(H)NH2, (11) RgCORh, (12) COORi, (13) CON(Rj)(Rk),(14) RlN(Rm)CON(Rn)2,(15) (CrC30)-alqueno,(16) (Cr C30)-alquino, (17) N3 , (18) RoCH(ORp)(ORq), (19) RrCH(SRs)(SRt), (20) RuBoro(ORv)(ORw), (21) c ORx; y donde uno o más C se reemplaza independientemente por (C3-C30)-cicloalquil, aril, aril-(C1-C30)-alquil, NRyRz,CO, O, S, Boro, haluro, P y (O-CH2-Ch 2)b;
B es un entero entre 1 y 500;
Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales independientemente seleccionados del grupo que consiste en H; (C1-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, donde uno o más carbonos son sustituidos opcionalmente por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO;
Rg, Ri, Ro, Rr y Ru son radicales independientemente seleccionados del grupo que consiste en (C1-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil; (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, donde uno o más C se reemplaza independientemente por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO.
En una representación particular la presente invención se refiere al compuesto de fórmula (II) como se define en el segundo aspecto de la invención, en donde:
son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; Deuterio; y F;
R5 se selecciona del grupo que consiste en H; CO-(Ci-C2o)-alquil; CONH-(Ci-C2o)-alquil; y piroglutamato.
En una expresión particular la presente invención se refiere al compuesto de fórmula (II) como se define en el segundo aspecto de la invención, o en la expresión previa, donde:
R2 " se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0001
Xi es H;
y es 0 o 1;
CL es seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0002
Rg, y R11 a R17 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0003
p y s son enteros independientemente seleccionado desde 0 a 500;
R10 es seleccionado entre H y (C1-C4)-alquil.
En una representación particular de cualquiera de las representaciones del segundo aspecto de la invención, m es un entero entre 2 y 50. En otra expresión particular de cualquiera de las expresiones del segundo aspecto de la invención, p y s son enteros independientes seleccionados entre 0 a 50.
En una expresión particular, el esqueleto polipeptídico del compuesto de la fórmula (II) del segundo aspecto de la invención se selecciona del grupo que consiste en: arginina, ornitina, lisina, sarcosina y serina.
En otra expresión particular, el esqueleto polipeptídico del compuesto de fórmula (II) del segundo aspecto de la invención es un polipéptido de dos bloques seleccionado del grupo que consiste en: serina-sarcosina, serina-lisina, glutámico-serina, serina-ornitina, serina-arginina, lisina-sarcosina, sarcosina-ornitina, sarcosina-arginina, ornitinaarginina, glutámico-ornitina, glutámico-arginina, glutámico-lisina, glutámico-sarcosina, fenilalanina-glutámico, y fenilalanina-lisina, fenilalanina-ornitina, fenilalanina-arginina, fenilalanina-sarcosina, y serina-fenilalanina.
En una representación particular, El esqueleto polipeptídico del compuesto de fórmula (II) del segundo aspecto de la invención es el poliglutamato, como se representa a continuación:
Figure imgf000010_0001
o sus sales, solvatos o isómeros, dónde:
m y R1 se definen como la representación particular del primer aspecto de la invención;
R5 se define como en el primer aspecto de la invención, y CL se selecciona de los siguientes grupos:
Figure imgf000010_0002
Rg, y R11 a R17 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en:
Figure imgf000011_0001
p y s son enteros independientemente seleccionados desde 0 a 500;
Río es seleccionado entre H y (Ci-C4)-alquil.
En una representación particular de la representación particular anterior, R1 se selecciona de los siguientes grupos:
Figure imgf000011_0002
El tercer aspecto de la presente invención se refiere a un polímero estrella autoensamblado reticulado que comprende una unidad recurrente de fórmula (III) a continuación:
Figure imgf000011_0003
o sus sales, solvatos o isómeros, dónde:
R1 a R8, I1 a I3, m, n y o se definen como en el primer aspecto de la invención;
x se define como en el segundo aspecto de la invención;
R2^es seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000012_0001
Xi e y se definen como en el segundo aspecto de la invención;
CL1 se define como CL en el Segundo aspecto de la invención.
En una representación particular, la presente invención se refiere al polímero en estrella autoensamblado reticulado de fórmula (III), como se define en el tercer aspecto de la invención en el que:
I1, I2 , e I3, son radicales independientemente seleccionados del grupo que consiste en H; Deuterio; y F;
R5 es seleccionado del grupo que consiste en H; CO-(C1-C20)-alkyl; CON(H)-(C1-C20)-alqui; y piroglutamato.
En otra representación particular, la presente invención se refiere al polímero en estrella autoensamblado reticulado según el tercer aspecto de la invención o a la representación preferida anterior, en la que:
cada R2, R3, y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000012_0002
X1 y X2 son definidas como en el primer aspecto de la invención;
y e y ' se definen como en el primer aspecto de la invención;
R1 se selecciona de los siguientes grupos:
Figure imgf000012_0003
A1, A2 , A3 y A4 denotan los residuos secundarios de aminoácidos hidrofóbicos y se seleccionan de los siguientes grupos o combinaciones de los mismos:
Figure imgf000013_0001
Li representa un espaciador seleccionado de los siguientes grupos:
Figure imgf000013_0002
p, q, r, s, t, u, v, y w, son enteros seleccionados de y 1 a 300 respectivamente;
y, el enlace que une estos grupos al resto de la molécula.
En otra representación particular, la presente invención se refiere al polímero estrella autoensamblado de acuerdo con la tercera representación de la invención o cualquiera de las dos representaciones anteriores, en las que:
R2 ” es seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000013_0003
CLi se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000013_0004
R9, y R11 a R17 son seleccionados del grupo que consiste en:
Figure imgf000014_0001
p y s son enteros seleccionados independientemente de 0 a 500;
Río se selecciona entre H y (Ci-C4)-alquil.
En una representación particular, la cadena principal polipeptídica del polímero estrella autoensamblado reticulado que comprende una unidad recurrente de fórmula (III) se selecciona del grupo que consiste en: arginina, ornitina, lisina, sarcosina y serina.
En otra representación particular, el esqueleto polipeptídico del polímero estrella autoensamblado reticulado que comprende una unidad recurrente de fórmula (III) es un polipéptido de dos bloques seleccionado del grupo que consiste en: serina-sarcosina, serina-lisina, glutámico-serina, serina-ornitina, serina-arginina, lisina-sarcosina, sarcosina-ornitina, sarcosina-arginina, ornitina-arginina, glutámico-ornitina, glutámico-arginina, glutámico-lisina, glutámico-sarcosina, fenilalanina-glutámico y fenilalanina-lisina, fenilalanina-ornitina, fenilalanina-arginina, fenilalanina-sarcosina y serina-fenilalanina.
En una representación particular, el esqueleto polipeptídico del polímero estrella autoensamblado reticulado que comprende una unidad recurrente de fórmula (III) es poliglutamato como se representa a continuación:
Figure imgf000014_0002
donde:
R1, R5 , m, y x es definido como en el segundo aspecto de la invención donde el esqueleto del polipéptido es poliglutamato;
CL1 es seleccionado entre los siguientes grupos:
Figure imgf000015_0001
R9 a R17 se definen como en la primera expresión particular del segundo aspecto de la invención.
En otra representación particular, el radical R1 del polímero reticulado en estrella autoensamblado de la representación particular anterior se selecciona de los siguientes grupos:
Figure imgf000015_0002
Los compuestos y el polímero en estrella autoensamblado reticulado de la presente invención, como se define en cualquiera de las representaciones o aspectos anteriores de la invención pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por ejemplo, Z, E), que incluyen isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales, y las mezclas de los mismos, caen dentro del alcance de la presente invención. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, y las mezclas de los mismos, pueden separarse por medio de cualquier técnica convencional bien conocida por el experto en la materia.
Los compuestos y el polímero estrella autoensamblado reticulado de la presente invención pueden estar en forma cristalina como libres o como solvatos, y ambas formas están destinadas a ser incluidas dentro del alcance de la presente invención. A este respecto, el término "solvato", como se usa en el presente documento, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto con la fórmula (I) o (II) o el polímero estrella autoensamblado entrecruzado (III) que puede ser usado en la preparación de un medicamento y solvatos farmacéuticamente inaceptables, que pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica, siempre que sea farmacéuticamente aceptable. En una representación particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos se pueden obtener por métodos de solvatación convencionales que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Excepto que se especifique lo contrario, los compuestos de la presente invención también incluyen compuestos que difieren solo en presencia de uno o más átomos enriquecidos en isótopos. Ejemplos de átomos enriquecidos en isótopos, sin limitación, son deuterio, tritio, 13C o 14C, o un átomo de nitrógeno enriquecido en 15N.
Un cuarto aspecto de la invención está relacionada con un conjugado que comprende los compuestos fórmula (I) o (II) como ha sido anteriormente definido, o el polímero estrella autoensamblado (III) como el anteriormente definido, y al menos un agente activo enlazado al compuesto o al polímero estrella autoensamblado. Al menos un agente(s) activo(s) puede(n) unirse covalentemente directamente o mediante uno o más enlazantes, o alternativamente al menos un agente(s) activo(s) puede(n) unirse no covalentemente al compuesto o al polímero estrella autoensamblado. En una representación preferida, al menos un agente activo está unido covalentemente a la cadena principal polipeptídica a través del residuo lateral de aminoácido a través de un enlace amida, éster, anhídrido o a través de un conector que incluye uno o más grupos funcionales, que incluyen, sin limitación, alquinos, azidas, disulfuros reactivos, maleimidas, hidrazida, hidrazonas, bases de Schiff, acetales, aldehídos, carbamatos y ésteres reactivos. En una representación alternativa, el enlace covalente es uno biosensible. La expresión "biosensible" se refiere a un enlace químico escindible bajo disparadores fisiológicos o externos específicos (por ejemplo, y sin limitación, pH, especies reactivas de oxígeno, ambiente reductor, enzimas específicas, glucosa, luz, temperatura, etc.).
En la presente invención, la expresión "agente activo" se refiere a un ingrediente activo y un agente de formación de imágenes.
Preferiblemente, el ingrediente activo se selecciona desde pequeños agentes (es decir, ingredientes activos farmacéuticos o fármacos) a biomoléculas (es decir, péptidos, (apolipo)proteínas, anticuerpos, FUA o fragmento de unión a antígeno y ácidos nucleicos). Los ejemplos de ingrediente activo incluyen, sin limitación, anticuerpo, antígeno, péptido (arginina-glicina-aspartato (RGD)), oligosacárido, bisfosfonato, aptámero, polisacárido, hialurónico, sulfato de condroitina, oligonucleótido de doble cadena (ADN), siRNA, fibronectina y folato.
En una representación preferida, el ingrediente activo se selecciona del grupo que consiste en agente anticancerígeno, antimetastásico, agente antiinflamatorio, antioxidante, agente neuroprotector, agente inmunoestimulante, agente capaz de desencadenar la reparación y/o regeneración de tejidos, antioxidantes, antiapoptóticos, proapoptóticos, agentes anti-amiloidótico y agentes disruptores de agregados de placa/proteína.
En una representación todavía preferida, el ingrediente activo se selecciona del grupo que consiste en: vincristina, vinblastina, amilorida, cloroquina, blafiomycyna, fasudil, bisfosfonato, primaquina, meclofenamato, tonabersat, disulfiram, ciclofosfamida, paclitaxel, dendrotoxina, doxorrubicina, metotrexato, epirrubicina, dinaciclib, buparlisib, palbociclib, veliparib, megestrol, examestano, goserelina, tamoxifeno, fulvestrant, trastuzumab, lapatinib, pertuzumab, selegilina, rasagilina, ladostigil M30, curcumina, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina..
En la presente invención, la expresión "agente de formación de imágenes" se refiere a cualquier sustancia que se usa como marcador, o que mejora estructuras específicas en cualquier técnica de formación de imágenes. Un agente de formación de imágenes, por lo tanto, incluye agente de imagen óptica, agente de imagen de resonancia magnética, radioisótopo y agente de contraste. Ejemplos, sin limitación, de agentes de imagen óptica son el tinte de acridina, un tinte de cumarina, un tinte de rodamina, un tinte de xanteno, un tinte de cianina y un tinte de pireno, Texas Red, tinte Alexa Fluor®, tinte BODIPY®, fluoresceína, colorante Oregon Green®, y Rhodamina Green™, que están disponibles comercialmente o se preparan fácilmente por métodos conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos de agentes de imagen apropiados para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, metales de transición y metales de transición radiactivos quelados a agentes quelantes, por ejemplo, DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), DOTA (1,4,7,10-Tetraazaciclododecano-1, Ácido 4,7,10-tetraacético) y NOTA (ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético).
En una representación alternativa, el conjugado definido en el cuarto aspecto de la invención o cualquier representación de la misma, comprende una cantidad de al menos un agente activo en el intervalo de 1 a 70% p/p basado en la relación de masa del agente activo al conjugado. En una representación preferida, el rango es de 1 a 50% p/p. En una representación aún más preferida, el conjugado comprende una cantidad del agente en el intervalo de 1 a 25% p/p.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, diagnóstica o teranóstica que comprende al menos un conjugado como se define en el cuarto aspecto de la invención, o cualquier realización junto con uno o más excipientes farmacéuticos o diagnósticos aceptables apropiados.
Un sexto aspecto de la invención se relaciona con el conjugado para su uso como medicamento, en diagnósticos o en una combinación de ambos (teranósticos).
Este aspecto también podría formularse como un método para la profilaxis y / o el tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a mamíferos que necesitan dicho tratamiento o diagnóstico, una cantidad efectiva de cualquiera de los conjugados de la presente invención, junto con uno o más excipientes y / o vehículos farmacéuticamente aceptables apropiados. Este aspecto también podría formularse como un método para el diagnóstico de una enfermedad en una muestra aislada de un sujeto, el método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de cualquiera de los conjugados que tienen uno o más agentes de imagen como se definieron anteriormente para la muestra aislada del sujeto. La detección de estos agentes de imagen puede llevarse a cabo mediante técnicas bien conocidas, como las técnicas de diagnóstico por imagen. Los ejemplos de técnicas de diagnóstico por imagen adecuadas para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, imágenes por resonancia magnética (IRM), rayos X, tomografía por emisión de positrones (TEP), tomografía computarizada por emisión de fotón único (TCEFU), microscopía de fluorescencia y fluorescencia in vivo.
En una representación particular de este aspecto, el conjugado para uso en la prevención y/o tratamiento del trastorno neurodegenerativo, enfermedad neurológica, cáncer, enfermedad infecciosa, trastorno relacionado con el envejecimiento, neuroinflamación, trastorno desmielinizante, esclerosis múltiple, trastorno isquémico, daño por isquemia-reperfusión, enfermedad amiloidótica, miocardiopatía, lesión de la médula espinal, trastorno inmunitario, trastornos inflamatorios, enfermedad rara, curación de heridas y enfermedad por almacenamiento lisosómico.
Las enfermedades neurodegenerativas pueden seleccionarse de la lista que comprende, sin limitarse a ellas, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, isquemia cerebral, parkinsonismos post-encefalíticos, distonías, síndrome de Tourette, patologías periódicas del movimiento de las extremidades, síndrome de piernas inquietas, trastornos de déficit de atención por hiperactividad, enfermedad de Huntington, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, demencia fronto-temporal y enfermedades neuromusculares.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables, y las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden usarse conjuntamente con otros fármacos adicionales, para proporcionar una terapia combinada. Dichos fármacos adicionales pueden ser parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden proporcionarse en forma de una composición separada para administración simultánea o no simultánea con la composición farmacéutica que comprende un compuesto con la fórmula (I) o la fórmula (II), o la sal, estereosiómero o solvato farmacéuticamente aceptable del polímero en estrella autoensamblado entrecruzado,
Los compuestos con la fórmula (I), la fórmula (II) o el polímero en estrella autoensamblado reticulado de fórmula (III) diseñados para uso terapéutico se preparan en forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Estas preparaciones pueden administrarse por cualquier ruta de administración apropiada, por lo que dicha preparación se formulará en la forma farmacéutica adecuada para la ruta de administración seleccionada. En una representación particular, la administración del compuesto de fórmula (I) o (II), o polímero estrella autoensamblado reticulado con la fórmula (III) proporcionada por esta invención se realiza por vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo vía subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intravenosa, etc.). Se puede encontrar una revisión de las diferentes formas farmacéuticas para la administración de medicamentos y los excipientes necesarios para obtenerlos, por ejemplo, en "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, SA Ediciones, Madrid, u otros habituales o similares en la Farmacopea Española y en los Estados Unidos.
En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un proceso para la síntesis del compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la invención o cualquier representación del mismo, comprendiendo el proceso:
(1 ) hacer reaccionar una forma de sal de amina o tetrafluoroborato o trifluoroacetato de amonio del iniciador de fórmula (IV) a continuación
Figure imgf000017_0001
con un N-carboxianhídrido apropiado (NCA); alternativamente, hacer reaccionar la forma de sal de amina o tetrafluoroborato o trifluoroacetato de amonio del iniciador de la etapa (1) con un N-carboxianhídrido apropiado de manera secuencial para obtener un copolímero en bloque; alternativamente, hacer reaccionar la forma de iniciador de amina o tetrafluoroborato o sal de amonio trifluoroacetato del paso (1) con una mezcla de NCA apropiada de manera estadística para obtener copolímeros aleatorios;
(2) opcionalmente, hacer reaccionar el grupo amina en la posición N-terminal con un grupo reactivo amina para introducir R5, R5’ y/o Rs-;
(3) opcionalmente, eliminar ortogonalmente los grupos protectores de la cadena lateral de aminoácidos;
(4) purificar el producto obtenido en las etapas (1), (2) o (3), opcionalmente por fraccionamiento, precipitación, ultrafiltración, diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial.
El paso (1) anterior puede incluir: a) la polimerización de apertura de anillo de monómeros de aminoácidos de N-carboxianhídrido (NCA) haciendo reaccionar la forma de iniciador de fórmula (IV) de amina o tetrafluoroborato o sal de amonio trifluoroacetato de fórmula (IV) anterior con la relación monómero / iniciador permite controlar el grado de polimerización (DP); b) una polimerización secuencial, en la que los copolipéptidos en bloque se preparan después de la reacción de polimerización a) de manera secuencial, permitiendo que se consuma el primer monómero de NCA antes de agregar el monómero para construir el siguiente bloque polipeptídico; o c) una polimerización estadística a) en la que se preparan copolipéptidos aleatorios después de la reacción de polimerización a) de manera estadística, mezclando todos los monómeros de NCA antes de comenzar la polimerización mediante la adición de una forma de iniciador de amina o tetrafluoroborato o sal de trifluoroacetato de amonio.
El paso (2) anterior corresponde al grupo terminal, donde el grupo amina en la posición N-terminal se hace reaccionar con un grupo reactivo amina para introducir R5, R5’ orRs-.
El paso (3) anterior corresponde a la desprotección, en la que las cadenas laterales de aminoácidos se eliminan ortogonalmente dependiendo del grupo protector presente en Z.
El proceso para la síntesis del compuesto de fórmula (II) del segundo aspecto de la invención o cualquier representación del mismo, comprendiendo además el proceso:
(5) introducir los grupos CL en la cadena lateral de aminoácidos reactivos, en la relación molar apropiada; (6 ) purificar el producto obtenido en la etapa (5), opcionalmente por fraccionamiento, precipitación, ultrafiltración, diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial.
El paso (5) anterior corresponde a la modificación posterior a la polimerización de la cadena lateral de aminoácidos, en donde la modificación requerida se introduce en la cadena lateral de aminoácidos reactiva en la relación molar deseada para introducir grupos CL.
El proceso para la síntesis del polímero estrella autoensamblado reticulado de fórmula (III) del tercer aspecto de la invención o cualquier representación de la misma, el proceso comprende además:
(7) hacer reaccionar los grupos CL de los compuestos autoensamblados de fórmula (II) formando conjuntos nanométricos, para entrecruzar covalentemente los polímeros en estrella autoensamblados;
(8 ) purificar el producto obtenido en la etapa (7) opcionalmente por fraccionamiento, precipitación, ultrafiltración, diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial.
El paso (7) anterior corresponde al paso de autoensamblaje y reticulación covalente, en el que los compuestos de fórmula (II) se autoensamblan en las condiciones apropiadas dependiendo de su naturaleza para formar conjuntos nanométricos. Luego, los grupos CL se hacen reaccionar para reticular covalentemente los polímeros en estrella autoensamblados.
En otra representación particular, el compuesto de fórmula (I) es un compuesto de fórmula (IA):
Figure imgf000018_0001
o sus sales, solvatos o isómeros, en donde m es un número entero seleccionado de 1 a 500, Z se selecciona de H, alquilo lineal o de cadena C1-C10, arilo o SiRR' siendo R y R' alquilo C1-C6 o un metal o catión orgánico
R1 se selecciona de los siguientes grupos:
Figure imgf000019_0001
donde Ai, A2, A3 y A4 denota los residuos secundarios de aminoácidos hidrófobos y se seleccionan de los siguientes grupos o combinaciones de los mismos:
Figure imgf000019_0002
y L1 representa un espaciador seleccionado de los siguientes grupos:
Figure imgf000019_0003
siendo p, q, r, s, t, u, v y w enteros seleccionados entre 0 a 10 y 1 a 300 respectivamente, y el enlace que une estos grupos al resto de la molécula.
En una representación preferida, R1 de formula (IA) se selecciona de los grupos siguientes:
Figure imgf000019_0004
En otra representación, el compuesto de fórmula (IA) es un compuesto de fórmula (IIA):
Figure imgf000020_0001
R
o sus sales, solvatos o isómeros en donde m y Ri se definen como en la representación particular de la invención correspondiente a un compuesto de fórmula (IA) como se define por primera vez anteriormente, x es y CL se selecciona de los siguientes grupos:
Figure imgf000020_0002
donde Rg a R17 se seleccionan de los siguientes grupos:
Figure imgf000020_0003
siendo p un número entero seleccionado de 0 a 10 y s un número entero seleccionado de 1 a 300 respectivamente, y R10 se selecciona entre un hidrógeno o un alquilo C1-C4,
y en donde el sustituyente descrito también está presente en las posiciones marcadas con R.
En una representación del compuesto de fórmula (IIA), R1 se selecciona de los siguientes grupos
Figure imgf000021_0001
Otro aspecto de la invención se refiere a un polímero que comprende una unidad recurrente de fórmula (IIIA):
Figure imgf000021_0002
en donde R1, m y x se definen como en la representación particular de la invención correspondiente a un compuesto de fórmula (IA) como se definió por primera vez y CL1 se selecciona de los siguientes grupos:
Figure imgf000021_0003
donde Rg a R17 se definen como anteriormente.
En una representación preferida del compuesto de fórmula (IIIA), Ri se selecciona de los siguientes grupos:
Figure imgf000022_0001
Otro aspecto de la invención es un conjugado que comprende el compuesto de fórmula (IIA) o el compuesto de fórmula (IIIA) y al menos un agente que está unido covalentemente al compuesto a través de los grupos superficiales COOH del compuesto de fórmula (IIIA) o a través de un espaciador, preferiblemente el agente se selecciona del grupo que consiste en un fármaco, un agente de direccionamiento, un agente de formación de imágenes ópticas, un agente de formación de imágenes por resonancia magnética y un agente estabilizador, más preferiblemente el conjugado de la reivindicación anterior en el que el agente es un fármaco seleccionado de selegilina, rasagilina, ladostigil M30, curcumina, demetoxicurcumina, bisdemetoxicurcumina.
Preferiblemente, en el conjugado descrito anteriormente, el conjugado comprende una cantidad del agente en el intervalo de 1% a 50% (peso/peso) basado en la relación de masa del agente al conjugado.
Otro aspecto se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un conjugado como se describe anteriormente y al menos un excipiente farmacéutico.
Otro aspecto se refiere al conjugado descrito anteriormente para su uso como medicamento.
Otro aspecto se refiere al conjugado como se describió anteriormente para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad o cáncer neurodegenerativo o neurológico.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia al que pertenece esta invención. Se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Los objetos, ventajas y características adicionales de la invención serán evidentes para los expertos en la materia al examinar la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos, dibujos, se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1.a) GPCs seleccionados del St-Poli-(gamma-bencil-L-glutamato) (PBLG) (compuestos de fórmula (I)) de diferentes pesos moleculares en DMF (1 % LiBr) a 8 mg mL-1. b) CD de St-PBLG (compuestos de fórmula (I)) a 2o °C en HFIP a 0.1 mg mL-1.
Fig. 2.a) GPCs seleccionados en DMF (1% LiBr) a 8 mgmL-1 y b) 1H-NMR seleccionados y respectiva asignación de señales en TFA deuterados de St-PTLL: Star-Poli(epsilon-trifluoroacetato-L-Lisina), St-PBLS: Star-Poli(Bencil-L-Serina), St-PSAR: St-Poli(Sarcosina), St-PBLG: St-Poli(gamma-bencil-L-glutamato) (compuestos de formula (I)). * R1 es un etilo.
Fig. 3.a) GPCs seleccionados en DMF (1 % LiBr) a 8 mg-mL'1 y b) 1H-NMR seleccionados y respectivo asignamiento de señales en TFA deuterados de St-PSAR: St-Poly(Sarcosina), St-PBLG: St-Poli-(gamma-bencil-L-glutamat), St-P(BLG-co-SAR): St-poli(gamma-bencil-L-glutamato-co-sarcosina) copolímero aleatorio, St-P(BLG-b-SAR): Stpoli(gamma-bencil-L-glutamato-bloque-sarcosina) copolímeros en bloque (compuestos de fórmula (I)). * R1 es un etilo.
Fig. 4.a) 1H-NMR de St-PGAs (compuestos de fórmula (I)) de diferentes pesos moleculares en D2O. El pequeño cuadrado rodea las señales del núcleo de bencilo. b) CD de St-PGA (fórmula de los compuestos (I)) en PBS a 37°C a 1 mg / ml que muestra la conformación de la bobina aleatoria típica de las cadenas de PGA.
Fig 5.a) 1H-NMR de (compuestos de fórmula (I)), St-P(BLG-co-SAR): copolímero aleatorio St-poli(gamma-bencil-L-glutamato-co-sarcosina), St-P(BLG-b-SAR): copolímero de bloque St-poli(gamma-bencil-L-glutamato-bloquesarcosina) en D2O. * R1 es un etilo.
Fig. 6.a) 1H-NMR de (compuestos de fórmula (II)), St-PGA con diferentes funcionalidades en D2O.
Fig.7. Representación de datos SANS de varios St-PGA (compuesto de fórmula (I)) a 10 mg-mL-1 en tampón PBS a pH = 7,4.
Fig. 8. Análisis de dependencia de la concentración del tamaño por DLS en tampón PBS a pH 7,4. a) Tasa de recuento medio (TRM) frente a la concentración de polímero en forma de estrella con iniciador a base de etilo, DP 180 como ejemplo (compuesto de fórmula (I)). b) Tasa de recuento media frente a concentración de polímero PGA lineal DP 150 como ejemplo.
Fig. 9. Representación esquemática del proceso de autoensamblaje llevado a cabo por poliglutamatos en forma de estrella (compuestos de fórmula (I) y (II)) estudiados según la interpretación de datos DLS y SANS.
Fig.10. Espectros de RMN2H del iniciador marcado con D con las asignaciones de picos correspondientes. a) Iniciador protegido con N-Boc en H2O 3 pL Acetona-d6 a 300 MHz. b) iniciador BF4 en H2O 3 pL Acetona a 500 Mh z . Fig. 11. Experimentos de contraste SANS con núcleo marcado con D en D2O (determinación de organización molecular externa de H) y H2O (determinación de organización molecular central marcada con D), a 10 mgmL-1 y 20 ° C de St-PGA deuterado (Compuesto de fórmula (I)).
Fig. 12. Micrografías Cryo-TEM de una muestra de St-PGA (compuesto de formula (I)) preparada en ddH2O a 1 mg mL-1
Fig. 13. Efecto de la fuerza iónica en el tamaño de St-PGA (Compuesto de fórmula (I)) a 2 mg-mL'1 y a 37 ° C representado por los cambios sufridos en la intensidad dispersada (TRM) (izquierda) y en Rh en número (derecha) tras la adición de una cantidad creciente de diferentes sales.
Fig. 14. a) Efecto de temperatura sobre el tamaño de St-PGA (Compuesto de fórmula (I)) a 10 mg-mL’1. b) Dependencia de la concentración del tamaño de St-PGA (Compuesto de fórmula (I)) a 37 °C.
Fig. 15. Tasa de recuento medio (TRM) frente a concentraciones crecientes que trazan a) St-PGA modificados con alquino (Compuesto de fórmula (II)) con diferentes grados de funcionalización; b) St-PGA modificados con azida con diferentes grados de funcionalización (Compuesto de fórmula (II)); c) alquino lineal PGA modificado como control negativo y d)
Fig. 16. Micrografías Crio-TEM de poliglutamatos en estrella modificados (Compuesto de fórmula (II)) a 1 mg-mL’1 en ddH2O; a) St-EG(2)Na(5); b) St-prop (10).
Fig. 17. Estudio de co-ensamblaje por DLS. Gráficos que muestran la determinación de CAC para St-EG(2)N3(5), (Compuesto de fórmula (II)), en presencia de concentración constante de St-prop(10), (Compuesto de fórmula (II)), (a ) y viceversa (b)
Fig. 18. Estudios de co-ensamblaje a través de experimentos DOSY de RMN (Compuestos de fórmula (II)), gráficos obtenidos ajustando las intensidades de los espectros de DOSY en la ecuación de Stejskal-Tanner y los coeficientes de difusión calculados (D).
Fig. 19. Espectros 2D NOESY que muestran la correlación NOE de los protones de propargil y etilenglicol de una mezcla que contiene 2 mgmL-1 de cada compuesto de fórmula (II): St-prop(10) y St-EG(2)N3(5).
Fig. 20. Representación esquemática de la captura covalente de polímeros en forma de estrella co-ensamblados que tienen funcionalidades ortogonales (Compuestos de fórmula (II) y (III)) ejemplificados para PGA.
Fig. 21. Representación esquemática de la captura covalente de polímeros co-ensamblados en forma de estrella que tienen funcionalidades ortogonales (Compuestos de fórmula (II)) (caso específico de alquinos y azidas) mediante química click a través de CuAAC obteniéndose compuestos de formula (III)
Fig. 22.1H-NMR en D2O de compuestos de fórmula (III) obtenidos por diferentes químicas de reticulación como ejemplo, y comparados con sus compuestos precursores de fórmula (II). a) Sistema reticulado (fórmula (III)) por química CuAAC y St-prop(10) y St-EG(2)N3(5), (compuesto de fórmula (II)). b) Sistema reticulado (fórmula (III)) por ditio química y St-PD(30) (compuesto de fórmula (II)).
Fig. 23. Comparación de ambos sistemas medidos (compuestos de fórmula II físicamente mezclados y compuesto de fórmula III) en términos de tamaño frente a concentración. Todos los valores corresponden a mediciones en PBS 7.4 y están representados en número.
Fig. 24. Imágenes de Crio-TEM a 2 mgmL-1 de compuestos de fórmula (III).
Fig. 25. Evaluación in vitro de los portadores de St-PGA recién sintetizados ((fórmula de compuestos (I)). A) Ejemplo de perfil de degradación por catepsina B monitorizada por GPC en PBS a 3 mg/ml y en diferentes puntos de tiempo. b) Ensayo de toxicidad contra la línea celular SHSY5Y de diferentes St-PGA (fórmula de compuestos (I)) medida por ensayo MTS a las 72 horas después del tratamiento. c) Ensayo de toxicidad contra la línea celular HUVEC de diferentes arquitecturas basadas en PGA medida por ensayo m Ts a las 72 horas después de los tratamientos. DB: Dibloque PEG42PGA200; PGA: linear PGA250; STAR: St-PGA250
Fig. 26. Evaluación in vitro de los portadores recién sintetizados. a) Estudio de absorción por citometría de flujo de un PGA marcado en forma de estrella fluorescente (compuestos de fórmula (I)) en la línea celular SHSY5Y. El experimento a 4 °C excluye los mecanismos dependientes de la energía. También se representa la diferencia entre el perfil de absorción a 4 y 37 grados (la denominada absorción "dependiente de la energía"). FAC: fluorescencia asociada a células =% de células positivasfluorescencia media/100. El FAC representado corresponde a la diferencia entre el FAC obtenido con las células tratadas y el CAF de las células de control no tratadas. b) Imagen confocal de la captación a las 2 horas después del tratamiento de un PGA en forma de estrella en la línea celular SHSY5Y después de un experimento de búsqueda de pulso, con histograma de co-localización. Se observó la combinación con el marcador lisosómico Lysotracker Red.
Fig. 27. Estudio de absorción de St-PGA ((compuestos de fórmula (I)) en comparación con PGA lineal de PM similares (alrededor de 250 GAU). A) FAC de ambos polímeros a lo largo del tiempo. b) FAC de ambos polímeros en un punto de tiempo de 5 horas que muestra diferencias significativas cuando las estadísticas se realizaron usando análisis ANOVA de una vía. p*< 0.05. c) % de células positivas (+) a fluorescencia de Oregon Green (OG), la comparación de ambos polímeros a 5 horas muestra las diferencias estadísticas esperadas. p*< 0.05. d) % de representación de células positivas comparando ambos polímeros junto con el control utilizado (autofluorescencia celular).
Fig. 28. Espectros de 1H-NMR (D2O) de St-DO3A-tBu y St-DO3A (conjugados de fórmula (I)). .
Fig. 29. % De actividad medida después del etiquetado y purificación de 111In por SEC de St-DO3A (compuesto de fórmula (I)).
Fig. 30. Biodistribución de St-DO3A-111In. Datos expresados como % ID normalizado por gramo de tejido en diferentes puntos de tiempo.
Fig. 31. Los datos normalizados de la señal de radiactividad de cada órgano respecto a la dosis inyectada (DI) por gramo de tejido, de St-PGA (compuesto de fórmula (I) en comparación con su homólogo lineal de PM similar).
Fig. 32. Ensayo de viabilidad celular de 3 arquitecturas diferentes de St-Clic (compuestos de fórmula (III)) contra la línea celular SHSY5Y hasta 3 mg-mL'1, 72 horas de tratamiento (n> 3, media ± Se M)..
Fig. 33.a) Cinética de absorción contra la línea celular SHSY5Y del polímero marcado con St-Click-OG (compuesto de fórmula (III)) en diferentes puntos de tiempo y diferentes temperaturas (4 °C para la unión, 37 °C para la absorción total). b) FAC que representa la fracción de absorción dependiente de energía, comparando las tres arquitecturas a lo largo del tiempo. n> 3, media ± SEM.
Fig. 34. Imagen confocal de la captación a las 2 horas después del tratamiento del compuesto St-Clic marcado con OG de fórmula (III)) en la línea celular SHSY5Y después de un experimento de búsqueda de pulso. Se observó colocalización con Lysotracker Red.
Fig. 35. Representación esquemática de la ruta sintética seguida para la modificación de la superficie de los PGA en forma de estrella capturados covalentemente (compuestos de fórmula (III)) para alcanzar las sondas duales. a) 1) DMTMMCl, 2) DO3AtBu-NH2 en ddH2O, r.t. 24 h. b) y f) 1) DMTMMCl, 2) Cy5.5 (6S-IDCC) en ddH2O, t.a. 24 h. c) y g) TFA:TIPS:ddH2O (95:2.5:2.5), t.a. 3 h. d) y i) GdCl3+ en PBS 0.1 M 7.4, r.t. 5 h. e) 1) DMTMMCl, 2) cysteamina-SS2TP en ddH2O, t.a. 24 h. h) An G en tampón HEPES 7.4, t.a. 16 h. *disco amarillo: DO3A, *disco morado: DO3A-Gd3+ *estrella azul: Cy5.5, *Flecha verde: Angiopep-2
Fig. 36. Potencial Z obtenido a 20 °C a partir de estructuras cliqueadas (compuestos de fórmula (III)) a 1 mg-mL’1 en ddH2O, antes y después de las modificaciones superficiales posteriores.
Fig. 37. Micrografías TEM de a) St-Clic-DO3A-Gd-Cy5.5, y b) St-Clic-DO3A-Gd-Cy5.5-ANG (compuestos de fórmula (III))
Fig. 38. % De ID normalizado por el área de píxeles de arquitecturas clicadas etiquetadas con Cy5.5 sin grupo director (a) y con grupo director (b) (compuestos de fórmula (III)).
Fig. 39. Biodistribución por imagen óptica en diferentes puntos temporales de arquitecturas clicadas con grupo director y sin grupo directora (compuestos de fórmula (III)). Experimento de trayectoria temporal. Las barras de error no se incluyen por razones de claridad.
Fig. 40. Viabilidad celular de los derivados de BDMC (compuestos de fórmula (I o III)) contra la línea celular SHSY5Y.
72 horas de ensayo MTS. n> 3, media ± SEM.
Fig. 41. Perfiles de liberación de fármacos a diferentes pH (5.0, 6.5 y 7.4) de St-Clic-BDMC (4% en peso) (compuesto de fórmula (III)). Los experimentos de trayectoria temporal se realizaron por triplicado. n > 3, media ± SEM.
Fig. 42.a) Representación esquemática de los cambios de fluorescencia ThT tras la fibrilación de proteínas. b) Imágenes de unímeros HEWL y fibrillas HEWL al calentar a 60 °C y agitar vigorosamente durante 24 h, pH 2.0. Fig. 43. Cambios en la intensidad de fluorescencia ThT con el tiempo en muestras HEWL incubadas con diferentes conjugados de BDMC (compuesto de fórmula (I o III)) a a) 10 pM de BDMC-eq. y b) 50 pM de BDMC-eq. n> 3, media ± SEM.
Fig. 44. Imágenes TEM obtenidas de muestras incubadas HEWL dentro de los diferentes derivados de poliglutamato BDMC (compuesto de fórmula (I, o III)) a 10 pM BDMC-eq. (c-e) en comparación con a) Control PBS y b) BDMC libre 10 pM.
Fig. 45. Cambios en la densidad (núcleos / 1000 pm2) de núcleos teñidos con PI en la capa piramidal de la región CA1 de cultivos organotípicos del hipocampo que comparan cortes de control tratados con vehículo y cultivos tratados con diferentes concentraciones de St-Clic-BDMC, (compuesto de fórmula (III)) (0,005, 0,05, 0,2 y 0,5 pM eq. de fármaco). El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas después aplicar los análisis ANOVA con test post hoc de Bonferroni. n> 3, media ± SEM.
Fig. 46. Cambios en la densidad (núcleos / 1000 pm2) de núcleos teñidos con PI en la capa piramidal de la región CA1 de cultivos organotípicos del hipocampo que comparan cultivos de control tratados con vehículo (sin polímero/sin Ap), cultivos pretratados con diferentes concentraciones de conjugado de polímero (compuesto de fórmula (III)) (0.05 pM eq. de fármaco (Polímero 0.05/No Ap) y 0.2 pM eq. de fármaco (Polímero 0.2/No Ap), expuesto solo al péptido AP1.42 (Sin polímero/Ap) o expuesto a AP1-42 y pretratado con diferentes concentraciones de polímero conjugado (0.05 pM eq. de fármaco (Polímero 0.05/Ap) y 0.2 pM eq. de fármaco (polímero 0.2/Ap). El asterisco azul en las barras indica diferencias estadísticamente significativas del grupo de control y el asterisco rojo indica diferencias estadísticamente significativas de los cultivos expuestos solo al péptido Ap1-42 (Sin polímero/Ap), después de los análisis ANOVA seguidos de las pruebas post hoc de Bonferroni. n> 3, media ± SEM.
Fig. 47. Diseño experimental de los tratamientos con compuesto de fórmula (III) realizado en el modelo ArcAbeta junto con el registro del peso del animal como prueba de la seguridad del tratamiento.
Fig. 48.1H-NMR en D2O de a) St-PGA-PD(22%)-Hyd(8.8%) y St-PGA-PD(22%)-Hyd-Boc(8.8%) con asignaciones, y b) St-PGA-PD(22%)-Cl-Hyd(8.6%) y St-PGA-PD(22%)-Cl-Hyd-Boc(8.6%) con asignaciones. R' representa el punto de enlace a la formula recurrente (III).
Fig. 49. Viabilidad celular contra células de cáncer de mama 4T1 incubadas con DOX libre y St-PGA-PD(22%)-Cl-Hyd(8.4%)-Dox(2.5%), compuesto de fórmula (III).
Fig. 50. Estudios de liberación de fármacos a pH 5 y pH 7,4 de St-PGA-PD(22%)-Cl-Hyd(8.4%)-Dox(2.5%), compuesto de fórmula (III).
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Síntesis de compuestos de formula (I)
Para sintetizar compuestos de fórmula I, primero se obtuvo el iniciador de estrella de 3 brazos en 2-4 pasos. Dicho iniciador se usó para polimerizar el monómero de N-carboxianhidrido del L-glutamato gamma-bencilo, para producir el polímero estrella protegido con bencilo (St-PBLG). Los grupos bencilo se eliminaron para producir St-PGA.
Figure imgf000026_0001
1.1. Ejemplo de síntesis de iniciadores estrella de 3 brazos.
a) Síntesis de 1.3.5-tri-tert-butil ((benzenotricarboniltris(azanodiil)) tris(etano-2.1-diil))tricarbamato
Figure imgf000026_0002
En un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora y una entrada y salida de N2 , se disolvieron 500 mg de tricloruro de 1,3,5-bencenotricarbonilo (1.88 mmol. 1 equivalente (eq.)) en 12 ml de THF anhidro. Se añadió N. N'. N''- diisopropiletilendiamina (DIEA) (803.31 mg. 6.22 mmol. 3.3 eq.) a la mezcla de reacción. seguido de la adición gota a gota de N-terc-butoxicarbonil-etilendiamina (N-Boc-etilendiamina) (1.34 g. 6.22 mmol. 3.3 eq.) durante un período de 10 min. La reacción se dejó proceder durante 2 horas. Después de ese tiempo. el disolvente se eliminó completamente al vacío. El producto se redisolvió en cloroformo y se lavó 3 veces con agua desionizada (ddH2O) y 3 veces con agua ácida (pH~3). Finalmente. la fase orgánica se secó al vacío y el producto se recristalizó 3 veces en THF/metanol/hexano produciendo un sólido cristalino blanco. El producto se secó a alto vacío y se almacenó a -20 °C.
Rendimiento: 82 %. 1H-NMR (300 MHz. DMSO) 88.68-8.65 (m. 3H). 8.41 (s. 3H). 6.92-6.88(m. 3H). 3.34-3.31 (m. 6H).
3.16-3.13 (m. 6H). 1.37 (s. 27H).13C-NMR (75 MHz. CDCla) 8166.80 (C=O). 156.84 (C=O). 134.58 (CAr cuaternario).
128.47 (CHAr). 79.57 (C cuaternario). 40.93 (CH2). 40.43 (CH2). 28.45 (CH3).
b) Síntesis de 1.3.5-(benzenotr¡carbon¡ltr¡s(azaned¡¡l))tr¡etanamon¡o. sal de BF4
Figure imgf000027_0001
En un matraz de fondo redondo equ¡pado con una barra ag¡tadora y un tapón. 200 mg de 1,3,5-tr¡-terc-but¡l ((benzenetr¡carbon¡ltr¡s (azaned¡¡l)) tris (etano-2,1-d¡¡l)) tr¡carbamato (0.33 mmol. 1 eq.) se d¡solv¡eron en d¡clorometano. Luego. 3.3 eq. del complejo de éter d¡etíl¡co de ác¡do tetrafluorobór¡co. HBF4.Et2O. (179 mg. 150 pL). se añad¡eron a la soluc¡ón que condujo a la formac¡ón ¡nstantánea de un sól¡do blanco. El prec¡p¡tado se f¡ltró y se recr¡stal¡zó tres veces en THF/metanol/hexano. El producto se secó a alto vacío y se almacenó a -20 °C.
Rend¡m¡ento: 98 %. 1H-NMR (300 MHz. D2O) 8 8.32 (s. 3H). 3.72-3.68 (m. 6 H) 3.25-3.21 (m. 6 H).13C-NMR (75 MHz. D2O) 8169.45 (C=O). 134.38 (Cap cuaternario). 129.36 (Cap).39.23 (CH2). 37.52 (CH2).19F-NMR: -150.48 (BF4). MALDI-TOF: 337.1709 [M+1]
Los ¡n¡c¡adores ut¡l¡zados para la preparac¡ón de pol¡pépt¡dos en la tabla 1 se s¡ntet¡zan s¡gu¡endo proced¡m¡entos análogos a los descr¡tos anter¡ormente. Para los ¡n¡c¡adores que cont¡enen L-fen¡lalan¡na. la ruta s¡ntét¡ca y sus señales de 1H-NMR se resumen a cont¡nuac¡ón. Para mayor clar¡dad. solo se muestra uno de los tres sust¡tuyentes en el mot¡vo 1.3.5-bencenotr¡carboxam¡da:
Figure imgf000027_0002
eq.). Después de 10 m¡nutos. se añad¡ó una soluc¡ón de N-Boc-N'-(L-fen¡lalan¡n¡l) et¡lend¡am¡na (3.9 eq.) en metanol. La reacc¡ón se dejó proceder durante 48 h. El producto se prec¡p¡tó en agua. se f¡ltró y se lavó con agua y Analmente fue l¡of¡l¡zado.
Figure imgf000027_0003
Proced¡m¡ento: En un matraz de fondo redondo equ¡pado con un ag¡tador. el compuesto (1 eq.) se suspend¡ó en 1 ml de metanol. Se añad¡ó soluc¡ón de HCl 4 M en d¡oxano (9 eq.) y se perm¡t¡ó que la reacc¡ón cont¡nuara durante 2 horas. La mezcla se prec¡p¡tó en éter d¡etíl¡co. se lavó y se red¡solv¡ó y se trató con NaOH (hasta pH 10). El prec¡p¡tado se f¡ltró. se lavó con agua y se l¡of¡l¡zó.
1H-NMR(DMSO-d6 ): 2.54 (dt. 1H). 2.94-3.14 (m. 7H). 4.72 (dt. 1H). 7.12-7.35 (m. 5H). 8.07 (t. 1H). 8.23 (s. 1H). 8.75 (d. 1H).
Figure imgf000028_0001
Procedimiento: se disolvió ácido 1,3,5-bencenotricarboxílico (1 eq.) en metanol y se añadió cloruro de DMTMM (3,9 eq.). Después de 10 minutos, se añadió una solución de N-Boc-N'-(L-fenilanina fenilalanil) etilendiamina (3,9 eq.) en metanol. La reacción se dejó continuar durante 48 h, se precipitó el crudo en agua, se filtró y se lavó con agua. El producto se liofilizó finalmente.
Figure imgf000028_0002
Procedimiento: En un matraz de fondo redondo equipado con un agitador, el compuesto (1 eq.) se suspendió en 1 ml de metanol. Se añadió solución de HCl 4M en dioxano (9 eq.) y se permitió que la reacción continuara durante 2 horas. La mezcla se precipitó en éter dietílico, se lavó y se redisolvió y se trató con NaOH (hasta pH 10). El precipitado se filtró, se lavó con agua y se liofilizó.
1H-NMR (DMSO-d6): 2.47 (dd, 1H), 2.8-3.1 (m, 7H), 4.49 (dt, 1H), 4.74 (ddd, 1H), 7.08-7.31 (m, 10H), 7.81 (t, 1H), 8.2 (t, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.77 (d, 1H).
1.2. Síntesis del polímero St-PBLG:
Figure imgf000028_0003
Brevemente: se añadió N-carboxianhidrido de Y-bencil-L-glutamato (0,5 g, 1,9 mmol) en un tubo Schlenk equipado con una barra agitadora, un tapón y se purgó con 3 ciclos de vacío / Ar, y se disolvió en 5 ml del producto en disolvente recién purificado. Se añadió el iniciador de 3 brazos y la mezcla se dejó agitando a 4°C durante 3 días en atmósfera inerte. Finalmente, la mezcla de reacción se vertió en un gran exceso de éter dietílico frío que produjo un polímero blanco después de su aislamiento.
Rendimiento: 70-90 %. 1H-NMR (300 MHz, DMF, 8) 8.58 (s, xH), 7.42 (s, 5H), 5.19 (s, 2H), 4.21 (s, 1H), 2.81 (s, 2H), 2.45 (s, 2H).13C-NMR (300 MHz, DMF, 8) 175.94 (s), 172.26 (s), 162.77-162.18 (m), 161.98 (s), 136.76 (s), 128.87 127.75 (m), 66.05 (s), 57.13 (s), 35.41-34.17 (m), 32.48 (s), 30.84, 30.30 -29.04 (m), 27.28 (s), 25.99 (s). x: DP obtenido/3 brazos.
Tabla 1. Variedad de iniciadores utilizados en los procesos de polimerización y diferentes DP obtenidos para St-PBLG, Mna
Estrella R1 DPteor kDa) Mnb (kDa) DPa DPb
( B
SE1 100 21.3 21.0 97 96 1.26
Etil
SE2
Figure imgf000029_0001
150 24.0 27.6 110 126 1.22
SE3 250 50.3 51.5 229 235 1.09
SH1 75 16.4 n.d. 75 n.d. 1.25
Hexil
SH2
Figure imgf000029_0002
^ 150 23.9 23.6 109 108 1.23
SH3 ' 250 51.5 52.7 235 240 1.17
SD1 75 15.7 16.9 72 77 1.13
SD2 DOOA 100 22.2 24.1 101 110 1.23
SD3
Figure imgf000029_0003
150 33.2 31.1 152 142 1.10
SD4 200 40.4 41.6 185 190 1.12
Cisteamina
SS1
Figure imgf000029_0004
200 43.1 n.d. 196 n.d. 1.22
Phe-Etil
SP1
Figure imgf000029_0005
400 79.8 79.8 375 375 1.12
Phe-Phe-Etil
Figure imgf000029_0007
Figure imgf000029_0006
a Determinado por NMR. b Determinado por GPC. Mn y DP hacen referencia al la masa molar promedio y al grado de polimerización, respectivamente. n.d.= no determinado.
Fig. 1 muestra la caracterización rutinaria mediante GPC y CD de los compuestos con fórmula (I).
Siguiendo el procedimiento general para la polimerización descrito en la sección 1.2 para St-PBLG, y usando el iniciador a base de etilo, se han sintetizado una serie de homopolipéptidos y copolipéptidos en bloque o aleatorios usando el aminoácido respectivo N-carboxianhidrido; épsilon-trifluoroacetato-L-lisina N-carboxianhidrido, bencil-L-serina N-carboxianhidrido, sarcosina NCA. Para los copolímeros aleatorios, los NCA se mezclaron en el seno de reacción antes de la adición del iniciador. Para el copolímero de bloque, el N-carboxianhidrido de L-glutamato gammabencilo se polimerizó primero mediante la adición de iniciador seguido de la adición del segundo monómero una vez que se consumió el primer monómero.
Tabla 2. Variedad de polímeros en forma de estrella (compuestos de fórmula (I)) sintetizados con otros monómeros de NCA.
Estrella R1 DPteoro Mna (kDa) Mnb(kDa) DPa DPb B
St-PTLL 60 13.2 10.7 59 48 1.13 St-PTLL 25 5.0 3.6 22 16 1.03 St-PBLS 60 n.d. 9.7 n.d. 55 n.d.
Figure imgf000030_0001
25 4.0 3.4 23 20 1.10 St-PSAR 60 5.0 4.3 70 61 1.18 *St-PTLL: Star-Poli(epsilon-trifluoroacetato-L-Lisina), St-PBLS: Star-Poly(Benzil-L-Serina), St-PSAR: St-Poli(Sarcosina). aobtenida mediante medida en GPC en DMF/LiBr (0.1%). bObtenido mediante 1H-NMR TFA deuterado. n.d.: no determinado.
Tabla 3. Copolímeros de polímeros en forma de estrella (compuestos de fórmula (I)) con BLG y SAR.
Estrella R1 DPt B LG DPt S A R Mna (kDa) Mnb (kDa) DPb DPb O
B LG S A R
St-P(BLG-co- Etil 30 30 7.9 6.4 23 20 1.06 LSAR)
Figure imgf000030_0002
St-P(BLG-b-LSAR) 30 30 8.5 6.6 24 20 1.05 * St-P(BLG-co-SAR): St-poli(gamma-benzil-L-glutamato-co--sarcosina) copolímero aleatorio, St-P(BLG-8-SAR): Stpoli(gamma-benzil-L-glutamato-block-L-sarcosina) copolímero de bloque. aObtenido por GPC en DMF/LiBr (0.1%). b Obtenido por 1H-NMR TFA deuterado.
Fig. 2 y 3 muestran la caracterización rutinaria por GPC de los compuestos de fórmula (I).
1.3. Desprotección de St-PBLG;
Se siguieron diferentes métodos dependiendo del iniciador utilizado: se aplicaron condiciones ácidas cuando se usaron iniciadores basados en etilo y hexilo (iniciadores que incluyen separadores de etilo o hexilo). Por otro lado, se aplicaron condiciones básicas para DOOA (3,6-dioxa-8-octaneamina) y síntesis de iniciadores basados en cisteamina (iniciadores que incluyen DOOA o separadores de cisteamina). Brevemente:
a) Desprotección de St-PBLG con HBr en ácido trifluoroacético (TFA): en un matraz de fondo redondo equipado con un tapón de vidrio y una barra agitadora, 50 mg de St-PBLG (0.23 mmol, 1 eq., unidades de ácido glutámico, GAU) se disolvieron en ácido trifluoroacético (TFA). Una vez disuelto, 2 eq. de HBr (48% v / v) por grupo carboxilo se añadieron gota a gota, y la mezcla se agitó durante 5 horas. Para la desprotección a gran escala de St-PBLG, se aplicaron 16 horas para asegurar la desprotección completa. Luego, la solución se vertió en un gran exceso de éter dietílico frío que produjo un sólido blanco después del aislamiento.
b) Desprotección de St-PBLG en condiciones básicas: en un matraz de fondo redondo, se disolvieron 40 mg de St-PBLG protegido con bencilo (0.183 mmol, 1 eq. GAU) en 16 ml de THF. La solución se enfrió a 4°C y 2 eq. de NaOH por grupo carboxílico del bloque de polipéptidos (14,7 mg, 0,369 mmol) se añadieron en 2 ml de ddH2O. La mezcla se agitó durante 16 horas. Finalmente, se eliminó el THF y el residuo se diluyó con ddH2O, se concentró y se purificó por ultrafiltración (Vivaspin®, tamaño de poro de membrana = 3000 Da) o por columnas de exclusión por tamaño (G-25).
Rendimientos: 75-86 %. 1H-NMR (300 MHz, D2O, 8) 8.2 (s, xH), 4.31-4.26 (m, 1H), 2.38-2.14 (m, 2H) 2.10-1.80 (m, 2H) 2.10-1.80 (m, 2H). x: DP obtenido/3 brazos. Dependiendo del iniciador utilizado, las señales correspondientes de etilo, hexilo o DOOA también estaban presentes. La desprotección de St-PBLG conduce al compuesto de fórmula (I) denominado St-PGA
Figure imgf000031_0001
Fig. 4 muestra la caracterización de rutina por 1H-NMR y dicroísmo circular de compuestos de fórmula (I) Siguiendo el método de desprotección a), los polipéptidos sintetizados en la tabla 3 fueron desprotegidos y la figura 5 muestra el respectivo análisis por RMN 1-H en D2O.
Ejemplo 2. Síntesis de compuestos de fórmula (II)
Figure imgf000031_0002
En un matraz de fondo redondo de un cuello, equipado con una barra de agitación y un tapón, se suspendieron 200 mg de St-PGA (1,55 mol GAU, 1 eq.) en 10 ml de ddH2O. Después, los eq. para la modificación deseada de cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metil morfolinio (DMTm M) (DMTm M c I) se añadieron disueltos en 5 ml de ddH2O (es decir, 128,7 mg, 0,465 mmol, 0,3 eq. para una modificación del 30%). Después de 10 minutos 0,93 mmol (0,6 eq. para una modificación del 30%) de la amina correspondiente se añadieron y el pH se ajustó a 8 añadiendo unas gotas de solución de NaHCO3 1M. La reacción se dejó transcurrir durante la noche agitando a temperatura ambiente. Después de esto, como todos los subproductos eran solubles en solución acuosa ácida, se realizó precipitación con ácido / base, diálisis (Vivaspin® MWCO 3000 Da) o cromatografía de exclusión por tamaño con columnas Sephadex G-25, para purificar el copolímero. Se obtuvo un sólido amorfo incoloro después de la liofilización. Rendimientos: 80-90 %. 1H-Nm R Sh (300 MHz, D2O) y estructuras químicas:
Figure imgf000032_0001
a) Estrella poli(ácido glutámico-co-propargil glutamato), St-Prop(x): 1H-NMR Sh (300 MHz, D2O): 8.2 (1H/(3DP),s), 4.30-4.02 (1H, m), 3.81 (2xH, s), 2.48 (1xH, s), 2.35-2.02 (2H, m), 2.01-1.65 (2H, m). x: porcentaje molar de modificación.
b) Estrella poli(ácido glutámico-co-EG(n)N glutamato), St-EG(2)N3(x): 1H-NMR Sh (300 MHz, D2O): 8.2 (1H/(3DP), 4.28-4.07 (1H, m), 3.65-3.51 (xH, m), 3.48 (2xH, t), 3.40-3.30 (2xH, m), 3.25 (2xH, d), 2.29 -2.00(2H, m), 1.98 -1.65 (2H, m). *R: 8 for EG2, 20 for EG6, 32 for e G9. x: porcentaje molar de modificación.
c) Estrella poli(ácido glutámico-co-piridil cisteamina), St-PD(x): 1H-NMR Sh (300 MHz, D2O): 8.4 (xH+1H/(3DP), m), 7.84 (2xH, m), 7.28 (xH, m), 4.33 (1H, m), 3.48 (2xH, m), 2.95 (2xH, m), 2.3-1.9 (4H, m). x: porcentaje molar de modificación.
d) Estrella poli(ácido glutámico-co-amino-etil-maleimida glutamato), St-Malei(X): 1H-NMR Sh (300 MHz D2O): 8.32 (1H/(3DP), s), 6.91 (2xH,s), 4.39 (1H,s), 3.80 -3.16 (4xH, m), 2.18 (, 4H , m). x: porcentaje molar de modificación.
e) Estrella poli(ácido glutámico-co-hidrazida-boc glutamato), St-hyd-boc(x): 1H-NMR Sh (300 MHz, D2O): 8.34 - 8.25 (1H/(3DP), s), 4.33 (1H, s), 2.53 - 1.75 (4H, m), 1.45 (x1H, s). x: porcentaje molar de modificación.
f) Estrella poli(ácido glutámico-co-acetaldehído) St-acetal(x): 1H-NMR Sh (300 MHz, D2O): 8.29 (1H/(3DP), s), 4.32 (1H, s), 3.87 -3.45 (x4H, m), 3.18 (x1H, m), 3.02 (x1H, m), 2.45 - 1.85 (4H, m), 1.77 - 1.47 (x4H, m), 1.19 (x6H, m). x: porcentaje molar de modificación.
La síntesis también se llevó a cabo en disolventes orgánicos como DMF, utilizando la sal BF4 del derivado DMTMM. La Fig.6 muestra el espectro 1H-NMR seleccionado como parte de la caracterización de rutina de los compuestos de fórmula (II).
Ejemplo 3. Estudio del ensamblaje y autoensamblaje mediante motivos BTA de compuestos de fórm ula (I) y (II)
3.1. Autoensamblaje de compuestos de fórmula (I).
a) Evidencias físico-químicas.
Cuando se realizó una caracterización exhaustiva de nuestros sistemas en forma de estrella, se encontraron datos interesantes sobre el tamaño de los compuestos. Se han realizado experimentos de dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS) como técnica de rutina en el laboratorio para dilucidar el tamaño y la conformación de la solución de los compuestos de la invención. Cuando estas arquitecturas fueron analizadas por SANS y después de un tratamiento de datos y ajustes adecuados (Fig. 7), el radio de giro se determinó en el rango de 70-160 nm, mucho más alto que el esperado para St-PGA individuales (entre 5-10 nm). Estos experimentos se llevaron a cabo a una concentración relativamente alta (10 mgmL-1) y, por lo tanto, podría desencadenarse el autoensamblaje. El análisis de ajuste SANS correlacionó estas estructuras con "esferas duras con ramas apuntando hacia afuera".
Además, cuando se realizaron mediciones de DLS en tampón PBS pH 7,4, se descubrió que esos sistemas se someten a un proceso de autoensamblaje dependiente de la concentración. A bajas concentraciones, se identificaron "unímeros" de 5-10 nm de diámetro, mientras que se formaron estructuras más grandes de alrededor de 100-200 nm de diámetro a altas concentraciones. Este fenómeno ocurrió en todos los sistemas en forma de estrella independientemente del espaciador en el núcleo BTA del iniciador (etilo, hexilo o DOOA, cisteamina, Phe-etilo). Sin embargo, no ocurrió en PGA lineal (Fig. 8 ). Con concentraciones crecientes, se pudo observar claramente la desaparición de las estructuras pequeñas y la aparición progresiva de las más grandes, hasta el punto en que solo se observaron estructuras grandes de 100-200 nm de tamaño (diámetro) (2 mg-mL'1). Al monitorizar la intensidad dispersa, la tasa de recuento promedio (MCR) en Kcps obtenida frente a la concentración, se puede obtener un valor de concentración de agregación crítica (CAC) con la intersección de las dos curvas lineales (Fig. 8 ). Este valor de CAC no solo representaba la concentración por encima de la cual se llevaban a cabo los procesos de agregación, sino que también representaba la concentración máxima de especies de polímeros libres no agregados presentes en la muestra bajo esas condiciones específicas (temperatura, fuerza iónica, pH).
La Tabla 4 resume los valores de CAC, radio hidrodinámico (Rh) y radio de giro (Rg) obtenidos por DLS y SANS respectivamente, para varios St-PGA con diferentes iniciadores y longitudes de cadena. Se obtuvieron valores Rh similares para todos los polímeros con forma de estrella medidos. Sin embargo, se observaron valores CAC más altos con longitudes de cadena mayores, con la excepción del iniciador DOOA. Esto podría deberse a la hidrofilicidad de este espaciador.
Tabla 4. Resumen de los valores de CAC, radio hidrodinámico (Rh) y radio de giro (Rg) obtenidos por DLS y SANS para diferentes polímeros en estrella.________________________________________
Estrella R1 GAU brazo a CAC. b R h c (nm) Rg d (nm)
SD2 Dooa 34 0.30 53.0 69.1
SD4 Dooa 62 0.30 47.7 91.1
SH3 Hexil 78 0.40 62.7 80.8
SE1 Etil 33 0 .2 0 60.1 160.7
SE3 Etil 77 0.55 123.7 84.5
a. GPC en DMF/LiBr a 8 mg-mL’1. b. Concentración Crítica de Agregación (CAC) medida por DLS (MCR vs. concentración) en PBS a 20 °C. c. Datos de DLS a 2 mg-mL’ 1 en tampón PBS a pH 7.4 a 20 °C expresado en intensidad promedio. Datos dedSANS (ILL, Grenoble), medidos a 10 mg-mL-1 en tampón PBS a pH 7.4 a 20 °C.
Por consiguiente, se propone un proceso de autoensamblaje para que estos sistemas conduzcan a estructuras más grandes con formas de esfera dura que tengan puntos de ramificación dirigidos hacia el exterior (Fig. 9). Debe notarse que el proceso de autoensamblaje de estos St-PGA representa un equilibrio reversible y dinámico entre especies libres no agregadas y grandes ensamblados con amplias distribuciones de tamaño. (Fig. 9)
Para desentrañar la organización molecular del núcleo BTA dentro de los ensamblajes, se realizaron experimentos de contraste SANS con arquitecturas BTA marcadas con Deuterio en el instrumento LOQ SANS en el ISIS (Reino Unido). Para ese fin, se sintetizó un iniciador de 3 brazos marcado con Deuterio (D) en dos pasos usando ácido 1,3,5-benceno tricarboxílico y etilendiamina N-Boc, ambos completamente deuterados (fig. 10).
Figure imgf000034_0001
Este sistema se estudió mediante experimentos de contraste SANS tanto en disolventes H2O como D2O. Cualitativamente, el experimento de contraste en H2O mostró una protuberancia prominente en comparación con la muestra en D2O. La agregación del núcleo BTA de autoensamblado dio como resultado diferencias en la densidad de longitud de dispersión entre el dominio hidrofóbico y el esqueleto del polímero expresado en nuestro sistema como una "protuberancia" en el gráfico I (Q) frente a Q en valores Q altos (Fig.11) . Esta característica proporcionó una indicación directa de una dimensión característica "corta" en la estructura, lo que sugiere la presencia de dominios autoensamblados de BTA. También señaló la presencia de dominios centrales BTA en vez de una distribución aleatoria de restos BTA a lo largo de la nanoestructura, de acuerdo con informes previos en la literatura. Este hecho confirma que el núcleo central de BTA es el motivo principal para el ensamblaje de estas arquitecturas en lugar de simplemente la forma de estrella. Cuando se observó bajo el microscopio utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), el polímero en forma de estrella con motivos BTA en el núcleo, exhibió nanopartículas homogéneas con forma globular de aproximadamente 80-100 nm de diámetro con dispersiones relativamente bajas, confirmando aún más los hallazgos obtenidos en el primer experimento SANS y análisis DLS (Fig. 12).
b) Respuesta a estímulos.
Con la dependencia de la concentración del tamaño verificada, se investigó más a fondo el efecto de diferentes estímulos, como la temperatura y la fuerza iónica, utilizando St-PGA sin ninguna modificación como sistema modelo. La dependencia del tamaño de la fuerza iónica de los medios se investigó después de las primeras evidencias encontradas (ver Tabla 5) al medir la misma muestra en ddH2O o tampón PBS 0.1 M pH 7.4.
Tabla 5. Determinación del tamaño de St-PGA (iniciada a base de etilo) por DLS (PBS y ddH2O) y RMN (DOSY). Compound R h a (nm) R h b (nm) R hc (nm) R hd (nm) R he (nm) St-PGA 36.4 69.1 123.7 2.7 124.4 *Datos obtenidos de una muestra de 2 mg-mL'1 a. DOSY NMR en D2O. b. DLS (número promedio) en ddH2O. c. DLS (intensidad promedio) en ddH2O. d. DLS (número promedio) en PBS a pH 7.4. e. DLS (intensidad promedio) en PBS 7.4.
Se puede concluir que la presencia de sal y, por lo tanto, la modulación de la fuerza iónica, afecta altamente el equilibrio del autoensamblaje al desplazarlo hacia la región unimérica. En ausencia de sales, en el DLS no se observaron unímeros. A partir de entonces, la fuerza iónica se estudió más a fondo, y decidimos investigar la influencia de diferentes sales en el tamaño del agregado (Fig. 13). Se eligieron el cloruro de sodio (NaCl), el clorhidrato de guanidinio (GuHCl) y el sulfato de sodio (Na2SO4) debido a sus diferentes naturalezas. Como se puede observar en la figura 13, la intensidad dispersa se reduce progresivamente al aumentar el contenido de sal, siendo el Na2SO4 el más perjudicial. Además, la dependencia de Rh (número medio) del contenido de sal revela el desmontaje de los agregados simplemente mediante la adición de 50 mM de cualquier sal.
La dependencia del tamaño de la concentración se estudió a 37°C en el rango de concentración de 1 a 10 mg-mL'1 de St-PGA. Como se puede observar en la Fig. 14, se descubrió un aumento repentino en el tamaño por encima de 5 mg mL-1 de ~ 70 nm a ~100 nm. También se descubrió una dependencia del tamaño de la temperatura cuando el sistema se estudió mediante mediciones de DLS a 10 mgmL-1 en el rango de temperaturas entre 10 y 60 °C.
3.2. Autoensamblaje de compuestos con fórmula (II).
Para ese propósito, varios polímeros en estrella basados en el iniciador de etil-BTA se modificaron con alquinos y azidas usando las técnicas optimizadas de post-polimerización, ya sea en la misma cadena de polímero o en diferentes polímeros para producir compuestos de fórmula (II). Entre el 5 y el 50% de las GAU (unidades de ácido glutámico) de St-PGA se modificaron con propargilamina y NH2EG (2) N3 respectivamente. Un polímero también se modificó doblemente con 10% de alquino y 20% de azida (%mol GAU). Se calcularon los polímeros analizados por DLS y CAC (fig. 15). Como control negativo para el estudio, también se midieron los PGA modificados con alquino lineal (5 y 10% en moles de GAU), lo que condujo a la ausencia de procesos de agregación en el rango de concentración estudiado.
Tabla 6. Resumen de los valores de CAC y radio hidrodinámico (Rh) obtenidos por DLS de los compuestos de fórmula (II).
Mod.
Compuesto GAU brazo a GAU b CAC c R hd (nm) R he (nm)
St-prop(5) 50 5 0.60 44.0 67.2 St-prop(10) 50 10 0.50 38.5 77.3 St-prop(20) 50 20 0.40 37.4 6 8 .6 St-prop(30) 50 30 0.35 49.2 95.5 St-prop(50) 50 50 0.35 45.1 90.6 St-EG(2)N a (5) 50 5 0.50 2.3 69.0 St-EG(2)N a (10) 50 10 0.55 2.7 58.2 St-EG(2)N 3 (20) 50 20 n.d.* 2 .6 75.2 St-EG(2)N 3 (30) 50 30 n.d.* 2.5 65.8 St-EG(2)N 3 (50) 50 50 n.d.* 2 .6 71.1 n.d.=no determinado. *CAC no se pudo calcular en el rango de concentraciones empleado. La agregación (si ocurre) se podría encontrar por encima de 2 mgmL-1. a. GPC en DMF/LiBr a 8 mgmL-1. b. Datos obtenidos por 1H-NMR en mol%. c. CAC medido por DLS in PBS a 20 °C y tamaños medidos por DLS a 2 mgmL -1 en PBS a 20°C d. Número promedio e. Intensidad promedio.
La morfología de los ensamblados también se investigó a través de Cryo-TEM. Como se muestra en la Fig. 16, esta morfología no varía significativamente del compuesto original con las diferentes modificaciones químicas introducidas. En todos los casos se encontraron agregados globulares en el rango de 100 nm. En general, estos resultados están en buena correlación con los encontrados para el compuesto original y también con los datos de DLS y SANS obtenidos para esta serie de compuestos. En un segundo ejemplo, para validar la versatilidad de este enfoque, se implementaron diferentes modificaciones de la cadena de polímeros (introducción de tioles, maleimidas, hidrazidas y acetales) para realizar otras estrategias de captura covalente. En primer lugar, se llevó a cabo la síntesis de polímeros en forma de estrella con unidades de ditiol activadas (usando piridil-cisteamina, PD), polímeros en estrella con grupos maleimida (usando NH2-CH2CH2-maleimida, malei), estrellas con grupos de hidrazida (hid) y acetales. La identidad de los compuestos se determinó por 1H-NMR, (Fig. 6 ) Su comportamiento de agregación se estudió también por DLS, lo que demostró estructuras agregadas de alrededor de 100 nm al aumentar la concentración.
Tabla 7. Resumen de los valores de CAC y radio hidrodinámico (Rh) obtenidos por DLS de los compuestos de fórmula (II).
Compuesto GAU brazo a Mod.
b CAC c
GAU R hd (nm) R h e (nm)
St-PD(4 50 4 0 .6 141.55 194.4 St-PD(10) 50 10 0.55 168.78 144 St-PD(21) 50 21 0.5 1 2 1 .8 8 142.5 St-PD(35) 50 30 0.45 84.68 n.d. St-PD(44) 50 44 0.3 n.d. 138.9 St-PD(60) 50 60 n.d.* n.d. 88.3 St-malei(5) 50 5 0.40 82.3 38.5 St-malei(10) 50 10 0.35 74.6 31.9 St-malei(35) 50 35 0.30 n.d. n.d. St-hid(5) 50 5 0.5 74.6 32.9 St-hid(10)____________________________ 50____________ 10____________ 0.4__________ 81_6_______ 35.8 n.d.=no determinado. *CAC no se pudo calcular en el rango de concentraciones empleado. La agregación (si ocurre) se podría encontrar por encima de 2 mg-mL-1. a. GPC en DMF/LiBr a 8 mg-mL-1. b. Datos obtenidos por 1H-NMR en mol%. c. CAC medido por DLS in PBS a 20 °C y tamaños medidos por DLS a 2 mg-mL-1 en PBS a 20°C d. Número promedio e. Intensidad promedio. e. Datos de DOSY en D2O
3.3. Coensamblaje de compuestos con fórmula (II).
Los estudios para evaluar el ensamblaje se realizaron mediante DLS, observando el cambio de valor de CAC de uno de los compuestos tras la adición de una cantidad constante (siempre por debajo de su CAC) del segundo componente. Se prepararon dos series diferentes de soluciones para los experimentos de determinación de CAC: St-EG (2) N3 (5), St-prop (10), y la misma serie pero con la adición del segundo componente en una concentración por debajo de su CAC. La figura 17 muestra las gráficas de dispersión de intensidad frente a la concentración variable de uno de los componentes manteniendo constante la concentración del otro componente (siempre por debajo de su CAC). Se pudo ver una disminución en el valor de CAC en ambos casos cuando el segundo compuesto se agregó a la solución. Estos hallazgos de alguna manera sugieren una sinergia en la formación de conjuntos mixtos a través de procesos de coensamblaje, lo que está de acuerdo con informes anteriores sobre especies de BTA modificadas con PEG, pero también con sistemas de copolímero de bloque.
La espectroscopía de RMN de eco de espín con gradiente pulsado, conocida como espectroscopía de RMN de difusión (o RMN de DOSY), permite determinar el coeficiente de difusión de las especies presentes en la solución. Luego, se probó el proceso de ensamblaje mediante el uso de una muestra que contenía St-prop (10) por encima de su CAC (2 mg-mL'1) en presencia de St-EG (2) N3 (5) por debajo de su CAC (0.1 mg • mL'1).
Como se puede ver en la Fig. 18, los espectros de RMN-1H mostraron las señales correspondientes a cada uno de los componentes empleados en el análisis de RMN-DOSY. Después del tratamiento de los datos, se puede ver que el compuesto St-prop (10) muestra el coeficiente de difusión característico de las especies autoensambladas (5.03 • 10­ 12 m2 s-1) esperado para la concentración estudiada. Sin embargo, el compuesto St-EG (2) N3, que, a 0.1 mg-mL-1 debería presentar un coeficiente de difusión mayor en comparación con las construcciones autoensambladas, redujo su coeficiente de difusión en un orden de magnitud de (3.12 •10-11 m2 s-1) a (5.2410-12 m2 s-1), que es prácticamente equivalente al encontrado para el componente St-prop (10). Estos resultados sugieren que aunque St-EG (2) N3 está por debajo del CAC, se mueve junto con las construcciones autoensambladas de la parte St-prop (10) y, por lo tanto, confirma indirectamente que estas arquitecturas pueden ensamblarse conjuntamente.
Además, la confirmación del proceso de coensamblaje se evaluó con la ayuda de los experimentos NOESY. Como se observa en la figura 19, se encontró una clara correlación de NOE para las señales de propargilo y etilenglicol, un resultado que confirma la proximidad espacial entre ambos grupos.
Ejemplo 4: Síntesis de compuestos de formula (III)
En la figura 20 se muestra un esquema general de la metodología propuesta para autoensamblar los poliglutamatos en forma de estrella en morfologías bien definidas y estabilizar los agregados mediante entrecruzamiento covalente, incluidas todas las variaciones químicas y estructurales. El siguiente ejemplo no limitante pretende ilustrar el enfoque ascendente (véase la figura 2 1 ) empleado para la construcción de estos vehículos complejos que emplean los derivados funcionalizados con propargilo y azida.
La metodología para el acoplamiento de alquino-azida catalizada por cobre (CuAAC) de derivados de St-PGA: utilizando los compuestos de fórmula (II), polímeros en forma de estrella St-prop (10) (Estrella-PGA basado en BTA-etilo y modificado con unidades de propargilamina 10 mol%) y St-EG (2) N3 (5) (Estrella PGA basado en BTA-etilo y modificado con unidades de oligoetilenglicol azida 5 mol%): Estos polímeros se eligieron para tener un exceso de unidades de propargilo para asegurar la conversión completa, ya que la reacción se realizará en una relación equimolar de ambas funcionalidades. La reacción se llevó a cabo en ddH2O (las construcciones estaban presentes en estado agregado como se vio anteriormente), usando una concentración para asegurar la única presencia de grandes estructuras dentro de la mezcla polimérica (relación 1 :1 , 2 mg-mL-1). La mezcla se sonicó primero durante 5 minutos para promover la homogeneización. Entonces, se añadieron 5 eq. de ascorbato de sodio en solución de ddH2O. Luego, la mezcla se desgasificó realizando dos ciclos de congelación-bomba-descongelación. 1,0eq. de CuSO4 se pesó bajo flujo de N2 y se añadió en solución de ddH2O a la mezcla de reacción. La mezcla completa final se desgasificó realizando otro ciclo de congelación-bomba-descongelación y se dejó reaccionar a 40°C en un baño de aceite protegido de la luz. La conversión completa se logró después de 3 días, de acuerdo con 1H-NMR (la señal de triazol a 7,8 integra para 5% en moles). También se llevaron a cabo otras químicas de acoplamiento que comprenden i) química de ditiol, ii) química de tiol-maleimida, iii) química de hidrazina-aldehído (Wolff-Kishner). Los productos obtenidos se caracterizaron por 1H-NMR y los resultados se muestran en la Fig. 22.
Además, el sistema clicado se estudió mediante mediciones de DLS en comparación con una mezcla física 1:1 de ambos componentes por separado después de la sonicación. Los experimentos de dilución se realizaron diluyendo ambas muestras hasta 32 veces la solución madre de1 mg-mL-1 d. En el caso de la mezcla física, ya se encontraron dos estructuras diferentes en la primera dilución (relación 1:2). Sin embargo, para la construcción clicada, solo se encontraron grandes estructuras de aproximadamente ~ 80-100 nm de diámetro, incluso a 1/32 de la concentración inicial (~ 0.03 mgmL-1) (Fig. 23). La pequeña disminución en los conjuntos encontrados para el sistema en el que se hizo clic (de 45 a 30 nm de radio) podría deberse a la baja cantidad de eq. de grupos de entrecruzamiento efectivos (en este caso azida, 5% en moles) dando como resultado un entrecruzamiento incompleto de las nanoestructuras autoensambladas.
Las imágenes Cryo-TEM del sistema pulsado confirmaron la formación de estructuras esféricas con un diámetro de ~ 100 nm (Fig. 24).
La captura covalente usando química de ditiol se realizó a concentraciones de 10 mg.mL-1 para cada compuesto en ddH2¿> para química de ditiol y en tampón PBS a pH 7.4 para tioleno, debido a la necesidad de controlar el pH durante el tiempo de reacción para garantizar la estabilidad del grupo maleimida. Después de la purificación por diálisis, el éxito del atrapamiento fue ratificado por 1H-NMR. (Fig. 22). En el caso de la química de ditiol, la confirmación se logró mediante la desaparición de las señales aromáticas correspondientes a los grupos piridilo, mientras que las señales de CH2 de la cisteamina se mantuvieron, en el caso de la química de ditiol. Para las reacciones de tioleno, la ausencia del pico de maleimida característico alrededor de 6,7, así como las señales de piridilo, eran indicativos de acoplamientos efectivos. Las mediciones de DLS y TEM confirmaron la captura covalente que conduce a estructuras estables de alrededor de 100 nm de diámetro.
Ejemplo 5. Síntesis de conjugados que comprenden compuestos de fórmula (I), (II) o (III) y otro agente.
La modificación de los residuos de glutamato se lleva a cabo en condiciones análogas para todos los compuestos comprendidos en las fórmulas I, II y III. Para simplificar, la estrategia sintética general se ilustra para una cadena principal de ácido poli-L-glutámico general como se muestra a continuación:
Figure imgf000037_0001
5.1. Conjugación de Oregon Green Cadaverina con compuestos de fórmula (I), (II) o (III):
Para la terapia basada en macromoléculas y los sistemas de liberación de fármacos de tamaño nanométrico, el marcado fluorescente se aplica comúnmente para permitir estudios de tráfico intracelular, localización específica dentro de las células y/o la realización de estudios in vivo y farmacocinéticas. Las sondas como el fluoróforo Oregon Green (OG) se han empleado ampliamente en estudios celulares para determinar la internalización y unión celular. Con este objetivo, la sonda conjugada debe cumplir algunos requisitos, como poseer una alta estabilidad química y un enlace químico estable para garantizar una monitorización adecuada del portador. Por otro lado, se requiere un porcentaje mínimo de carga de la sonda para evitar una mala interpretación de los resultados debido a cambios en la conformación del polímero que resultan de cambios en la carga y solubilidad. Para cumplir con todos estos criterios, se conjugó menos del 1% (molar) de OG a través de un enlace amida no biodegradable. La conjugación de OG con el sistema de clic se realizó utilizando diisopropilcarbodimida (DIC) / hidroxibenzotriazol (HOBt) como activante de ácido carboxílico en disolventes orgánicos, o DMTMM Cl en solución acuosa. El protocolo de conjugación de OG empleado, había sido establecido previamente en el laboratorio del Dr. Vicent, asegurando una eficiencia de conjugación del 80-90% del marcador fluorescente. El siguiente esquema representa la ruta sintética para el del marcado de polímeros:
Figure imgf000038_0001
En un matraz de fondo redondo de dos cuellos equipado con una barra agitadora, se pesaron y disolvieron 29 mg de compuestos de fórmula (I), (II) o (III) (0,225 mmol de unidades de ácido glutámico o GAU, 1 eq.) en 1,5 ml de DMF anhidro bajo flujo de N2. Se añadieron N,N'Diisopropilcarbodiimida (1.12 j L) y DIC (0.85 mg, 0.00674 mmol, d = 0.806 g/mL, 0.03 eq.) y la reacción se dejó continuar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadió directamente hidroxibenzotriazol, HOBt (1 mg, 0,00674 mmol, 0,03 eq.). Luego se dejó que la reacción continuara durante 10 minutos antes de agregar Oregon Green Cadaverina (1 mg, 2.25 ■ 10-3 mmol, 0.01 eq.). El pH se ajustó a 8 agregando ~ 100 j L de DIEA. La mezcla se dejó agitando durante la noche protegida de la luz. Finalmente, el disolvente se eliminó al vacío a temperatura ambiente y el producto se disolvió en 300 j l de agua y luego se añadieron ~ 50 j l de NaHCO3 1M. La solución se purificó por columna Sephadex PD-10 empleando agua destilada como eluyente. La carga de Oregon Green (OG) se calculó por fluorescencia usando un lector de placas Victor2 WallaceTM, dotado con filtro de excitación de 490 y un filtro de emisión de 535nm. Para realizar dicha cuantificación, se realizó inicialmente una curva de calibración con OG. Rendimiento: 95%. Carga de OG: 0,8 mol de GAU.
5.2. Conjugación de Cy5.5 a compuestos de fórmula (I), (II) o (III).
Brevemente, en un matraz de fondo redondo de un cuello, el polímero basado en PGA se disolvió en ddH2O (1 eq. GAU). Seguidamente, los grupos carboxílicos se activaron usando DMTMM Cl (es decir, 0.02 eq. para una modificación del 2%). Se permitió que la reacción continuara durante 10 minutos. Después de ese tiempo, se agregó Cy5.5 (es decir, 0.02 eq. para una modificación del 2%) en ddH2O. El pH se ajustó a 8 añadiendo bicarbonato de sodio 1 M. La reacción se dejó proceder durante 24 horas, protegida de la luz. Para la purificación, los productos se emplearon tanto Sephadex G25 como a diálisis utilizando Vivaspin® MWCO 5000. La estimación del contenido de Cy5.5 se realizó por fluorescencia (Aem: 595 nm, Aex: 680 nm) después de la construcción de una curva de calibración apropiada del marcador fluorescente Cy5.5 en el tampón PBS.
Rendimientos: 60-70%. Eficiencia de conjugación 70-90%.
5.3. Conjugación de DO3AtBu-NH2 con compuestos de fórmula (I), (II) o (III):
En cuanto a la conjugación de OG, se usaron DIC/HOBt como activadores de ácido carboxílico en disolventes orgánicos o DMTMM Cl en solución acuosa.
Figure imgf000039_0001
En un matraz de fondo redondo de dos cuellos equipado con una barra de agitación, se disolvieron 300 mg (de St-PGA), 110 GAU, 2,32 mmol GAU, 1 eq., en 20 ml de DMF anhidro bajo flujo de nitrógeno. Luego, se añadieron 53 pL de DIC (88 mg, 0.70 mmol, 0.3 eq.) y la reacción se dejó proceder durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadió HOBt (94 mg, 0,70 mmol, 0,3 eq.), directamente. Seguidamente, se dejó que la reacción continuara durante 10 minutos antes de que se añadiera DOaAtBu-NH2 (282 mg, 0,46 mmol, 0,2 eq.), para una modificación del 20%. El pH se ajustó a 8 añadiendo ~ 100 pL de DIEA. La mezcla se dejó agitando durante 48 horas a temperatura ambiente y protegida de la luz. Finalmente, el disolvente se eliminó parcialmente al vacío, se precipitó en un gran exceso de acetona fría, se filtró y se lavó tres veces con acetona fría. Se obtuvo un sólido amarillo pálido después del secado. El porcentaje de GAU modificada se calculó como 20% mol de GAU, de acuerdo con la señal de los grupos tBu a 1,4 ppm en comparación con el protón alfa de las cadenas principales de PGA en los espectros de 1H-NMR. Eficiencia de conjugación: 100%. Rendimiento: 75%.
Desprotección de DO3A tBu-NH?:
Figure imgf000039_0002
Se usaron dos protocolos diferentes dependiendo de la naturaleza del compuesto. Para construcciones sin ningún grupo sensible a las condiciones del ácido trifluoroacético (TFA), se aplicó el primer protocolo. Se introdujo el uso de triisopropilsilil éter (TIPS) en el segundo protocolo para evitar la ruptura de enlaces disulfuro durante las condiciones de desprotección.
Protocolo 1. EL sistema se disolvió en una mezcla de CH2C h/ TFA (3/2, v / v) y se dejó bajo agitación intensa durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de ese tiempo, la solución se precipitó vertiéndola en un gran exceso de éter dietílico frío. Se obtuvo un sólido amarillo pálido después de filtrar, lavar con éter dietílico y secar al vacío. La desprotección completa se logró según lo confirmado por 1H-NMR. Rendimientos: 80-90%.
Protocolo 2. El sistema se disolvió en una mezcla de TFA/H2O/TIPS (95/2.5/2.5, v/v) y se dejó agitando a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, el contenido se precipitó en un gran exceso de éter dietílico frío. Se recogió un sólido amarillo pálido, se lavó con éter dietílico y se secó al vacío. La desprotección completa se confirmó mediante análisis 1H-NMR. Rendimientos: 80-90%.
5.4. Radiomarcaje con 111In de compuestos de fórmula (I), (II) o (III).
Como ejemplo, se preparó St-PGA-DO3A-111In disolviendo 51,3 mg de St-PGA-DO3A en agua desionizada a una concentración final de 10 mg/ml. Luego, se transfirieron de 0,25 a 0,5 ml de esta disolución a un tubo de microondas y el pH se ajustó a 3,5-4 añadiendo tampón HEPES y HCl 2 M. A continuación, se añadieron 7-27 MBq de 111InCl3 en HCl 0,05 M y la mezcla de reacción se calentó a 90 °C durante 5 minutos utilizando un microondas de laboratorio con radiación monomodal (Discover Benchmate, CEM). Posteriormente, la mezcla de reacción se enfrió con gas nitrógeno. La reacción se detuvo después de 5 minutos a temperatura ambiente mediante la adición de 50 pl de ácido etilendiaminotetraacetato (EDTA) 50 mM. El producto St-PGA-DO3A-111In se purificó a partir de 111In-EDTA sin reaccionar mediante un cartucho de cromatografía de exclusión molecular (Bio Gel P-6, BioRad) usando solución salina tamponada con fosfato (pH = 7) como eluyente, a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min. El perfil de elución se determinó fraccionando, 0,77 ml por fracción, y midiendo cada fracción con un calibrador de dosis (VDC 405, Veenstra). El rendimiento radioquímico (RY) se calculó como el porcentaje de la actividad en cada fracción eluída del cartucho de exclusión molecular de la actividad total purificada y corregida teniendo en cuenta el decaimiento.
5.5. Marcado DO3A-Gd3+ para IRM de compuestos de fórmula (I), (II) o (III).
En un matraz de fondo redondo de un cuello, el polímero correspondiente con DO3A en forma de sal sódica (1 eq. de unidades de DO3A GAU modificadas) se disolvió en PBS 0.1 M pH 7.4. Seguidamente, GdCh (1 eq.) disuelto en ddH2O se añadió sobre la solución principal. Durante este proceso, se controló el pH y se mantuvo constante a 8. El grado de complejación de Gd (III) se determinó analizando alícuotas durante el proceso de reacción empleando 4-(2-piridilazo) resorcinol, que vira de color amarillo a naranja en presencia de Gd libre.) No se detectó Gd libre después de 5 horas de tiempo de reacción. Luego se detuvo la reacción y se purificó mediante diálisis usando Vivaspin® 5000 MWCO. La ausencia de Gd libre se confirmó nuevamente usando el método de valoración descrito anteriormente con los contenidos dializados.
Ejemplo 6: Validación de compuestos de fórmula (I) como sistemas de transporte
6.1. Degradación mediante Catepsina B: Para asegurar que la biodegradabilidad de los sistemas poliglutamato con forma de estrella dependiente de la enzima no se había visto comprometida por los cambios estructurales, todos los polímeros se incubaron en presencia de la enzima lisosómica Catepsina B. El St-PGA se degradó en presencia de la enzima lisosómica Catepsina B del mismo modo que el polímero equivalente con arquitectura lineal. Para probar el perfil y la relación de la degradación de los polímeros por la Catepsina B, se prepararon soluciones de St-PGA (3 mg/ml). Se pesaron exactamente 3 mg y se añadieron 700 ul de tampón de acetato 20 mM, pH 6, 100ul de EDTA 2 mM, se añadieron 100 ul de DTT 5 mM. Finalmente, se agregaron 6,25 unidades de catepsina B (100 pl de una solución de 25 unidades de catepsina B en 400 pl de tampón de acetato pH 620 mM. La catepsina B requiere pH 6 para estar activa, la solución de DTT se agrega para activar la catepsina B y se añadió la solución de EDTA para formar complejos con los cationes libres (principalmente Ca2+ que inactiva las catepsinas).
Una vez que se prepararon las soluciones, se tomaron alícuotas de 100 pL en diferentes puntos de tiempo (t = 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas) después de la homogeneización de las soluciones. Mientras tanto, las muestras se mantuvieron a 37°C en agitación. Las alícuotas tomadas fueron congeladas y luego analizadas por GPC. Para evaluar la masa de los conjugados, se inyectaron 100 pL de solución de conjugado de 3 mg/ml en PBS en el GPC usando dos columnas de gel TSK en las series G2500 pWx L y G3000 PWXL con un detector triple Viscotek TDATM 302 87 con detección UV acoplada. La fase móvil utilizada fue PBS 0.1 M, flujo 1 mL/min.
Como se esperaba, se descubrió que los polímeros en estrella fueron degradados por la enzima lisosómica con una cinética similar independientemente del MW y el iniciador utilizado para la polimerización (Fig. 25a).
6.2. Viabilidad celular. Otra característica clave para la validación de los compuestos de la invención como posibles portadores de fármacos o sondas de imagen es su toxicidad en cultivos celulares. A este respecto, se realizaron ensayos MTS de 72 horas (ensayo de agente colorimétrico 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) frente a línea celular de neuroblastoma derivado de humanos (SHSY5Y) así como en HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana). Se encontró que los polímeros no son tóxicos hasta 3 mg/ml (Fig. 25b y c).
6.3. Internalización celular. La comprensión de los mecanismos de internalización celular utilizados por los nanofármacos se ha convertido en un factor clave en el campo de los sistemas de liberación de fármacos. Las nanomedicinas utilizan principalmente vesículas endocíticas o endosomas, que a su vez emplean un mecanismo complejo para dirigir las diferentes moléculas a ubicaciones intracelulares específicas. Se puede decir que la carga, la forma, la composición del material y los grupos funcionales de la superficie son parámetros fisicoquímicos básicos que determinan la entrada celular de nanomedicinas por vía endocítica.
Las técnicas de microscopía confocal y la citometría de flujo se usan rutinariamente con polímeros marcados fluorescentemente para evaluar su internalización por las células. Las imágenes confocales de células vivas permiten visualizar el tráfico entre múltiples compartimentos dentro de células vivas individuales a lo largo del tiempo, evitando posibles artefactos derivados de los protocolos de fijación. Por otro lado, la citometría de flujo nos proporciona información semicuantitativa sobre el mecanismo de internalización.
La citometría de flujo (captación y unión celular) junto con el análisis de microscopía confocal de células vivas (destino subcelular y ruta) en la línea celular de neuroblastoma derivado de humanos (SHSY5Y), se utilizaron para estudiar el tráfico celular de los polímeros en forma de estrella marcados con OG (Fig. 26). Los experimentos de citometría de flujo se llevaron a cabo a diferentes temperaturas, 37 °C (para medir la internalización total) y a 4°C (para medir la unión celular) para determinar la presencia de mecanismos de internalización dependientes o no dependientes de la energía, como la endocitosis o difusión, respectivamente. Vale la pena mencionar que todos los experimentos se realizaron en presencia del inhibidor de la catepsina BCA-047 para evitar la degradación de las cadenas de ácido poliglutámico a lo largo de los períodos de incubación.
Las imágenes confocales de células vivas permiten visualizar el tráfico entre múltiples compartimentos dentro de células vivas individuales a lo largo del tiempo, evitando cualquier posible artefacto derivado de los protocolos de fijación. Los resultados de ambas técnicas mostraron claramente un mecanismo de internalización dependiente de la energía debido a la ausencia de absorción a 4°C como se observa por citometría de flujo. Esto se confirmó aún más con los estudios de microscopía confocal a las 2 horas después del tratamiento con un polímero marcado con OG en células SHSY5Y después de un experimento de búsqueda de pulso, donde se observó la colocalización en los lisosomas con el uso del marcador lisosomal Lysotracker Red (Fig. 26b).
Curiosamente, el St-PGA-OG mostró un aumento significativo en la absorción celular a las 5 horas en comparación con el conjugado lineal-PGA-OG de MW similar (Fig. 27). Esto podría atribuirse a las propiedades inherentes asignadas a los polímeros en forma de estrella. Como base general, los polímeros en estrella tienen una estructura más compacta, presumiblemente con forma globular, y tienen grandes áreas de superficie, mayores concentraciones de grupos terminales funcionales para polímeros con igual peso molecular y propiedades reológicas únicas que los convierten en plataformas óptimas para la administración de medicamentos y la obtención de imágenes. entre otras aplicaciones biológicas.
6.4. B iodistribución y farmacocinética (PK). Para validar aún más los nanoportadores sintetizados, se estudió si biodistribución in vivo, así como sus perfiles farmacocinéticos (PK) mediante mediciones de radioactividad. Para ese propósito, se introdujo el radionúclido emisor de rayos gamma 111In en los PGA en forma de estrella a través de la química de complejación como se explicó anteriormente. Para lograr una complejación estable del radioisótopo metálico, se requiere la incorporación de agentes quelantes bifuncionales en la cadena principal del polímero. Los agentes quelantes más utilizados para 111In se basan en ácidos poliaminocarboxílicos como el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), el ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), o 1, Ácido 4,7-triazaciclododecano-1,4,7-tetraacético (NOTA). Para la biodistribución de arquitecturas basadas en PGA radiomarcadas, se seleccionó el agente quelante derivado de DOTA con un grupo amina libre adecuado para la conjugación (DO3A-NH2). Es bien sabido que DO3A-NH2 forma complejos estables con varios iones M2+ y M3+ como 68Ga o 111In. Por lo tanto, el 20% en moles de GAU de DO3A-tBu-NH2 se conjugó eficazmente a través de un enlace amida a un St-PGA110 (B 1.23).
La eficiencia de conjugación fue casi cuantitativa (ya que se buscó un 10% en moles de GAU) con un rendimiento en masa razonable del 75%. El porcentaje de modificación se calculó de acuerdo con el análisis 1H-NMR comparando la integral correspondiente del CH alfa de PGA (4,24 ppm) con los 27 protones de los grupos tBu a 1,40 ppm (Fig. 28). Los grupos tBu se desprotegieron fácilmente usando la mezcla CH2Ch / TFA (3/2, v / v). Finalmente, el polímero St-PGA-DO3A se marcó con 111In como se describió anteriormente. Los rendimientos radioquímicos fueron > 85% para St-PGA-DO3A-111In en toda la síntesis (como se muestra en la Fig. 29).
Los experimentos con animales para probar la biodistribución y el perfil PK se llevaron a cabo con dosis inyectadas i.v. entre 37 KBq y 2.5 MBq de polímeros marcados con 111In (1-20 pg/g de peso corporal) y monitoreadas hasta 24 horas (se sacrificaron 4-5 ratones por punto de tiempo 0.5, 1,2, 4, 8 y 24 horas). Se extrajeron sangre y órganos y se midió la radiactividad ex vivo en el contador gamma.
Según los resultados obtenidos de la biodistribución, donde el mayor porcentaje de dosis inyectada (ID) correspondía a los riñones, se puede concluir que estas nuevas arquitecturas de polipéptidos siguen perfiles de excreción renal sin acumulación específica en ningún órgano (Fig. 30).
El perfil de biodistribución obtenido para St-PGA se comparó luego con el obtenido para su contraparte lineal de MW similar (100 GAU, B: 1.20). La biodistribución de PGA lineal se realizó previamente utilizando el radioisótopo 68Ga, por lo tanto, solo se pudieron registrar tiempos cortos (hasta 3 horas) debido a la descomposición del radionúclido (aproximadamente 68 minutos para 68Ga). Si se comparan los puntos de tiempo cortos (0.5h, 1h y 2h) del% de ID/g de tejido de PGA-DO3A-68Ga y St-DO3A-111In, se observa una mayor acumulación general en todos los órganos del polímero en forma de estrella, en comparación con el que se encuentra en la construcción lineal de PGA como se muestra en la figura 31.
Aunque los perfiles plasmáticos son similares para ambos compuestos, se pueden establecer diferencias cuando comparamos los parámetros farmacocinéticos (PK) obtenidos para PGA-DO3A-68Ga con St-PGA-DO3A-111In. El polímero lineal no se detectó después de 4 horas después de la administración. Su vida media biológica o terminal estimada resultó ser 13 veces mayor para el polímero estrella, este hecho podría atribuirse en parte al uso de diferentes radionucleidos para el estudio. El uso de 111In permitió estudiar y estimar los parámetros PK de los polímeros estrella proporcionando resultados más precisos debido al mayor período de semidesintegración para 111In (2.1 días) en comparación con 68Ga (68 min).
Tabla 8. Parámetros farmacocinéticos principales de St-PGA- [111In] -DO3A y PGA- [68Ga] -DO3A estimados por un modelo de 2 compartimientos siguiendo la ecuación C(t)=Axe('ALPHAxt)+Bxe('BETAxt). Los valores representan la media ± SD.
Parámetro St-PGA[111 In]-DO3A- pGA-[68Ga]-DO3A-A (% ID/mL) 22.33±5.13 35.00±12.88
B (% ID/mL) 0.04±0.01 4.35±2.78
ALPHA (Ir1) 4.73±0.42 7.28±2.56
BETA (h-1) 0.06±0.04 1.18±0.59
AUC (% ID.h/mL) 5.45±0.76 8.50±0.67
t1/2 ALPHA (h) 0.15±0.01 0.10±0.03
t1/2 b e t a (h) 12.05±7.96 0.59±0.29
Cl (mL/h) 18.35±2.55 11.77±0.93
Vss (mL) 46.34±44.44 5.25±2.52
En el caso del modelo de dos compartimentos, se pueden definir varios términos de volumen. Vss es el volumen de distribución apropiado (Vd) cuando las concentraciones plasmáticas se miden en condiciones de estado estacionario. Este valor Vss es aproximadamente 9 veces mayor para el polímero estrella en comparación con el lineal, lo que significa una mayor distribución del portador. El valor de eliminación (Cl) del compartimento central es ligeramente mayor también en el polímero en forma de estrella (18.35 vs. 11.77 mL/h para p Ga lineal). El valor de eliminación renal de la inulina (un compuesto modelo que se excreta solo por filtración glomerular y no está sujeto a secreción tubular o reabsorción) se ha establecido en alrededor de 20 ml/h en ratones FVB. Este valor es realmente cercano al valor obtenido para el polímero estrella. Por lo tanto, se podría afirmar que el polímero se elimina solo por filtración glomerular. En el caso de PGA lineal, el valor es ligeramente menor. Esto podría explicarse por la unión del compuesto a proteínas plasmáticas, reduciendo la filtración glomerular, o si el polímero lineal pudiera reabsorberse en los túbulos.
Ejemplo 7: Validación de compuestos de fórmula (111) como portadores
7.1. Viabilidad celular. Se estudió la viabilidad celular frente la línea celular SHSY5Y de las tres arquitecturas cliqueadas químicamente diferentes. Todos ellos resultaron no tóxicos hasta 3 mgmL-1 cuando se probaron a las 72 horas de incubación siguiendo un protocolo MTS para la determinación de la viabilidad celular. Los resultados se muestran en la Fig. 32.
7.2. Internalización celular. La citometría de flujo (captación y unión celular) junto con el análisis de microscopía confocal de células vivas (destino subcelular y ruta) en la línea celular de neuroblastoma derivado humano (SHSY5Y), se utilizaron para estudiar el tráfico celular de las estrellas clicadas marcadas con OG (compuestos de fórmula III). Los experimentos de internalización se llevaron a cabo a diferentes temperaturas, 37°C (internalización total) y 4°C (unión) para determinar la presencia de mecanismos de internalización dependientes o no dependientes de energía, tales como endocitosis o difusión, respectivamente. Vale la pena mencionar que todos los experimentos se realizaron en presencia del inhibidor de la catepsina B CA-047 para evitar la posible degradación de las cadenas de PGA a lo largo de los períodos de incubación. Los resultados se representaron mediante fluorescencia asociada a células (CAF) durante el tiempo de incubación. El CAF representa el porcentaje de células positivas multiplicado por la intensidad de fluorescencia y dividido por 100, eliminando siempre el CAF de las células de control (sin tratamientos) para evitar cualquier artefacto del fenómeno de autofluorescencia.
Los resultados mostrados en la Fig.33 demuestran los mecanismos de internalización dependientes de energía (endocitosis) debido a la ausencia de absorción a 4°C como se observa por citometría de flujo. Como era de esperar, esta estructura de forma globular se internalizó rápidamente, mostrando alrededor del 95% de las células positivas ya a los 15 minutos (Fig. 33a). Además, cuando esta construcción se comparó con el PGA lineal y el PGA estrella sin clic, se observó un aumento significativo en la fluorescencia asociada a células (CAF) (Fig. 33b). No solo dicho compuesto atraviesa una absorción más rápida (de acuerdo con las células CAF y% positivas) sino que la cantidad de construcción internalizada es significativamente mayor en comparación con los otros 2 sistemas. Además, la localización conjunta con el marcador lisosomal Lysotracker Red se encontró en imágenes de microscopía confocal (Figura 34).
Ejemplo 8. Validación de compuestos de fórmula (III) como portadores para cruzar la barrera hematoencefálica (BHE)
8.1. Estrategia sintética y caracterización.
Para validar los sistemas como portadores adecuados para la administración intravenosa, se realizaron experimentos de biodistribución. Las estrellas cliqueadas se marcaron con DO3A-Gd3+ para técnicas de resonancia magnética y Cy5.5 para técnicas de imagen óptica de fluorescencia. Además, para ratificar la versatilidad de los sistemas que se utilizarán como portadores a través de la BHE, el ligando de orientación ANGIOPEP-2 (ANG-2) actualmente en ensayos clínicos de fase II se vinculó a los polímeros. La ruta sintética de estos conjugados se puede ver en la figura 35.
Brevemente, se empleó DMTMM Cl para activar los ácidos carboxílicos, permitiendo la introducción de DO3AtBu-NH2 en primer lugar, seguido de Cy5.5 en la síntesis del sistema no dirigido. Las unidades modificadas con DO3A se cuantificaron por 1H-NMR. Por otro lado, la estimación del contenido de Cy5.5 se realizó por fluorescencia (se llevó a cabo la curva de calibración del colorante Cy5.5 previamente, en tampón PBS, previamente).
Para la construcción no dirigida, los grupos protectores de tBu de DO3A se eliminaron fácilmente en este punto, usando la mezcla TFA:TIPS:H2O (95:2.5:2.5). En el caso del polímero objetivo, las unidades de cisteamina-2TP se introdujeron nuevamente por modificación posterior a la polimerización en medios acuosos antes de la introducción de Cy5.5. La cuantificación se determinó como 10% en moles de GAU por 1H-NMR. Luego, se eliminaron los grupos protectores de tBu de DO3A, y ANG se conjugó siguiendo estrategias anteriores por medio de enlaces disulfuro. Finalmente, Gd3 se complejó con construcciones que llevan DO3A usando un 1:1 eq. De (DO3A:GdCh).
La reacción se llevó a cabo en PBS 0,1 M a pH 8 (se observó precipitación de GdCh a pH más bajo) y se controló mediante valoración usando 4-(2-piridilazo) resorcinol. Este agente de valoración cambia de amarillo a naranja en presencia de Gd3 libre. Después de 5 horas de tiempo de reacción, no se detectó Gd3+ libre. La reacción se purificó por diálisis y se probó nuevamente la ausencia de Gd3+ libre. Las características fisicoquímicas de los conjugados se resumen en la Tabla 9.
Tabla 9. Características fisicoquímicas de los conjugados empleados para la biodistribución in vivo.
mol%GAU mol%GAU/ wt% mol%GAU/ wt% Compuesto w t% wt% GdDO3A Cy5.5 ANG
St-C//ck-DO 3 A-Gd-Cy5.5 10.0 mol% 0.5 mol%
12.020.3 wt% 3.1 wt% -
St-C//ck-DO 3 A-Gd-Cy5.5-ANG 10 mol%
17.6 wt% 10.4 0.5 mol%
2.7 wt% 1.5 mol% 13.8 wt%
El potencial Z de las arquitecturas clicadas antes y después de las modificaciones de la superficie se registró en ddH2O a 20°C y los resultados se muestran en la Fig. 36. Como se puede observar, las modificaciones de la superficie con DO3A-tBu y cisteamina-2TP, significativamente disminuyen el potencial Z negativo obtenido para la estructura en la que se hizo clic con todos los grupos carboxílicos sin modificar y presumiblemente expuestos en la superficie.
La introducción del Cy5.5 cargado negativamente dentro de la estructura resultó en un aumento en el potencial Z obtenido. Finalmente, cuando las secuencias peptídicas de ANG-2 se conjugaron, el potencial Z disminuyó drásticamente a casi neutro, probablemente debido a un efecto de protección proporcionado por las 19 secuencias aa. Además, el tamaño de los sistemas se estimó por TEM en el rango de 70-100 nm de diámetro (Fig. 37)
8.2. Evaluación in vivo de compuestos de fórmula (III) como portadores para cruzar la BHE.
Los experimentos de biodistribución se llevaron a cabo utilizando ratones C57BL/6 y técnicas de fluorescencia aprovechando el marcaje de Cy5.5 en los transportadores poliméricos. Se administraron arquitecturas dirigidas y no dirigidas i.v. a través de la vena de la cola a ratones anestesiados con isofluorano, a una dosis de 4,15 mg-Kg'1 Cy5.5 eq. Luego se sacrificaron dos animales en diferentes momentos (1, 3, 7, 14 y 24 horas). Antes del sacrificio, los ratones se anestesiaron primero con un cóctel de anestesia letal, se extrajo sangre de la vena cava y se realizó perfusión con solución salina para determinar con precisión la cantidad de compuesto en el cerebro. Luego, se extrajeron los órganos y se midió su fluorescencia usando el filtro rojo en MAESTRO™. Para la cuantificación de fluorescencia, se obtuvieron datos normalizados tomando siempre la misma área de píxeles para todos los órganos expresados como señal promedio (recuentoss-1). Se realizó una curva de calibración de los compuestos en el mismo MAESTRO™ para estimar la fluorescencia correspondiente a la dosis inyectada. Los datos de biodistribución obtenidos de polímeros no dirigidos y dirigidos se representan en las figuras 38 y 39.
Cuando se compararon ambos compuestos, no se encontraron diferencias importantes en la biodistribución, como se puede observar en la Fig. 39. Los perfiles de excreción renal se pudieron observar en ambos casos. Sin embargo, se encontró que el compuesto dirigido se acumula en mayor medida en órganos como el hígado y los riñones. En particular, cuando se compararon los datos de biodistribución de estas arquitecturas más grandes con los de las estrellas sin clics, se observó una mayor acumulación en los pulmones en los puntos de tiempo tempranos. Este hecho estuvo de acuerdo con la naturaleza de las arquitecturas utilizadas, ya que los tamaños superiores a 100 nm tienden a acumularse en los pulmones. Por lo tanto, esta familia de arquitecturas podría tener un uso potencial para atacar enfermedades pulmonares como el cáncer de pulmón. Sin embargo, estos portadores también demostraron ser seguros ya que no se observó pérdida de peso en los animales. Además, la acumulación pulmonar disminuyó significativamente con el tiempo, validándolos como posibles portadores.
Es importante tener en cuenta que el compuesto dirigido con ANG ofreció una mayor acumulación de cerebro en los primeros momentos en comparación con la contraparte no dirigido. Sin embargo, se encontró una acumulación similar para ambos compuestos en puntos de tiempo tardíos, como 24 horas. Sorprendentemente, la cantidad encontrada en el cerebro en ambos casos fue entre 1-1.5% ID, que es 20-30 veces mayor que la obtenida para las estrellas sin clics (0.05% ID). Como se mencionó anteriormente y según la literatura, el% ID normal para aquellos sistemas que pueden llegar al cerebro generalmente está entre 1-2% ID, con el máximo obtenido con 4%.
Ejemplo 9. Validación como portador para tratar la enfermedad neurodegenerativa
9.1. Protocolo sintético y caracterización.
El objetivo fue obtener conjugados combinados para administración sistémica con efecto sinérgico utilizando los restos propargil neuroprotectores y neurorescatadores y los curcuminoides neuro-antiinflamatorios, buscando una nueva estrategia terapéutica en la enfermedad de Alzheimer. Brevemente, en un matraz de fondo redondo de dos cuellos, equipado con una barra agitadora, el polímero estrella correspondiente se disolvió en 10 ml de DMF anhidra bajo atmósfera de nitrógeno. Después, se añadió 1.5 eq. del porcentaje deseado de modificación de GAU de DMTMMBF4 en 5 ml más de DMF anhidra. La reacción se dejó proceder durante 10 minutos. Entonces, 1.5 eq. del porcentaje deseado de modificación GAU de bisdemetoxicurcumina (BDMC) se añadieron a la mezcla de reacción, seguido de una cantidad catalítica de DMAP. Se comprobó que el pH era de alrededor de 7. La reacción se dejó continuar durante 72 horas. Para la purificación, la mezcla se vertió en un gran exceso de éter dietílico. Después del aislamiento, el sólido amarillento se convirtió en forma de sal de sodio mediante la adición cuidadosa de NaHCO3 1M. Luego, la solución acuosa se lavó con éter dietílico hasta que no se encontró coloración amarillenta en la fase orgánica. Finalmente, el producto en fase acuosa se purificó por diálisis usando Vivaspin® MWCO 5000, y se liofilizó. El contenido de BDMC se determinó mediante UV-VIS a 415 usando una curva de calibración con BDMC libre. El FDC se estimó por HPLC siguiendo el método: el eluyente A era ddH2O y el eluyente B era acetonitrilo. Las muestras se analizaron usando el siguiente gradiente: de 40% de B a 80% de B durante 20 minutos usando una columna Lichrospher 100 RP 18, 5.0 pm (dimensión: longitud x ID) = 125 x 4.0 mm). Tiempo de retención de BDMC (tr) 5,98 minutos. Los experimentos se realizaron por triplicado. El % de fármaco libre se estableció realizando una curva de calibración con BDMC disuelto en la mezcla ddH2O / Acetonitrilo (50/50) e inyectado en las mismas condiciones de HPLC.
Tabla 10. Características fisicoquímicas de los conjugados BDMC a través de un enfoque ascendente, conjugados de fórmula (II) y (III).
Conjugado TDC wt% FDC wt% o f TDC
(Abs 415 nm ) (Abs 415 nm, HPLC)
St-BDMC 0.5 <1
St-BDMC 1 <1
St-BDMC 2.5 <1
St-EN(2)Na(5)-BDMC 1.25 <1
St-Click-BDMC 2.00 <1
St-Click-BDMC 4.00 <1
*TDC: contenido total de fármaco; FDC: contenido de fármaco libre.
9.2. Viabilidad celular.
En primer lugar, se exploró la citotoxicidad de los polímeros que contienen BDMC hasta 15 pM de eq. de fármaco. Según estudios previos encontrados en la literatura, un rango de concentración de curcuminoides de 0.1-1 pM debería ser suficiente para inducir un beneficio terapéutico al disminuir el estrés oxidativo. Además, el valor de CI50 para la agregación de Ap y la peroxidación lipídica de los curcuminoides también se encuentra en esa concentración de concentración, lo que indica que tal dosis debería ser suficiente para producir efectos antioxidantes y antiinflamatorios. Como se puede observar en la Fig. 40, se encontraron toxicidades no significativas de hasta 10 pM de eq. de fármaco. El compuesto St-Clic-BDMC con 4% en peso de BDMC se seleccionó para investigaciones adicionales (100% de viabilidad celular a 10 pM).
9.3. Perfiles de liberación de drogas.
Como se usó un espaciador sensible al pH (éster) para la conjugación de BDMC, se estudió la cinética de la liberación del fármaco en condiciones hidrolíticas. Se incubaron muestras de St-Clic-BDMC 4% en peso, (seleccionado de experimentos de viabilidad celular) a 37 °C a diferentes pH incluyendo 5.0 (lisosoma), 6.5 (endosoma) y 7.4 (sangre) hasta 96 horas. Se obtuvo un perfil de liberación de fármaco sostenido y controlado después del análisis por HPLC. Aproximadamente el 20% del fármaco conjugado se liberó en 2 días a pH 5.0, mientras que los valores de pH 6.5 y 7.4 mostraron un perfil de liberación mucho más lento (ver Fig. 41).
9.4. Prevención de la formación de fibrillas in vitro.
Con el fin de lograr una prueba de concepto, se verificó la actividad de los compuestos en un primer intento utilizando un modelo aceptado basado en el uso de la lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL) para la formación de amiloide proteico. HEWL es una proteína monomérica compuesta por 129 aminoácidos con conformación enriquecida en hélice, y representa una de las proteínas modelo más conocidas para estudiar la agregación proteica. Se ha demostrado que a pH ácido esta proteína sufre agregación amiloide (Fig. 42). Por lo tanto, se comprobó la actividad de varios conjugados que llevan BDMC, como inhibidores de la formación de fibrillas mediante la medición de fluorescencia de Tioflavina T (ThT), que está en correlación con la formación de fibrillas. ThT es una sal de benzotiazol utilizada como colorante para visualizar y cuantificar la presencia o fibrilación de agregados de proteínas mal plegadas, o amiloide, tanto in vitro como in vivo (es decir, placas compuestas de beta amiloide encontrada en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer). El ensayo ThT mide los cambios en la intensidad de fluorescencia de ThT al unirse a las fibrillas amiloides (Fig. 42). La fluorescencia mejorada se puede observar por microscopía de fluorescencia o por espectroscopía fluorescente. El ensayo espectroscópico se usa normalmente para controlar la fibrilación con el tiempo.
Se incubaron varios compuestos portadores de BDMC y BDMC libre, en comparación, a dos concentraciones diferentes (10 y 50 pm de BDMC-eq.) Durante 24 horas con HEWL (solución de 2 mg-mL-1) a 60 ° C bajo una agitación magnética intensa y a pH bajo para favorecer la agregación amiloide. Las soluciones de PBS y el vehículo polimérico se usaron como controles positivos. Vale la pena mencionar que tampoco se encontró fibrilación cuando HEWL se incubó a temperatura ambiente ni cuando no se usó agitación magnética. Se tomaron alícuotas de las muestras de fibrillas en diferentes momentos y se mezclaron con alícuotas de ThT durante 5 minutos.
Finalmente, se midió la fluorescencia en un VictorTM Wallace (Aexc 450 nm y Aem 510 nm) y se eliminó la fluorescencia de fondo del curcuminoide (Fig. 43). Mediante este ensayo, se podría concluir que los conjugados de polímero exhiben un comportamiento inhibidor de fibrillas ligeramente mejor (aunque no significativamente diferente) que el BDMC libre. También estaba claro que la actividad de los conjugados se debía principalmente a la presencia de curcuminoides y no a las cadenas de PGA. El uso de concentraciones más altas (50 pM eq. de fármaco) no mejoró los resultados obtenidos en comparación con concentraciones más bajas (10 pM eq. de fármaco). Entonces se seleccionó 10 pM BDMC-eq, como la concentración para proseguir con los experimentos. Imágenes mediante TEM confirmaron estos resultados, como se puede observar en la figura 44.
9.5. Efectos de St-Click-BDMC sobre la neurotoxicidad inducida por Ap en cultivos organotípicos del hipocampo.
El efecto neuroprotector de la estructura polimérica que porta curcuminoides se evaluó en cultivos organotípicos de la corteza entorrinal-hipocampo. Para estudiar la neuroprotección, el diseño experimental incluyó pretratamientos con el conjugado antes de que un péptido amiloide-p (Ap1-42) desencadenara una lesión. Este modelo ex vivo ha sido validado previamente para determinar la neurotoxicidad y constituye una manera efectiva de identificar el efecto neuroprotector de moléculas con potencial terapéutico real contra la enfermedad de Alzheimer. Los cultivos organotípicos de cortes que contienen tanto la corteza entorrinal como el hipocampo son un excelente modelo ex vivo para monitorizar la estructura y la fisiología de estas regiones del sistema límbico, ya que conservan los circuitos principales del hipocampo, incluida su entrada excitadora principal que proviene de la corteza entorrinal. Además, pueden mantenerse durante largos períodos de tiempo, óptimos para evaluar la actividad farmacológica en las neuronas o las células gliales de los diferentes tratamientos a lo largo del tiempo. El hipocampo y la corteza entorrinal se encuentran entre las regiones más afectadas en AD, acumulando una alta densidad de depósitos extracelulares de péptido Ap, y son parcialmente responsables de la pérdida progresiva de memoria y el deterioro cognitivo observado en estos trastornos neurológicos.
El trabajo previo ha proporcionado una fuerte evidencia de que el péptido sintético Ap1-42 es capaz de inducir lesiones neuronales en este tipo de cultivo organotípico. Por lo tanto, el objetivo era analizar este daño celular y su supuesta prevención mediante un pretratamiento con St-Clic-BDMC 4% en peso utilizando tinción con yoduro de propidio (PI) (Figs. 45 y 46). El PI es un compuesto polar impermeable a las membranas celulares intactas, pero capaz de penetrar en las células dañadas y unirse al ADN nuclear, proporcionando una fluorescencia roja brillante. Este marcaje fluorescente, nos permite la cuantificación de la densidad de las células degeneradas en una región determinada. En nuestro caso, la región de interés (ROI) fue la región CA1 del hipocampo (cornus ammonis 1), donde varios estudios han encontrado efectos neurodegenerativos inducidos por péptidos Ap.
Primero se investigó la viabilidad de los cultivos organotípicos en presencia de St-Click-BDMC y ausencia de péptidos Ap (48 horas de incubación). Los cortes se tiñeron con PI, se fijaron y finalmente se analizaron por microscopía confocal. Nuestro conjugado polimérico, hasta 0.2 pM BDMC-eq, no indujo cambios significativos en la densidad de núcleos positivos de iP en comparación con los cultivos de control (0.005 pM F (4,18) = 11.096, p = 1; 0.05 pM F (4,18) = 11.096, p = 1; 0.2 pM F (4,18) = 11.096, p = 0.41). A 0,5 pM de eq. de concentración de fármaco se observó un aumento en la muerte celular (F (4,18) = 11.096, p <0.0001) (Ver Fig. 45).
Las concentraciones de 0.05 y 0.2 pM de fármaco eq. se seleccionaron para tener la concentración máxima tolerada para proporcionar efectos neuroprotectores en cultivos tratados con Ap1-42. En este caso, los cortes organotípicos se pretrataron con el conjugado polimérico 48 horas antes de la inducción de muerte celular Ap. Posteriormente, las láminas cultivadas se trataron con una segunda dosis de conjugado y Ap1-42 (concentración final 1 pM). 48 horas después, la muerte celular se cuantificó después de la tinción con PI, fijación y análisis por microscopía confocal. En este caso, el pretratamiento con 0.2 pM BDMC-eq. indujo un aumento significativo en la muerte celular (F (5,19) = 9.574, p = 0.006) pero no en el caso de 0.05 pM BDMC-eq. Los cultivos tratados con Ap1-42 aumentaron la muerte celular en comparación con los controles (vehículo (F (5,19) = 9,574, p = 0,0001) y equivalentes de fármaco 0,05 pM de conjugado polimérico (F (5,19) = 9,574, p = 0.006)) como se muestra en la Fig. 46. Pretratamiento de cultivos con conjugado de polímero 0.05 pM (F (5,19) = 9.574, p = 0.005) o 0.2 pM (F (5,19) = 9.574, p = 0.026 ) antes de la adición de Ap1-42 indujo una disminución significativa en la densidad de los núcleos marcados con PI en comparación con los cultivos tratados solo con el péptido Ap1-42. (Fig. 46).
En general, el constructo con BDMC probado en cultivos organotípicos no muestra toxicidad después de 48 horas de tratamiento a las diferentes concentraciones probadas, excepto por una concentración de 0,5 pM. Cuando se aplicaron dosis repetidas (en el caso del experimento de pretratamiento), la concentración de 0.2 pM resultó tóxica para los cultivos no tratados con péptido Ap1-42, sin embargo, esta concentración fue efectiva para la prevención de la toxicidad Ap1-42. El Pretratamiento con conjugado de polímero a 0,05 o 0,2 pM de fármaco-eq. redujo significativamente la muerte celular en cultivos tratados con péptido Ap1-42. Como la concentración de 0.05 pM resultó suficiente para producir efectos neuroprotectores significativos contra la neurotoxicidad Ap1-42 sin ser tóxica, esta concentración se seleccionó para avanzar. Se están realizando más experimentos para identificar los posibles mecanismos de neuroprotección seguidos por nuestras construcciones.
9.6. Estudios preliminares de St-Clic-BDMC que demuestran la seguridad en un modelo de enfermedad de Alzheimer genéticamente modificado
Para ese propósito, la cepa de ratón ArcAbeta se usó como modelo in vivo de ratón con Alzheimer. Como nuestra idea es abordar la enfermedad desde un punto de vista neuroprotector, se eligieron animales jóvenes (de 8 a 11 meses). Dado que este modelo de ratón comienza a acumular carga de placa alrededor de los 6-9 meses de edad, no habrá cantidades excesivas e irreversibles de placas Ap. En primer lugar, la seguridad in vivo es un requisito para cualquier compuesto antes de proceder con su validación. Por lo tanto, se diseñó un estudio piloto con St-clic-DO3A-Gd-Cy5.5.-BDMC con un programa de dosis seleccionado basado en estudios de PK. En este primer experimento, se controló el peso del animal como prueba de seguridad en administraciones sucesivas del compuesto. Se eligieron tres grupos diferentes de animales: animales de tipo salvaje como control (x2), animales ArcAbeta utilizados como controles no tratados inyectados con solución salina (x7) y animales ArcAbeta tratados con el compuesto a una dosis comparable a la utilizada en los estudios de biodistribución (2 mg • Kg-1 BDMC eq.) (X7). Los animales fueron inyectados seis veces en dos semanas sin mostrar signos de toxicidad, como se muestra en la Figura 47, donde no se observó pérdida de peso de los animales tratados.
Ejemplo 10. Validación como portador de aplicaciones anticancerígenas.
10.1. Protocolo sintético y caracterización.
Nuestro objetivo era obtener conjugados para administración sistémica buscando una nueva estrategia terapéutica en la investigación del cáncer. Como fármaco modelo, la doxorrubicina (DOX) se conjugó a través de enlaces lábiles al pH (hidrazona) con compuestos de fórmula I, II o III, reticulados con 20% de grupos PD. La síntesis de compuestos basados en compuestos de fórmula (III) se describe en detalle aquí. En primer lugar, el conector de hidrazona se introdujo en el esqueleto polimérico de los compuestos de fórmula III. Brevemente, en un matraz de fondo redondo de un cuello con una barra agitadora y dos tabiques, 1 eq. del compuesto de fórmula III (forma ácida) se disolvió en el volumen requerido de anh. DMF (es decir, 40 ml por 400 mg). Seguidamente, para la modificación deseada, se añadieron 200mg de DMTMMBF4, disueltos en anh. DMF (es decir, 0.9302 mmol, 0.3 eq. Para una modificación del 20%). Se comprobó que el pH era 5. Después de 10 minutos, se añadió la amina correspondiente (tert-butil-carbazato), disuelta en DMF anhidra. El pH se ajustó a 7-8 con DIEA. La reacción se dejó proceder durante 48 horas, agitando a temperatura ambiente bajo atmósfera de N2. El producto se precipitó en éter dietílico, se filtró y se secó. El grupo protector Boc se eliminó con TFA. La reacción se dejó proceder durante 45 minutos, agitando a temperatura ambiente. El producto se precipitó finalmente en éter dietílico frío, se lavó tres veces con éter dietílico y dos veces con agua milli-Q® pH 3.
Se obtuvo un sólido amorfo incoloro después de la liofilización. La Fig. 48 muestra las RMN de protones de ejemplos de compuestos de fórmula (II y III) sintetizados siguiendo este procedimiento. A continuación, se incorporó el % de GAU de DOX en el compuesto por reacción en DMSO, catalizado con cuatro gotas de ácido acético, y se dejó que la reacción continuara durante 48 horas, agitando a temperatura ambiente bajo atmósfera de N2. Después de la evaporación de la mitad del volumen, los polímeros se precipitaron en éter dietílico frío añadiendo primero THF para mejorar la miscibilidad de DMSO en éter. El precipitado se disolvió en 6 ml de DMF y se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Sephadex® LH-20. La primera fracción se aisló y el disolvente se evaporó usando una bomba de vacío. El producto seco se suspendió en agua milli-Q® y se convirtió en la forma de sal de sodio mediante la adición de NaCO3. El exceso de sales se eliminó por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Sephadex® G-25. Se obtuvo un sólido amorfo incoloro después de la liofilización. La carga total del fármaco se midió por espectroscopía UV / VIS a 480 nm, dando como resultado DOX (7,85% en peso) de unidades de ácido glutámico (GAU) al 2,5% en moles. Rendimientos: 56-85%
10.2. Viabilidad celular.
Las células de cáncer de mama 4T1 de ratón se cultivaron en medio RPMI 1640 (con L-Glutamina y Hepes 25 mM) y se incubaron a 37 °C con una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. El ensayo de viabilidad celular MTS se realizó con cuantificación después de 72 horas.
En cada pocillo de una placa de microtitulación estéril de 96 pocillos, se sembraron e incubaron 2000 células durante 24 horas en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Se preparó una solución madre de 1 mg/ml (DOX eq.) Del compuesto de la invención en PBS y se diluyó con medio para alcanzar una concentración final de 0,1-50 |jg/ml. El medio de seis pocillos se retiró y se reemplazó por 100 jL de cada dilución. Después de 72 horas de incubación, se añadieron 10 j l de MTS / PMS (20: 1 ) a cada pocillo. Las células fueron incubadas durante 3 horas más. La absorbancia a 570 nm se midió espectrofotométricamente usando el lector de placas Victor2WallaceTM. Para los cálculos, la absorbancia de las células tratadas se comparó con la absorbancia de las células de control no tratadas, lo que representa un 100% de viabilidad celular. Como se representa en la Fig. 49, el compuesto ejerció una toxicidad similar a la del DOX libre y, por lo tanto, representa un candidato prometedor.
10.3. Liberación de fármaco.
Se exploró el perfil de liberación de DOX en diferentes condiciones de pH. El compuesto de la invención se disolvió en diferentes soluciones de pH PBS (pH 5 y 7,4) a una concentración de 3 mg / ml. Luego, se añadieron 2 ml de esta solución en un dispositivo Float-A-lyzer G2 (MWCO 1000 Da). El dispositivo flotó bajo agitación en 100 ml de la solución tampón correspondiente. Todas las muestras fueron incubadas en un horno a 37 °C durante el experimento. Se tomaron alícuotas de 1000 jL de solución de PBS, en donde el dispositivo flotaba, en diferentes puntos de tiempo (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 32 h , 48 h, 56 h, 72 h, 80 h, 96 h, 168 h) y se reemplazaba con solución de PBS fresca para mantener el volumen de 100 m. Después de la liofilización, cada alícuota se disolvió en 120 j l de DMSO al 10% y se añadieron 100 j l de esta en una placa oscura de 96 pocillos. La concentración de DOX en las placas se midió por espectroscopía de fluorescencia por triplicado. Se preparó una curva de calibración de DOX en DMSO al 10% a partir de diluciones siguiendo el mismo procedimiento. La fluorescencia (exc 450nm / emi 595nm) se midió usando el lector de placas Victor2WallaceTM. Se obtuvo una liberación del fármaco dependiente del pH ya que casi no hubo liberación a un pH de 7.4 y aproximadamente un 18% de liberación del fármaco a un pH de 5.0 a las 80 horas. Figura 50.

Claims (1)

  1. R E IV IN D IC A C IO N E S
    1. Un compuesto de fórmula (I) a continuación, que comprende homopolipéptidos o copolipéptidos aleatorios o de bloque:
    Figure imgf000049_0001
    (I)
    o sus sales, solvatos o isómeros, donde:
    m, m', m '', n, n', n '', o, o ' y o " son enteros seleccionados independientemente de 0 a 500, en donde al menos uno de ellos es > 1 ;
    R6 a R8, R6 ' a R8 ' y R6 - a R8 - son seleccionados independientemente entre H y metilo;
    Ii a I3 son seleccionados independientemente entre el grupo consistente en H; halógeno; deuterio; y (Ci-C20)-alquilo; R2 a R4, R2 ' a R4 ' y R2-- a R4 " son seleccionados independientemente entre el grupo consistente en:
    Figure imgf000049_0002
    X1 y X2 son seleccionados independientemente entre el grupo consistente en H; N; NH2 ; y Z;
    X3 y X4 son seleccionados independientemente entre el grupo consistente en H; y Z;
    y e y ' son enteros entre 0 y 3; e y y' = 2 o 3;
    y '' e y ' ' ' son enteros entre 0 y 2 ; e y y ' = 1 o 2
    Z es seleccionado entre el grupo consistente en H; contraión metálico; contraión inorgánico; y grupo protector de aminoácido;
    R1, R r y R-r son radicales seleccionados independientemente entre el grupo consistente en:
    Figure imgf000050_0001
    Ai, A2, A 3 y A4 son radicales seleccionados independientemente entre el grupo definido por R2 a R4, R2- a R4-, y R2- a R4-;
    L1 es un radical seleccionado independientemente entre el grupo consistente en (C1-C500)-alquilo, en donde uno o más H están opcionalmente sustituidos por: (1) (C3-C30)-cicloalquilo, (2) un radical C derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, cada anillo estando independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, estando los anillos aislados o fusionados y teniendo 3-20 miembros. Cada miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en C, CH, CH2, CO, N y NH, (3) OH, (4) NRaRb, (5) ONRcRd, (6) CN, (7) haluro, (8) SH2 , (9) SReRf, (10) N(H)NH2, (11) RgCORh, (12) COORi, (13) CON(Rj)(Rk), (14) RlN(Rm)CON(Rn)2, (15) (C1-C30)-alqueno, (16) (C1-C30)-alquino, (17) N3, (18) RoCH(ORp)(ORq), (19) RrCH(SRs)(SRt), (20) RuBoro(ORv)(ORw), (21) CORx; y en donde uno de más C se reemplaza independientemente por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, aril-(C1-C30)-alquil, NRyRz, CO, O, S, boro, haluro, P y (O-CH2-CH2)b;
    B es un entero entre 1 y 500;
    Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; (C-i-C30)-alquilo; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C rC 30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO;
    Rg, Ri, Ro, Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C-i-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C rC 30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO; R5 , R5 ' y R5-- son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; y (C1-C50ü)-alquil, opcionalmente sustituidos por: (1) (C3-C30)-cicloalquil, (2) un radical C derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, cada anillo estando independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, los anillos estando aislados o fusionados y teniendo 3-20 miembros cada miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en C, CH, CH2, CO, N y NH, (3) OH, (4) NRaRb, (5) ONRcRd, (6) CN, (7) haluro, (8) SH2 , (9) SReRf, (10) N(H)NH2 , (11) RgCORh, (12) COORi, (13) CON(Rj)(Rk), (14) R|N(Rm)CON(Rn)2, (15) (C1-C30)-alqueno, (16) (C1-C30)-alquino, (17) N3 , (18) RoCH(ORp)(ORq), (19) RrCH(SRs)(SRt), (20) Ruboro(ORv)(ORw), (21) CORx; y en donde uno de más C se reemplaza independientemente por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, arilo-(C1-C30)-alquilo, NRyRz, CO, O, S, boro, haluro, P y (O-CH2-CH2)b;
    B es un entero entre 1 y 500;
    Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; (C-i-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C rC 30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO;
    Rg, R|, Ro, Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C-i-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil; (C-i-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO;
    2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:
    I1, I2 y I3 , son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; Deuterio; y F;
    R5 , R5 ' y R5-- son idénticos entre ellos, y son seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; CO-(Cr C20)-alquil; CONH-(CrC20)-alquil; y piroglutamato.
    3. El compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en donde:
    R2=R2 '=R2", R3=R3 '=R3", y R4=R4 '=R4", y cada uno de ellos está seleccionado independientemente del grupo que consiste en:
    Figure imgf000051_0001
    Xi y X2 están independientemente seleccionados del grupo consistente en H; N; -NH2;y Z;
    y e y ' son enteros entre 0 y 3; e y y' = 2 o 3;
    Ri=Ri =Ri ' y Ri están seleccionados de entre los siguientes grupos:
    Figure imgf000051_0002
    Ai, A2 , A3 y A4 denotan los residuos laterales de aminoácidos hidrofóbicos y se seleccionan de los siguientes grupos o combinaciones de estos:
    Figure imgf000051_0003
    Li es tal y como está definido en la reivindicación 1.
    4. Un compuesto con fórmula (II):
    Figure imgf000051_0004
    o sus sales, solvatos o isómeros, en donde:
    Ri a R8, Ii a I3, n, y o, están definidos como en la reivindicación 1;
    m es un entero entre 2-500;
    x es un número entero entre 0.01*m a 0.5*m;
    R2 " es un radical seleccionado del grupo consistente en:
    Figure imgf000052_0001
    Xi es H;
    y es 0 o 1;
    CL es un radical seleccionado del grupo que consiste en un alquilo (C1-C500), en el que uno o más H están opcionalmente sustituidos con: (1) (C3-C30)-cicloalquilo, (2) un C-radical derivado de un sistema de anillo con 1-6 anillos, cada anillo estando independientemente saturados, parcialmente insaturados o aromáticos, los anillos estando aislados o fusionados y teniendo 3-20 miembros, cada miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en C, CH, CH2, CO, N y NH, (3) OH, (4) NRaRb, (5) ONRcRd, (6) CN, (7) haluro, (8) SH2 , (9) SReRf, (10) N(H)NH2, (11) RgCORh, (12) COORi, (13) CON(Rj)(Rk), (14) RlN(Rm)CON(Rn)2, (15) (C1-C30)-alqueno, (16) (C1-C30)-alquino, (17) N3, (18) RoCH(ORp)(ORq), (19) RrCH(SRs)(SRt), (20) RuBoro (ORv)(ORw), (21) CORx; y en donde uno de más C se reemplaza independientemente por (C3-C30)-cicloalquil, aril, aril-(C1-C30)-alquil, NRyRz, CO, O, S, boro, haluro, P y (O-CH2-CH2)b;
    B es un entero entre 1 y 500;
    Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; (C-i-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil (C rC 30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO;
    Rg, Ri, Ro, Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C1-C30)-alquil; (C1-C30)-alquilfenil; fenil; (C1-C30)-alquil; y (C3-C8)-cicloalquil, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O; S; F; N; NH; P; y CO.
    5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en donde:
    I1, I2 e I3 , son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; Deuterio; y F;
    R5 se selecciona del grupo que consiste en H; CO-(C1-C20)-alquil; CONH-(C1-C20)-alquil; y pirogutamato.
    6. Un polímero estrella autoensamblado entrecruzado que comprende una unidad recurrente de fórmula (III):
    o sus sales, solvatos o isómeros, en donde:
    Ri a R8, Ii a I3, m, n y o están definidos como en la reivindicación 1 ;
    x está definido como en la reivindicación 4;
    R2 " se selecciona del grupo consistente en:
    Figure imgf000053_0001
    Xi e y están definidos como en la reivindicación 4;
    CLi está definido como CL en la reivindicación 4.
    7. El polímero en estrella autoensamblado entrecruzado según la reivindicación 6 , en el que:
    Ii, I2 , e I3, son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en H; deuterio; y F;
    R5 se selecciona del grupo que consiste en H; CO-(Ci-C2o)-alquil; CON(H)-(Ci-C2o)-alquil; y piroglutamato.
    8. El polímero en estrella autoensamblado y entrecruzado según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en el que: cada R2, R3, y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en:
    Figure imgf000053_0002
    Xi y X2 están definidos como en la reivindicación i;
    y e y ' están definidos como en la reivindicación i;
    Ri se selecciona de los siguientes grupos:
    Figure imgf000053_0003
    Ai, A2 , A3 y A4 denotan los residuos laterales de aminoácidos hidrófobos y se seleccionan de los siguientes grupos o combinaciones de estos:
    Figure imgf000054_0001
    Li es como se define en la reivindicación 1.
    9. Un conjugado que comprende el compuesto de fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1­ 3, el compuesto de fórmula (II) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4-5, o el polímero estrella autoensamblado entrecruzado de fórmula (III) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6-8, y al menos un agente activo que está unido al compuesto o al polímero estrella autoensamblado.
    10. El conjugado según la reivindicación 9, en el que, el al menos unagente activo se selecciona del grupo que consiste en un ingrediente activo y un agente de formación de imágenes, o combinaciones de los mismos.
    11. Una composición farmacéutica, diagnóstica o teranóstica que comprende al menos un conjugado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 junto con uno o más excipientes farmacéuticos o diagnósticos apropiados.
    12. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 para uso como medicamento, en diagnóstico o teranóstico.
    13. Uso de un compuesto de fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el compuesto de fórmula (II) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4-5, o el polímero estrella autoensamblado entrecruzado de fórmula (III) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6-8, como transportador.
    14. Uso del conjugado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, cuando el al menos agente activo es un agente de imagen, como agente de imagen.
    15. Un método para la síntesis del compuesto de fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el proceso comprende:
    (1) hacer reaccionar un iniciador de amina o sal TFA/BF4 de fórmula siguiente (IV):
    Figure imgf000054_0002
    en donde I1 a I3 , R1, Rr y R r son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, con un apropiado N-carboxianhidrido (NCA);
    alternativamente, hacer reaccionar el iniciador en forma amina o tetrafluoroborato o sal de amonio trifluoroacetato de la etapa (1) con los N-carboxianhídridos apropiados de manera secuencial para obtener un copolímero en bloque;
    alternativamente, hacer reaccionar el inciador en forma amina o tetrafluoroborato o sal de amonio trifluoroacetato de la etapa (1) con un NCA apropiado de manera estadística para obtener copolímeros aleatorios.
    (2) opcionalmente, hacer reaccionar el grupo amina en la posición N-terminal con un grupo reactivo amina para introducir R5, R5’ y/o Rs-;
    (3) opcionalmente, eliminar ortogonalmente las cadenas laterales de aminoácidos;
    (4) purificar el producto obtenido en las etapas (1), (2) o (3), opcionalmente por fraccionamiento, precipitación, ultrafiltración, diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial.
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