ES2898251T3 - Polímeros entrecruzados compuestos de polisacáridos y poliaminoácidos, y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un polímero entrecruzado que comprende una unidad recurrente de la fórmula (I) siguiente: **(Ver fórmula)** o su sal, solvato o isómero, en el que: El PLS es un radical de un polisacárido; PLS-RU es un radical de una unidad de repetición del polisacárido; El PAA es un radical de un poliaminoácido, en el que el poliaminoácido se selecciona del grupo formado por un homo- , un aleatorio y un copoliaminoácido en bloque, con la condición de que el homo-poliaminoácido no sea policatiónico; AA es un radical de una unidad de aminoácido del poliaminoácido; El subíndice x del radical (AA) es un número entero que va de 1 a 200; El subíndice v del radical [(PAA)-(AA)x] es un número entero que va de 1 a 48; El subíndice w del radical (PLS-RU) es un número entero que va de 1 a 200; In es un iniciador ROP que comprende un grupo X terminal por cada radical [(PAA)-(AA)], en el que cada grupo X terminal está directamente unido a cada radical [(PAA)-(AA)], y en el que el grupo X terminal se selecciona del grupo que consiste en -NH-, -O-, -S-, o combinaciones de los mismos; CL es un radical seleccionado del grupo que consiste en: (C1-C500)-alquilo, en el que dos o más H están sustituidos por: (1) (C1-C500)-alquilo; (2) (C3-C30)-cicloalquilo, (3) C-radical derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, siendo cada anillo independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, estando los anillos del sistema de anillos aislados o fusionados y teniendo cada anillo 3-20 elementos, cada elemento independientemente seleccionado del grupo que consiste en C, CH, CH2, CO, O, S, N y NH, (4) OH, (5) NRaRb, (6) ONRcRd, (7) CN, (8) haluro, (9) SH2, (10) SReRf, (11) N(H)NH2, (12) RgCORh, (13) COORi, (14) CON(Rj)(Rk) (15) RlN(Rm)CON(Rn)(R'n), (16) (C1-C30)- alqueno, (17) (C1-C30)-alquino, (18) N3, (19) RoCH(ORp)(ORq), (20) RrCH(SRs)(SRt), (21) RuB(ORv)(ORw), (22) CORx; y en el que ninguno, uno o más C, están sustituidos independientemente por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, aril-(C1-C30)- alquilo, NRyRz, CO, O, S, S(O), S(O2), B, P y (O-CH2-CH2)A; el subíndice A del radical (O-CH2-CH2) es un número entero entre 1 y 500; Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Ri, Rj, Rk, Rm, Rn, R'n, Rp, Rq, Rs, Rt, Rv, Rw, Rx, Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo formado por H, (C1-C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenil-(C1-C30)-alquilo y (C3-C8)- cicloalquilo; en los que, en cualquiera de ellos, excepto el H, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, S(O), S(O2), haluro, N, NH, P y CO; Rg, Rl, Ro, Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C1-C30)-alquilo, (C1- C30)-alquilfenilo, fenil-(C1-C30)-alquilo, y (C3-C8)-cicloalquilo; donde, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, S(O), S(O2), haluro, N, NH, P, y CO; con la condición de que: (1) CL puede estar presente o no, de modo que si CL no está presente, el radical PLS-RU y el radical AA forman un enlace estable directo.

Description

DESCRIPCIÓN
Polímeros entrecruzados compuestos de polisacáridos y poliaminoácidos, y usos de los mismos
ÁREA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de los polímeros entrecruzados compuestos por polisacáridos y poliaminoácidos, así como a los hidrogeles derivados de dichos polímeros entrecruzados. Se describe también un proceso para prepararlos, así como su uso en la administración de agentes activos para aplicaciones farmacéuticas y (dermo-)cosméticas, y como medio de cultivo de células/tejidos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los hidrogeles son materiales poliméricos reticulados en forma de red tridimensional de origen natural o sintético, que se hinchan en contacto con el agua para formar materiales blandos y elásticos y que retienen una fracción importante de la misma en su estructura sin disolverse. Los hidrogeles pueden clasificarse en varios tipos según sus diferentes propiedades fisicoquímicas, por ejemplo, según su viscosidad: fluidos, semisólidos y sólidos; según su estructura: elásticos (como la gelatina) y no elásticos (como el gel de sílice); según la naturaleza de la fase sólida: inorgánicos (como el magma de bentonita) y orgánicos (como los carbómeros, los derivados celulósicos, los poloxámeros, etc.). Otra clasificación se basa en la naturaleza de las uniones de redes tridimensionales (3D) que los constituyen, los hidrogeles pueden ser geles físicos (la red 3D que los forma está formada por interacciones no covalentes) y geles químicos (aquellos en los que la red está formada por enlaces covalentes); este último tipo de enlace es muy fuerte y da lugar a redes reticuladas, en las que el entramado molecular está fijado por los nudos covalentes de dichas redes. Los sólidos poliméricos son especialmente adecuados para formar hidrogeles debido a su estructura de cadena larga y a las estructuras que adoptan en solución. La flexibilidad de dichas cadenas hace posible que se deformen y permitan la entrada de moléculas de disolvente en su estructura 3D.
Los hidrogeles más utilizados en cosmética son hidrogeles fluidos y elásticos, que tienen una fase orgánica sólida, como el alcohol polivinílico, el Carbopol© (formado de carbómero) y los derivados de la celulosa (como la carboximetilcelulosa sódica, la metilcelulosa o el ácido hialurónico). La povidona y el Plurónico© (formado por poloxámeros) son también los más utilizados.
El estado de la técnica describe varios documentos que divulgan ácidos hialurónicos reticulados y geles que los comprenden. En muchos de ellos la reticulación tiene lugar utilizando polilisina. Por ejemplo, en WO2006021644 se describe un ácido hialurónico reticulado, en el que el agente reticulante es la poli-lisina. El ácido hialurónico reticulado resultante es menos sensible a los diferentes factores de biodegradación, a la vez que es soluble en agua; se utiliza en cirugía reconstructiva y/o plástica. El ácido hialurónico reticulado se obtiene utilizando al menos un catalizador. El documento US2001039336 también describe el ácido hialurónico reticulado y un gel que lo comprende, en el que el ácido hialurónico está modificado con polilisina; se utiliza como administración de fármacos.
Existe una clara necesidad de desarrollar nuevos polímeros entrecruzados compuestos por polisacáridos y poliaminoácidos que mantengan sus propiedades y permitan transportar eficazmente los agentes activos, especialmente, a través de la piel.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
El problema a resolver por la presente invención es proporcionar un polímero entrecruzado biocompatible capaz de incorporar componentes para su uso como administración de fármacos y en (dermo-)cosmética, incluyendo su uso para la preparación de hidrogeles y su administración tópica.
La diferencia entre los polímeros cruzados de la presente invención y los divulgados en el estado de la técnica es que los polímeros entrecruzados de la presente invención no comprenden homo-poliaminoácidos policationes. Sorprendentemente, los polímeros entrecruzados descritos en la presente invención muestran propiedades inesperadas, en particular, un aumento de la proliferación de células y tejidos y de la permeabilidad de la piel. También, inesperadamente, los polímeros entrecruzados de la presente invención actúan como potenciadores de la permeabilidad, al tiempo que proporcionan una resistencia a la degradación por la acción de la hialuronidasa. Además, se ha descubierto que los polímeros entrecruzados de la presente invención se adhieren al estrato córneo proporcionando una fuente de liberación lenta y permeación del polímero entrecruzado a la capa epidérmica. Aunque el ácido hialurónico reticulado se ha descrito ampliamente, normalmente se utilizan el éter diglicidílico de 1,4-butanediol y la divinil sulfona como agentes de reticulación. Lo que es particularmente relevante es el hecho de que los polímeros entrecruzados de la presente invención obtenidos a través de la reticulación de polisacáridos aniónicos y poliaminoácidos utilizan químicas biocompatibles que dan lugar a materiales totalmente biocompatibles y biodegradables capaces de modular las propiedades reológicas. El uso de estos polímeros entrecruzados como vehículos de administración de fármacos o en combinación con otros portadores, que actúan como potenciadores de la permeabilidad, no se había descrito anteriormente. También cabe destacar la sorprendente compatibilidad de los polímeros entrecruzados de la presente invención con emulsiones de agua en aceite (del inglés water/oil, W/O) y aceite en agua (O/W), hecho que abre su aplicabilidad en formulaciones tópicas convencionales dando lugar a un vehículo muy versátil para aplicaciones (dermo-)cosméticas y farmacéuticas (por ejemplo, cremas, lociones, hidrogeles....).
Como se ha demostrado profundamente en la presente divulgación, los inventores se han dado cuenta de que, sorprendentemente, controlando cuidadosamente las condiciones de la reacción de reticulación de los polímeros entrecruzados de la presente invención, y por lo tanto la composición del polímero entrecruzado final, se puede lograr un ajuste fino de sus propiedades viscoelásticas. Por un lado, los inventores se han dado cuenta de que las cadenas laterales del esqueleto del polipéptido dentro de los polímeros entrecruzados divulgados en el estado de la técnica no son relevantes o están totalmente saturadas para la reticulación. Así, se ha descubierto que los grupos funcionales laterales de los aminoácidos en los poliaminoácidos desempeñan un papel importante en la interacción con las barreras biológicas y, por tanto, en las propiedades de administración de fármacos. En consecuencia, otra ventaja de la presente invención es la versatilidad del polímero entrecruzado en el sentido de que se pueden utilizar aminoácidos específicos en las secuencias polipeptídicas como sustrato de proteasas para modular las aplicaciones de liberación, por ejemplo, sustrato para metaloproteinasas de la matriz en la inflamación aguda que se degrada más rápidamente y libera agentes activos; o el uso como agentes de reticulación, aminoácidos precursores de la generación de colágeno u otros componentes de la matriz extracelular que es interesante en (dermo-)cosméticos. La tecnología de reticulación divulgada en el presente documento permite, por ejemplo, controlar el aumento del peso molecular del ácido hialurónico de partida, de modo que se pueden producir hidrogeles hialurónicos reticulados conformemente.
Así, en un primer aspecto, la invención se refiere a un polímero entrecruzado que comprende una unidad recurrente de la fórmula (I) siguiente:
Figure imgf000003_0001
O su sal, solvato o isómero, donde: PLS es un radical de un polisacárido; PLS-RU es un radical de una unidad de repetición del polisacárido; PAA es un radical de un poliaminoácido, en el que el poliaminoácido se selecciona del grupo que consiste en un homo-, un aleatorio y un copoliaminoácido bloque, con la condición de que el homopoliaminoácido no sea poli catiónico; AA es un radical de una unidad de aminoácido del poliaminoácido; el subíndice x del radical (AA) es un número entero que va de 1 a 200; el subíndice v del radical [(PAA)-(AA)x ] es un número entero comprendido entre 1 y 48; el subíndice w del radical (PLS-RU) es un número entero comprendido entre 1 y 200; In es un iniciador ROP que comprende un grupo X terminal por cada radical [(PAA)-(AA)], en el que cada grupo X terminal está directamente unido a cada radical [(PAA)-(AA)], y en el que el grupo X terminal se selecciona del grupo formado por -NH-, -O-, -S-, o combinaciones de los mismos; Cl es un radical seleccionado del grupo formado por (C1-C500)-alquilo, en el que dos o más H están sustituidos por (1) (C1-C500 )-alquilo, (2) (C3 -C3ü)-cicloalquilo, (3) C-radical derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, siendo cada anillo independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, estando los anillos del sistema de anillos aislados o fusionados y teniendo cada anillo 3-20 elementos, cada elemento independientemente seleccionado del grupo que consiste en C, CH, CH2 , CO, O, S, N y NH, (4) OH, (5) NRa Rb, (6) ONRc Rd , (7) CN, (8) haluro, (9) SH2 , (10) SRe Rf , (11) N(H)NH2 , (12) RgCORh , (13) COORi, (14) CON(Rj )(Rk) (15) RlN(Rm)CON(Rn)(R'n), (16) (C1-C30)-alqueno, (17) (C1-C30)-alquino, (18) N3 , (19) RoCH(ORp)(ORq), (20) RrCH(SRs )(SRt ), (21) RuB(ORv )(ORw ), (22) CORx ; y en el que ninguno, uno o más C, están sustituidos independientemente por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, aril-(C1-C30)-alquilo, NRy Rz , CO, O, S, S(O), S(O2 ), B, P y (O-CH2-CH2K el subíndice A del radical (O-CH2-CH2 )es un número entero comprendido entre 1 y 500; Ra , Rb , Rc , Rd , Re , Rf , Rh , Ri, Rj , Rk, Rm , Rn, R'n , Rp, Rq , Rs , Rt , Rv , Rw , Rx , Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo formado por H, (C-i -C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenil-(C1-C30)-alquilo y (C3-Cs )-cicloalquilo en los que, en cualquiera de ellos, excepto el H, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo formado por O, S, S(O), S(O2 ), haluro, N, NH, P y CO; Rg , Ri, Ro , Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C-i -C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenil-(C-i-C30)-alquilo y (C3-Cs )-cicloalquilo; en los que, en cualquiera de ellos, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, S(O), S(O2), haluro, N, NH, P y CO; con la condición de que: (1) CL puede estar presente o no, de modo que si CL no está presente, el radical p LS-RU y el radical AA forman un enlace directo estable.
Tal como lo entiende el experto en el presente contexto, el término "unidad recurrente" implica que el polímero entrecruzado comprende al menos 2 unidades recurrentes.
Tal como lo entiende el experto en vista de su conocimiento general común y de la enseñanza técnica del presente documento, en la práctica un polímero entrecruzado de la presente invención puede comprender normalmente de 2 a 200 unidades recurrentes.
En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado que comprende el polímero entrecruzado de la invención y al menos un agente activo que se une al polímero entrecruzado.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende el conjugado de la invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del conjugado de la invención como agente de imagen. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, diagnóstica o teranóstica que comprende el conjugado de la invención, y uno o más excipientes o portadores farmacéutica, diagnóstica y teranósticamente aceptables, respectivamente.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al conjugado o la composición farmacéutica de la invención para su uso en medicina o terapia.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al conjugado o a la composición de diagnóstico de la invención para su uso en diagnóstico.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al conjugado o a la composición farmacéutica o de diagnóstico de la invención para su uso en teranóstica.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición (dermo-)cosmética que comprende el polímero entrecruzado o el conjugado de la invención, y uno o más excipientes cosméticamente aceptables.
También se divulga aquí un medio de cultivo para células y/o tejidos que comprende el polímero entrecruzado de la invención.
Además, se divulga en el presente documento un método de cultivo de células y/o tejidos que comprende el cultivo de dichas células y/o tejidos en el medio de cultivo de la invención.
Estos y otros objetos de la presente invención se describirán con más detalle en la sección de descripción de la invención que sigue. A menos que se defina previamente lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende el experto en la materia a la que pertenece la invención. En la práctica de la presente invención pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos. A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La FIG. 1 muestra los espectros de 1H RMN de las materias primas (sal de clorhidrato de L-lisina (Lys-HCl)), poli-L-glutamato de sodio (NaPGA), hialuronato de sodio (NaHA)) y los polímeros entrecruzados [HA]-[PGA]-[Lys] obtenidos en los ejemplos 1a y 1b.
La FIG. 2 muestra el análisis por cromatografía de exclusión de tamaño del polímero entrecruzado [HA]-[PGA]-[Lys] obtenido en el Ejemplo 1a.
La FIG. 3 muestra el análisis por cromatografía de exclusión de tamaño del polímero entrecruzado [HA]-[PGA]-[Lys] obtenido en el Ejemplo 1b.
La FIG.4 muestra los espectros de 1H RMN de las materias primas (poli-L-glutamato de sodio bifuncional iniciado con n-butildiamina (Na-nBu(PGA)2 ) y hialuronato de sodio (NaHA), y el polímero entrecruzado [HA]-[PGA] sintetizado obtenido en el Ejemplo 2.
La FIG.5 muestra el análisis por cromatografía de exclusión de tamaño del polímero entrecruzado de [HA]-[PGA] autoreticulado obtenido en el Ejemplo 2 utilizando Na-nBu(PGA)2.
La FIG.6 muestra el análisis por cromatografía de exclusión de tamaño del polímero entrecruzado de [HA]-[PGA] autoreticulado obtenido en el Ejemplo 2 utilizando Na-nBuPGA.
La FIG. 7 muestra el análisis reológico oscilatorio realizado con los polímeros entrecruzados [HA]-[PGA]-[Lys] obtenidos en los Ejemplos 1a (círculos) y 1b (cuadrados) y el NaHA comercial de 250KDa (triángulos hacia abajo) y 50 KDa (triángulos hacia arriba) al 5% en peso. Los datos del módulo de almacenamiento (G', símbolos rellenos) y del módulo de pérdida (G'', símbolos vacíos) bajo el experimento de tensión oscilante se midieron dentro del régimen viscoelástico lineal a una frecuencia de 1Hz.
La FIG.8 muestra el gráfico de barras que representa el grado de separación de las formulaciones que comprenden el polímero entrecruzado de la invención con las formulaciones cosméticas convencionales. "SP" representa el grado de separación. "0" corresponde a la no separación. "1" corresponde a una aparición mínima de la fase acuosa. "2-4" corresponde a una mayor cantidad de fase acuosa separada. "5" corresponde a una completa separación de fases en el agua emulsionante y el aceite.
La FIG.9 muestra los resultados de la digestión con hialuronidasa del polímero cruzado del Ejemplo 1b.
La FIG. 10 muestra las imágenes de microscopía de barrido láser confocal de rodajas de piel permeadas con una solución del polímero entrecruzado de la invención formulada con micelas poliméricas marcadas con fluorescencia. La FIG. 11 muestra los espectros 1H RMN y UV-Vis del polímero entrecruzado del Ejemplo 1b conjugado con -Cy5.5. La FIG. 12 muestra el análisis por cromatografía de exclusión por tamaño de los polímeros entrecruzados [HA]-[PGA]-[Lys] marcados con fluorescencia obtenidos en el Ejemplo 3, utilizando cianina 5,5 con detectores RI y UV (676 nm). La FIG. 13 muestra las imágenes de microscopía de barrido láser confocal de rodajas de piel permeadas con una solución del polímero entrecruzado marcado con fluorescencia obtenido en el Ejemplo 3.
La FIG. 14 muestra la viabilidad celular del polímero entrecruzado obtenido en el Ejemplo 1a en fibroblastos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Todos los términos utilizados en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, se entenderán en su significado ordinario conocido en la técnica. Otras definiciones más específicas para ciertos términos utilizados en la presente solicitud son las que se exponen a continuación y se pretende que se apliquen de manera uniforme a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, a menos que una definición establecida expresamente proporcione una definición más amplia.
Polímeros entrecruzados de la invención
Un polímero entrecruzado que comprende una unidad recurrente de la fórmula (I) siguiente:
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( i )
o su sal, solvato o isómero, donde PLS es un radical de un polisacárido; PLS-RU es un radical de una unidad de repetición del polisacárido; PAA es un radical de un poliaminoácido, en el que el poliaminoácido se selecciona del grupo formado por un homo-, un aleatorio y un copoliaminoácido bloque, con la condición de que el homopoliaminoácido no sea policatiónico; AA es un radical de una unidad de aminoácido del poliaminoácido; el subíndice x del radical (AA) es un número entero comprendido entre 1 y 200; el subíndice v del radical [(PAA)-(AA)x ] es un número entero comprendido entre 1 y 48; el subíndice w del radical (PLS-RU) es un número entero comprendido entre 1 y 200; In es un iniciador ROP que comprende un grupo X terminal por cada radical [(PAA)-(AA)], en el que cada grupo X terminal está directamente unido a cada radical [(PAA)-(AA)], y en el que el grupo X terminal se selecciona del grupo que consiste en -NH-, -O-, -S-, o combinaciones de los mismos; CL es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C-i-C500)-alquilo, en el que dos o más H están sustituidos por: (1) (C-i-C500)-alquilo, (2) (C3 -C30)-cicloalquilo, (3) C-radical derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, siendo cada anillo independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, estando los anillos del sistema de anillos aislados o fusionados y teniendo cada anillo 3-20 elementos, cada elemento independientemente seleccionado del grupo que consiste en C, CH, CH2 , CO, O, S, N y NH, (4) OH, (5) NRa Rb, (6) ONRc Rd , (7) CN, (8) haluro, (9) SH2 , (10) SRe Rf , (11) N(H)NH2 , (12) RgCORh , (13) COORi, (14) CON(Rj )(Rk) (15) RlN(Rm )CON(Rn)(R'n), (16) (C-,-C30)-alqueno, (17) (Cr C30)-alquino, (18) N3 , (19) RoCH(ORp)(ORq), (20) RrCH(SRs )(SRt ), (21) RuB(ORv )(ORw ), (22) CORx ; y en el que ninguno, uno o más C, están sustituidos independientemente por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, aril-(C1-C30)-alquilo, NRy Rz , CO, O, S, S(O), S(O2 ), B, P y (O-CH2-CH2 K el subíndice A del radical (O-CH2-CH2) es un número entero comprendido entre 1 y 500; Ra , Rb, Rc , Rd , Re , Rf , Rh , Ri, Rj , Rk, Rm , Rn, R'n , Rp, Rq , Rs , Rt , Rv , Rw , Rx , Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo formado por H, (C-i -C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenil-(C1-C30)-alquilo y (C3-Cs )-cicloalquilo en los que, en cualquiera de ellos, excepto el H, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo formado por O, S, S(O), S(O2 ), haluro, N, NH, P y CO; Rg , Ri, Ro , Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C-i -C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenil-(C-i-C30)-alquilo y (C3-Cs )-cicloalquilo; en los que, en cualquiera de ellos, uno o más carbonos, están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, S(O), S(O2), haluro, N, NH, P y CO; con la condición de que: (1) CL puede estar presente o no, de modo que si CL no está presente, el radical p LS-RU y el radical AA forman un enlace directo estable. Cuando en el presente documento se hace referencia al polímero entrecruzado, si procede, también se hace referencia a la correspondiente sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización particular del polímero entrecruzado descrito anteriormente, el subíndice v es un número entero entre 1 y 5 y cada grupo terminal X es -NH-.
El término "poliaminoácido (polímero)" (o PAA), tal y como se utiliza aquí, se refiere a un polímero formado por al menos dos unidades repetitivas de aminoácidos. Los aminoácidos de un poliaminoácido pueden ser L- o D-aminoácidos. Sin embargo, a menos que se indique lo contrario, los aminoácidos del poliaminoácido de la presente invención son L-aminoácidos.
El poliaminoácido del polímero entrecruzado de la invención puede estar formado por un solo tipo de unidad repetitiva aminoacídica, denominada en el presente documento homo-poliaminoácido. El término homo-poliaminoácido "policatiónico", cuando se utiliza aquí, se refiere a un homo-poliaminoácido en el que la unidad de repetición aminoacídica se selecciona del grupo que consiste en lisina, ornitina, histidina, prolina y arginina.
Alternativamente, el poliaminoácido del polímero entrecruzado de la invención puede consistir en más de un tipo de aminoácido como unidad de repetición, referido aquí como co-poliaminoácido.
Los términos "copoliaminoácido aleatorio" y "copoliaminoácido bloque", tal y como se utilizan en el presente documento, se refieren a un copoliaminoácido en el que los diferentes aminoácidos están unidos de forma aleatoria o secuencial (por ejemplo, LAVILLA, C. et al., 2016), respectivamente. Un ejemplo de un poliaminoácido aleatorio es el acetato de glatiramer (ROBIN, Y, 2015).
El término "enlace peptídico", tal como se utiliza aquí, se refiere a un enlace químico covalente que une dos monómeros de aminoácidos consecutivos a lo largo de una cadena de (poli)péptidos, poliaminoácidos o proteínas. El término "polisacárido", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una molécula polimérica de hidratos de carbono compuesta por más de 10 monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos. Su estructura varía de lineal a muy ramificada. Los polisacáridos incluyen, sin limitación, los glicosaminoglicanos, el dextrano y sus derivados, la celulosa y sus derivados (p. ej, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, ftalato de acetato de celulosa, succinato de acetato de celulosa, butirato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa), quitosano y sus derivados, glucano, arabinoxilanos, carragenanos, pectina, glucógeno, fucoidán, pentosano, alginato o ciclodextrinas, o sus sales y derivados, incluidos los ésteres y sulfatos.
El término "glicosaminoglicano", tal y como se utiliza aquí, se refiere a polisacáridos largos no ramificados que consisten en un disacárido repetitivo, en el que la unidad repetitiva (excepto el queratán) consiste en un aminoazúcar (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) junto con un azúcar urónico (ácido glucurónico o ácido idurónico) o galactosa. Los glicosaminoglicanos se clasifican en cuatro grupos: heparina/heparán sulfato, condroitín sulfato/dermatán sulfato, queratán sulfato y ácido hialurónico.
El término "ácido hialurónico", tal como se utiliza aquí, abarca todas las variantes y combinaciones de variantes de ácido hialurónico, hialuronato o hialuronano, de diversas longitudes de cadena y estados de carga.
Los homo-polisacáridos son polisacáridos compuestos por un solo tipo de monosacárido, es decir, la unidad que se repite es un monosacárido. Los heteropolisacáridos son polisacáridos compuestos por dos o más tipos diferentes de monosacáridos, es decir, la unidad que se repite es dos o más tipos diferentes de monosacáridos.
El término "oligosacárido", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una molécula polimérica de carbohidrato (o polisacárido) compuesta por entre 2 y 10 monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos.
El término "monosacárido", tal como se utiliza aquí, se refiere a una forma simple de un azúcar que consiste en una sola unidad de sacárido que no puede descomponerse en bloques de construcción de sacáridos más pequeños. Los monosacáridos preferidos para el polisacárido se seleccionan del grupo que consiste en furanosa, fructosa, glucosa, galactosa, manosa, un monosacárido modificado, como, y sin limitación, el ácido siálico y la eritrosa, y sus mezclas. El monosacárido puede estar en su forma lineal o cíclica (es decir, isómeros cíclicos hemiacetales).
En el contexto de la presente invención, los siguientes términos tienen el significado que se detalla a continuación:
- El término "alquilo" se refiere a un radical hidrocarbonado recto o ramificado que tiene el número de átomos de carbono si se indica y que está unido al resto de la molécula por un solo enlace. Por ejemplo, (C-i-C6)-alquilo, incluye pero no se limita a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tert-butilo, isopentilo, hexilo, etc. - El término "alqueno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, recto o ramificado, con el número de átomos indicado, que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono
- El término "alquino" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, recto o ramificado, con el número de átomos indicado, que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono
- El término "alcoxi" se refiere a una fracción que tiene la fórmula -OR, en la que R es un grupo alquilo como se ha definido anteriormente. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi e isopropiloxi
- El término "amina" se refiere a una fracción -NR3, en la que cada grupo R es H o alquilo como se ha definido anteriormente; una fracción amino puede ionizarse para formar el correspondiente catión amonio
- El término "amida" se refiere a una molécula -NRC(O)R o -C(O)NR2, en la que cada grupo R es H o alquilo, como se ha definido anteriormente
- El término "acilo" se refiere a una fracción derivada de la eliminación de uno o más grupos hidroxilo de un oxoácido, incluidos los ácidos inorgánicos; el acilo contiene un átomo de oxígeno de doble enlace y un grupo alquilo como se ha definido anteriormente
- El término "alquilamina" se refiere a un alquilo como el definido anteriormente, en el que uno o más hidrógenos se sustituyen por un amino como el definido anteriormente. Los ejemplos de grupos alquilamina incluyen, sin limitación, metilamina, etilamina e isopropilamina
- El término "haluro" se refiere a fluoruro, cloruro, bromuro o yoduro
- El término "arilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos que tiene cualquier número adecuado de átomos de anillo y cualquier número adecuado de anillos. Los grupos arilo pueden incluir cualquier número adecuado de átomos de anillo, como 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 átomos de anillo, así como de 6 a 10, 6 a 12 o 6 a 14 miembros de anillo. Los grupos arilo pueden ser monocíclicos, fusionados para formar grupos bicíclicos (por ejemplo, benzociclohexilo) o tricíclicos, o unidos por un enlace para formar un grupo biarilo. Los grupos arilo representativos incluyen el fenilo, el naftilo y el difenilo. Otros grupos arilos incluyen el bencilo, que tiene un grupo de enlace metileno. Algunos arilos pueden estar "sustituidos" o "no sustituidos". "Arilo sustituido" se refiere a grupos arilo sustituidos por uno o más grupos seleccionados entre haluro, OH, amino, alquilamina, amida, acilo, NO2, CN, alquilo y alcoxi. Si se indica, el arilo puede tener uno o más carbonos sustituidos por, por ejemplo, un heteroátomo; incluyen, sin limitación, el pirrol, la piridina, el imidazol, el pirazol, el triazol, el tetrazol, la pirazina, la pirimidina, la piridazina, la triazina (1,2,3­ , 1,2,4- y 1,3,5-isómeros), el tifeno, el furano, el tiazol, el isotiazol, el oxazol y el isoxazol. Si están fusionados a un sistema de anillos aromáticos, como el fenilo, incluyen, sin limitación, los benzopirroles, las benzopiridinas y las benzopirazinas
- El término "alquil-arilo" se refiere a un grupo arilo que está unido a un compuesto a través de un alquilo que tiene el número de carbonos indicado
- El término "cicloalquilo" se refiere al conjunto de anillos monocíclicos saturados o parcialmente saturados, bicíclicos fusionados o policíclicos con puente que contienen el número de átomos indicado. Los anillos monocíclicos saturados de cicloalquilo incluyen, por ejemplo, el ciclopropilo, el ciclobutilo, el ciclopentilo, el ciclohexilo y el ciclooctilo. Los anillos bicíclicos y policíclicos saturados incluyen, por ejemplo, el ciclooctano. Los grupos cicloalquilos también pueden ser parcialmente saturados, teniendo uno o más enlaces dobles o triples en el anillo. Los grupos cicloalquilos representativos que son parcialmente insaturados incluyen, pero no se limitan a, ciclobuteno, ciclopenteno, ciclohexeno, ciclohexadieno, ciclohepteno, cicloheptadieno, cicloocteno y ciclooctadieno. Cuando el cicloalquilo es un monocíclico saturado, los grupos ejemplares de cicloalquilo C3-C8 incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Del mismo modo, los grupos ejemplares de monocíclicos saturados (C3-C6 )-cicloalquilo, incluyen, pero no se limitan, a ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Los grupos cicloalquilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los grupos cicloalquilo sustituidos pueden estar sustituidos con uno o más grupos seleccionados entre haluro, OH, amino, alquilamino, amido, acilo, NO2 , CN, alquilo y alcoxi. Si se indica, el cicloalquilo puede tener uno o más carbonos sustituidos, por ejemplo, por un heteroátomo. Si son monocíclicos, incluyen, sin limitación, la aziridina, la azetidina, la pirrolidina, la piperidina, el azepano, el azocano, la pirazolidina, la imidazolidinie, la piperazina (1,2-, 1,3-y 1,4- isómeros), el tetrahidrofurano, el oxano, la oxazolidina, el dioxano o la ditiana. Si son saturados, incluyen, sin limitación, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolina, oxetanilo, tetrahidrofurano o tetrahidropiranilo. Si son insaturados, incluyen, sin limitación, 2,3-dihidrofuranilo, 2,5­ dihidrofuranilo, 3,4-dihidropiranilo, 3,6-dihidropiranilo o 1,4-dihidropiridinilo.
- El término "azida" se refiere al anión con la fórmula N3 '
- El término "carbamato" se refiere a una fracción -RO-CO-NR2 , en la que cada grupo R es H o alquilo como se ha definido anteriormente, y en la que dicha fracción se deriva del correspondiente ácido carbámico (es decir, NH2COOH)
- El término "base de Schiff' se refiere a una fracción R2C=NR' (en la que cada grupo R es H o alquilo, excepto R', que no puede ser hidrógeno). Las bases de Schiff pueden considerarse una subclase de las iminas, ya que son cetaminas secundarias o aldiminas secundarias, dependiendo de su estructura; existen varios sistemas de denominación especiales para estos compuestos; por ejemplo, una base de Schiff derivada de una anilina, en la que R' es un fenilo o un fenilo sustituido, puede denominarse anil
- El término "hidrazona" se refiere a una fracción R2C=NNH2 en la que cada grupo R es un alquilo como se ha definido anteriormente
- El término "maleimida" se refiere a una fracción R2C2(CO)2NH en la que cada grupo R es H o alquilo como se ha definido anteriormente; también se refiere a aquellas fracciones en las que el grupo NH se sustituye por grupos alquilo o arilo como se ha definido anteriormente o por un polímero como el polietilenglicol
- El término "acetal" se refiere a una fracción R2C(OR')2 en la que ambos grupos R' son alquilos, tal como se ha definido anteriormente. Los dos grupos OR' pueden ser equivalentes entre sí o no. Los dos grupos R pueden ser equivalentes entre sí (un "acetal simétrico") o no (un "acetal mixto"), y uno o ambos pueden ser grupos H o alquilo como se ha definido anteriormente
- El término "hidrazida" se refiere a una clase de compuestos orgánicos que comparten un grupo funcional común caracterizado por un enlace covalente de nitrógeno a nitrógeno con 4 sustituyentes, siendo al menos uno de ellos un grupo acilo. La estructura general de una hidrazida es E(=O)-NR-NR2 , donde los R son frecuentemente H, pudiendo ser los E, y las hidrazidas se clasifican en consecuencia, O, es decir, carbohidrazidas (R-C(=O)-NR-NR2), S, es decir, sulfonohidrazidas (R-S(=O)2-NR-NR2 ), y dihidrazidas fosfónicas (R-P(=O)(-NR-NR2)2.
El poliaminoácido del polímero entrecruzado de la presente invención comprende un iniciador (o "In"). El término "iniciador" (o "In"), tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula química empleada para la iniciación de la reacción de polimerización por apertura de anillo (ROP) de los N-carboxianhídridos de a-aminoácidos mediante el mecanismo de amina normal, en el que el iniciador se incorpora dentro de la cadena principal del poliaminoácido resultante (como se divulga, por ejemplo, en DENG, C. et al., 2014; y US9623125B2). El iniciador puede contener uno o más grupos nucleófilos que pueden iniciar la reacción ROP, en consecuencia, el iniciador puede ser mono o multifuncional, respectivamente, dando lugar a uno o varios grupos X terminales en el polímero cruzado de la invención, respectivamente.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la In tiene la siguiente estructura química, grupo(s) W-nucleófilo(s), donde W es un radical seleccionado del grupo que consiste en: (C 1-C 500)-alquilo, en el que uno o más H están sustituidos por: (1)
(C-i -C500)-alquilo, (2) (C3-C30)-cicloalquilo, (3) C-radical derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, siendo cada anillo independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, estando los anillos del sistema de anillos aislados o fusionados y teniendo cada anillo 3-20 elementos, cada elemento independientemente seleccionado del grupo que consiste en C, CH, CH2 , CO, O, S, N y NH, (4) OH, (5) NRa Rb, (6) ONRc Rd , (7) CN, (8) haluro, (9) SH2 , (10)
SRe Rf , (11) N(H)NH2 , (12) RgCORh , (13) COORi, (14) CON(Rj )(Rk) (15) RlN(Rm )CON(Rn)(R'n), (16) (Cr C30)-alqueno,
(17) (Cr C30)-alquino, (18) N3 , (19) RoCH(OR p)(ORq), (20) RrCH(SRs )(SRt), (21) RuB(ORv )(ORw ), que ninguno, uno o más C, están sustituidos independientemente por (C3-C30) -cicloalquilo, arilo, aril-(C1-C30)-alquilo,
NRy Rz , CO, O, S, S(O), S(O2), B, P y (O-CH2-CH2 K el subíndice A del radical (O-CH2-CH2 ) es un número entero comprendido entre 1 y 500; Ra , Rb, Rc , Rd , Re , Rf , Rh, Ri, Rj , Rk , Rm , Rn, R'n , Rp, Rq , Rs , Rt , Rv , Rw , Rx , Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo formado por H, (Ci -C3o)-alquilo, (Ci -C3 o)-alquilfenilo, fenilo (Ci -C3 o)-alquilo y (C3-C8)-cicloalquilo en los que en cualquiera de ellos, excepto e1H, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo formado por O, S, S(O), S(O2), haluro, N, NH, P y CO; Rg , Rl, Ro , Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C1-C30) -alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenilo, (C1-C30)-alquilo y (C3-C8 )-cicloalquilo; en los que uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, S(O), S(O2), haluro, N, NH, P y CO. En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el iniciador tiene como grupo nucleófilo una amina, resultando -NH- como grupo terminal X del polímero entrecruzado de la invención.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el iniciador tiene como grupo nucleófilo un hidroxilo, resultando un -O- como grupo terminal X del polímero entrecruzado de la invención.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el iniciador tiene como grupo nucleófilo un tiol, resultando un -S- como grupo terminal X del polímero entrecruzado de la invención.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el iniciador tiene 2, 3, 4, 5, 6 , 7 y 8 grupos nucleófilos que inician la reacción ROP simultáneamente.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el iniciador se selecciona del grupo que consiste en (C1-C500)-alquil amina (por ejemplo, butilamina, propilamina, etilamina, etc.), etilenglicol y polietilenglicol de n=2 a n=16, donde n es el número de unidades de etilenglicol que se repiten, con una amina terminal como grupo nucleófilo.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el iniciador tiene entre 1 y 5 grupos nucleófilos (o el subíndice v de la fórmula I de cualquiera de los polímeros entrecruzados de la presente invención) o v es un número entero entre 1 y 5, y el grupo nucleófilo del iniciador es -NH2.
El término "molécula enlazadora", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una molécula que tiene un primer grupo químico que reacciona con uno o más grupos funcionales en un polisacárido y un segundo grupo químico que reacciona con uno o más grupos funcionales en un poliaminoácido, dando lugar a un radical denominado "CL" del polímero entrecruzado de la presente invención.
Los grupos químicos de la molécula enlazadora y el grupo funcional del polisacárido y del poliaminoácido son químicamente complementarios, es decir, capaces de formar un enlace estable. Dicho grupo funcional puede referirse a un grupo funcional inherente al polisacárido o al poliaminoácido (es decir, en el caso de un polisacárido o un poliaminoácido de origen natural, es decir, un polisacárido o un poliaminoácido presente en la naturaleza o en los organismos vivos), o a un grupo funcional añadido al polisacárido o al poliaminoácido, como resultado de una funcionalización previa a su reacción con el grupo químico correspondiente de la molécula enlazadora (es decir, en el caso de un polisacárido o un poliaminoácido no natural, es decir, un polisacárido o un aminoácido no presente en la naturaleza o en los organismos vivos). Los grupos funcionales del polisacárido y del poliaminoácido que reaccionan con el primer y el segundo grupo químico de la molécula enlazadora pueden ser iguales o diferentes entre sí.
El grupo químico de la molécula enlazadora incluye, sin limitación, alquinos, azidas, disulfuros reactivos, maleimidas, hidrazidas, hidrazonas, bases de Schiff, acetales, aldehídos, carbamatos y ésteres reactivos, o funcionalidades hidrofóbicas.
Los grupos funcionales del polisacárido pueden obtenerse, sin limitación, por oxidación, por ejemplo, oxidación de grupos -CH2OH a -CHO y/o -COOH; oxidación de periodato de grupos hidroxilos vecinales, opcionalmente seguida de reducción, por ejemplo, reducción de -CHO a -CH2OH o acoplamiento con aminas para formar iminas seguido de reducción a aminas secundarias; sulfatación; desamidación, opcionalmente seguida de desaminación o formación de amidas con nuevos ácidos; y esterificación.
Por ejemplo, el polisacárido puede ser funcionalizado con ácido succínico para obtener un grupo funcional de ácido carboxílico, que es capaz de reaccionar con una molécula enlazadora que tenga un grupo químico amina para formar un enlace amida.
Los grupos funcionales del poliaminoácido pueden obtenerse mediante el acoplamiento a través de la funcionalidad de la cadena lateral del aminoácido, incluyendo, sin limitación, la formación de amidas, la aminación reductora, la esterificación, la formación de iminas, la reacción tiol-eno, la formación de disulfuros, etc. Por ejemplo, el poliaminoácido puede funcionalizarse con alquinos, azidas, disulfuros reactivos, maleimidas, hidrazidas, hidrazonas, bases de Schiff, acetales, aldehídos, carbamatos y ésteres reactivos, o funcionalidades hidrofóbicas.
El enlace estable puede ser no covalente, covalente reversible y covalente irreversible. Si es necesario, puede aplicarse una química ortogonal para realizar selectivamente el enlace estable. El término "enlace no covalente", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un enlace que no implica compartir electrones, sino que implica variaciones más dispersas de las interacciones electromagnéticas entre las moléculas. El enlace no covalente puede clasificarse en varias categorías, como la interacción electrostática, la interacción n, las fuerzas de Van der Waals, el enlace de hidrógeno y el efecto hidrofóbico.
Los términos "enlace entrecruzado", "reticulado" o "reticulación", cuando se utilizan aquí, se refieren a un enlace químico de una cadena polimérica con otra.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el radical CL no está presente en el polímero entrecruzado de la invención.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el radical CL está presente en el polímero cruzado de la invención.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el radical CL del polímero entrecruzado de la presente invención se selecciona del gru o ue consiste en:
Figure imgf000009_0001
Donde de R1 a R5 y de R7 a R13 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0002
p' y s' son números enteros seleccionados independientemente entre 0 y 500; y R6 se selecciona independientemente del grupo formado por H y (C1-C4)-alquilo.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el radical CL del polímero entrecruzado de la presente invención es -NH-CH(COOH)-(C1_C30)-alquilo-NH-En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, u opcionalmente en combinación con el polímero entrecruzado de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, en el que CL está presente o no está presente, y en el que opcionalmente, v es un número entero entre 1 y 5 y cada grupo terminal X es -NH-, el radical PAA del polímero cruzado de la invención es un radical de fórmula (II)
Figure imgf000009_0003
(II)
Y el radical AA es un radical de fórmula (III)
Figure imgf000010_0001
En donde m, n, o, p y q son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 500, y en donde m+n+o+p+q > 1; de R1 a R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000010_0002
Cada Xi y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, N, NH2 , y Z; cada X3 y X4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y Z; cada y e y' es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 3, donde y+y' = 2 o 3; cada y'' e y''' es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 2, en el que y''+y''' = 1 o 2; Z se selecciona del grupo que consiste en H, contraión metálico y contraión inorgánico ; y de R8 a R13 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y -C1- C4 alquilo; con la salvedad de que: (1) cuando la CL no está presente, el radical AA está unido mediante un enlace peptídico al radical PAA a través de la amina terminal del radical PAA; y (2) cuando la CL está presente, el radical AA está unido a la CL a través de la amina terminal del radical AA.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, u opcionalmente en combinación con el polímero entrecruzado de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, en el que CL está presente o no está presente, y en el que opcionalmente v es un número entero entre 1 y 5 y cada grupo terminal X es -NH-, el radical PAA del polímero entrecruzado de la invención es un radical de fórmula IV
Figure imgf000011_0001
(IV)
Y el radical AA es un radical de fórmula (V)
Figure imgf000011_0002
En donde, m, n, o, p y q son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 500, y en donde m+n+o+p+q > 1; R1 a R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
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R'6se selecciona del ru o formado or:
Figure imgf000012_0001
Cada X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, N, NH2 , y Z; cada X3 y X4 se selecciona del grupo que consiste en H y Z; cada subíndice y e y' de Ri a R5 es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 3, donde y+y' = 2 o 3; cada subíndice y'' e y''' de R1 a R5 es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 2, donde y"+y'" = 1 o 2; cada subíndice y de R'6 es 1 o 2; el subíndice y' de R'6 es 0 o 1; Z se selecciona del grupo formado por H, contraión metálico y contraión inorgánico; R7 es un radical seleccionado del grupo formado por (Ci -C500)-alquilo, en el que uno o más H están sustituidos por: (1) (C1-C500)-alquilo, (2) (C3-C30)-cicloalquilo, (3) C-radical derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, siendo cada anillo independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, estando los anillos del sistema de anillos aislados o fusionados y teniendo cada anillo 3-20 elementos, cada elemento independientemente seleccionado del grupo que consiste en C, CH, CH2 , CO, O, S, N y NH, (4) OH, (5) NRa Rb , (6) ONRc Rd , (7) CN, (8) haluro, (9) SH2 , (10) SRe Rf , (11) N(H)NH2 , (12) RgCORh, (13) COORi, (14) CON(Rj )(Rk) (15) R|N(Rm)CON(Rn)(R'n), (16) (Ci -Cao)-alqueno, (17) (Ci -Ca o)-alquino, (18) N3, (19) RoCH(ORp)(ORq ), (20) RrCH(SRs )(SRt ), (21) RuB(ORv )(ORw ), (22) CORx ; y en el que ninguno, uno o más C, están sustituidos independientemente por (C3-C30) -cicloalquilo, arilo, aril-(C1-C30)-alquilo, NRy Rz , CO, O, S, S(O), S(O2), B, P y (O-CH2-CH2K el subíndice A del radical (O-CH2-CH2 ) es un número entero entre 1 y 500; Ra , Rb, Rc , Rd , Re , Rf , Rh, Ri, Rj , Rk , Rm , Rn, R'n , Rp, Rq , Rs , Rt , Rv , Rw , Rx , Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo formado por H, (C1-C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenilo (C1-C30)-alquilo y (C3-Cs )-cicloalquilo; en los que en cualquiera de ellos, excepto el H, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo formado por O, S, S(O), S(O2 ), haluro, N, NH, P y CO; Rg , Ri, Ro , Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C-i -C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenilo, (C1-C30)-alquilo y (C3-Cs )-cicloalquilo; en los que uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, S(O), S(O2), haluro, N, NH, P y CO; y de Re a R13 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y (C1-C4 )-alquilo; con la salvedad de que: (1) cuando no está presente CL, el radical AA está unido mediante un enlace peptídico al radical PAA a través de la amina terminal del radical PAA; y (2) cuando está presente CL, el radical AA está unido a CL a través de RV
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el radical R7 del polímero entrecruzado de la presente invención se selecciona del grupo formado por H, CO-(C1-C20) -alquilo, CONH-(C1-C20)-alquilo y piroglutamato.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, u opcionalmente en combinación con el polímero entrecruzado como se ha definido anteriormente de las fórmulas (I), (II) y (III), donde CL está presente o no está presente, y donde v es un número entero entre 1 y 5 y cada grupo terminal X es -NH-, el poliaminoácido del polímero entrecruzado de la presente invención es un homo-poliaminoácido, donde R1=R2=R3=R4=Rs =R6. En una realización preferida, dicho R1=R2=R3=R4=Rs =R6 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000013_0001
En el que Z se selecciona del grupo formado por H, contraión metálico y contraión inorgánico.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, u opcionalmente en combinación con el polímero entrecruzado como se ha definido anteriormente de las fórmulas (I), (IV) y (V), en el que CL está presente o no, y en el que v es un número entero entre 1 y 5 y cada grupo terminal X es -NH-, el poliamino del polímero entrecruzado de la presente invención es también un homo-poliaminoácido, en el que R1=R2=R3=R4=Rsy R'6 es el radical doble correspondiente de dicho R1=R2=R3=R4=Rs. En una realización preferida, dicho Ri =R2=R3=R4=R5 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000013_0002
Y dicho R'6 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000013_0003
En el que Z se selecciona del grupo formado por H, contraión metálico y contraión inorgánico.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, u opcionalmente en combinación con el polímero entrecruzado como se ha definido anteriormente de las fórmulas (I), (II) y (III), en el que CL está presente o no está presente, y en el que v es un número entero entre 1 y 5 y cada grupo terminal X es -NH-, el poliaminoácido del polímero entrecruzado de la invención es un copoliaminoácido aleatorio o en bloque. En una realización preferida, dichos R1 , R2 , R3 , R4 , R5 y R6 del copoliaminoácido aleatorio o en bloque se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000014_0001
Donde cada X i y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, N, NH2 , y Z; cada X3 y X4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y Z; cada y e y' es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 3, donde y+y' = 2 o 3; cada y'' e y"' es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 2, donde y"+y"' = 1 o 2; Z se selecciona del grupo que consiste en H, contraión metálico y contraión inorgánico. En una realización más preferida, R1 , R2 , R3 , R4 , R5 y R6 del poliaminoácido aleatorio o en bloque de la invención se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000014_0002
Donde cada X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, N, NH2, y Z; cada X3 y X4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y Z; cada y e y' es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 3, donde y+y' = 2 o 3; cada y'' e y''' es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 2, donde y''+y''' = 1 o 2; Z se selecciona del grupo que consiste en H, contraión metálico y contraión inorgánico. En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, u opcionalmente en combinación con el polímero entrecruzado como se ha definido anteriormente de las fórmulas (I), (IV) y (V), en el que CL está presente o no, y en el que v es un número entero entre 1 y 5 y cada grupo terminal X es -NH-, el poliaminoácido del polímero entrecruzado de la presente invención es un copoliaminoácido aleatorio o en bloque. En una realización preferida, los radicales de Ri a R5 del copoliaminoácido aleatorio o en bloque se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000015_0001
Y el radical R'ese selecciona del grupo formado por:
Figure imgf000015_0002
Donde cada X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, N, NH2, y Z; cada X3 y X4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y Z; cada subíndice y e y' de R1 a R5 es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 3, donde y+y' = 2 o 3; cada subíndice y'' e y''' de R 1a R5 es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 2, donde y"+y'" = 1 o 2 ;
cada subíndice y de R'6 es 1 o 2; el subíndice y' de R'6 es 0 o 1; y cada Z se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, contraión metálico y contraión inorgánico. En una realización más preferida, los radicales de R1 a R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000016_0001
Donde cada Xi y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, N, NH2, y Z; cada X3 y X4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y Z; cada subíndice y e y' de R1 a R5 es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 3, donde y+y' = 2 o 3; cada subíndice y'' e y''' de R1 a R5 es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 2, donde y"+y'" = 1 o 2 ;
cada subíndice y de R'6 es 1 o 2; el subíndice y' de R'6 es 0 o 1; y cada Z se selecciona independientemente del grupo formado por H, contraión metálico y contraión inorgánico.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el polisacárido del polímero entrecruzado de la presente invención se selecciona del grupo formado por el ácido hialurónico, la pectina, el quitosano y el condroitín sulfato.
En otra realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, u opcionalmente en combinación con la realización particular en la que el polímero entrecruzado es de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, y CL no está presente, el polisacárido del polímero entrecruzado es ácido hialurónico, el PAA es poliglutamato, el AA es glutamato, v es un número entero entre 2 y 4 y x+w es un número entero entre 2 y 200.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más de las diversas realizaciones descritas anteriormente, u opcionalmente en combinación con la realización particular en la que el polímero entrecruzado es de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, y CL está presente, el polisacárido del polímero entrecruzado es ácido hialurónico, el PAA es poliglutamato, el AA es glutamato, v=1, x+w es un número entero entre 2 y 200 y el CL es -NH-CH(COOHMC1. C4)-alquil-NH-.
Sales, isómeros y solvatos de los polímeros cruzados de la invención
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sal" se refiere a las sales ácidas o básicas del polímero entrecruzado de la presente invención. Por ejemplo, los polímeros entrecruzados de la presente invención contienen uno o más nitrógenos básicos y, por tanto, pueden formar sales al reaccionar con ácidos, tanto orgánicos como inorgánicos. Los ejemplos de dichas sales incluyen, sin limitación sales de ácidos inorgánicos, como el ácido clorhídrico, el ácido bromhídrico, el ácido yodhídrico, el ácido nítrico, el ácido perclórico, el ácido sulfúrico o el ácido fosfórico; y sales de ácidos orgánicos, como el ácido metanosulfónico, el ácido trifluorometanosulfónico, el ácido etanosulfónico, el ácido bencenosulfónico, el ácido p-toluenosulfónico, el ácido fumárico, el ácido oxálico, el ácido acético, el ácido maleico, el ácido ascórbico, el ácido cítrico, el ácido láctico, el ácido tartárico, el ácido malónico, el ácido glicólico, el ácido succínico y el ácido propiónico, entre otros; y sales de amonio cuaternario, como el yoduro de metilo, el yoduro de etilo y similares.
Algunos polímeros entrecruzados de la presente invención pueden contener uno o más protones ácidos y, por tanto, también pueden formar sales al reaccionar con bases. Los ejemplos de dichas sales incluyen, sin limitación: sales de cationes inorgánicos, como sodio, potasio, calcio, magnesio, litio, aluminio, zinc, etc.; y sales formadas con aminas farmacéuticamente aceptables, como amoníaco, alquilaminas, hidroxialquilaminas, lisina, arginina, N-metilglucamina, procaína y similares.
No existen limitaciones en cuanto a los tipos de sales que pueden utilizarse, siempre que sean farmacéuticamente aceptables para su uso con fines terapéuticos, por lo que no son tóxicas. Por sales farmacéuticamente aceptables se entienden aquellas sales que, según criterios médicos, son adecuadas para ser utilizadas en contacto con los tejidos de los seres humanos u otros mamíferos sin causar una toxicidad indebida, irritación, respuestas alérgicas o efectos similares. Las sales farmacéuticamente aceptables son ampliamente conocidas por un experto en la materia.
Las sales de un polímero entrecruzado de la invención pueden obtenerse durante el aislamiento y la purificación final de los polímeros entrecruzados de la invención o prepararse tratando un polímero entrecruzado de la invención con una cantidad suficiente del ácido o la base deseados para producir la sal de manera convencional. Las sales pueden, a su vez, convertirse en otras sales mediante el intercambio de iones utilizando, por ejemplo, y sin limitación, una resina de intercambio de iones.
Los polímeros entrecruzados de la invención y sus sales pueden diferir en cuanto a ciertas propiedades físicas, pero, a efectos de la invención, son equivalentes. Todas las sales de polímeros entrecruzados de la invención están incluidas en el ámbito de la invención.
Los polímeros entrecruzados de la presente invención pueden formar complejos con disolventes con los que se les hace reaccionar o de los que se precipitan o cristalizan. Estos complejos se conocen como solvatos. Tal como se utiliza aquí, el término "solvato" se refiere a un complejo de estequiometría variable formado por un soluto (un polímero entrecruzado de la invención o una sal del mismo) y un disolvente. Los ejemplos de disolventes incluyen disolventes farmacéuticamente aceptables como, sin limitación, agua, etanol y similares. Un complejo formado por agua se conoce como hidrato. Los solvatos de los polímeros entrecruzados de la invención (o las sales de los mismos), incluidos los hidratos, se incluyen en el ámbito de la invención.
Los polímeros entrecruzados de la invención pueden existir en diferentes formas físicas, es decir, en forma amorfa y en forma cristalina. Además, los polímeros entrecruzados de la presente invención pueden ser capaces de cristalizar en más de una forma, característica conocida como polimorfismo. Los polimorfos pueden diferir en algunas propiedades físicas ampliamente conocidas por los expertos en la materia, como, por ejemplo, los difractogramas de rayos X, los puntos de fusión o la solubilidad. Todas las formas físicas de los polímeros entrecruzados de la invención, incluidas todas las formas polimórficas de los mismos ("polimorfos"), están incluidas en el ámbito de la presente invención.
Algunos polímeros entrecruzados de la presente invención pueden existir en forma de varios isómeros ópticos (o estereoisómeros) dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros simples, los enantiómeros o los diastereoisómeros y sus mezclas entran en el ámbito de la presente invención. Del mismo modo, y a menos que se indique lo contrario, los polímeros entrecruzados de la invención pretenden incluir polímeros entrecruzados que sólo difieren en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen uno o más hidrógenos sustituidos con deuterio o tritio, o que tienen uno o más carbonos sustituidos con carbono enriquecido en 13C o 14C, o uno o más nitrógeno sustituido con nitrógeno enriquecido en 15N están dentro del alcance de la presente invención.
Se divulga aquí un proceso para la síntesis de los polímeros entrecruzados de fórmula (I) en el que no está presente el CL y el polisacárido y el poliaminoácido son naturales, el proceso comprende: (1.1) reacción del polisacárido y del poliaminoácido a través de sus grupos funcionales (y complementarios) mediante la activación del ácido carboxílico y el acoplamiento con la amina reactiva, en la que el grado de reticulación del polímero entrecruzado resultante se controla ajustando la relación molar relativa entre los ácidos carboxílicos activados y las aminas reactivas y las condiciones de reacción, a saber, temperatura, tiempo de reacción y concentración, y (1.2) la purificación por fraccionamiento, precipitación, ultrafiltración, diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial del producto de reacción obtenido en la etapa anterior. En otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la síntesis de los polímeros entrecruzados de fórmula (I) en el que el CL no está presente y el polisacárido y/o el poliaminoácido son de origen no natural, el proceso comprende, (2.1) la modificación química del polisacárido y/o del poliaminoácido para incorporar grupo(s) funcional(es) químicamente complementario(s) entre ellos que reaccionaría(n) para formar un enlace estable en las condiciones de reacción apropiadas, y la modulación del grado de reticulación del polímero entrecruzado resultante a través de las proporciones molares de los grupos funcionales y de las condiciones de reacción, a saber, temperatura, tiempo de reacción y concentración, y (2.2) la purificación por fraccionamiento, precipitación, ultrafiltración, diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial del producto de reacción obtenido en la etapa anterior.
También se divulga en el presente documento un proceso para la síntesis de los polímeros entrecruzados de fórmula (I) en los que está presente CL y el polisacárido y el poliaminoácido son naturales, el proceso comprende los siguientes pasos: (3.1) reaccionar el polisacárido con el poliaminoácido utilizando una molécula enlazadora para generar el radical CL correspondiente mediante (3.1.a) la disolución del polisacárido y el poliaminoácido en una solución acuosa (solución A), (3.1.b) la adición de un grupo activador de ácido carboxílico a la solución A (solución B), (3.1.c) añadir la "molécula enlazadora" a la solución B para que reaccione con los ácidos carboxílicos activados, y (3.2) purificar el producto de reacción obtenido en la etapa (3.1) por fraccionamiento, precipitación, ultrafiltración, diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial. La presente invención también proporciona un proceso para la síntesis de los polímeros entrecruzados de fórmula (I) en el que está presente CL y el polisacárido y/o el poliaminoácido son de origen no natural, el proceso comprende el siguiente paso: (4.1) modificación química del polisacárido y/o del poliaminoácido para incorporar grupo(s) funcional(es) químicamente complementario(s) con los grupos químicos de la molécula enlazadora, (4.2) reacción de dicho polisacárido y poliaminoácido químicamente modificados con la molécula enlazadora para formar enlaces estables, y generación del radical CL correspondiente mediante (4.2.a) disolviendo el polisacárido y el poliaminoácido químicamente modificados en una solución acuosa (solución A'), (4.2.b) añadiendo un grupo activador de ácido carboxílico a la solución A (solución B), (4.2.c) añadiendo la "molécula enlazadora" a la solución B' para que reaccione con los ácidos carboxílicos activados, (4.3) purificar el producto de reacción obtenido en la etapa (4.2) por fraccionamiento, precipitación, ultrafiltración, diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial.
Conjugados
El término "conjugado", tal como se utiliza aquí, se refiere a una combinación que comprende el polímero entrecruzado de la presente invención y al menos un agente activo. En consecuencia, los polímeros entrecruzados de la presente invención pueden ser utilizados como entrega de fármacos de agentes activos, donde la entrega puede ser una liberación sostenida o no. Por consiguiente, la invención se refiere a un conjugado que comprende el polímero entrecruzado de la presente invención y al menos un agente activo que está unido al polímero entrecruzado.
En el contexto de la presente invención, el término "agente activo" se refiere a un agente farmacéutico activo, un agente de imagen o un agente cosmético.
El agente o agentes activos pueden estar unidos covalentemente al polímero entrecruzado directamente o a través de un grupo conector. El término "grupo de conexión", cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a una fracción orgánica que conecta o une el polímero entrecruzado de la presente invención y al menos un agente activo, donde el grupo de conexión puede ser, independientemente y sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, carbamato, metilfosfonato, guanidinio, disulfuros, ésteres, hidrazonas, sulfamato, sulfamida, acetal, formacetal, tioformacetal, sulfona, amida y mezclas de los mismos. El agente activo puede estar unido covalentemente al polímero entrecruzado a través del poliaminoácido, del polisacárido o de ambos. En una realización particular, el enlace covalente es un enlace biorreactivo. El término "enlace biorreactivo", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un enlace químico escindible bajo desencadenantes fisiológicos o externos específicos (por ejemplo, y sin limitación, pH, especies reactivas de oxígeno, entorno reductor, enzimas específicas, glucosa, luz, temperatura, etc.). En una realización particular, al menos el agente activo del conjugado de la presente invención está unido al polímero entrecruzado de la presente invención a través del radical PLS-(PLS-RU)w y/o el radical (PAA)-(AA)x .
Alternativamente, el agente activo puede estar unido de forma no covalente al polímero entrecruzado de la presente invención.
En una realización particular, al menos el agente activo puede incorporarse en el polímero entrecruzado de la invención mediante su encapsulación en micelas, liposomas, micelas poliméricas o polimerosomas.
En una realización particular, al menos el agente activo del conjugado de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en un agente farmacéutico activo, un agente de imagen y combinaciones de los mismos.
En una realización particular, al menos el agente farmacéutico activo se selecciona desde pequeñas moléculas (es decir, fármacos o profármacos) hasta biomoléculas (es decir, hormonas, péptidos, (apolipo)proteínas, anticuerpos, Fab o fragmentos de unión a antígeno, y ácidos nucleicos o análogos). Los ejemplos de ingredientes farmacéuticos activos incluyen, sin limitación, anticuerpos, antígenos, péptidos de arginina-glicina-aspartato (RGDs), bifosfonatos, aptámeros, gaptámeros, polisacáridos, oligonucleótidos de doble cadena (ADN), siRNA, ARN de horquilla corta, micro ARN, secuencia antisentido, ribozima o enzima de ARN, ácido nucleico bloqueado, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico intercalante, etc. En una realización particular, el ingrediente farmacéutico activo se selecciona del grupo que consiste en vacunas, antioxidantes, antiinflamatorios, neuroprotectores, vitaminas, filtros UV, iones, metales, factores de crecimiento, células madre, extractos naturales, quimioterapéuticos, inhibidores de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK), proteínas, antídotos, analgésicos, anestésicos, antidiabéticos, antibióticos, antifúngicos, antihistamínicos, corticoides, agentes anticancerígenos, agentes antimetastáticos, antiapoptóticos, proapoptóticos, agentes neuroprotectores, agentes inmunoestimulantes y agentes inmunosupresores.
Las vitaminas incluyen análogos de las vitaminas, derivados de las vitaminas y vitaminas modificadas, que pueden incluirse en las partículas (p. ej, micropartículas) y composiciones de la presente divulgación incluyen, entre otras, la vitamina A (y los precursores de la vitamina A), la tiamina (vitamina B1), la riboflavina (vitamina B2), la niacina (vitamina B3), la piridoxina (vitamina B6), el ácido fólico, las cobalaminas (vitamina B12) ácido pantoténico (vitamina B5), vitamina C, vitamina D, vitamina E, biotina, vitamina K, otras vitaminas del complejo B, compuestos relacionados con el complejo B como la colina y el inositol, por ejemplo, y carotenoides como, y sin limitación, luteína, licopeno, zeaxantina y astaxantina. Se entenderá que los derivados y análogos de las vitaminas están dentro del alcance de la presente divulgación. Los análogos contemplados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a la modificación de la estructura del anillo, los grupos funcionales o las cadenas laterales de la molécula de vitamina, incluyendo la eliminación adicional de grupos protectores y sales y complejos de los mismos derivados de cualquier fuente, como ser sintetizados químicamente o identificados por un proceso de cribado, como el cribado de productos naturales, siempre que el análogo posea alguna actividad de unión para el receptor de la vitamina. En una realización particular, la vitamina es folato, nicotinamida, N, N-dietilnicotinamida, biotina o salicilato de sodio.
Tal como se utiliza en este documento, el término "agente de imagen" se refiere a cualquier sustancia que se utiliza como etiqueta, o que mejora estructuras específicas en cualquier técnica de imagen. Un agente de imagen, por lo tanto, incluye un agente de imagen óptica, un agente de imagen de resonancia magnética, un radioisótopo y un agente de contraste. Ejemplos, sin limitación, de agentes de formación de imágenes ópticas son el colorante de acridina, el colorante de cumarina, el colorante de rodamina, el colorante de xanteno, el colorante de cianina y el colorante de pireno, el Texas Red, el colorante de Alexa Fluor® , el colorante de BODIPY® , la fluoresceína, el colorante Oregon Green® y el colorante Rhodamine Green™, que están disponibles comercialmente o se preparan fácilmente por métodos conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos de agentes de formación de imágenes apropiados para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, metales de transición y metales de transición radiactivos quelados a agentes quelantes, por ejemplo DTPA (ácido dietileno triamina pentaacético), DOTA (ácido 1,4,7,10-Tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético) y NOTA (ácido 1,4,7-Triazaciclonano-1,4,7-triacético).
En otra realización particular, el agente activo es un agente cosmético. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "agente cosmético" se refiere a un agente destinado a ser aplicado al cuerpo humano para limpiar, embellecer, promover el atractivo o alterar la apariencia sin afectar a la estructura o las funciones del cuerpo. El polímero entrecruzado solo o el conjugado del polímero entrecruzado y al menos el agente cosmético actúan tratando y/o previniendo los efectos de los radicales libres, incluyendo y sin limitación, la peroxidación de las sustancias cutáneas, en particular, los lípidos de la membrana de las células como los queratinocitos, la inflamación, el envejecimiento, la despigmentación y la finura de los granos de la piel, mejorando la diferenciación de los queratinocitos, hidratando la piel, y también la acción anestésica sobre las terminaciones nerviosas cutáneas.
En otra realización particular, al menos un agente cosmético de los conjugados de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en vitaminas A, B1, B6, B12, E, C, PP, ácido retinoico, retinal, retinol y sus ésteres, ácido salicílico y sus derivados, en particular sales o ésteres del mismo, ácido 2,5-dihidroxibenzoico, el tocoferol y sus ésteres, en particular el fosfato de tocoferol, el ácido asiático, el ácido madecásico y sus ésteres glucosídicos, el asiaticósido, el extracto de Centella asiatica, el extracto de Siegesbeckia orientalis, los oligómeros de proantocianuro, en particular los obtenidos a partir de pepitas de uva, y sus ésteres, en particular los ésteres palmítico y esteárico los derivados del ácido ascórbico, en particular su fosfato y sus sales, el ácido eritórbico, los oligoelementos, en particular en forma de sal, concretamente en forma de aspartato o de cloruro de magnesio, de selenio, de zinc o de cobre, los ácidos alfa-hidroxilados, en particular el ácido málico, el ácido láctico y el ácido tartárico, y sus ésteres, en particular con alcoholes grasos como el alcohol estearílico, los aminoácidos, en particular la serina, la treonina, la citrulina y los aminoácidos que constituyen el NMF (factor natural de hidratación), las ceramidas, en particular las 2, 3 ó 6 ceramidas utilizadas solas o en mezcla, las fotoceramidas, en particular las extraídas del trigo, y los ecdisteroides, en particular la ecdisterona, y sus ésteres.
En una realización particular, al menos el agente cosmético de los conjugados de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en un agente capaz de desencadenar la reparación y/o regeneración de tejidos, una micela y una vitamina.
El término "ingrediente activo capaz de desencadenar la reparación y/o regeneración de los tejidos", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la regeneración de las células de la piel que permite reducir, por ejemplo, las estrías en la piel humana, o permite la curación de las células de la piel después de una quemadura, como, por ejemplo, una quemadura solar.
Composiciones farmacéuticas, de diagnóstico, teranósticas y (dermo)cosméticas
En otro aspecto, la invención también se refiere a una composición farmacéutica, diagnóstica o teranóstica que comprende al menos el conjugado de la presente invención que comprende al menos un agente farmacéutico activo y/o un agente de imagen, respectivamente, y uno o más excipientes o portadores farmacéutica, diagnóstica y teranósticamente aceptables, respectivamente.
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica (o formulaciones) que comprende al menos un agente farmacéutico activo, el polímero entrecruzado de la invención (o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo), y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con el resto de los ingredientes de la composición y no ser perjudiciales para quienes toman dicha composición.
La naturaleza de la composición farmacéutica, como es bien sabido, dependerá de la naturaleza del agente farmacéutico activo y de su vía de administración. En principio, puede utilizarse cualquier vía de administración, por ejemplo, oral, sistémica, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular, intratecal, intranasal, administración ocular, rectal, tópica y subcutánea.
Las formulaciones farmacéuticas sólidas para la administración oral incluyen comprimidos, gránulos y cápsulas. En cualquier caso, el método de fabricación se basará en la mezcla simple, la granulación seca o la granulación húmeda del principio activo con excipientes. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes como la lactosa, la celulosa microcristalina, el manitol o el hidrogenofosfato de calcio; agentes aglutinantes como, por ejemplo, el almidón, la gelatina o la polivinilpirrolidona; agentes disgregantes como el carboximetilalmidón de sodio o la croscarmelosa de sodio; y agentes lubricantes como, por ejemplo, el estearato de magnesio, el ácido esteárico o el talco. Los comprimidos pueden recubrirse además con excipientes adecuados mediante técnicas conocidas, con el fin de retrasar la disgregación y la absorción de los mismos en el tracto gastrointestinal, y lograr así una acción sostenida durante un período de tiempo más largo, o simplemente mejorar sus propiedades organolépticas o su estabilidad. Los polvos y gránulos pueden obtenerse para preparar suspensiones orales añadiendo agua, mezclando el agente farmacéutico activo con agentes dispersantes o humectantes, agentes de suspensión y conservantes. También pueden añadirse otros excipientes, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.
Las formas líquidas para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes de uso común, como agua destilada, etanol, sorbitol, glicerol, polietilenglicoles (macrogol) y propilenglicol. Dichas formulaciones también pueden contener adyuvantes, como agentes humectantes, suspensores, edulcorantes y aromatizantes, conservantes y reguladores del pH.
Según la presente invención, las preparaciones inyectables, para la administración parenteral, comprenden soluciones, suspensiones o emulsiones estériles, en un disolvente acuoso o no acuoso, como propilenglicol, polietilenglicol o aceites vegetales. Estas formulaciones farmacéuticas pueden contener también adyuvantes, como agentes humectantes, emulsionantes y dispersantes, y conservantes. Pueden esterilizarse mediante cualquier método comúnmente conocido o prepararse como formulaciones sólidas estériles que se disuelven posteriormente en agua o en cualquier otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. También es posible partir de materias primas estériles y mantenerlas en estas condiciones durante todo el proceso de fabricación.
Para la administración rectal, la composición farmacéutica de la invención puede ser preferentemente supositorios sobre bases oleosas, como, por ejemplo, aceites vegetales o glicéridos sólidos semisintéticos, o sobre bases hidrofílicas, como polietilenglicoles (macrogol).
Para la administración nasal o la inhalación, la composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de aerosol, del que se libera convenientemente utilizando propulsores adecuados.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden formularse para su aplicación tópica, para el tratamiento de patologías que afectan a zonas u órganos accesibles por dicha vía, como los ojos, la piel y el tracto intestinal. Estas composiciones farmacéuticas incluyen cremas, lociones, geles, polvos, soluciones y parches en los que el compuesto está disperso o disuelto en excipientes adecuados. La administración local de factores de crecimiento con un andamio de este tipo facilita la curación de heridas y la regeneración de tejidos en muchas situaciones.
Los polímeros entrecruzados de la presente invención, ya sea solos o incorporando al menos un agente cosmético, pueden utilizarse también en (dermo-)cosméticos. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a una composición (dermo-)cosmética que comprende el polímero entrecruzado de la presente invención o el conjugado de la presente invención en el que al menos el agente activo es un agente cosmético, y uno o más excipientes cosméticamente aceptables. Como tal, las composiciones (dermo-)cosméticas de la presente invención pueden ser ampliamente utilizadas en diversas aplicaciones como composiciones de limpieza, cosméticos para el cuidado de la piel, cosméticos para el cabello y cosméticos de maquillaje. Ejemplos de los mismos, y sin limitación, incluyen leche, crema, mascarilla, fluido, champú, limpiador corporal, limpiador facial, pañuelo húmedo (para la limpieza), pañuelo húmedo (para la limpieza de la cara), y desmaquillante (para la máscara de pestañas, la sombra de ojos y la base de maquillaje). Algunos ejemplos de cosméticos para el cuidado de la piel son el gel de masaje, el gel corporal y la mascarilla facial. Los ejemplos de cosméticos para el cabello incluyen el tratamiento para el cabello, el enjuague, la preparación para el peinado y el tinte para el cabello.
En una realización particular, la composición (dermo-)cosmética se utiliza para el cuidado, la protección y/o el tratamiento de la piel, las mucosas y/o el cabello. Por razones de comodidad de uso, las composiciones (dermo-)cosméticas están destinadas a aplicaciones tópicas, frecuentemente en forma de emulsión. La composición (dermo)cosmética según la invención puede proporcionarse en forma de emulsión de aceite en agua (O/W, del inglés, oil/water) o de agua en aceite (W/O, del inglés, water/oil). La fase acuosa y la fase oleosa se utilizan, por su parte, en proporciones relativas habituales en el campo de la cosmética, según la forma galénica deseada para la composición (dermo-)cosmética. La determinación de estas proporciones relativas es competencia de los expertos en la materia. Según una característica particularmente ventajosa de la invención, la composición (dermo-)cosmética comprende preferentemente un agente hidratante fisiológico, contenido en la fase acuosa, y un agente emoliente fisiológico, contenido en la fase oleosa. Cuando la composición (dermo-)cosmética es una emulsión, la proporción de la fase grasa oscila entre el 5 y el 80% p/p, preferentemente entre el 5 y el 50% p/p. Las emulsiones pueden comprender o no excipientes cosmética y/o dermatológicamente aceptables. Estos excipientes pueden ser, en particular, tensioactivos, sustancias grasas, agentes hidratantes, conservantes, perfumes, agentes gelificantes, quelantes, pigmentos como el TiO2, etc.
Al menos el agente cosmético puede estar presente en la composición (dermo)cosmética en un rango de 0,001 a 5% peso/peso de al menos el agente cosmético en relación con el peso total de la composición (dermo)cosmética (p/p), de 0,05 a 4%, de 0,05 a 3%, de 0,04 a 2%, de 0,05 a 2%, o de 0,01 a 1%.
Usos terapéuticos, diagnósticos y teranósticos de los conjugados de la invención
La presente invención también se refiere al uso del conjugado o la composición farmacéutica de la presente invención, en la que al menos el agente activo es un agente farmacéutico activo, para la medicina. Alternativamente, la presente invención también se relaciona con el conjugado o la composición farmacéutica de la presente invención, en la que al menos el agente activo es un agente farmacéutico activo, para su uso en medicina o terapia. Alternativamente, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad farmacéuticamente eficaz del conjugado o la composición farmacéutica de la presente invención, en la que al menos el agente activo es un agente farmacéutico activo.
La presente invención también se relaciona con el uso del conjugado o la composición farmacéutica de la presente invención en la que al menos el agente activo es un agente de imagen en diagnóstico, lo que puede redactarse alternativamente como un método para el diagnóstico de una enfermedad en un sujeto. Alternativamente, la presente invención también se refiere a un conjugado o una composición de diagnóstico de la presente invención en la que al menos el agente activo es un agente de formación de imágenes para su uso en el diagnóstico.
La presente invención también se refiere al uso de un conjugado o una composición farmacéutica de la presente invención para la teranóstica. Alternativamente, la presente invención también se refiere a un conjugado o una composición farmacéutica de la presente invención para su uso en teranóstica.
En la presente descripción, el término "terapéutico" incluye el tratamiento y la prevención.
Los términos "tratamiento" y "tratar", tal como se utilizan aquí, se refieren a la eliminación, reducción o disminución de la causa o los efectos de una enfermedad. A efectos de la presente invención, "tratamiento" y "tratar" incluyen, sin limitarse a ello, el alivio, la reducción o la eliminación de uno o más síntomas de la enfermedad, la reducción del grado de la enfermedad, la estabilización (es decir, el no empeoramiento) del estado de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, el alivio o la mejora del estado de la enfermedad y la remisión (total o parcial) de la enfermedad.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "prevención" y "prevenir" se refieren a la administración de un compuesto, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o de una composición farmacéutica según la invención a un sujeto al que no se le ha diagnosticado la posibilidad de padecer la enfermedad en el momento de la administración. La prevención también incluye evitar la reaparición de la enfermedad en un sujeto que ha sufrido previamente dicha enfermedad. La prevención puede ser completa o parcial.
Tal como se utilizan aquí, los términos "diagnóstico" y "diagnosis" se refieren a la identificación de la naturaleza y la causa de un determinado fenómeno.
El término "teranóstica", tal y como se utiliza aquí, se refiere a la terapia de diagnóstico para pacientes individuales con el fin de probar su posible reacción a la toma de nuevos medicamentos y adaptar un plan de tratamiento para ellos, en otras palabras, es una forma de terapia de diagnóstico que prueba la reacción del paciente a la medicación basada en los resultados de la prueba.
Los términos "sujeto", "individuo", "animal" y "paciente" incluyen cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, para el que se desea una terapia y/o prevención. Los sujetos mamíferos incluyen a los seres humanos, los animales domésticos, los animales de granja y los animales de zoológico o de compañía. En una realización particular de la invención, el sujeto es un mamífero. En una realización más particular, el sujeto es un humano, preferiblemente un humano de cualquier raza y sexo.
Alternativamente, la invención se refiere al uso del conjugado o la composición farmacéutica de la invención y uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables, para la preparación o la fabricación de un medicamento. La presente invención también se refiere a un método de cuidado cosmético de la piel que comprende la administración tópica a la piel de un sujeto de una cantidad cosméticamente eficaz de la composición (dermo-)cosmética de la invención. En una realización particular, el método de cuidado cosmético de la piel es para realizar un cuidado cosmético seleccionado del grupo que consiste en evitar o disminuir los efectos nocivos de los radicales libres en la piel, para frenar o eliminar las erupciones o sensaciones de pinchazos o picaduras en la piel, de favorecer la diferenciación de los queratinocitos, de restaurar la hidratación normal de la epidermis, de mejorar la finura del grano de la piel, de ralentizar o tratar los efectos del envejecimiento en la piel, de atenuar la hiperpigmentación, comprendiendo la administración tópica en zonas de la piel de un ser humano que lo necesite, de una cantidad cosméticamente eficaz de la formulación cosmética de la presente invención.
Las expresiones "cantidad farmacéuticamente eficaz" y "cantidad cosméticamente eficaz", tal y como se utilizan en el presente documento, se entienden como una cantidad capaz de proporcionar un efecto terapéutico y un efecto cosmético, respectivamente, y que puede ser determinada por el experto en la materia por medios comúnmente utilizados.
Medio de cultivo y usos del mismo
La presente invención también se refiere a un medio de cultivo para células y/o tejidos que comprende el polímero entrecruzado de la presente invención. Así como un método de cultivo de células y/o tejidos que comprende el cultivo de dichas células y/o tejidos en dicho medio de cultivo (como se muestra en la FIG. 14).
Tal y como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "una" significa "al menos uno" o "uno o más". La referencia a "el método" incluye la referencia a pasos y métodos equivalentes divulgados en el presente documento y/o conocidos por los expertos en la materia.
EJEMPLOS
Productos químicos
Todos los productos químicos utilizados en los siguientes ejemplos eran de grado reactivo y se utilizaron sin mayor purificación y se compraron a Sigma-Aldrich, a menos que se indique lo contrario.
Se adquirieron ácidos hialurónicos de diferentes MW (peso molecular) de Saequim Especialidades S.L. (Aurora, 50KDa), cuando se utilizaron para las reacciones químicas detalladas en los Ejemplos, y de Soliance (PrimalHyal300, 200KDa), cuando se utilizaron para fines de comparación en los Ejemplos. La hialuronidasa (HAasa) de 999 unidades/mg y el cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMMCl) se compraron a Sigma Aldrich. La N, N-dimetilformamida anhidra (DMF, >99,8% anhidra), el dimetilsulfóxido (Dm So , >99,8% anhidra) y el tetrahidrofurano (THF, >99,8% anhidra) se compraron a Scharlab S. L. (Sentmenat, España). El nitrato de sodio, el hidróxido de sodio, el fosfato de sodio monobásico y el hidrogenofosfato de sodio heptahidratado se obtuvieron de VWR International. La sal de clorhidrato de L-lisina y el ácido clorhídrico concentrado 12M se obtuvieron de Fisher Scientific. La cianina 5,5 amina y los colorantes DiL se compraron a Lumiprobe e Invitrogen, respectivamente. El óxido de deuterio se compró a Deutero GmbH. En todas las preparaciones acuosas se utilizó agua ultrapura con una resistividad de 18MQ.cm (Milli-Q® ultrapura). El poliglutamato de sodio de 15KDa iniciado con n-butilamina, y el poliglutamato de sodio de 3KDa de diferentes arquitecturas, a saber, iniciado con n-butilamina o 1,4-n-butildiamina, se sintetizaron como se describe en otros lugares (véase, por ejemplo, DENG, C. et al, 2014; LU, H. et al, 2014). El equipo de filtración de flujo tangencial (TFF) modelo 900-1893 con una columna PES de 30KDa MWCO (Molecular Weight Cut Off) fue proporcionado por Spectrum Labs. Los Vivaspin de 100KDa MWCO PES se compró a Sartorius.
Espectroscopia 1H RMN
Los espectros de 1H RMN se registraron a 27°C (300°K) en un 300 Ultrashield™ de Bruker (Billerica MA, USA). Los datos se procesaron con el software Topspin (Bruker GmbH, Karlsruhe, Alemania). Las muestras se prepararon a 5 mg/mL en disolventes deuterados.
SEC-RI-MALS
Las mediciones SEC en medios acuosos que contenían 0,1M de NaNO3 y 0,005% (p/p) de azida como aditivo se realizaron en un sistema AF2000 de Postnova Analytics (Landsberg, Alemania). El sistema se configuró para trabajar en modo SEC con una bomba isocrática (PN1130), un automuestreador (PN5300), un índice de refracción (RI, PN3150) y 21 ángulos dispersión de luz multiángulo (MALS, PN3621). Se empleó un flujo de trabajo de 0,7 mL/min a 30°C con una columna TSKgel G6000PWXL. Se utilizaron el índice de refracción y la dispersión de luz multiángulo para la detección y la determinación del MW, la calibración de los detectores RI y MALS se logró con Pullulan bien definido (50KDa) y la validación con estándares de sal sódica de ácido polimetacrílico (62,5KDa PMASS), adquiridos en Polymer Standards Service (PSS)/Mainz Alemania. Para la caracterización de NaPGA/Na-nBu(PGA)2 , NaHA y polímeros entrecruzados, se inyectaron 30 pL de la solución correspondiente de 5 mg/mL cada vez. Los valores dn/dc se determinaron a partir de la masa recuperada asumiendo una recuperación del 95-100% de la columna cromatográfica y se encontró que estaban dentro de 0,185-0,195 para el PGA, y 1,4-1,5 para e1HA y polímeros entrecruzados.
EJEMPLO 1. Diseño y síntesis de polímeros entrecruzados de ácido hialurónico-ácido poli-L-glutámico-L-lisina-([HA]-[PGA]-[Lys])
Se sintetizaron dos polímeros entrecruzados representativos de [HA]-[PGA] utilizando L-lisina como molécula enlazante siguiendo procedimientos convencionales de acoplamiento de péptidos conocidos por el experto en la materia (por ejemplo, BARZ, M et al., 2013). El método sintético proporcionó un procedimiento para controlar el grado de reticulación y el enriquecimiento del polímero entrecruzado dentro de la mezcla del producto complejo, controlando cuidadosamente las condiciones de reacción (por ejemplo, la proporción molar de los reactivos, el pH, la concentración de la mezcla de reacción, etc.).
Procedimiento sintético general
Se prepararon las siguientes disoluciones:
- El hialuronato de sodio (NaHA) se disolvió en agua destilada (solución A)
- El poli-L-glutamato de sodio iniciado con n-butilamina (Na-nBuPGA) se disolvió en agua destilada (solución B) - El cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMMCl) se disolvió en agua destilada (solución C)
- La sal de clorhidrato de L-lisina (Lys-HCl) se disolvió en agua destilada (solución D)
Primero se mezclaron las disoluciones A y B. A continuación, se añadió la disolución C. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 15 minutos. A continuación, se añadió la disolución D, y la reacción se llevó a cabo durante la noche a TA (temperatura ambiente), ajustándose entonces el pH. El producto obtenido se purificó por diálisis utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) con una membrana de MWCO 30KDa lavando con tampón fosfato (PB) 5mM a pH 7,5 y con agua destilada secuencialmente. La solución se liofilizó y se obtuvo un polvo blanco. La FIG. 1 muestra los espectros de 1H RMN de las materias primas (sal de clorhidrato de L-lisina Lys-HCl, poli-L-glutamato de sodio NaPGA y hialuronato de sodio NaHA) utilizadas para preparar las soluciones anteriores.
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Esquema 1. Metodología sintética para la síntesis del polímero entrecruzado [HA]-[PGA]-[Lys] de los Ejemplos 1a y 1b, donde m es 126, n es 100, y x y < 6,4.
EJEMPLO 1a. Polímero entrecruzado de bajo grado de reticulación [HA]-[PGA]-[Lys]
Se sintetizó un polímero entrecruzado de bajo grado de reticulación [HA]-[pGA]-[Lys] siguiendo el procedimiento sintético general descrito anteriormente. Las cantidades de los reactivos empleados en cada reacción se detallan en la Tabla 1. El volumen total de reacción fue de 1,165 mL. Las reacciones se realizaron a pH=6-7.
Tabla 1
Figure imgf000023_0002
La FIG. 1 muestra los espectros de 1H RMN del polímero entrecruzado [HA]-[PGA]-[Lys] sintetizado, obtenido en el Ejemplo 1a, tras la purificación por eliminación de los residuos laterales. Como se muestra en los espectros de 1H RMN, los residuos de PGA se incorporaron dentro de la estructura del polímero entrecruzado resultante (véase la región punteada).
Los cromatogramas del NaHA comercial antes (línea sólida) y después de la reticulación con NaPGA (línea de puntos) se obtuvieron utilizando un detector RI. Como se muestra en la FIG. 2, el recuadro muestra la superposición de la señal RI y la distribución de MW después de la determinación del MW absoluto (índice de refracción y dispersión de la luz). La Tabla 2 muestra el análisis cuantitativo del MW y el PDI (índice de polidispersidad) mediante el análisis RI-MALS del NaHA y del polímero entrecruzado obtenido en el Ejemplo 1a. La reticulación se evidenció por el aumento del doble del MW del polímero entrecruzado [HA]-[PGA]-[Lys] obtenido en el Ejemplo 1a frente al NaHA.
Tabla 2
Figure imgf000023_0003
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EJEMPLO 1b. Polímero entrecruzado de alto grado de reticulación [HA]-[PGA]-[Lys]
Se sintetizó un polímero entrecruzado de alto grado de reticulación [HA]-[PGA]-[Lys] siguiendo el procedimiento sintético general descrito anteriormente. Las cantidades de los reactivos empleados en cada reacción se detallan en la Tabla 1, pero el volumen total de reacción fue de 840 mL. La reacción se realizó a un pH=8,5.
Como se muestra en los espectros de 1H RMN del polímero entrecruzado [HA]-[PGA]-[Lys] sintetizado obtenido en el Ejemplo 1b de la FIG. 1, los residuos de PGA se incorporaron dentro de la estructura del polímero entrecruzado sintetizado (véase la región punteada).
Los cromatogramas del NaHA comercial antes (línea sólida) y después de la reticulación con los residuos de NaPGA (línea de guiones) se obtuvieron utilizando un detector RI. Como se muestra en la FIG. 2, el recuadro muestra la superposición de la señal RI y la distribución de Mw después de la determinación del MW absoluto (índice de refracción y dispersión de la luz). La Tabla 3 muestra el análisis cuantitativo del MW y la PDI mediante el análisis RI-MALS del NaHA y del polímero entrecruzado obtenido en el Ejemplo 1b. La reticulación se evidenció por el aumento del triple del mW del polímero entrecruzado [HA]-[PGA]-[Lys] obtenido en el Ejemplo 1b frente al NaHA.
Tabla 3
Figure imgf000024_0003
__________________
EJEMPLO 2. Diseño y síntesis de un polímero entrecruzado de ácido hialurónico-ácido poli-L-glutámico ([HA]-[PGA]) auto-reticulado
Se sintetizó un polímero entrecruzado [HA]-[PGA] representativo utilizando un motivo PGA bifuncional y simétrico con dos partes de amina reactiva N-terminal, y siguiendo los procedimientos sintéticos convencionales descritos en otro lugar.
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Metodología sintética para la síntesis del polímero entrecruzado [HA]-[PGA] utilizando un poli-L-glutamato bifuncional, concretamente un PGA iniciado con la n-butil diamina bifuncional (Na-nBu(PGA)2), donde m es 126, n es 100 y < 6.
Procedimiento sintético general
Para la síntesis del polímero entrecruzado auto-reticulante [HA]-[PGA], utilizando el motivo PGA bifuncional y simétrico que tiene dos partes de amina reactiva N-terminal, se prepararon las siguientes disoluciones:
- El hialuronato de sodio (NaHA) se disolvió en agua destilada (solución A)
- El cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMMCl) se disolvió en agua destilada (solución B)
- El poli-L-glutamato de sodio bifuncional, iniciado con 1,4-butildiamina (Na-nBu(PGA)2), se disolvió en agua destilada (solución C)
Las cantidades empleadas de las soluciones anteriores se resumen en el cuadro 4.
Tabla 4
Figure imgf000025_0002
Se añadió la disolución B sobre la A y se ajustó el pH a 7 con NaOH. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 15 minutos. Después, se añadió la disolución C y la reacción se llevó a cabo durante la noche a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 8,5, y se midió para ser 6-5. El producto obtenido se purificó por diálisis utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) con una membrana de MWCO 30 KDa lavando con PB 5 mM a pH 7,5 y con agua destilada secuencialmente. La solución se liofilizó y se obtuvo un polvo blanco. La FIG. 4 muestra los espectros de 1H RMN de las materias primas, poli-L-glutamato de sodio (Na-nBu-(pGA)2 ) e hialuronato de sodio (NaHA) utilizados para preparar las disoluciones anteriores. Como se muestra en los espectros, los residuos de PGA se incorporaron a la estructura del polímero entrecruzado sintetizado (véase la región punteada).
Para la síntesis del polímero entrecruzado [HA]-[PGA] utilizando el motivo PGA monofuncional que tiene una única fracción de amina reactiva N-terminal, se prepararon las siguientes disoluciones (las cantidades empleadas de las disoluciones son también las resumidas en la Tabla 4 anterior):
- El hialuronato de sodio (NaHA) se disolvió en agua destilada (solución A)
- El cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMMCl) se disolvió en agua destilada (solución B)
- El poli-L-glutamato de sodio monofuncional (Na-nBuPGA) iniciado con n-butilamina se disolvió en agua destilada (solución C)
Se añadió la disolución B a la A y se ajustó el pH a 7 con unos pocos microlitros de NaOH 1M. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 15 minutos. A continuación, se añadió la disolución C y se ajustó el pH a 8,5 con unos pocos microlitros de NaOH 1M. La reacción se llevó a cabo durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, el producto se purificó por diálisis utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) con una membrana de MWCO 30KDa lavando primero con PB 5mM a pH 7,5 y luego con agua destilada. La disolución se liofilizó y se obtuvo un polvo blanco.
Para comprobar que el PGA bifuncional reticulaba eficazmente la HA a través de los dos restos amínicos finales, se obtuvo un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del correspondiente polímero entrecruzado [HA]-[PGA] reticulado con el PGA bifuncional y simétrico (véase la FIG. 5, línea sólida). También se obtuvieron cromatogramas comparativos utilizando el detector RI para el NaHA antes (línea cuadrada) y después de la reticulación con PGA (línea cruzada). El recuadro muestra la superposición de la señal de RI y la distribución de MW tras la determinación del MW absoluto (índice de refracción y dispersión de la luz). La reticulación con PGA bifuncional se evidencia por el aumento del doble del MW. La tabla 5 muestra el análisis cuantitativo del MW y el PDI mediante el análisis RI-MALS del NanBu(PGA)2 , el HA y el polímero entrecruzado [HA]-[PGA] resultante.
Tabla 5
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Como experimento de control, se empleó PGA monofuncional en la reacción de reticulación. Se obtuvo un análisis por cromatografía de exclusión de tamaño del correspondiente polímero entrecruzado [HA]-[PGA] auto-reticulado (véase la FIG. 6, línea sólida). Cromatogramas comparativos utilizando el detector RI para el hialuronato de sodio comercial (línea cruzada) y después de la reacción de reticulación con el PGA monofuncional (línea sólida). El recuadro muestra la superposición de la señal de RI y la distribución de MW tras la determinación del MW absoluto (índice de refracción y dispersión de la luz). La falta de reticulación se pone de manifiesto por el pequeño aumento del MW y una mayor bimodalidad del cromatograma. A diferencia del PGA bifuncional, este PGA monofuncional carecía de la capacidad de generar puntos de reticulación y, por lo tanto, los resultados coincidían con la presencia de conjugados HA-PGA en lugar de estructuras reticuladas. La tabla 6 muestra el análisis cuantitativo del MW y el PDI mediante el análisis RI-MALS del NaHA, el Na-nBuPGA y el polímero entrecruzado [HA]-[PGA] resultante, que mostró un pequeño aumento del MW en comparación con el HA original, lo que confirma la formación de conjugados HA-PGA en lugar de polímeros entrecruzados.
Tabla 6
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EJEMPLO 4. Reología
Las mediciones reológicas se realizaron en un reómetro TA AR-G2 equipado con un accesorio de control de temperatura Peltier, utilizando una geometría de placa paralela de acero (40 mm de diámetro). La distancia de separación se fijó en 1.000 nm. Las muestras ensayadas consistieron en los polímeros entrecruzados de los Ejemplos 1a, 1b y el NaHA comercial (50 KDa y 250 KDa). Las muestras se prepararon en las condiciones requeridas en agua miliQ y se envejecieron durante 24 h. Se colocó una capa homogénea de muestra entre las dos placas. Los pasos de barrido de frecuencia y tensión se realizaron a 20°C.
Las propiedades viscoelásticas se estudiaron en experimentos oscilatorios y los resultados se muestran en la FIG. 7. Todas las mediciones se realizaron dentro del régimen viscoelástico lineal (LVR) a una frecuencia de 1 Hz. Para ello, las condiciones experimentales para alcanzar el LVR se determinaron ejecutando un paso de barrido de tensión (tensión oscilatoria: 0,1-1.000 Pa a 1 Hz) y un paso de barrido de frecuencia (0,1-100 Hz a 0,2 Pa). La independencia del módulo de almacenamiento y de pérdida con la frecuencia y la tensión oscilatoria aplicada definió el LVR. Los resultados mostraron que a la concentración estudiada (5% en peso) sólo el hidrogel del Ejemplo 1b mostró el comportamiento reológico esperado para los hidrogeles viscoelásticos, es decir, un módulo de almacenamiento (G') superior al módulo de pérdida (G''). El hidrogel del polímero entrecruzado del Ejemplo 1a, y los HA comerciales de 50 KDa y 250 KDa, mostraron un carácter líquido viscoso siendo G'' mayor que G' en las condiciones obtenidas. Estos resultados sugirieron que el hidrogel del polímero entrecruzado del Ejemplo 1b, con un grado de reticulación ligeramente superior al del Ejemplo 1a, proporcionaba un hidrogel viscoelástico no accesible con los HA comerciales y lineales. En general, estos resultados mostraron que, sorprendentemente, controlando cuidadosamente las condiciones de la reacción de reticulación y, por tanto, la composición del polímero entrecruzado final, se podía conseguir un ajuste fino de las propiedades viscoelásticas.
El hidrogel del polímero entrecruzado del Ejemplo 1b se caracterizó además con diferentes concentraciones del polímero entrecruzado. Se comprobó que todas las muestras ensayadas presentaban un comportamiento viscoelástico dentro del rango de tensiones aplicadas, es decir, el módulo de almacenamiento (G') mayor que el módulo de pérdida (G''). Como se muestra en la Tabla 7, el módulo de almacenamiento aumentó con la concentración, así como el límite elástico, donde se perdió el carácter viscoelástico debido a la mayor contribución del módulo de pérdida (G''>G').
Tabla 7. Parámetros reológicos para el polímero entrecruzado de alto grado de reticulación del Ejemplo 1b a diferentes concentraciones a 15°C
Figure imgf000027_0002
a Determinado como el punto donde G'=G''. b Determinado a una tensión oscilante de 1 Pa. "wt" significa peso. Los datos mostraron que, en las condiciones empleadas, el polímero entrecruzado del ejemplo 1b mostraba un carácter viscoelástico (G'>G''), mientras que el polímero entrecruzado del ejemplo 1a con un grado de reticulación menor y los HA comerciales (250 KDa y 50 KDa) se comportaban como líquidos viscosos en los experimentos oscilatorios realizados (véase la FIG. 7).
EJEMPLO 5. Ensayo de compatibilidad de los polímeros entrecruzados de la invención con formulaciones cosméticas
La compatibilidad de los polímeros entrecruzados de la presente invención con formulaciones cosméticas convencionales se estudió utilizando una emulsión O/W (aceite en agua) de baja viscosidad como ejemplo representativo de una fórmula cosmética convencional. En particular, el polímero entrecruzado ensayado fue el del ejemplo 1b.
Como procedimiento general, las fases de aceite y agua se mantuvieron en un baño de 80°C (arena de mar) durante 15 minutos para asegurar la homogeneidad de la temperatura. El polímero entrecruzado de alto grado de reticulación del Ejemplo 1b se disolvió en la fase acuosa y se incluyó el emulsionante en la fase oleosa. La fase acuosa se colocó en un vaso de precipitados de 100 mL, y se agitó a 5.000 r. p. m. utilizando un ultraturrax T25 equipado con un cabezal 25N-18G. La fase oleosa se añadió a la fase acuosa obtenida anteriormente durante un período de 10 minutos, tras lo cual se mantuvo la agitación mientras se dejaba enfriar a TA para producir la formulación cosmética que se iba a probar. La Tabla 7 muestra las cantidades relativas empleadas para su preparación. Como se muestra en la Tabla 7, en general, la adición del polímero entrecruzado del Ejemplo 1b aumentó la viscosidad de la formulación ensayada.
Tabla 8
Figure imgf000027_0001
a medido a una velocidad de cizallamiento de 1s-1. "A&L" significa alcohol y lauril sulfato sódico
La estabilidad forzada de la formulación cosmética se estudió mediante centrifugación a diferentes temperaturas, que van de 5 a 40°C, y a diferentes r. p. m., que van de 7.500 a 10.000 rpm. La incorporación del polímero entrecruzado del Ejemplo 1.b aumentó la estabilidad de la formulación frente a la fuerza de centrifugación (véase la FIG. 8).
EJEMPLO 6. Digestión de los polímeros entrecruzados de la invención con hialuronidasa (HAasa)
La degradación de la HAasa se estudió mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Inicialmente, 3,75 mg/mL de HA comercial (250 KDa) y el polímero entrecruzado del Ejemplo 1b se incubaron independientemente con hialuronidasa (0,005 mg/ml correspondiente a 5 U/mL) a 37°C dentro del instrumento Autosampler AF2000. Se inyectaron 30 pl de cada muestra en los puntos de tiempo requeridos. La determinación del MW se llevó a cabo con detección RI y MALS empleando un dn/dc determinado a partir de la masa recuperada. Como se muestra en la FIG.
9, la determinación del Mw a partir de la SEC-RI-MALS reveló una rápida degradación de la HA comercial en las primeras 5 h, lo que dio lugar a una reducción del MW hasta 35 KDa, mientras que el MW del polímero entrecruzado permaneció prácticamente inalterado tras el tratamiento de 24h con HAasa.
EJEMPLO 7. Polímeros entrecruzados como sistema de administración de fármacos: ensayos de permeación en la piel humana
Para estudiar el potencial de los polímeros entrecruzados de la presente invención en aplicaciones tópicas, se realizaron estudios de permeabilidad en la piel humana.
EJEMPLO 7.1. Polímeros entrecruzados como sistema de administración de fármacos de micelas poliméricas Se evaluó la influencia de las disoluciones de polímeros entrecruzados como plataforma para la formulación de micelas poliméricas como vehículos de administración de fármacos.
Materiales y métodos
Se prepararon micelas poliméricas marcadas con fluorescencia a partir del copolímero en bloque comercial Poloxamer® mediante la metodología del co-solvente. Brevemente, el Poloxamer® (20mg/ml) y el colorante fluorescente (Dil-C18(3), 0,2mg/mL) se disolvieron en THF y se añadieron gota a gota en agua MilliQ con agitación continua a TA hasta la evaporación del disolvente orgánico. Las formulaciones se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante 24 horas, seguidas de una centrifugación a 1.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se dializó con agua MilliQ, MWCO=1.000Da. Las micelas poliméricas resultantes marcadas con fluorescencia se formularon independientemente en agua MilliQ y en una solución de 3,75 mg/mL del polímero entrecruzado del Ejemplo 1a.
Preparación de la piel
La permeabilidad de la piel se estudió utilizando piel humana de espesor total obtenida en una operación de cirugía plástica. Para reducir la variabilidad interindividual y permitir una mejor comparación de los resultados, se utilizó la piel de un solo donante en todos los experimentos. La piel se cortó en trozos (4x4cm) adecuados para ser colocados en una célula de difusión de tipo franz modificada. La piel, cubierta con papel de filtro humedecido con solución salina y envuelta en película de plástico y con papel de aluminio, se almacenó a -20°C hasta su utilización. Antes de realizar el ensayo, se retiró cuidadosamente la grasa subcutánea con un bisturí y se dejó que la piel llegara a TA.
Estudio de permeabilidad
En todos los estudios de permeación cutánea se empleó la célula de difusión de tipo franz modificada con un área de difusión de 0,95 cm2. La piel se montó cuidadosamente entre los compartimentos superior del donante y el inferior del receptor con el estrato córneo hacia arriba. A continuación, se llenó la cámara receptora con 8 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH=7,4) con mucho cuidado para evitar que quedara aire atrapado bajo la membrana, y se agitó a 600 r.p.m. a una temperatura termostática de 37°C. Después de un tiempo de equilibrio de 30 minutos, se introdujeron 100 pl de cada una de las formulaciones probadas en el compartimento donante utilizando una pipeta estándar. Se utilizó una concentración fija de las formulaciones en todos los casos (10 mg/mL de micelas poliméricas marcadas con fluorescencia). A continuación, se selló el compartimento donante con Parafilm® y papel de aluminio. El experimento se realizó durante 24 horas. A intervalos de tiempo predeterminados, se retiró todo el medio receptor del compartimento receptor y se sustituyó por un volumen igual de tampón fresco equilibrado a la temperatura experimental (37°C).
Visualización de la piel mediante microscopía confocal de barrido láser
Una parte de la piel se fijó en formalina al 10% durante 24 horas, seguida de sacarosa al 30% en tampón fosfato. La piel se criopreservó en hielo seco y luego se cortó con un microtomo en rodajas de 10 micras de grosor. Los trozos de piel se congelaron a -20°C, se recortó un trozo de 0,2cm*0,5cm de la zona tratada y se incrustó en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Se utilizó un criostato (Leica Cryostat CM 3050S, Wetzlar, Alemania) para preparar las secciones transversales verticales de la piel. Se obtuvieron de nueve a doce secciones verticales de cada muestra con un grosor de 20 pm y se almacenaron a 4°C hasta su análisis microscópico. Los cortes se colocaron en portaobjetos de vidrio, se fijaron con formalina y se tiñeron con 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). A continuación, se examinaron con un microscopio confocal de barrido láser. El Dil-C18(3) se excitó a Aex=549 nm y se detectó a Aem=566 nm y las señales de emisión fluorescente se representaron con un color rojo. Los núcleos celulares teñidos con DAPI se excitaron con la línea de 405 nm del diodo azul. Se comprobó que las micelas poliméricas marcadas con el colorante Dil-C18(3) (rojo) se acumulaban preferentemente en el estrato córneo cuando se formulaban en agua MilliQ pura (FIG. 10A). Por el contrario, se observó un claro aumento de la permeabilidad en la capa epidérmica en presencia del polímero entrecruzado, como revela el aumento de la fluorescencia del Dil-C18(3) (rojo) en la región epidérmica (núcleo de los queratinocitos teñido con DAPI, azul) (FIG. 10B).
EJEMPLO 7.2. Polímeros entrecruzados como sistema de administración de fármacos de moléculas activas conjugadas
Materiales y métodos
La cianina 5,5 amina (Cy5,5) se adquirió de Lumiprobe. El dimetilsulfóxido (DMSO), el hidróxido de sodio y el etanol absoluto (>99%) se obtuvieron de Scharlab. El agente de acoplamiento 4-(4,6-Dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMMCl) se sintetizó siguiendo los procedimientos convencionales conocidos por el experto en la materia. Los vivaspin, con un MWCO de 100 KDa, se compró a Sartorius.
Reacción de conjugación
El polímero entrecruzado del Ejemplo 1b (401,33 g/mol por unidad de hialuronato de sodio; 100,00 mg; 0,2492 mmol) se añadió a un matraz de fondo redondo de 50 mL y se disolvió en agua purificada tipo I (18 mL) a TA con agitador magnético. Paralelamente, en un vial con agitador magnético se disolvió el agente de acoplamiento DMTMMCl (276,72 g/mol; 3,45 mg; 0,0125 mmol; 0,05 eq al hialuronato) en agua purificada tipo I (1,5 mL). La disolución de DMTMMCl se añadió a la disolución del polímero entrecruzado y el pH se ajustó a 7 con unos pocos microlitros de NaOH 1M. La activación del acoplamiento del ácido carboxílico a través del DMTMMCl se dejó que se produjera durante 20-30 minutos. Después, se añadió una disolución de Cy5.5 (753,88 g/mol; 1,88 mg; 0,0025 mmol; 0,01eq al hialuronato) previamente preparada en DMSO (0,5 mL) y agua purificada tipo I (0,5 mL) y se ajustó el pH a 8,5 con unos pocos pl de NaOH 1M. La disolución azul resultante de la reacción de conjugación del polímero entrecruzado con el Cy5.5 se dejó proceder durante 72 horas a TA.
Purificación de la conjugación
A continuación, se añadió la disolución de conjugación en un vivaspin MWCO de 100 KDa y se lavó con 200 mL de PB 5 mM a pH 7,5 para eliminar los subproductos orgánicos de la reacción (N-metilmorfolina (NMM), DMTMMCl y 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) y el DMSO. La solución resultante se lavó de nuevo con 50 mL de agua purificada tipo I para eliminar las sales de PB. A continuación, la solución obtenida se liofilizó y el polvo azul resultante se lavó cinco veces con 45 mL por cada uno de etanol absoluto y se eliminó al vacío. Finalmente, se obtuvo un polvo azul seco.
Cuantificación de Cy5.5 por UV-Vis
Se preparó una disolución madre de Cy5.5 a 2,5 mg/mL en DMSO. Una segunda disolución madre de Cy5.5 en agua purificada tipo I se obtuvo a 0,025 mg/mL a través de la disolución madre de DMSO. La curva de calibración se preparó utilizando Cy5.5 como estándar a concentraciones crecientes (0,05 a 0,25 pg/mL de Cy5.5) midiendo la absorbancia a A=676 nm. Se prepararon disoluciones del polímero entrecruzado del ejemplo 1b conjugado con Cy5.5 aproximadamente a 0,10 pg/mL de Cy5.5 en agua purificada tipo II. Se midió la absorbancia a A=676 nm y se determinó que la carga de Cy5,5 en el polímero entrecruzado era del 1,1 % en peso.
La FIG. 11, muestra la caracterización del conjugado del polímero entrecruzado del Ejemplo 1b con Cy5.5 por 1H RMN y UV-Vis. Los espectros de 1H RMN mostraron las señales típicas del polímero entrecruzado del Ejemplo 1b, y la baja carga de Cy5.5. dificulta la evaluación adecuada de las señales de 1H RMN relacionadas con Cy5.5. Sin embargo, el análisis de UV mostró la presencia de absorbancia característica de Cy5.5 dentro de los conjugados de polímero entrecruzado-Cy5.5. Más importante aún, la FIG. 12 mostraba los cromatogramas de exclusión por tamaño de los conjugados de polímero cruzado-Cy5.5 con detectores RI y UV (676 nm) que mostraban la presencia homogénea de Cy5.5 a lo largo de la población de polímero entrecruzado y, por tanto, confirmaban la identidad y la pureza del conjugado.
La Tabla 9 muestra el MW determinado por cromatografía de exclusión de tamaño para la HA 50KDa comercial, el polímero entrecruzado del Ejemplo 1b y el conjugado polímero entrecruzado-Cy5.5. Los resultados mostraron que la conjugación del polímero entrecruzado con Cy5.5 aumenta ligeramente el MW del polímero entrecruzado correspondiente.
Tabla 9
Figure imgf000029_0001
Siguiendo los métodos experimentales descritos en el Ejemplo 7.1, se evaluó el conjugado polímero entrecruzado-Cy5.5 para la administración tópica en la piel mediante los experimentos de permeación descritos anteriormente, utilizando una concentración de 10 mg/ml de conjugado en agua milliQ.
Visualización de la piel mediante microscopía confocal de barrido láser
La piel se fijó en formalina al 10% durante 24 horas, seguido de un 30% de sacarosa en tampón fosfato. A continuación, la piel se criopreservó en hielo seco y se cortó con un microtomo en rodajas de 10 micras de grosor. Los trozos de piel se congelaron a -20°C. Se cortaron trozos de 0,2cm*0,5cm de la zona tratada y se incrustaron en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Se utilizó un criostato (Leica Cryostat CM 3050S, Wetzlar, Alemania) para preparar las secciones transversales verticales de la piel. Se obtuvieron de nueve a doce secciones verticales de cada muestra con un grosor de 20 |jm y se almacenaron a 4°C hasta su análisis microscópico. Los cortes se colocaron en portaobjetos de vidrio, se fijaron con formalina y se tiñeron con 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). A continuación, se examinaron con un microscopio confocal de barrido láser. El conjugado polímero entrecruzado-Cy5.5 se excitó a Aex=676 nm y se detectó a Aem= 694 nm y las señales de emisión fluorescente se representaron con un color rojo. Los núcleos celulares teñidos con DAPI se excitaron con la línea de 405 nm del diodo azul. Se descubrió que los conjugados de polímero entrecruzado-Cy5.5 se acumulaban preferentemente en el estrato córneo con una clara permeabilidad en la capa de la epidermis, como se muestra en la FIG. 13, lo que sugiere que se generó inesperadamente un depósito de polímero entrecruzado en la capa del estrato córneo que proporciona una liberación sostenida de los polímeros entrecruzados de la presente invención en la capa epidérmica.
EJEMPLO 8. Polímeros entrecruzados como componente del medio de cultivo celular para mejorar la viabilidad celular.
Estudio de viabilidad celular
Para realizar los estudios de viabilidad celular in vitro, se utilizaron fibroblastos. Los medios de cultivo utilizados fueron el Medio de Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido en glucosa, complementado con un 2% de penicilina/estreptomicina y 50 mL de suero fetal bovino (FBS) en una incubadora humidificada al 5% de CO2 y a 37°C.
Procedimiento
Se sembraron 50 pL de células en placas de 96 pocillos a una concentración de 2.000 células/pocillo. Tras 24 horas, se añadieron 50 pL de cada tratamiento hasta alcanzar un volumen final de 100 pL en el pozo. Todos los tratamientos se filtraron antes de añadirlos al pozo (tamaño de poro 0,45 pm). Las células se incubaron con las muestras o los controles durante 72 horas y luego se realizó el ensayo MTS. Para ello, se añadieron 20 pL de la disolución de Metosulfato de Fenazina mínima al 90% (PMS, Sigma, España) y de la sal de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetilfenil)-2-(4-sulfofenil)-2H tetrazolio), (MTS, Promega, España), con una dilución 1:20 respectivamente. Tras 3 horas de incubación, se leyó la absorbancia a 490 nm mediante el lector de placas Victor2Wallac™. Las concentraciones ensayadas estaban en un rango de 5 a 0,02 mg/ml para el polímero entrecruzado obtenido en el Ejemplo 1a.
REFERENCIAS
1. LAVILLA C, BYRNE M and HEISE A. Block-sequence-specific polypeptides from or-amino acid A/-carboxyanhydrides: synthesis and influence on polypeptide properties. Macromolecules 2016, Vol. 49(8), páginas 2941-2947.
2. ROBIN, Y. or-Amino acid N-carboxyanhydrides in pharmaceutical innovations. Chimica Oggi - Chemistry Today 2015, Vol. 33(4), páginas 26-31.
3. DENG C. et al. Functional polypeptide and hybrid materials: Precision synthesis via or-amino acid N-carboxyanhydride polymerization and emerging biomedical applications. Progress in Polymer Science 2014, Vol. 39, páginas 330-364.
4. LU H. et al. Recent advances in amino acid N-carboxyanhydrides and synthetic polypeptides: chemistry, selfassembly and biological applications. Chem. Comm. 2014, Vol. 50, páginas 139-155.
5. BARZ, M et al. A versatile post-polymerization modification method for polyglutamic acid: synthesis of orthogonal reactive polyglutamates and their use in “click chemistry”. Polym. Chem. 2013, Vol. 4(10), páginas 2989-2994.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polímero entrecruzado que comprende una unidad recurrente de la fórmula (I) siguiente:
Figure imgf000031_0001
o su sal, solvato o isómero, en el que:
El PLS es un radical de un polisacárido;
PLS-RU es un radical de una unidad de repetición del polisacárido;
El PAA es un radical de un poliaminoácido, en el que el poliaminoácido se selecciona del grupo formado por un homo-, un aleatorio y un copoliaminoácido en bloque, con la condición de que el homo-poliaminoácido no sea policatiónico; AA es un radical de una unidad de aminoácido del poliaminoácido;
El subíndice x del radical (AA) es un número entero que va de 1 a 200;
El subíndice v del radical [(PAA)-(AA)x ] es un número entero que va de 1 a 48;
El subíndice w del radical (PLS-RU) es un número entero que va de 1 a 200;
In es un iniciador ROP que comprende un grupo X terminal por cada radical [(PAA)-(AA)], en el que cada grupo X terminal está directamente unido a cada radical [(PAA)-(AA)], y en el que el grupo X terminal se selecciona del grupo que consiste en -NH-, -O-, -S-, o combinaciones de los mismos;
CL es un radical seleccionado del grupo que consiste en: (C1-C500)-alquilo, en el que dos o más H están sustituidos por: (1) (C-i-C500)-alquilo; (2) (C3-C30)-cicloalquilo, (3) C-radical derivado de un sistema de anillos con 1-6 anillos, siendo cada anillo independientemente saturado, parcialmente insaturado o aromático, estando los anillos del sistema de anillos aislados o fusionados y teniendo cada anillo 3-20 elementos, cada elemento independientemente seleccionado del grupo que consiste en C, CH, CH2 , CO, O, S, N y NH, (4) OH, (5) NRa Rb , (6) ONRc Rd , (7) CN, (8) haluro, (9) SH2 , (10) SRe Rf , (11) N(H)NH2, (12) RgCORh, (13) COORi, (14) CON(Rj )(Rk) (15) RlN(Rm )CON(Rn)(R'n), (16) (C1-C30)-alqueno, (17) (C-i^^-a lqu ino , (18) N3 , (19) RoCH(ORp)(ORq), (20) RrCH(SRs )(SRt), (21) RuB(ORv )(ORw ), (22) CORx ; y en el que ninguno, uno o más C, están sustituidos independientemente por (C3-C30)-cicloalquilo, arilo, aril-(C1-C30)-alquilo, NRy Rz , CO, O, S, S(O), S(O2), B, P y (O-CH2-CH2 M ;
el subíndice A del radical (O-CH2-CH2) es un número entero entre 1 y 500;
Ra , Rb , Rc , Rd , Re , Rf , Rh , Ri, Rj , Rk, Rm , Rn, R'n , Rp , Rq , Rs , Rt , Rv , Rw , Rx , Ry y Rz son radicales seleccionados independientemente del grupo formado por H, (C-i -C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenil-(C1-C3 ü)-alquilo y (C3-C8 )-cicloalquilo; en los que, en cualquiera de ellos, excepto el H, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, S(O), S(O2 ), haluro, N, NH, P y CO;
Rg , Ri, Ro , Rr y Ru son radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en (C-i-C30)-alquilo, (C1-C30)-alquilfenilo, fenil-(C1-C30)-alquilo, y (C3-C8)-cicloalquilo; donde, uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, S(O), S(O2), haluro, N, NH, P, y CO; con la condición de que: (1) CL puede estar presente o no, de modo que si CL no está presente, el radical PLS-RU y el radical AA forman un enlace estable directo.
2. El polímero entrecruzado según la reivindicación 1, en el que el CL no está presente.
3. El polímero entrecruzado según la reivindicación 1, en el que está presente el CL.
4. El polímero entrecruzado según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en el que
PAA es un radical de fórmula (II)
Figure imgf000031_0002
AA es un radical de fórmula (III)
Figure imgf000032_0001
donde
m, n, o, p y q son números enteros seleccionados independientemente entre 0 y 500, y en los que m+n+o+p+q > 1; de R1 a R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000032_0002
cada X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, N, NH2 , y Z;
cada X3 y X4 se selecciona de forma independiente del grupo formado por H y Z;
cada y e y' es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 3, donde y+y' = 2 o 3;
cada y'' e y''' es un número entero seleccionado independientemente entre 0 y 2, donde y"+y'" = 1 o 2 ;
Z se selecciona del grupo formado por H, contraión metálico y contraión inorgánico; y
de R8 a R13 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y -C1-C4 alquilo;
con la condición de que: (1) cuando CL no está presente, el radical AA está unido mediante un enlace peptídico al radical PAA a través de la amina terminal del radical PAA; y (2) cuando CL está presente, el radical AA está unido al CL a través de la amina terminal del radical AA.
5. El polímero entrecruzado según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en el que
PAA es un radical de fórmula IV
Figure imgf000033_0001
(IV)
AA es un radical de fórmula (V)
Figure imgf000033_0002
e n e l q u e ,
m , n , o , p y q s o n n ú m e r o s e n t e r o s s e l e c c i o n a d o s i n d e p e n d i e n t e m e n t e e n t r e 0 y 500 , y e n l o s q u e m n o p q > 1 ; d e R 1 a R 5 s e s e l e c c i o n a n i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n :
Figure imgf000034_0001
5
c a d a X i y X 2 s e s e l e c c i o n a i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n H , N , N H 2 , y Z ;
c a d a X 3 y X 4 s e s e l e c c i o n a d e f o r m a i n d e p e n d i e n t e d e l g r u p o f o r m a d o p o r H y Z ;
c a d a s u b í n d i c e y e y ' d e R 1 a R 5 e s u n n ú m e r o e n t e r o s e l e c c i o n a d o i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e 0 a 3 , d o n d e y y ' = 2 o 3 ; c a d a s u b í n d i c e y ' ' e y " ' d e R 1 a R 5 e s u n n ú m e r o e n t e r o s e l e c c i o n a d o i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e 0 a 2 , d o n d e y " y m = 1 10 o 2 ;
c a d a s u b í n d i c e y d e R ' 6 e s 1 o 2 ;
e l s u b í n d i c e y ' d e R ' 6 e s 0 o 1 ;
c a d a Z s e s e l e c c i o n a i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n H , c o n t r a i ó n m e t á l i c o y c o n t r a i ó n i n o r g á n i c o ; R 7 e s u n r a d i c a l s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n : ( C 1 - C 500 ) - a l q u i l o , e n e l q u e u n o o m á s H e s t á n s u s t i t u i d o s 15 p o r : ( 1 ) ( C 1 - C 500 ) - a l q u i l o ; ( 2 ) ( C 3 - C 30 ) - c i c l o a l q u i l o , ( 3 ) C - r a d i c a l d e r i v a d o d e u n s i s t e m a d e a n i l l o s c o n 1 - 6 a n i l l o s , s i e n d o c a d a a n i l l o i n d e p e n d i e n t e m e n t e s a t u r a d o , p a r c i a l m e n t e i n s a t u r a d o o a r o m á t i c o , e s t a n d o l o s a n i l l o s d e l s i s t e m a d e a n i l l o s a i s l a d o s o f u s i o n a d o s y t e n i e n d o c a d a a n i l l o 3 - 20 e l e m e n t o s , c a d a e l e m e n t o i n d e p e n d i e n t e m e n t e s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n C , C H , C H 2 , C O , O , S , N y N H , ( 4 ) O H , ( 5 ) N R a R b , ( 6 ) O N R c R d , ( 7 ) C N , ( 8 ) h a l u r o , ( 9 ) S H 2 , ( 10 ) S R e R f , ( 11 ) N ( H ) N H 2 , ( 12 ) R g C O R h , ( 13 ) C O O R i , ( 14 ) C O N ( R j ) ( R k ) ( 15 ) R l N ( R m ) C O N ( R n ) ( R ' n ) , ( 16 ) ( C 1 - C 30 ) -a l q u e n o , ( 17 ) ( C r C 30 ) - a l q u i n o , ( 18 ) N 3 , ( 19 ) R o C H ( O R p ) ( O R q ), ( 20 ) R r C H ( S R s ) ( S R t ) , ( 21 ) R u B ( O R v ) ( O R w ) , ( 22 ) C O R x ; y e n e l q u e n i n g u n o , u n o o m á s C , e s t á n s u s t i t u i d o s i n d e p e n d i e n t e m e n t e p o r ( C 3 - C 30 ) - c i c l o a l q u i l o , a r i l o , a r i l -( C 1 - C 30 ) -a l q u i l o , N R y R z , C O , O , S , S ( O ) , S ( O 2 ) , B , P y ( O - C H 2 - C H 2 K
E l s u b í n d i c e A d e l r a d i c a l ( O - C H 2 - C H 2 ) e s u n n ú m e r o e n t e r o e n t r e 1 y 500 ;
R a , R b , R c , R d , R e , R f , R h , R i , R j , R k , R m , R n , R ' n , R p , R q , R s , R t , R v , R w , R x , R y y R z s o n r a d i c a l e s s e l e c c i o n a d o s i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e l g r u p o f o r m a d o p o r H , ( C 1 - C 30 ) - a l q u i l o , ( C 1 - C 30 ) - a l q u i l f e n i l o , f e n i l o , ( C 1 - C 30 ) - a l q u i l o y ( C 3 - C 8 ) -c i c l o a l q u i l o ; e n l o s q u e e n c u a l q u i e r a d e e l l o s , e x c e p t o e l H , u n o o m á s c a r b o n o s e s t á n o p c i o n a l m e n t e s u s t i t u i d o s p o r u n h e t e r o á t o m o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o f o r m a d o p o r O , S , S ( O ) , S ( O 2 ) , h a l u r o , N , N H , P y C O ;
R g , R i, R o , R r y R u s o n r a d i c a l e s s e l e c c i o n a d o s i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n ( C -1- C 30 ) - a l q u i l o , ( C 1 -C 30 ) - a l q u i l f e n i l o , f e n i l o , ( C 1 - C 30 ) - a l q u i l o y ( C 3 - C 8 ) - c i c l o a l q u i l o ; e n e l q u e u n o o m á s c a r b o n o s e s t á n o p c i o n a l m e n t e s u s t i t u i d o s p o r u n h e t e r o á t o m o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n O , S , S ( O ) , S ( O 2 ) , h a l u r o , N , N H , P y C O ; y R 8 t o R 13 s e s e l e c c i o n a n d e f o r m a i n d e p e n d i e n t e d e l g r u p o f o r m a d o p o r H y ( C 1 - C 4 ) - a l q u i l o ;
c o n l a c o n d i c i ó n d e q u e : ( 1 ) c u a n d o n o e s t á p r e s e n t e C L , e l r a d i c a l A A e s t á u n i d o m e d i a n t e u n e n l a c e p e p t í d i c o a l r a d i c a l P A A a t r a v é s d e l a a m i n a t e r m i n a l d e l r a d i c a l P A A ; y ( 2 ) c u a n d o e s t á p r e s e n t e C L , e l r a d i c a l A A e s t á u n i d o a C L a t r a v é s d e R V
6 . E l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 4 , e n e l q u e R - i = R 2 = R 3 = R 4 = R 5 = R 6.
7 . E l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 5 , e n e l q u e R - i = R 2 = R 3 = R 4 = R 5 y R '6 e s e l c o r r e s p o n d i e n t e r a d i c a l d o b l e d e d i c h o R - i = R 2 = R 3 = R 4 = R 5
8 . E l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 4 , e n e l q u e e l p o l i a m i n o á c i d o e s u n c o p o l i a m i n o á c i d o a l e a t o r i o o e n b l o q u e .
9 . E l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 8 , e n e l q u e R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 y R 6 s e s e l e c c i o n a n i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n :
Figure imgf000035_0001
Z , X 1 a X 4 , y , y ' , y ' ' e y ' ' ' s o n l o s d e f i n i d o s e n l a r e i v i n d i c a c i ó n 5 .
10 . E l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 5 , e n e l q u e e l p o l i a m i n o á c i d o e s u n c o p o l i a m i n o á c i d o a l e a t o r i o o e n b l o q u e .
11 . E l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 10 , e n e l q u e d e R i a R 5 s e s e l e c c i o n a n i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n :
Figure imgf000036_0001
y Z , d e X 1 a X 4 , y , y ' , y ' ' e y ' ' ' s o n l o s d e f i n i d o s e n l a r e i v i n d i c a c i ó n 6.
12 . E l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 2 , e n e l q u e e l p o l i s a c á r i d o e s á c i d o h i a l u r ó n i c o , e l P A A e s p o l i g l u t a m a t o , e l A A e s g l u t a m a t o , v e s u n n ú m e r o e n t e r o e n t r e 2 y 4 y x w e s u n n ú m e r o e n t e r o e n t r e 2 y 200 .
13 . E l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 3 , e n e l q u e e l p o l i s a c á r i d o e s á c i d o h i a l u r ó n i c o , e l P A A e s p o l i g l u t a m a t o , e l A A e s g l u t a m a t o , v = 1 , x w e s u n n ú m e r o e n t e r o e n t r e 2 y 200 y C L e s - N H - C H ( C O O H ) - ( C 1 - C 4 ) - a l q u i l -N H - .
14 . U n c o n j u g a d o q u e c o m p r e n d e e l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o d e f i n i d o e n c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s d e 1 a 13 y a l m e n o s u n a g e n t e a c t i v o q u e s e u n e a l p o l í m e r o e n t r e c r u z a d o .
15 . E l c o n j u g a d o s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 14 , e n e l q u e a l m e n o s e l a g e n t e a c t i v o s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n u n a g e n t e f a r m a c é u t i c o a c t i v o , u n a g e n t e d e i m a g e n , c o m b i n a c i o n e s d e l o s m i s m o s y u n a g e n t e c o s m é t i c o .
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