KR20180135013A - 히알루론산 콘쥬게이트 및 이들의 용도 - Google Patents

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KR20180135013A
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피에르 모덴스
에릭 알르만
올리비에 조단
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유니베르시떼 드 제네브
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Abstract

본 발명은 히알루론산 폴리머 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머의 새로운 그래프트 폴리머, 이의 제조, 조성물 및 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 활성 약제로서 및 적어도 하나의 생활성제를 위한 송달 시스템으로서 유용한 나노입자를 자발적으로 형성할 수 있는 pH 및/또는 열-민감성 조성물에 관한 것이다.

Description

히알루론산 콘쥬게이트 및 이들의 용도
본 발명은 히알루론산 폴리머 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머의 그래프트 폴리머, 이들의 제조, 조성물 및 용도에 관한 것이다
생물의학 분야에서 히드로겔은 최근 몇 년 동안 광범위하게 개발되어 왔다. 이들은 이들의 높은 함수량(water content), 조직-유사 탄성(tissue-like elasticity) 및 보다 우수한 생체적합성으로 인하여 높은 관심을 받는 중요한 물질이 되고 있다.
히드로겔은 친수성 호모폴리머 또는 코폴리머 네트워크로 구성되며, 물 또는 생리학적 유체 내에서 팽창할 수 있다. 히알루론산 (HA)는, 또한 히알루로난, 또는 이의 염인 소듐 히알루로네이트로 불리며, 천연의 선형 헤테로폴리사카라이드 폴리머로서 전형적으로 척추 동물의 결합 조직(connective tissue) 및 상피 조직(epithelial tissue)에서 발견되며, 105-107 달톤의 분자량을 갖는다. HA는β-1, 3-N-아세틸 글루코사민 및 β-1, 4-글루쿠론산의 반복되는 디사카라이드 단위들로 구성되며, 우수한 점탄성 성질, 높은 수분 보유력, 및 높은 생체적합성을 갖는다 (Lavertu et al., 2008, Biomacromolecules, 9, 640-65). 흔히, HA는 수탉 벼슬로부터 추출되었고, 최근 미세조류 또는 미세조류 또는 세균 발효를 통해 근본적으로 제조된다 (Liu et al., 2011, Microb. Cell Fact., 10, 99). HA는 의약, 화장료 및 기능성 식품의 광범위한 분야에 적당하다 (Fraser et al., 1997, J. Intern. Med., 242, 27-33; Robert, 2015, Pathol Biol, 63, 32-34). 특히, 연골의 윤활 및 향상성에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 천연 HA는 낮은 보유력 및 히알루로니다제 효과로 인한 분해 때문에 인체 내에서 장기간 지속하지 않고 이식 부위로부터 떨어진다(Brown et al., 1991, Exp. Physiol., 76, 125-134). 그러므로, 효과적인 응용을 위하여 HA의 화학적 변형, 특히 가교 변형이 고려되어 왔다(Schante et al., 2011, Carbohydrate 폴리머s, 85, 469-489).
pH 또는 열-민감성 폴리머들이 또한 합성, 제형화되었고 히드로겔 매트릭스를 형성하였다(Na, 2008, Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 5, 482-487; Coronado et al., 2011, Polymer Bulletin, 67, 101-124 및 Lee et al., 2010, Soft Matter, 6, 977-983). 그러나, 이들 pH 또는 열-민감성 폴리머는, 이들의 물리화학적 성질로 인하여, 단지 겔 매트릭스를 형성할뿐이고 효율적인　쿠션 효과를 제공하지 않는다. 게다가, 이들의 인비보 잔류 시간은 빠른 효소적 HA 분해에 의해 여전히 제한된다.
폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (문헌에서는 다음과 같이 다양한 약어로 표기된다: pNiPAM, PNIPA, PNIPAAm, NIPA, PNIPAA 또는 PNIPAm, 또한 IUPAC에 따라 폴리[1-(이소프로필카르바모일)에틸렌]로 명명되고, 또한 N-(1-메틸에틸)-2-프로펜아미드 호모폴리머로 명명됨)는 HA를 변형하여 pH 또는 열-민감성을 부여하기 위하여 사전에 사용된 높은 pH 또는 열-반응적 폴리머이다 (Schild, 1992, Progress in polymer Science, 17, 163-249). pNiPAM는 소수성 도메인 및 제자리 형성(in situ forming) 히드로겔의 연계를 통해 물리적 가교를 도입하기 위한 우수한 생체적합성을 갖는 후보자를 대표한다(Tan et al., 2009, Biomaterials, 30, 6844-6853; Cooperstein et al., 2013, Biointerphases, 8, 19). 약 32℃의 하한 임계 용액 온도(LCST) 이하의 열-민감성의 경우에, pNiPAM의 소수성 N-치환된 기들은 물 분자에 의해 수화되어 균질 용액을 형성한다. LCST 이상에서는, N-치환된 기들 사이의 소수성 상호작용이 증가하여 물 수화 에너지를 뛰어넘어 소수성 폴리머 사슬들의 응집과 히드로겔 형성을 유도한다 (Guan et al., 2011, Expert Opinion on Drug Delivery, 8, 991-1007). pNiPAM 모노머가 생분해성이 아니지만, 낮은 분자량의 순수한 pNiPAM 사슬은 신장 클리어런스(renal clearance)에 의해 제거되는 것이 밝혀졌다(He et al., 2008, Journal of Controlled Release, 127, 189-207). 열-가역적 히알루론산-폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (HA-pNiPAM) 히드로겔은 조직 공학, 약물 송달 시스템 등과 같은 여러 영역에서 응용하기 위하여 이미 제형화되었고 순수한 pNiPAM과 유사하게 체온에 히드로겔 매트릭스를 형성한다(Ohya et al., 2001, Biomacromolecules, 2, 856-863). 특히, 열-가역적 히알루로난-폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (HA-pNiPAM)히드로겔은 가역적 부가-단편 사슬 이동 중합(reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization, RAFT) 및 "클릭(click)" 화학을 통해, 알킨기로 HA의 기능화 및 사슬 전이제(CTA) 및 구리-함유 촉매의 존재하에서 아지도-말단 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (N3-PNIPAM)와 상기 형성된 HA 프로파길 아미드의 반응을 통해 합성되었다(WO 2010/099818; Mortisen et al., 2010, Biomacromolecules, 11, 1261-1272). 이들의 분해 생성물은 35x103g·mol-1의 hTERT-BJ1 섬유아세포에 세포적합적인 것으로 밝혀졌다 (Mortisen et al., 2010, supra). 이들 HA-pNiPAM 겔 매트릭스의 단점은 이들이 장기간 윤활 또는 쿠션 효과를 제공하지 않고 또한 잔류 구리를 포함할 수 있다는 사실에 있다.
그러므로, 잘 용인하고 합성이 용이하면서도, 적당한 생체역학적 성질을 갖는 주입 부위의 신체 내 오랜 잔류 시간을 제공할 수 있는 HA-유래 폴리머를 발견할 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 온도 및/또는 pH의 변화로 자발적으로 나노입자를 형성할 수 있는 그래프트 폴리머인 HA 그래프트 폴리머(HA-N-이소프로필아크릴아미드계 콘쥬게이트)의 예상하지 못한 발견과 관련이 있다. 이들 새로운 HA 그래프트 폴리머는, 온도의 변화(LCST 이상) 및/또는 pH의 변화로 나노입자들을 형성하는 능력을 그래프트 폴리머에 부여하는, N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머를 HA위에 그래프트하는데 사용되는 링커 분자를 포함하며, 이는 pH 및/또는 열-민감성 폴리머를 사용하기 전에는 결코 도달할 수 없는 커다란 증진을 대표한다. 본 발명은 조직 재생 분야에서 내과-외과적 및 화장품적 필요성을 채우고 있으며, 약물 송달 분야에서 새로운 용도/응용을 할 수 있게 한다. 이들 HA 그래프트 폴리머는, 잠재적 자동-윤활 나노-볼-베어링(potential self-lubricating nano-ball-bearing, SLNBB) 성질을 갖는 자발적 나노입자 형성으로 인하여 주사 부위의 신체에서 오랜 잔류시간을 갖는 주사가능하고, 안정하고, 생체적합하며 생분해성인 pH 및/또는 열-민감성 폴리머 그래프트 폴리머이며, 의학 또는 화장품 분야에서 새로운 윤활액보충요법(viscosupplementation)/윤활물질로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 양상은 본 발명에 따른 히알루론산 및 N-이소프로필아크릴아미드계 (HA 그래프트 폴리머)의 그래프트 폴리머를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 적어도 하나의 HA 그래프트 폴리머 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머를 포함하는 나노입자에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 적어도 하나의 HA 그래프트 폴리머를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 적어도 하나의 HA 그래프트 폴리머를 포함하는 히드로겔에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 적어도 하나의 HA 그래프트 폴리머 또는 이들의 조성물을 포함하는 연조직 필러에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따라 HA 그래프트 폴리머, 이들의 조성물, 이들의 히드로겔, 이들의 연조직 필러 또는 나노입자의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 인비보 약물 송달, 인비트로 세포 또는 생물학적 조직 배양 및 조직 공학 분야에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머에 관한 것이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머 또는 이들의 조성물을 포함하는 세포 또는 생물학적 조직 배양 배지를 제공한다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물을 포함하는 복원 조직(reconstruction tissue)을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 의학적 질병, 및 특히 관절성 병리학(joint pathologies), 관절 질환(articular diseases), 눈 병리학(eye pathologies), 피부 괴사(skin defect) 또는 피부 상처, 비뇨기과 조직 벌킹, 임의 조직 변성(tissue degeneration)의 예방 또는 치료에서, 심미적 또는 치료적 이유로 또는 종양 또는 혈관 기형의 치료를 위하여 신체 일부 부피의 상승/변형 및/또는 증가에 사용되는 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 의학적 질병, 및 특히 관절성 병리학, 관절 질환, 눈 병리학, 피부 괴사 또는 피부 상처, 비뇨기과 조직 벌킹, 임의 조직 변성의 예방 또는 치료를 위하여, 심미적 또는 치료적 이유로 또는 종양 또는 혈관 기형의 치료를 위하여 신체 일부의 부피의 상승/변형 및/또는 증가를 위한 약제학적 제형을 제조하기 위한 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 세포 또는 생물학적 배양 배지 또는 복원 조직의 제조를 위한 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 대상의 관절성 병리학, 관절 질환, 눈 병리학, 피부 괴사 또는 피부 상처, 비뇨기과 조직 벌킹 및 임의 조직 변성, 종양 또는 혈관 기형으로부터 선택된 의학적 질병을 예방, 치료 또는 완화시키는 방법으로서, 치료가 필요한 대상에 효과적인 함량의 적어도 하나의 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머 또는 이의 약제학적 제형을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 적어도 하나의 본 발명의 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물을, 예를 들어 동결 건조 형태로 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 적어도 하나의 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물을 포함하는 예방 또는 치료를 위한 물질, 예를 들어 생활성제, 약품물질, 단백질 또는 항체의 캡슐화를 위한 나노입자들의 제조용 키트에 관한 것이다.
도 1은 출발 물질의 것과 비교된 본 발명 D-F의 그래프트 폴리머의 D2O에서의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다. A: 히알루론산(HA), B: HA-DBCO, C: pNiPAM 아지드 말단, D: HA-B1, E: HA-B2 및 F: HA-P2, 실시예 1에 설명되어 있음.
도 2는 실시예 2에 설명된 것처럼 측정된 본 발명의 그래프트 폴리머의 주사가능성을 나타낸다. A: 23G 바늘(거리 %)을 갖는 주사기에서 피스톤의 스트로크 거리의 함수로서 유체를 배출하는데 필요한 뉴톤(N)의 힘. 주사 프로파일의 특징을 위해 3개 힘이 평가되었다: Fi(초기 힘), Fp (안정기 힘, plateau force) 및 Ff (최종 힘). B: 20℃ 바늘-주사기 시스템에서 23G(B1) 및 29G(B2)에 의한 HA 그래프트 폴리머 주사 프로파일의 일반적 개요. 빈 주사기, Ostenil®, 및 PBS가 대조군으로 사용되었다. C: 37℃에서 29G 바늘에 의한 HA 그래프트 폴리머 주사 프로파일의 일반적 개요.
도 3는 HA-B1(A), HA-B2(B), HA-P2 (C) 및 HA-pNiPAM 그래프트 폴리머 (음성 대조군)(D)의 SEM 현미경 사진이다. 기준자 = 1μm 및 실시예 4에서 설명된 것처럼 측정된 나노입자 트래킹 분석법(Nanoparticle Tracking Analysis, E)에 의해 측정된 온도(40℃ 내지 25℃, 2min/step)의 함수로서 형성된 나노입자의 퍼센트.
도 4는 실시예 7에서 설명된 것처럼 37℃에서 생리 식염수, Ostenil®, HA-B2 및 HA-P2로부터 덱사메타손의 누적 인비트로 약물 방출 프로파일을 나타낸다. 28h 후, 폴리머 매트릭스는 가열(121℃)에 의해 가수분해되었고, 덱사메타손의 남은 함량을 측정하였다.
도 5는 실시예 5에서 설명된 것처럼 건강한 마우스 내 피하 주사(subcutaneous injection) 및 골관절염(osteoarthritis) 마우스 모델에 7일 동안 관절내 주사(intra-articular injection) 후 마우스 내 백색 광 이미지와 겹쳐진 HA-Cy5 및 HA-P2-Cy5 생체 내 형광(intravital fluorescence)의 증가된 잔류성/지속성의 예들을 나타낸다.
용어 "폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬"은 2 내지 약 5,000 에틸렌 글리콜 단위, 바람직하게는 2 내지 6 또는 2 내지 4 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 사슬을 의미한다.
용어 "히알루론산" (HA)는 D-글루쿠론산 및 D-N-아세틸글루코사민으로 구성된 선형 헤테로폴리사카라이드를 의미하며, 이는 β-1,4 및 β-1,3 글리코시드 결합들이 번갈아 가며 함께 연결되어 있다. 본 발명에 따른 적당한 HA 폴리머는 12,500 이하의 디사카라이드 반복으로 구성된 폴리사카라이드를 포함하며 기원에 따라 약 500 내지 5,000,000 Da, 특히 약 500 내지 3,000,000의 크기를 갖는다. 각 반복 단위는 D-글루쿠론산 모티프 위에 카르복실적 화학기를 가지며, 이는 잠재적으로 연결되어 본 발명에 따른 그래프트 폴리머를 형성할 수 있다. 특정 양상에 따라, 본 발명의 링커를 갖는 이들 카르복실기의 치환 정도는 약 0.5~50 %, 전형적으로 2 내지 약 10 %이다.
여기 사용된 용어 "가교 또는 치환의 정도"는 HA 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머 상에 초기에 존재하는 기능기 쌍들의 총 수량에 대한 가교 또는 그래프트 결합으로 전환되는 기능기 쌍들의 수량을 의미하며, 퍼센트로 표현된다.
본 발명에 따른 적당한 HA 폴리머는 다양한 기원으로부터 나올 수 있으며, 천연(일반적으로 동물), 반합성 또는 생체기술적(예를 들어, 비동물, 미생물 발효에 의한 생산)을 포함할 수 있다.
용어 "N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머"는 IUPAC N-프로판-2-일프로프-2-엔아미드 (CAS number 2210.25.5)로 명명된 모든 폴리머를 포함한다. 본 발명에 따른 적당한 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 폴리머는 약 500 내지 35,000 Da, 특히 2,000 내지 25,000 Da의 분자량을 갖는 폴리머를 포함한다.
용어 "콘쥬게이트된" 또는 "그래프트된"은 HA 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머 사이에 공유 결합을 형성하여 본 발명의 그래프트 폴리머 또는 콘쥬게이트를 유도하는 것을 나타내기 위하여 사용되며, 여기서 그러한 공유 결합은 본 발명에 따른 링커를 통해 일어난다.
용어 "클릭" 화학은, 다양한 화학 반응(e.g. 아지드-알킨 부가환화(시클로addition))을 의미하며, 이들은 이들의 높은 수율, 위치선택성(regioselectivity), 안정성 및 공격적 부산물의 생성없이 진행될 수 있는 능력으로 특징되며, 다음 문헌에 기술되어 있다: Kolb et al., 201, Chem. Int. Ed Engl., 40(11), 2004-2021. 중요하게, 이들 반응은 온화한 용매(benign solvent)에서 일어날 수 있으며, 물 및 산소에 민감하지 않으며, 높은 열역학적 추진성을 갖는다. 이들 반응의 가장 공통적인 예는 불포화된 종들의 부가환화의 결과로 형성된 탄소 헤테로원자 결합, 친핵성 치환 화학, 비-알돌(non-aldol) 카보닐 화학, 및 탄소-탄소 다중 결합에 대한 첨가들이다. 본 발명의 그래프트 폴리머는 클릭 화학에 의해 합성될 수 있으며, 합성 경로의 예들은 여기 제시되며, 표준 기술을 사용하여 당업자에 의해 약간 변형될 수 있다.
용어 "알킬"은 단독, 또는 다른 용어들하고 함께 사용될 때, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C20 알킬이며, 1~20 탄소 원자를 갖는 일가 알킬기를 의미한다. 이 용어는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, n-펜틸, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 2,2-디메틸프로필, n-헥실, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, n-헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, 테트라히드로게라닐, n-도데실, n-트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실, n-헥사데실, n-옥타데실, n-노나데실, 및 n-에이코사닐 및 이와 유사한 것과 같은 기들로 예시된다. 바람직하게는, 이들은 C1-C9 알킬, 보다 바람직하게는 C1-C6 알킬, 특히 바람직하게는 C1-C4 알킬을 포함하며, 이는, 유추에 의해, 각각 1 내지 9 탄소 원자를 갖는 1가 알킬기, 1 내지 6 탄소 원자를 갖는 1가 알킬기 및 1 내지 4 탄소 원자를 갖는 1가 알킬기를 의미한다. 특히, 이들은 C1-C6 알킬을 포함한다.
용어"C5-C10 시클로알킬"은, C6-C8 시클로알킬 (e.g., 시클로헥실, 시클로옥틸) 또는 다중 축합링 (e.g., 노르보르닐)과 같은 단일 링을 갖는 5 내지 10 탄소원자의 포화 또는 불포화된 카보시클릭기를 의미한다. C3-C8-시클로알킬은 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로프로필, 시클로부틸, 노르보르닐 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어"헤테로시클로알킬"은 상기 정의에 따른 C5-C10-시클로알킬기를 의미하며, x 이하의 탄소 원자까지는 O, S, NR로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로 원자로 교체되고, R은 수소 또는 메틸로 정의된다. 헤테로시클로알킬은 피롤리디닐, 피페리디닐, 피레라지닐, 모르폴리닐, 테트라히드로푸라닐, 아자시클로옥틸 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "C8 시클로알킬" 은 단일링 (e.g., 시클로옥틸) 또는 다중 축합링(e.g., 디벤조시클로옥티닐, 모노플루오화된 시클로옥틴, 디벤조시클로옥틴, 디플루오로시클로옥틴, 비아릴아자시클로옥티논, 시클로옥틴, 디벤조아자시클로옥틴, 논플루오로시클로옥틴, 아릴-레스 시클로옥틴(aryl-less cyclooctyne), 비시클로노닌 및 디메톡시아자시클로옥틴)을 갖는 8 탄소원자의 포화 또는 불포화된 카보시클릭기 또는 다음 문헌에 개시된 것들을 의미한다: Debets et al., 2011, Accounts for Chemical research, 44(9), 805-815.
용어 "C8 헤테로시클로알킬"는 상기 정의에 따른 C8 시클로알킬기를 의미하며, 3 이하 탄소원자까지 O, S, NR로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자에 의해 교체되며, R은 수소 또는 메틸로서 정의된다. C8 헤테로시클로알킬은 선택적으로 치환된 아자-디벤조시클로옥티닐 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "알콕시카보닐"은 -C(O)OR을 의미하며, 여기서 R은 "C1-C6 알킬", "아릴", "헤테로아릴", "아릴 C1-C6 알킬", "헤테로아릴 C1-C6 알킬" 또는 "헤테로알킬"을 포함한다.
용어 "알콕시카보닐 C1-C6 알킬" 은 알콕시카보닐 치환기를 갖는 C1-C6 알킬기를 의미하며, 2-(벤질옥시카보닐)에틸 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "아미노"는 -NRR'를 의미하며, 여기서 R 및 R'는 독립적으로 H , "C1-C6 알킬", "아릴", "헤테로아릴", "C1-C6 알킬 아릴", "C1-C6 알킬 헤테로아릴," "시클로알킬," 또는 "헤테로시클로알킬,"이고, 여기서 R 및 R'는, 이들에 부착된 질소 원자와 함께 선택적으로 3-8-원자 헤테로시클로알킬 링을 형성할 수 있다.
용어 "아미노 알킬"는 아미노 치환기를 갖는 알킬기를 의미하며, 2-(1-피롤리디닐)에틸 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "아미노카보닐"는 -C(O)NRR'를 의미하며, 여기서 R 및 R'는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴, "아릴 C1-C6 알킬" 또는 "헤테로아릴 C1-C6 알킬" 을 의미하며, N-페닐 카보닐 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "아미노카보닐 C1-C6 알킬"는 아미노카보닐 치환기를 갖는 알킬기를 의미하며, 2-(디메틸아미노카보닐)에틸, N-에틸 아세트아미딜, N,N-디에틸-아세트아미딜 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "아실아미노"는 -NRC(O)R'을 의미하며, 여기서 R 및 R'는 독립적으로 H, "C1-C6 알킬", "C2-C6 알케닐", "C2-C6 알키닐," "C3-C8-시클로알킬", "헤테로시클로알킬", "아릴", "헤테로아릴", "아릴 C1-C6 알킬", "헤테로아릴 C1-C6 알킬," "아릴 C2-C6 알케닐", "헤테로아릴 C2-C6 알케닐", "아릴 C2-C6 알키닐", "헤테로아릴 C2-C6 알키닐", "시클로알킬 C1-C6 알킬" 또는 "헤테로시클로알킬 C1-C6 알킬"이며, 아세틸아미노 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "아실아미노 C1-C6 알킬"는, 아실아미노 치환기를 갖는 C1-C6 알킬기를 의미하며, 2-(프로피오닐아미노)에틸 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "아실"은 -C(O)R을 의미하며, 여기서 R은 H, "알킬", 바람직하게는 "C1-C6 알킬", "아릴", "헤테로아릴", "C3-C8-시클로알킬", "헤테로시클로알킬", "아릴 C1-C6 알킬", "헤테로아릴 C1-C6 알킬", "C3-C8-시클로알킬 C1-C6 알킬" 또는 "헤테로시클로알킬 C1-C6 알킬"을 포함하며, 아세틸 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "아실 C1-C6 알킬"은 아실 치환기를 갖는 C1-C6 알킬기을 의미하며, 2-아세틸에틸 및 이와 유사한 것을 포함한다.
각 치환기의 정의로 제한하지 않는한, 상기 용어 "치환된"은, "C1-C6 알킬", "C2-C6 알케닐", "C2-C6 알키닐", "C3-C8-시클로알킬", "헤테로시클로알킬", "C1-C6 알킬 아릴", "C1-C6 알킬 헤테로아릴", "아릴 C1-C6 알킬", "헤테로아릴 C1-C6 알킬", "C1-C6 알킬 시클로알킬", "C1-C6 알킬 헤테로시클로알킬", "아미노", "아미노술포닐", "암모늄", "아실 아미노", "아미노 카보닐", "아릴", "헤테로아릴", "술피닐", "술포닐", "알콕시", "알콕시 카보닐", "카바메이트", "술파닐", "할로겐", 트리할로메틸, 시아노, 히드록시, 메르캅토, 니트로, 및 이와 유사한 것으로부터 선택된 1 내지 5 치환기로 치환된 기를 의미한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 생물학적이지 않거나 또는 달리 바람직하지 못한 것은 아니고, 특히 독성이 없는 물질로 구성된 담체를 의미한다.
용어 "이상(biphasic) 히드로겔"은 하한 임계 용액 온도 (LCST) 이상의 상태를 설명하기 위하여 여기 사용되며, 낮은 점도의 겔 유사 연속상 내의 응축된 겔 나노입자의 현탁액으로 특징된다.
용어 "단상(monophasic) 히드로겔" 및 "단상 그래프트 폴리머 용액"은 LCST 이하의 유동가능한 단상 상태를 설명하기 위한 것으로 상호 교체가능하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 양상에 따라, 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머는 약 25℃ 내지 약 32℃인 LCST에서, 예를 들어 신체 온도에서 단상 히드로겔 및 이상 히드로겔 사이를 전이한다.
용어 "담체" 는 활성제외 약제학적 제형 내에 존재하는 임의 성분을 의미하므로, 희석제, 바인더, 윤활제, 붕괴제, 필러, 착색제, 습윤제 또는 에멀화제, pH 완충제, 방부제 및 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 "생활성제"는 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물 내로 통합되는 생물학적 활성을 갖는 임의 약제를 설명하기 위하여 사용된다. 이는 천연, 합성, 반합성 또는 이들의 유도체일 수 있으며, 소수성, 친수성, 용해성 및 불용성 화합물을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 포유류, 예를 들어 동물 및 인간, 특히 인간에 알려진 임의 치료 분야의 상태를 치료 및/또는 예방 및/또는 진단에 유용한 생활성제일 수 있으며, 상기 치료 분야는, 이에 한정되지는 않지만, 염증성 질환 (관절염, 골관절염, 및 류마티스 관절염을 포함), 눈 병리학, 종양 및 감염을 포함한다. 상기 생활성제는 거대분자 화합물 또는 소분자 화합물, 예를 들어 펩티드, 단백질, 올리고- 및 폴리-뉴클레오티드, 항생제, 항균제, 성장 인자, 효소, 항종양성(anti-tumor) 약물, 항염증성 약물, 항바이러스성 약물, 항세균, 항진균성 약물, 마취제, 항-네오플라스틱성 약물, 진통제, 항응혈제(anticoagulant), 지혈성 약물 및 항체로부터 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 적어도 하나의 생활성제는 코르티코스테로이드 및 p38 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 억제제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
용어 "피부 질병" 또는 "피부 질환"은 피부 손상을 포함하며, 여기서 상기 피부 표면은 이의 표면에 필연적인 절개없이 아픈 함몰부를 나타내며, 예를 들어 노화-관련 조직 손상(예를 들어 주름), 상처 및 흉터, 예를 들어 여드름 또는 루벨라 흉터를 포함한다. 이들 질병은 상처, 흉터, 건선(psoriasis), 여드름, 습진 및 주사(rosacea)를 더 포함한다. 용어 "상처"는, 손상된 조직, 예를 들어 트라우마 또는 수술에 뒤따르는 임의 손상된 조직을 포함한다. 포유류에서 상처는 예를 들어, 찰과상(abrasions), 열상(laceration), 타박상, 뇌진탕, 자창, 피부 절단, 외과적 창상, 총상, 열적 상처(thermal wound), 화학적 상처, 물리고 쏘인 상처 및 전기적 상처를 포함한다. 이것은 만성 피부 질환, 예를 들어 궤양을 더 포함한다.
용어 "눈 병리학 또는 질병"은 눈 및 특히 각막에 영향을 미치는 상처들이다. 그러한 질병은 각막 찰과상, 각막 스크래치, 각막 알칼리 화상, 노화-관련 황반 변성, 돌출 눈(bulging eye), 백내장, 거대세포바이러스망막염(cytomegalovirus retinitis), 색각이상(color blindness), 사시, 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema), 비문증(eye floater) 및 속눈썹, 녹내장, 원추각막, 약시(lazy eye), 저시력, 고안압증(ocular hypertension), 망막박리(retinal detachment), 눈꺼풀 떨림, 포도막염, 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca, KCS) 및 안구 건조증을 포함한다.
용어 "관절성 병리학"은 골관절염, 관절염 통증, 류마티스 관절염, 감염 및 염증성 통증, 연골, 뼈, 인대 또는 혈액포(synovial capsule) 손상을 일으키는 트라우머적 무릎 사건을 포함한다.
용어 "복원 조직"는, 신체의 손상된 조직, 예를 들어 상피, 신경병학, 연골 또는 뼈 조직의 손상된 조직을 회복시키기 위하여 유용한 생물학적 조직(내생적 또는 외생적) 또는 합성 또는 반합성 물질을 의미한다.
여기 사용된, "치료" 및 "치료하는" 및 이와 유사한 것은 일반적으로 원하는 약물학적 및/또는 물리적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는, 질환, 증후군 또는 이들의 상태를 예방 또는 부분적으로 예방의 측면에서 예방적이고 및/또는 질환, 상태, 증후 또는 질환에 기여하는 역 효과의 부분적 또는 완전한 치료의 측면에서 치료적일 수 있다. 여기 사용된 용어 " 치료"는 포유류, 특히 인간의 질환을 치료하는 것을 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 질환을 갖는 것으로 아직 진단되지는 않았지만 질환 성향이 있는 것으로 예진된 대상에서 발생하는 질환을 예방;(b) 질환의 억제, 즉 발달을 잡거나; 또는 질환을 완화, 즉 질환 및/또는 이의 증후 또는 상태의 퇴보를 야기, 예를 들어 손상의 개선 또는 치료.
여기 사용된 용어 "대상"은 포유류를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 포유류는 인간, 영장류, 및 가축, 예를 들어 소, 양, 돼지, 말 및 특히 경주마, 실험실 쥐 및 이와 유사한 것들을 포함한다.
본 발명에 따른 치료의 용어 "효능"은 본 발명에 따른 사용에 반응하는 질환 과정에서의 변화를 기초로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 치료의 효능은 관절 통증의 감소, 관절의 윤활성 개선, 대상의 이동성 개선, 눈 표면의 개선 또는 감소된 안압에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 그래프트 폴리머
일 실시예에 따라, 히알루론산 폴리머 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머의 그래프트 폴리머, 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염이 제공되며, 여기서 히알루론산 폴리머 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머는 화학식 (II)의 적어도 하나의 링커를 통해 콘쥬게이트된다:
Figure pct00001
여기서 Ra 및 Rb 중 하나는 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머에 공유적으로 연결되고, Ra 및 Rb 중 어느 하나는 히알루론산 폴리머에 공유적으로 연결되고, Ra 또는 Rb가 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머에 공유적으로 연결될 때, 이것은 R1 와 동등하고, Ra 또는 Rb가 히알루론산 폴리머에 공유적으로 연결될 때, 이것은 R3 과 등가이고, 여기서 R 1 은, -(CH2)x-NH-(CH2)y-S-, -(CH2)x-NH-O-C(O)-(CH2)y-S-, -(CH2)x-NH-(CH2)y-C(O)-NH-(CH2)z-S-, -(CH2)x-O-C(O)-CR7R8-, -C(O)-(CH2)x-C(O)-NH-(CH2)y-S 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬로부터 선택된 기이고 , 여기서 R 7 및 R 8 는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸이고; R 3 는 -E-G-L1-이고, 여기서 E는 없거나, 또는 -C(O)-NR9-, -C(O)-O- 및 -C(O)-로부터 선택되고, G는 선택적으로 치환된 C1-C20 알킬, 예를 들어 에틸, 선택적으로 치환된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬, 선택적으로 치환된 아실아미노 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 아실 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 아미노카보닐 C1-C6 알킬 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알콕시로부터 선택된 링커기이고, L 1 는 -NR10C(O)-, -C(O)-NR10-, -C(O)-O- 및 -C(O)-로부터 선택되며, 여기서 R 9 및 R 10 는 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸로부터 선택되며; A는 선택적으로 치환된 C5-C10-시클로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬, 예를 들어 선택적으로 치환된 C8 시클로알킬 또는 선택적으로 치환된 C8 헤테로시클로알킬 링이며, 여기서 R 5 은 H, 선택적으로 치환된 알콕시, 예를 들어 메톡시 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기를 나타내며; x, y 및 z는 1 내지 20 으로부터 독립적으로 선택된 정수이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 HA 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하며:
Figure pct00002
여기서 M은 화학식 (M1) 및 화학식 (M2)의 모이어티로부터 선택된 기이며:
Figure pct00003
,
R 2 는 -B-(CH2)i-D이며, 여기서 B는 없거나 또는 -S-C(S)-S- 및 -S-으로부터 선택되며; D는 선택적으로 치환된 C1-C15 알킬, 예를 들어 선택적으로 치환된 메틸, 에틸, 부틸, 프로필, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데카닐 (e.g. 선택적으로 치환된 C1-C4 알킬, 예를 들어 선택적으로 치환된 메틸 또는 에틸), 선택적으로 치환된 알콕시카보닐 C1-C4 알킬, 선택적으로 치환된 아미노 C1-C4 알킬, 선택적으로 치환된 아미노카보닐 C1-C6 알킬, -COOH 및 -NH2로부터 선택된 기이며; p는 1 내지 500으로부터 독립적으로 선택된 정수이고; i는 0 내지 500으로부터 독립적으로 선택된 정수이고; R 6 는 치환의 정도에 따라 -COOH 및 R 3 으로부터 선택된 기이고; L는 여기 정의된 화학식(II)의 링커이고; n은 1 내지 7,000으로부터 선택된 정수이다.
특정 실시예에 따라, 화학식 (I)의 콘쥬게이트를 제공하고, 여기 링커 L는 이의 Rb 치환기를 통해 콘쥬게이트의 HA 모이어티에 연결된다.
특정 실시예에 따라, 화학식 (I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 링커 L는 이의 Ra 치환기를 통해 콘쥬게이트의 HA 모이어티에 연결된다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 R 1 는 -(CH2)x-O-C(O)-CR7R8-이고, 여기서 R 7 및 R 8 는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 R 1 는 -C(O)-(CH2)x-C(O)-NH-(CH2)y-S이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 x는 3이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 x는 2이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 y는 2이다.
또 다른 특정 예에 따라, 화학식 (Ia)의 HA 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하며:
Figure pct00004
여기서 L, R2, R6 및 p는 본 명세서에 설명되어 있는 것과 같다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 A는 선택적으로 치환된 C8 시클로알킬 또는 선택적으로 치환된 C8 헤테로시클로알킬 링이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서A는 선택적으로 치환된 아자-디벤조시클로옥티닐이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 p는 약 50 내지 200이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 R7 및 R8 는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 특히 메틸이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 B는 -S-C(S)-S-이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 B는 없다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 i는 0 내지 20, 특히 0 내지 15, 예를 들어 0 내지 11, 특히 11이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 D는 선택적으로 치환된 C1-C4 알킬, 예를 들어 선택적으로 치환된 메틸 (e.g. C1-C12 알킬에 선택적으로 치환된 메틸)이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 L는 화학식(IIa)에 따른 기이며:
Figure pct00005
여기서 A, R1, R3 및 R5 는 여기 설명되어 있는 것과 같다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 L는 화학식(IIb)에 따른 기이며:
Figure pct00006
여기서 A, R1, R3 및 R5 여기 설명되어 있는 것과 같다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 L는 화학식(II')에 따른 기이며:
Figure pct00007
여기서 R 11 및 R 12 는 H, 선택적으로 치환된 알콕시, 예를 들어 메톡시 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기를 나타내며, Ra 및 Rb 는 여기 설명된 것과 같다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 L는 화학식(IIa')에 따른 기이며:
Figure pct00008
여기서 R 11 및 R 12 는 H, 선택적으로 치환된 알콕시, 예를 들어 메톡시 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기를 나타내며, R1 및 R3는 여기 설명된 것과 같다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 L는 화학식(IIb')에 따른 기이며:
Figure pct00009
여기서 R 11 및 R 12 는 H, 선택적으로 치환된 알콕시, 예를 들어 메톡시 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기를 나타내며, R1 및 R3는 여기 설명된 것과 같다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 R 3 는 여기 설명된 -E-G-L1-이며, 여기서 링커 기 G는 선택적으로 치환된 아실아미노 C1-C6 알킬, 특히 PEG기로 치환된 아실아미노 C1-C6 알킬기이며, 예를 들어 다음 화학식의 기이며: -C1-C6 알킬-NH-C(O)-(CH2-CH2-O)j- CH2-CH2-, 여기서 j는 1 내지 10, 특히 1 내지 8 또는 1 내지 6로부터 선택되며, 예를 들어 j는 1, 2, 3 또는 4, 특히 4이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 R 3 는 여기 설명된 -E-G-L1- 기이고, 여기서 링커기 G는 C1-C20 알킬, 예를 들어 선택적으로 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬로 선택적으로 치환된 메틸, 예를 들어 다음 화학식의 기이며: -C1-C6 알킬-(CH2-CH2-O)j-O-CH2-, 여기서 j는 1 내지 10, 특히 1 내지 8 또는 1 내지 6로부터 선택되며, 예를 들어 j는 1, 2, 3 또는 4, 특히 4이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 R 3 는 여기 설명된 -E-G-L1- 기이고 , 여기서 링커기 G는 선택적으로 치환된 C1-C20 알킬, 예를 들어 메틸이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 R 3 는 여기 설명된 -E-G-L1- 기이고, 여기서 E는 없다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며 , 여기서 R 3 는 여기 설명된 -E-G-L1- 기이며, 여기서E는 -CO)-이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 R 3 는 여기 설명된 -E-G-L1- 기이며, 여기서 L1 는 -NR10C(O)-이다.
특정 실시예에 따라, R10 는 H이다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 L는 화학식(II)에 따른 기이며, 특히 화학식(II'')을 갖는 (IIa')이며:
Figure pct00010
여기서 Q는 없거나, 또는 다음 화학식의 기이며: -NH-C(O)-(CH2-CH2-O)1-4- CH2-CH2-, R 11 및 R 12 는 여기 설명되어 있는 것과 같다.
특정 실시예에 따라, 화학식(I)의 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 L는 화학식(II)에 따른 기이고, 특히 화학식(II''')을 갖는 (IIb')이며:
Figure pct00011
여기서 G1 는 PEG이고, 보다 특정 실시예에서 다음 화학식의 기이며: - (CH2-CH2-O)1-4-, 예를 들어 -(CH2-CH2-O)2- 및 R 11 및 R 12 는 여기 설명된 것과 같다.
특정 실시예에 따라, R 11 및 R 12 는 H이다.
특정 실시예에 따라, 다음 군으로부터 선택되는 화학식(I)의 콘쥬게이트 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하며:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
약 0.5 및 50 사이, 바람직하게는 약 2 및 10의 사이의 치환도를 갖는다.
특정 실시예에 따라, 본 발명의 콘쥬게이트의 약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 소듐, 포타슘, 암모늄 및 칼슘을 포함한다.
특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 히알루론산 폴리머의 그래프트를 제공하며, 여기서 R 3 는 여기 정의된 -E-G-L1- 기이고, 여기서 E는 없다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 히알루론산 폴리머의 그래프트 폴리머를 제공하며, 여기서 R 3 는 여기 정의된 -E-G-L1- 기이고, 여기서 E 는 -C(O)-이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 히알루론산 폴리머의 그래프트 폴리머를 제공하며, 여기서 R 3 은 여기 정의된 -E-G-L1- 기이고, 여기서 G는 선택적으로 치환된 C1-C20 알킬이며, 예를 들어 메틸, 에틸 및 프로필로부터 선택된다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 히알루론산 폴리머의 그래프트 폴리머를 제공하며, 여기서 R 3 는 여기 정의된 -E-G-L1-기이고, 여기서 L 1 은 -C(O)-O-이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 히알루론산 폴리머의 그래프트 폴리머를 제공하며, 여기서 R 3 는 -O-(CH2)-C(O)-O- 기이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 히알루론산 폴리머의 그래프트 폴리머를 제공하며, 여기서 R 3 는 -(CH2)3-C(O)-O-이다.
본 발명의 콘쥬게이트의 분자량은 출발 물질의 선택에 의해 변경될 수 있고 이의 선택은 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물의 의도한 기능, 제형 및 이의 형성된 히드로겔에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 원하는 그래프트 폴리머 조성물 분해 속도, 여기 선택적으로 통합된 생활성제의 원하는 방출 속도, 치료할 치료적 상태는 본 발명의 콘쥬게이트를 위한 분자량의 선택에 영향을 미칠 것이다.
일 실시예에서, 윤활/필러 조성물에 사용하기 위한 본 발명의 그래프트 폴리머의 분자량은 약 2,000 내지 약 250,000,000 Da, 바람직하게는 약 500,000 내지 약 10,000,000로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 약물 송달 시스템에서 또는 약물 송달 시스템으로서 사용되기 위한 본 발명의 그래프트 폴리머의 분자량은 약 2,000 내지 약 250,000,000 Da, 바람직하게는 약 500,000 내지 약 10,000,000으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트의 제조
본 발명에 따른 새로운 HA 콘쥬게이트는 구리-없는 "클릭"화학 및 다음 일반적 방법 및 절차를 사용하여 용이하게 이용가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 전형적 또는 바람직한 실험 조건(즉, 반응 온도, 시간, 시약의 몰, 용매 등)이 주어지는 경우에, 달리 언급되지 않는 한 다른 실험 조건들이 또한 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 최적 반응 조건은 사용된 특정 반응물 또는 용매에 따라 변화할 수 있으나, 그러한 조건은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 루틴한 최적화 과정을 사용하여 결정될 수 있다. 화학식(I)의 콘쥬게이트들을 얻기 위한 일반적 합성법은 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머를 갖는 아지드를 시클로옥틴 모이어티를 갖는 HA 폴리머와 반응시키거나, 또는 HA 폴리머를 갖는 아지드를 시클로옥틴 모이어티를 갖는 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머와 반응시키는 것이다.
본 발명의 일 양상에 따라, 히알루론산 폴리머 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머의 그래프트 폴리머를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 히알루론산 폴리머 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머는 다음 단계를 포함하는 화학식(II)의 적어도 하나의 링커 L에 의해 콘쥬게이트된다:
(a) "클릭 화학" 반응에 참여할 수 있는 적어도 하나의 제1 기능기에 콘쥬게이트된 적어도 하나의 카르복실산기를 갖는 HA 폴리머를 제공하는 단계;
(b) 상기 제1 기능기와 함께 "클릭 화학" 반응에 참여할 수 있는 적어도 하나의 제2 상보적 기능기를 갖는 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 기능기들 중 하나는 아지드 모이어티이고 다른 기능기는 상기 링커 L의 전구체를 갖는 알킨인, 단계;
(c) HA 폴리사카라이드의 적어도 하나의 제1 기능기와 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머의 적어도 하나의 제2 상보적 기능기를 "클릭 화학" 반응을 통해 반응시켜 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물을 얻는 단계; 및
(d) 상기 그래프트 폴리머 조성물을 분리하는 단계.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명의 방법은 단계 d)에서 얻어진 그래프트 폴리머 조성물 내에 적어도 하나의 생활성제를 물리적으로 분산 및/또는 공유적으로 연결 및/또는 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
화학식(I)의 콘쥬게이트, 특히 화학식(Ic1)의 콘쥬게이트를 얻기 위한 일반적 합성 접근법은 이하 반응식 1에 설명된다. 화학식 (I)에 따른 HA 콘쥬게이트는, 여기서 R1, R2, R3, R5, R6 및 p는 상세한 설명에 정의된 것으로서, 적당한 용매, 예를 들어 1:1의 부피비의 물-DMSO 혼합물 내에서 사용자 제조 또는 상업적으로 이용가능한 출발 물질로부터 클릭 화학에 의해 하나의 단일 화학 단계로 제조될 수 있다.
중간체(Ia1)는 상업적으로 이용할 수 있거나, 기능기 중 하나는 아지드 모이어티인 화합물을 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머와 아미드화, 에스테르화, 티오에테르화, 산화 또는 Ugi 축합 반응시켜 제조될 수 있다.
중간체 (Ib1)는 상업적으로 이용가능하거나, 또는 화학식 (Lprec1)의 링커 전구체를 히알루론산 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염과 아미드화, 에스테르화, 티오에테르화 또는 말레이미드-술피드릴 반응, 산화 또는 Ugi 축합반응시켜 제조되며, 예를 들어 다음 문헌에 설명되어 있다: Schant
Figure pct00015
et al., 2011, Carbohydrate 폴리머s, 85, 469-489.
Figure pct00016
여기서 A 및 R5 는 여기 정의되어 있는 것과 같고, R3' 는 -E-G-L1 '이며, 여기서 E 및 G는 여기 정의되어 있는 것과 같고, L1' 는 아미노기이다.
반응식 1
Figure pct00017
화학식 (I), 특히 화학식 (Ic2)의 콘쥬게이트를 얻기 위한 또 다른 일반 합성법은, 소비자 제작 또는 상업적으로 이용가능한 출발 물질로부터 적당한 용매, 예를 들어 물 및/또는 디메틸 술폭시드 등 내에서 클릭 화학에 의해 하나의 단일 화학 단계로서 이하 반응식 2에 설명되어 있다.
반응식 2
Figure pct00018
중간체 (Ia2)는 상업적으로 이용가능하거나, 화학식 (Lprec2)의 링커 전구체와 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머를 아미드화, 에스테르화, 티오에테르화, 산화 또는 Ugi 축합 반응시켜 제조될 수 있다.
Figure pct00019
여기서 A 및 R5 는 여기에 정의되어 있는 것과 같고, R1 '는 알콜, 카르복실산, 카보닐, 아지드, 티오에스테르, 말레이미드, 아실 포스페이트, 산무수물, 아실 클로라이드, 카르복실레이트 아미노 또는 에스테르 기이다.
중간체 (Ib2)는 상업적으로 이용가능하거나, 또는 하나의 기능기가 아지드 모이어티인 화합물을 히알루론산 또는 이의 임의 약제학적으로 허용가능한 염과
아미드화, 에스테르화, 티오에테르화, 산화 또는 Ugi 축합 반응하여 제조될 수 있다.
특정 실시예에 따라, 중간체 (Ia2)를 제공하며,
Figure pct00020
여기서 A, R1, R2, R5 및 p는 여기 정의되어 있는 것과 같다.
조성물
본 발명은, 조성물로서 약제학적 또는 치료적 약제, 또는 이들을 포함하는 의약 장치 및 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상은, 바람직하게는 포유류 환자, 가장 바람직하게는 의학적 질병, 및 특히 관절성 병리학, 관절 질환, 눈 병리학(예를 들어 노화-관련 황반 변성, 돌출 눈, 백내장, 거대세포바이러스망막염, 색각이상, 사시, 당뇨병성 황반부종, 비문증 및 속눈썹, 녹내장, 원추각막, 약시, 저시력, 고안압증, 망막박리, 눈꺼풀 떨림 및 포도막염), 피부 괴사 또는 피부 상처 (예를 들어 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진 및 주사) 및 임의 조직 변성[예를 들어 복압성 요실금(stress urinary incontinence), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군(sjφgren's syndrome), 혼합된 결합 조직 질환, 건선 관절염, 마르팡증후군(marfan syndrome), 페이로니병(peyronie's disease), 엘로스-단로스 증후군(ehlers-Danlos syndrome), 불완전골형성(osteogenesis imperfecta), 스티클러증후군(stickler syndrome), 알포트 증후군(alport syndrome), 선천구축거미가락증(congenital contractural arachnodactyly), 로이 디에츠 증후군(Loeys-Dietz syndrome) 및 괴혈병]으로 고통받는 인간 환자이다.
특정 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 콘쥬게이트 또는 조성물을 포함하는 약제용 약제학적 제형을 제공한다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 비경구적 제형이다.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 주사가능한 제형, 예를 들어 관절 내(intra-articular), 동맥 내(intra-arterial), 정맥, 윤활액 내(intrasynovial), 피부내(intradermal), 진피하층(subdermal), 점막밑(submucosal), 간질성(interstitial) 및 근육내 제형이다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 경구 제형이다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 국소적 제형이다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 안과적 제형이다.
대안적으로 본 발명은 상술된 것과 동일한 용도를 위하여 또 다른 포유류, 인간에 사용될 수 있는 조성물을 제공한다.
본 발명은 화장품 분야, 복원 수술(예를 들어, 조직 복원) 및 세포 또는 생물학적 조직 배양(예를 들어, 줄기 세포 배양)에 유용한 조성물 또는 의학 장치를 더 제공한다. 이들 조성물은 각각 화장품적으로 허용가능한 담체 또는 세포 또는 생물학적 조직 배양 영양소를 더 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은, 연조직 필러 조성물, 예를 들어 진피 및 진피하층 필러를 포함하며, 본 발명에 따른 적어도 하나의 콘쥬게이트 또는 이의 히드로겔 또는 나노입자를 포함한다. HA-계 연조직 필러 조성물의 제조는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예를 들면 다음 문헌에 설명된 것처럼 수행될 수 있다: Jeon et al., 2007, Carbohydrate Polymers, 2007. 70(3): p. 251-257, Iannitti et al, 2013, Int. J. Pharm., 456:583-592.
특정 실시예에 따라, 본 발명의 조성물은 20℃에서 약 100Hz 진동 모드에서 측정될 때 약 0.001 Pa*s 및 약 100 Pa*s, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 Pa.s의 점도를 갖는다.
특정 실시예에 따라, 본 발명의 조성물은 29 게이지 바늘을 통해 약 1mm/분의 분출 속도를 갖고 25℃에서 약 0.01 N 내지 약 20 N, 바람직하게는 약 1 N 내지 약 5 N의 분출력을 갖는다.
특정 실시예에 따라, 수성 용매 내에서 가용화시, 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물은, 온도 변화에 따라 단상-대-이상 상전이를 나타내는 pH 및/또는 열-민감성 히드로겔을 형성할 수 있다.
특정 양상에 따라, 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물은 LCST 이하, 약 25℃ 내지 약 32℃ 이하의 단상 히드로겔 및 "단상 그래프트 폴리머 용액"을 형성한다. 또 다른 특정 양상에 따라, 그러한 하한 임계 용액 온도 이상에서 이상 히드로겔을 형성한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물은 약 25℃ 내지 약 32℃ 이상, 예를 들어 신체 온도 이상에서 나노입자를 자발적으로 형성할 수 있다.
게다가 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물는 가역적으로 나노 입자를 형성하므로, 저장 및 운송 동안 잠재적 온도 효과가 폴리머의 물리적 상태에 비가역적으로 영향을 미치지 않을 것이라는 장점이 있다.
특정 실시예는 약 40 내지 500 nm의 평균 크기를 갖는 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물의 나노 입자를 제공한다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명의 조성물은 생분해성 및 생체적합적 pH 및/또는 열-가역적 히드로겔의 형태일 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 실온 또는 실온 인접 온도 또는 그 이하에서 단상(용액 또는 액체) 및 약 생리학적(또는 인비보) 온도 또는 그 인접 온도 또는 그 이상의 온도에서 겔 상태인 pH 및/또는 열-가역적 생분해성 히드로겔의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 추가적 성분(s) 예를 들어 명반, 안정화제, 항균제, 완충제, 착색제, 착향제, 아주반트, 및 이와 유사한 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 종래 사용된 아주반트, 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물의 형태로 놓여질 수 있고, 고체, 예를 들어 정제 또는 충진된 캡슐로서, 또는 액체, 예를 들어 용액, 현탁액, 연고, 에멀젼, 엘릭시르, 또는 동일한 것으로 충진된 캡슐, 필름 또는 겔로서 사용될 수 있고 모두 경구용일 수 있다. 상기 조성물은 또한, 사용 전에 물 또는 다른 적당한 비이클과 재구성하기 위한 건식 제품으로서 제형화될 수 있다.
액체 제형으로서 본 발명의 조성물은, 이에 한정되지는 않지만, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽, 및 엘릭시르를 포함한다.
그러한 액체 제제는, 이에 한정되지는 않지만, 현탁화제, 에멀화제, 비수성 비이클 및 방부제를 포함한다. 현탁화제는, 이에 한정되지는 않지만, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로오스, 글루코오스/설탕 시럽, 젤라틴, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 및 수소화된 식용 지방을 포함한다. 에멀화제는, 이에 한정되지는 않지만, 레시틴, 소르비탄 모노올리에이트, 및 아카시아를 포함한다. 방부제는, 이에 한정되지는 않지만, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 소르브산을 포함한다. 분산제 또는 습윤제는, 이에 한정되지는 않지만 폴리(에틸렌 글리콜), 글리세롤, 소혈청알부민, Tween®, Span®을 포함한다. 추가로, 물질뿐만 아니라 제형 가공 기술 및 이와 유사한 것들은 다음 문헌에 기재되어 있다: The Science 및 Practice of Pharmacy (Remington: The Science & Practice of Pharmacy), 22 nd Edition, 2012, Lloyd, Ed. Allen , Pharce utical Press, 이는 참조로서 여기 통합되어 있다.
본 발명의 고체 조성물은 종래 방법으로 제형화된 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은 이에 한정되지는 않지만, 결합제, 필러, 윤활제, 붕괴제 및 습윤제를 포함하는 종래 부형제를 포함할 수 있다. 결합제는, 이에 한정되지는 않지만, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트래거캔스검, 전분의 점액 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 필러는, 이에 한정되지는 않지만, 락토오스, 설탕, 미정질 셀룰로오스, 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 및 소르비톨을 포함한다. 윤활제는, 이에 한정되지는 않지만, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 및 실리카을 포함한다. 붕괴제는, 이에 한정되지는 않지만, 감자 전분 및 소듐 전분 글리콜레이트를 포함한다. 습윤제는, 이에 한정되지는 않지만, 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 당해 기술 분야에서 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물 또는 히드로겔은 생체 활성제를 더 포함하며, 이는 그래프트 폴리머 조성물 내에 분산되거나 공유적으로 이에 부착된다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물 또는 히드로겔은 생활성제 송달 시스템 형태이다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 생활성 물질은 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물 또는 히드로겔의 총 함량을 기초로 약 0.001 내지 40 wt%, 바람직하게는 약 0.01 내지 30 wt%의 함량으로 존재할 수 있다.
또 다른 양상에 따라, 본 발명에 따른 조성물은, HA 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물을 포함하는 세포 또는 생물학적 조직 배양 배지를 포함한다. 이 배양 배지는 세포 영양제, 예를 들어 글루코오스, 비타민, 성장 인자, 금속 이온 및 이와 유사한 것을 더 포함할 수 있다.
또 다른 양상에 따라, 본 발명에 따른 조성물은, 신체의 손상 조직, 예를 들어 상피, 신경병학, 연골 또는 뼈 조직의 손상 조직을 회복시키는데 유용한 생물학적 조직 (내생적 또는 외생적) 또는 합성 또는 반합성 물질을 포함한다.
또 다른 특정 실시예에서, 배양 배지의 제조 방법을 제공하며, 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머를 세포 배양 영양제, 예를 들어 글루코오스, 비타민, 성장 인자, 금속 이온 및 이와 유사한 것과 혼합시키는 단계를 포함한다.
또 다른 특정 실시예에서, 복원 조직의 제조방법을 제공하며, 본 발명에 따른 HA 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물을 신체의 손상 조직을 회복시키는데 유용한 물질, 조직 또는 세포, 예를 들어 줄기 세포 또는 상피, 신경병학, 연골 또는 뼈 조직과 조합시키는 단계를 포함한다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물, 또는 히드로겔을 제조하는 방법, 특히 유효 성분(active principle)을 위한 송달 시스템을 제조하는 방법을 제공하며, 다음 단계를 포함한다:
- 겔 상태로 본 발명의 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물 또는 히드로겔을 제공하는 단계;
- 송달될 유효 성분을 제공하는 단계;
- 본 발명의 상기 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물 또는 히드로겔을 상기 유효 성분(예를 들어 약물)과 혼합시키는 단계;
- 선택적으로 상기 혼합물의 온도를 증가시켜 나노입자의 형성을 유도하는 단계(전형적으로 약 25 내지 약 40℃);
- 상기 유효 성분(예를 들어 약물)이 부하된 상기 얻어진 조성물, 히드로겔 또는 나노입자를 수집하는 단계.
특정 양상에 따라, 본 발명의 조성물, 히드로겔, 또는 나노입자는 일단 유효 성분이 일단 부하되면 경구용 및 상기 유효 성분 주사의 제자리 방출(in situ release)에 유용할 수 있다.
투여 모드
본 발명의 조성물은 잇몸, 구강 저부, 볼, 입술, 혀, 치아를 포함하는 구강의 점막 표면에 투여하는 것을 포함하는 경구 루트에 의한 임의 방버으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 또한 주사, 예를 들어 피하 주사, 윤활액 내, 관절내, 근육내, 진피하층, 점막밑 및 간질(interstitial) 주사에 의해 임의 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 피부, 다양한 점액질 또는 눈에 국소적으로 투여될 수 있다.
조합
일 양상에 따라, 본 발명의 폴리머 또는 이의 임의의 적당한 약제학적으로 허용가능한 염 및 이의 약제학적 제형은 단독 또는 적어도 하나의 보조 약제와 병행하여 투여될 수 있다.
특정 양상에 따라, 본 발명에 따른 보조 약제는 본 발명에 따른 생활성제 뿐만 아니라 순수한 HA, 콘드로이딘 설페이트 또는 또 다른 관절 내 약물 조성물을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 콘쥬게이트 및 이의 약제학적 제형을 개인에게 염증성 질환 (관절염, 골관절염, 및 류마티스 관절염 포함), 눈 병리학, 종양 및 감염의 치료에 유용한 적어도 하나의 보조 약제와 동시에 또는 연속해서 투여하는 단계를 포함한다. 이들 보조 약제는 항생제, 항균제, 성장 인자, 효소, 항종양성 약물, 항염증성 약물, 예를 들어 코르티코스테로이드, 항바이러스성 약물, 항세균, 항진균성 약물, 마취제, 항-네오플라스틱성 약물, 진통제, 항응혈제 및 지혈성 약물으로부터 선택될 수 있다.
상기 보조 약제와 동시에 투여되는 본 발명의 폴리머, 나노입자 또는 히드로겔 또는 이의 약제학적 제형은 같거나 다른 조성물로 투여되고 같거나 다른 투여 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 본 발명의 폴리머, 이의 나노입자 또는 히드로겔의 농도 범위는 각 경우의 환경, 근본적 질환, 임상적 지시 및 목적하거나 및/또는 필요한 통증 완화의 원하는 강도에 따라 변화할 수 있다.
실시예에 따라, 본 발명의 적어도 하나의 콘쥬게이트 또는 이의 임의 적당한 약제학적으로 허용가능한 것을 여기 설명된 적어도 하나의 보조 약제, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다.
개인에게 단일 또는 다중 복용으로서 투여되는 복용량은 다양한 인자들, 약동학적 성질, 환자 상태 및 특성(성별, 연령, 체중, 건강 및 크기), 증후의 정도, 동시 치료, 치료의 빈도 및 원하는 효과에 따라 변화할 것이다.
환자
일 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 임의 조직 변성, 관절 질환, 눈 병리학, 피부 괴사 또는 상처로 고통받거나 또는 그러한 위험이 있는 대상이다.
추가 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 관절성 병리학 및 관절 질환 예를 들어 골관절염, 관절염, 감염, 류마티스 관절염 및 연골, 뼈, 인대 또는 혈액포 손상을 일으키는 트라우마적 무릎 사건으로 고통받거나 고통받을 위험이 있는 대상이다.
또 다른 추가 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 눈 병리학 예를 들어 노화-관련 황반 변성, 돌출 눈, 백내장, 거대세포바이러스망막염, 색각이상, 사시, 당뇨병성 황반부종, 비문증 및 속눈썹, 녹내장, 원추각막, 약시, 저시력, 고안압증, 망막박리, 눈꺼풀 떨림 및 포도막염으로 고통받거나 받을 위험이 있는 대상이다.
또 다른 추가 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 피부 괴사 또는 상처, 예를 들어 흉터, 찰과상 열상, 타박상, 뇌진탕, 자창, 피부 절단, 외과적 상처, 총상, 열적 상처, 화학적 상처, 물리거나 쏘인 상처 및 전기적 상처로 고통받거나 고통받을 위험이 있는 대상이다. 만성 피부 질병, 예를 들어 궤양을 더 포함한다.
또 다른 추가 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 신체 부분의 부피 증진 또는 원자적 개조, 예를 들어 비뇨기과 조직 벌킹, 심미적 또는 치료적 이유로 신체의 일부의 부피를 임의 상승/변형 및/또는 증가시킬 의지가 있거나 필요한 대상이다.
또 다른 추가 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 종양 또는 혈관 기형으로 고통받는 대상이다.
본 발명에 따른 용도
특정 실시예에 따라, 본 발명의 HA 콘쥬게이트 및 이의 조성물은 다양한 응용 분야, 예를 들어 인비트로 세포 또는 생물학적 조직 배양에서, 조직 필러로서, 화장품 및 조직 가공 분야에서 유용하다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 그래프트 폴리머 또는 히드로겔 또는 나노입자의 용도를 제공하며, 이 용도는 송달 시스템, 인비트로 세포 또는 생물학적 조직 배양 또는 조직 가공 물질, 예를 들어 신경외과적, 뼈, 연골, 상피 복원 조직의 제조를 위한 용도이다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명의 HA 콘쥬게이트 및 이의 조성물은 의학적 질병, 및 특히 관절성 병리학, 관절 질환, 눈 병리학, 피부 괴사 또는 상처의 예방 또는 치료, 비뇨기과 조직 벌킹, 임의 조직 변성, 심미적 또는 치료적 이유로 또는 종양 또는 혈관 기형의 치료를 위하여 신체 일부의 부피의 상승/변형 및/또는 증가에 사용되는데 유용하다.
또 다른 특정 실시예에 따라, 본 발명의 제형은 종양 또는 혈관 기형의 모세혈관계 내로 주사하기 위하여 LCST 이하에서 단상 히드로겔 형태로 사용될 수 있고, 여기서 상기 제형은 신체 온도(LCST 이상)에 노출시 제자리 작은 히드로겔 입자를 형성하여, 도관 색전증(vascular embolization)을 가능하게 한다. 상기 종양 또는 혈관 기형의 결과적 색전증은 결과적으로 혈액 및 영양소를 차단하게 되고 종양을 직접적으로 죽이거나 또는 추가 수술적 절제 또는 치료를 위한 제제, 예를 들어 방사선 치료 또는 화학요법과 병행하는 치료에 유용한다.
본 발명의 추가 특정 양상에 따라, 도관 색전증에 사용되는 본 발명의 HA 콘쥬게이트 및 이의 조성물이 제공된다.
또 다른 추가 특정 양상에 따라, 화장품 용도 및 성형 수술 및 재건 수술(reconstructive surgery)을 위한 본 발명의 HA 콘쥬게이트 및 이의 조성물이 제공된다.
또 다른 추가 특정 양상에 따라, 인비보 약물 송달에 사용하기 위한 본 발명의 HA 콘쥬게이트 및 이의 조성물이 제공된다.
특정 실시예에 따라, 본 발명의 적어도 하나의 HA 콘쥬게이트를 포함하는 pH 및/또는 열-민감성 생분해성 히드로겔이 제공되며, 이는 많은 응용분야, 예를 들어 적어도 하나의 생활성제의 송달 시스템 또는 조직 가공에서의 세포 송달 시스템, 세포 또는 생물학적 조직 배양 시스템 및 이와 유사한 분야에서 유용하다.
특정 양상에 따라, 적어도 하나의 생활성제를 위한 송달 시스템으로서의 본 발명에 따른 히드로겔의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 본 발명의 적어도 하나의 HA 콘쥬게이트 또는 이의 임의 적당한 약제학적으로 허용가능한 조성물을 단독 또는 적어도 하나의 보조 약제와 병행하여, 조직 변성 및 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 제형의 제조를 위한 용도가 제공된다.
특정 양상에 따라, 본 발명의 HA 콘쥬게이트 및 이의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 콘쥬게이트는 제자리 자발적 나노입자를 형성할 수 있다.
본 발명을 설명하는 실시예들이 이하 보다 상세하게 도면에 제시된 실시예들을 참조로 설명될 것이다.
실시예S
다음 약어는 각각 이하 정의된 것들을 의미한다:
DMSO (디메틸 술폭시드), MWCO (분획 분자량, Molecular weight cut-off).
실시예 1: 본 발명의 히알루론산 콘쥬게이트의 합성
본 발명의 콘쥬게이트는 상기 반응식 1에 설명된 방법으로 합성되었고, 여기서 링커를 구축하는데 사용된 출발 물질(링커 전구체)은 다음과 같다: 디벤조시클로옥틴-아민(DBCO-아민) (화학식 (L-prec1), 여기서 A는 C8 헤테로시클로알킬 링으로서, 디벤조시클로옥틴이며, R5는 H이고, R3' 는 -E-G-L1 ' 기이고, 여기서 E는 -C(O)-이고, G는 에틸이고, L1 ' 는 -NH2이다), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구매. 디벤조시클로옥틴-PEG4-아민 (DBCO-PEG4-아민) 화학식 (L-prec1), 여기서 A는 C8 헤테로시클로알킬 링으로서, 디벤조시클로옥틴이고, R5 는 H이고, R3' 는 -E-G-L1 ' 기이고, 여기서 E는 -C(O)-이고, G는 -NH-C(O)-(CH2-CH2-O)4- CH2-CH2-이고, L1 ' 는 -NH2이며, 클릭 화학 도구(Click Chemistry Tools)(Scottsdale, Arizona, USA)에서 구매.
대안적으로, 링커 전구체 DBCO-아민 및 DBCO-PEG4-아민은 다음 문헌에 설명된 것처럼 제조될 수 있다: Pola et al., 2014, Polym. Chem., 5, 1340, 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)　아지드 말단(pNiPAM-N3)은 다음에 설명된 것처럼 제조될 수 있다: Xu et al., 2007, Macromolecules, 40, 9103-9110.
아지도-PEG3-아민(N3-PEG4-아민)은 Click Chemistry Tools (Scottsdale, Arizona, USA)에서 구매하였다.
디벤조시클로옥틴-NHS 에스테르(DBCO-NHS 에스테르) (화학식 (L-prec2), 여기서 A는 C8 헤테로시클로알킬 링으로서, 디벤조시클로옥틴이고, R5는 H이고, R1' 는 -E-G-R1'기이고, 여기서 E는 -C(O)-이고, G는 에틸이고, R1' 는 N-히드록시숙신이미드/에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (NHS/EDC))으로 활성화된 -COOH이다.
대안적으로, 상기 링커 전구체 N3-PEG4-아민은 다음에 설명된 것처럼 제조될 수 있다: Hiki et al., 2007, Bioconjugate Chem., 18, 2191-2198. DBCO-NHS 에스테르는 다음에 설명된 것처럼 제조될 수 있다: Liu et al., 2012, J. Am. Chem. Soc., 134, 1888618888.
사용된 추가 출발 물질은 다음과 같다:
히알루론산 (HA)는 Soliance (Pomacle, France) (MW: 1.85 MDa)에서 구입하였고; N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드히드로클로라이드 (EDC), N-히드록시숙신이미드(NHS), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)　아지드 말단(pNiPAM-N3) (MW: 15kDa)(화학식 (Ia1), 여기서 R1 은 상세한 설명에 정의된 것과 같고, x는 3이고, R7 및 R8 는 메틸이고, p는 132이고, R2 는 상세한 설명에 정의된 것과 같고, B는 -S-C(S)-S-이고, i는 11이고, D는 메틸이다) 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)아민 말단(pNiPAM-아민)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구매하였다. 시아닌5-아지드 (Cy5-N3)는 Lumiprobe (Hannover, Germany)에서 제공받았다.
HA-B1의 합성
본 발명의 표제 콘쥬게이트는 이하 반응식 1A에 따라 합성되었다.
HA (1)는 1%(w/v)의 증류수에 용해시킨다. 폴리머의 용해 후, EDC를 첨가(1 eq. COO-)하고, 5min 후 NHS를 자기 교반(5 min, 1,200 RPM)하에서 용해시켰다(1 eq.). pH는 NaOH/HCl 0.1M을 가지고 pH 겔 전극 Metrohm (Herisau, Switzerland) 으로 5.0으로 조절하였다. DBCO-아민(2)을 상기 정의된 화학식(Lprec1)의 전구체로서 사용하고 물-DMSO 혼합물의 최종 부피비 40:60이 되도록 DMSO(1 eq.)를 첨가하였다. 실온에서 밤새 반응물을 교반하고, 에탄올 내에서 침전시켜 화학식(Ib1)의 중간체(3)를 얻었고, 여기서 A는 C8 헤테로시클로알킬 링으로서, 디벤조시클로옥틴이고, R5는 H이고, R3 는 -C(O)-(CH2)2-NH-C(O)-이다. 이 침전물(3)을 동결건조시키고, 1%(w/v)의 증류수에 재용해시키고, 상술된 화학식(Ia1)의 중간체로서 사용된 pNiPAM-N3 (1 eq.)(4)을 첨가하였다(2 h, 1,200 RPM). HA-P1를 3번 증류수 내에서 3 시간 동안 1,500RPM에서 NaCl 5%(w/v)에 대하여 투석하였고(MWCO 25,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA), 에탄올 내에 침전시키고 동결건조하고 4℃에서 저장하였다.
본 발명의 얻어진 콘쥬게이트 HA-B1의 구조는 다음 조건으로 결정하였다: 1H NMR Gemini 300 MHz from Varian (Grenoble, France) 스펙트럼 (도 1D), 주위 온도, 용매로서 D2O을 사용.
반응식 1A
Figure pct00021
HA-DBCO의 치환 정도(DS)는, HA 아세틸 양성자 피크(δ 2.00 ppm)의 적분(integration)에 대한 DBCO 방향족 양성자 피크(δ 7.67 ppm)의 적분의 비를 사용하여 8.0%(1 eq. COO-)로서 결정되었고, HA-B1의 치환 정도는 pNiPAM 메틸 양성자 피크(δ 1.56 ppm)의 적분에 대한 DBCO 방향족 양성자 피크(δ 7.67 ppm)의 적분의 비를 사용하여 7.13 % (1 eq. COO-)으로 최종적으로 정량되었다.
HA-P2의 합성
본 발명의 표제 콘쥬게이트는 이하 반응식 1B에 따라 합성되었다:
HA (1)는 1%(w/v)로 증류수에 용해된다. 폴리머 용해 후, EDC를 첨가(0.5 eq. COO-)하고, 5 min 후 NHS(0.5 eq.)를 자기 교반(5 min, 800 RPM) 하에 용해시켰다. pH는 NaOH/HCl 0.1M을 사용하여 pH 겔 전극 Metrohm (Herisau, Switzerland)으로 5.0으로 조절하였다. DBCO-PEG4-아민(2P)(0.5 eq.)을 DMSO와 함께 첨가하여 물-DMSO 혼합물의 최종 부피 비 40:60이 되게 하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고, 3h 동안 900RPM으로 3번 증류수 내에서 NaCl 5%(w/v) 대하여 투석하여(MWCO 12-14,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA), 화학식(Ib1)의 중간체(3P)를 얻었으며, 여기서 A는 C8 헤테로시클로알킬 링으로서, 디벤조시클로옥틴이고, R5 는 H이고, R3 는 -C(O)-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2-CH2-O)4)-(CH2)2-NH-C(O)-이다. 혼합물을 1 %(w/v)으로 증류수에 재용해시키고, pNiPAM-N3 (0.5 eq.)(4)을 첨가하였다(2 h, 1,500 RPM). HA 콘쥬게이트를 3h 동안 900RPM으로 3번 증류수 내에서 NaCl 5 %(w/v)에 대해 투석하고(MWCO 25,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA), 이후 900RPM에서 3h 동안 3번 증류수 내에서 투석하고, 동결건조하고, 4℃에서 저장하였다. 본 발명의 콘쥬게이트 HA-B2는 또한 DBCO-PEG4-아민 (2P) 대신에 DBCO-아민(2)을 사용하여, 다른 비(pNiPAM/HA)를 사용한 것을 제외하고는 (HA-B1)과 동일한 콘쥬케이트를 유도하는 방법으로 합성되었다. 동결건조 후, 얻어진 콘쥬게이트의 구조 및 DS는 상술한 것처럼 D2O 내에서 1H NMR 스펙트럼으로 결정되었다(도 1F 및 1E). HA-B2 및 HA-P2의 DS는 각각 7.47 % 및 9.53 % (0.5 eq. COO-)이었다.
반응식 1B
Figure pct00022
HA-B3의 합성
본 발명의 표제 콘쥬게이트는 일반 반응식 2 특히 이하 반응식 2A에 따라 합성되었다:
반응식 2A
Figure pct00023
HA (1)는 1%(w/v)으로 증류수 내에 용해된다. 폴리머의 용해 후, EDC(1 eq. COO-)를 첨가하고, 5min 후 NHS(1 eq.)을 자기 교반 (5 min at 1,200 RPM)하면서 용해시켰다. 상기 pH를 NaOH/HCl 0.1M를 가지고 pH 겔 전극 Metrohm(Herisau, Switzerland)으로 5.0으로 조절하고, N3-PEG4-아민(5)(1 eq.)을 DMSO와 함께 첨가하여 물-DMSO 혼합물의 최종 부피비 40:60이 되게 하였다. HA-N3를 1,500RPM에서 3h 동안 3번 증류수 내에서 NaCl 5 % (w/v)에 대하여 투석(MWCO 1,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA)하고, 에탄올 내에 침전시키고, 동결전조시켜 HA-N3 (6)(중간체 Ib2 , 여기서 R3 는 -C(O)-NH-CH2-O-(CH2-CH2-O)2- CH2- CH2-이다)을 얻었다.
pNiPAM-아민 (7)를 자기 교반 (5 min at 1,200 RPM)하면서 1%(w/v)로 증류수 내에 용해시켰다. 상기 pH는 NaOH/HCl 0.1M 가지고 pH 겔 전극 Metrohm (Herisau, Switzerland)으로 7.0으로 조절되고, DBCO-NHS 에스테르(8)를 첨가(1 eq.)하고, 상기 정의된 화학식(Lprec2)의 전구체로서 사용되었고, 여기서 A는 아자-디벤조시클로옥티닐이고, R5 은 H이고, R1'는 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 4-옥소부타노일이고, DMSO를 가지고 물-DMSO 혼합물의 최종 부피비가 40:60이 되도록 하여 pNiPAM-DBCO (9)(중간체 Ia2, 여기서 A는 아자-디벤조시클로옥티닐이고, R5 는 H이고, R3는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-NH-(CH2)2-S이고, R2 는 -B-(CH2)i-D이며, 여기서 B는 없고, i는 0이고, D는 메틸이다)를 얻었다. pNiPAM-DBCO는 1,500RPM에서 3h 동안 3번 증류수에 대하여 투석(MWCO 1,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA)하고 동결 건조되었다.
HA-N3 (6)는 1 %(w/v)으로 증류수 내에서 용해시키고, pNiPAM-DBCO(9)(1 eq.)를 첨가(2 h, 1,500 RPM)하였다. HA 콘쥬게이트를 900 RPM에서 3h 동안 3번 증류수 내에서 NaCl 5%(w/v)에 대해 투석(MWCO 25,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA)하고, 이후 900RPM으로 3h 동안 3번 증류수 내에서 투석하고 동결건조하고 4℃에서 저장하여 본 발명의 콘쥬게이트 HA-B3, 특히 화학식(I)의 콘쥬게이트를 얻었으며, 여기서 M는 M2이다.
HA-pNiPAM (비교 대조군)의 합성
링커 없는 HA-pNiPAM의 비교 콘쥬게이트는 다음과 같이 설명된 방법을 사용하여 합성되었다: HA는 1%(w/v)으로 증류수 내에 용해된다. 폴리머의 용해 후, EDC를 첨가 (1 eq. COO-), 5min 후 NHS(1 eq.)를 자기 교반(5 min at 1,200 RPM)하면서 첨가하였다. 상기 pH를 NaOH/HCl 0.1M를 가지고 pH 겔 전극 Metrohm (Herisau, Switzerland)으로 5.0으로 조절하고, pNiPAM-아민(1 eq.)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. HA-pNiPAM를 1,500RPM으로 3h 동안 3번 증류수 내에서 NaCl 5%(w/v)에 대하여 투석(MWCO 25,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA) 하였고, 에탄올 내에 침전되었고 동결건조하여 4℃에서 저장하였다.
HA-P2-Cy5 (형광 HA 콘쥬게이트)의 합성
HA 콘쥬게이트 및 형광 염료-아지드를 0.1%(w/w)의 Cy5-N3를 제외하고 실시예와 동일한 합성 파라미터의 HA-P2와 결합시키고, 상기 혼합물에 첨가하고, pNiPAM-N3를 첨가하였다.
HA-Cy5 (비교 형광 대조군)의 합성
HA(1)는 1.5%(w/v)으로 증류수 내에서 용해킨다. 폴리머의 용해 후, EDC를 첨가 (1.1 eq. COO-)하고, 5min 후 NHS(1.1 eq.)를 자기 교반(5 min at 900 RPM)하에 첨가하였다. 상기 pH는, NaOH/HCl 0.1M를 가지고 pH 겔 전극 Metrohm (Herisau, Switzerland)으로 5.0으로 조절되었다. DBCO-아민(1 eq.)을 DMSO와 함께 첨가하여 물-DMSO 혼합물의 최종 부피비가 1:1이 되게 하였다. 상기 반응물을 실온에서 밤새 교반하고, 900RPM에서 3h 동안 3번 증류수 내에서 NaCl 5%(w/v)에 대하여 투석(MWCO 12-14,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA) 하고, 이후 900RPM으로 3h 동안 3번 증류수 내에서 투석하였다. 혼합물을 1 %(w/v)으로 증류수 내에 재용해시키고, 0.1 %(w/w)의 Cy5-N3을 첨가하였다(2 h, 1,500 RPM). HA 콘쥬게이트를 900RPM으로 3h 동안 3번 증류수 내에서 NaCl 5 %(w/v)에 대해 투석(MWCO 12-14,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA)하고 이후 900RPM에서 3h 동안 증류수 내에서 투석하고 동결건조하고 4℃에서 저장하였다.
실시예 2: 본 발명의 화합물의 주사가능성
본 발명의 화합물의 주사가능성을 시험하기 위하여, 5N 이하의 주사가능한 힘에서 HA 콘쥬게이트의 최대 퍼센트(w/v)를 결정하였다.
1 mL 주사기 Norm-ject® 를 23G 바늘로 충진시키고, BD Micro-FineTM 29G　고정 바늘 1mL 인슐린 주사기를 사용하였다. 주사력은 Texture Analyzer TA.XT. plus (Tracomme AG, Switzerland)을 사용하여 20℃ 및 37℃에서 측정하였다. HA 콘쥬게이트는 2 주사기-바늘 시스템을 사용하여 평가하고, 주사기 물질에 의해 영향받은 주사 프로파일을 나타낸다(도 2B). 사실상, BD Micro-FineTM 29G　고정 바늘은 이중 실링링을 갖는 플런저 스토퍼를 갖게 만들어져서 느린 흡입과 주사가 되게 하였다. 도 2에 보여진 것처럼 Fi(초기 힘) 및 Fp(유지 힘)은 23G 주사기를 가지고 했을 때 Ff(final force)과 유사하거나 이보다 높았으며, 29G 주사기를 가지고 했을 때 Fi>Fp>Ff 를 나타내었다.
HA-B1, HA-B2 및 HA-P2의 농도는 각각 7.5 %, 0.5 % 및 0.75 % (w/v)이고 주사하는 것이 용이하다(<5 N). 이들 결과는 본 발명의 HA 콘쥬게이트의 우수한 주사가능성 및 주사 시스템에 따른 최대 농도의 증가 가능성을 밝혔다.
실시예 3: 본 발명의 화합물들의 유변학적 거동(Rheological behavior)
본 발명의 화합물의 유변학적 거동은 다음과 같이 조사되었다:
35/2° Ti cone을 갖는 침상 평판 기하구조(cone-plate geometry)를 사용하는 Haake Rheostress(Vreden, Germany)를 사용하고 습도 제어된 방 내에서 20℃에서 0.1　s-1 내지 100　s-1　의 절단 속도를 사용하여, 0.4　mL 샘플의 HA-B1 (7.5 %w/v), HA-B2 (0.5 %w/v), HA-P2 (0.75 %w/v) 및 Ostenil® (1 %w/v)에서 유변학적 측정을 하였다. 결과는 본 발명의 모든 HA 그래프트 폴리머와 Ostenil® 가 비뉴톤(non-newtonian) 및 의가소성 유체(pseudoplastic fluid)이었다는 것을 나타내었다. 의가소성 유체의 점도는 절단성 증가에 따라 감소하였고, 이는 주사를 용이하게 하는 유리한 성질이다. 하한 임계 용액 온도(LCST)는 1℃/min의 가열 속도로 온도의 함수로서 역학 유체측정 G' (탄도) 및 G'' (점도) 계수에 의해 조사되었다. LCST는 G' 및 G'' 계수의 교차점에 의해 특징되었다. 모든 HA 콘쥬게이트는 그 온도 이하에서는 혼합물이 혼화가능한 임계 온도를 나타내었다(LCST): HA-P1에 대해 24-25℃ 및 HA-B2및 HA-P2에 대해 31-32℃. 본 발명의 모든 HA 그래프트 폴리머는 Ostenil® 와 다른 용액(G''<G')이었고, HA-P2 경우에, G' 및 G'' 값이 빠르게 증가하였고, 특히 HA-B1과 다르게 탄성 성질(G')이 증가하였다. pNiPAM 및 링커의 그래프팅은나노입자 형성에 영향을 주고, 이어서 LCST 이상에서 유변학적 성질을 변화시켜 이상 나노입자-용매 혼합물임을 나타냈다.
실시예 4: 본 발명의 콘쥬게이트의 입자들의 크기 및 형태학
본 발명의 HA 그래프트 폴리머를 증류수 내에서 용해시켰고, HA 그래프트 폴리머 용액을 37℃에서 배양하여, 나노 입자를 형성하였다.
형성된 HA 나노입자의 평균 입자 크기는 3가지 방법으로 LCST 이상에서 결정되었다: Image J version 1.45s 분석 소프트웨어(NIH, USA), Dynamic Light Scattering (DLS) (Nanosizer, Malvern, England) 및 나노입자 트래킹 분석 (NTA) (NanoSight LM10, Malvern, England)을 사용하여 50 입자들의 직경을 측정한 주사 전자 현미경 사진 (SEM) (Jeol Microscope, JSM-7001TA, Tokyo, Japan). SEM 분석은 도 3에 도시된 것처럼 37℃에서 배양한 후 HA 콘쥬게이트의 나노입자 형태학을 밝혔다. HA-B1 나노입자는 다른 HA 콘쥬게이트에 비하여 보다 작고 매우 구형이었다. pNiPAM/HA의 높은 그래프팅 비는 온도의 함수로서 나노 입자의 구형 형성(도 3 ABC) 및 점도/탄도에 영향을 미쳤다. HA-P2 (도 3B)에 대해, 나노입자 크기는 PEG4 링커의 영향을 나타내었다. 또한, HA-P2 나노입자는 HA-B2의 빠른 가역적 전이와 다르게 LCST(31-32℃) 이하에서 느리게 재용해되었다(도 3E). 분명하게, PEG4 링커는 형성된 HA 콘쥬게이트의 용해성 및 나노 입자 크기에 영향을 미쳤다(표 1).
본 발명의 콘쥬게이트 SEM - 크기 모드
수 (nm)		 DLS - 크기,
강도 (nm)		 NTA - 크기
수 (nm)
HA-B1 88-97 223 ± 55 52
HA-B2 65-84 133 ± 24 53
HA-P2 203-261; 377-435 239 ± 95 231
대조적으로, Ostenil® 히드로겔 및 링커 없는 그래프트 폴리머 HA-pNiPAM(음성 대조군) (Fig. 3D)는 가열시 나노 입자를 전혀 형성하지 않았다.
실시예 5: 생체 내 형광(Intravital fluorescence)
본 발명의 콘쥬게이트의 인비보 잔류 시간은 다음과 같이 평가되었다:
마우스의 생체 내 형광은 마우스 내 2개 주사 경로(건강한 하피(hypodermis) 및 무릎 골관절염에서 관절 내 주사)로 투여한 후 HA-P2-Cy5 및 HA-Cy5 (비교 대조군)에 대해 평가되었다. HA-P2-Cy5 및 HA-Cy5 용액 (1 %w/v)을 관절 (n=7) 및 피하 (n=4)로 주사하였다. HA-Cy5의 경우에, 큰 차이가 관찰되었다. 7일 후, 총 신호는 관절 내 주사에서 감소하였고, 픽셀 면적은 피하 사이트에서 증가하였다. HA-Cy5는 주사 사이트에서 짧은 잔류 시간을 나타냈다(도 5).HA-P2-Cy5는 체온에서 자발적으로 나노입자를 형성하였다. 픽셀 면적이 증가하는 것은 평균 신호의 감소와 균형이 맞추어졌다. 명백하게, HA-P2-Cy5의 총 신호에 대해서는 큰 차이가 발견되지 않았다. HA 콘쥬게이트는 자발적 나노입자 형성으로 인하여 주사 사이트에서 체내 긴 잔류시간을 나타내었다(도 5).
실시예 6: 생체적합성
본 발명의 콘쥬게이트의 생체적합성은 다음과 같이 평가되었다:
건강한 마우스에 HA-P2-Cy5을 7 일(n=4) 및 21일(n=4) 피하 주사 후, 피부 조각을 제거하였고, 여기서 시아닌 5 형광이 검출되었고 정중면(sagittal plane) 내에서 절단되었다. 파라핀 내에 포매한 후, 4 μm 단편을 마이크로톰으로 절단하였다. 단편을 헤마톡실린-에오신 (HE)으로 염색하였다. 주사 부위에서 HA-P2-Cy5의 생체 적합성은 조직/물질 상호작용에 의해 제어된다. 21일 후 피하 주사시 HA-P2-Cy5의 상호작용 및 생체적합성이 확인되었다. 조직 반응에서 대식 세포, 조직 주요 세포들은 대조군(Ostenil®)에 비하여 조직을 더 이상 감싸지 않았다.
실시예 7: 인비트로 약물 방출
본 발명의 HA 그래프트 폴리머로부터 나노입자의 약물 방출 프로파일을 결정하기 위하여, 인비트로 약물 방출은 다음과 같이 수행되었다. 염류 용액(NaCl 0.9 %), Ostenil®, 본 발명의 그래프트 폴리머 HA-B2 및 HA-P2를 덱사메타손 염기 (약물)으로 포화시켰다. 10 mL의 이전 용액을 400 mL NaCl 0.9 % (w/v)에 대하여 투석 가방(MWCO 1,000, Spectra/Por® membrane, Rancho Dominguez, USA) 내에 넣고, 37℃ 및 80 RPM에서 배양하였다. 28 h 후, 폴리머 매트릭스는 가열(121 ℃)하여 가수분해시켜 남아있는 함량의 덱사메타손을 방출하고, DMSO를 첨가하여 물:DMSO의 최종 부피비가 1:1이 되게 하였다. 각 시점에서 방출된 약물을 C18 Hypersil Gold column (50/2.1, 1.9 μm bead particle size, Thermo Scientific, Waltham, USA)을 사용하여 역상 UHPLC로 정량화하였다. 이동상은 물 중 0.1% v/v 포름산(A) 및 아세토니트릴 중 0.1% v/v 트리플루오로아세트산(TFA)(B)로 구성되고, 경사 용리는 30-95 % A(0-3　min), 95-10 %A(3-4　min), 10-30 % A (4-4.5　min) 및 30 % A (4.5-5　min)을 사용하였고, 흐름 속도 400 μL.min-1으로 하였다.
HA 그래프트 폴리머는 대조군(염류 용액 및 Ostenil®)에 비하여 약 2.5 시간 더 덱사메타손을 잡고 있었다. 도 4에 도시된 것처럼, 분해(t=30) 후, 40%의 덱사메타손이 여전히 HA 콘쥬게이트의 나노 입자 내부에 존재하였다.
LCST 이상에서, HA 콘쥬게이트 나노입자에 덱사메타손 염기와 같은 소수성 약물 물질이 부하되었다. 이 연구는 새로운 약물 송달 시스템으로서 본 발명의 HA 콘쥬게이트 나노입자의 높은 효율을 나타내었다.
실시예 8: 안정성
본 발명의 그래프트 폴리머의 안정성은 다음과 같은 유변학 및 pH/제타 전위 측정값으로 평가되었다:
HA 그래프트 폴리머를 4℃에 저장하고 점도는 시간에 따라 체크하였다(t0, t7 및 t30). 유변학 측정은 HA-B2 (0.5 % w/v) 및 HA-P2 (0.75 % w/v)의 0.4mL 샘플을 가지고 35/2° Ti cone를 갖는 침상 평판 구조를 사용하는 Haake Rheostress(Vreden, Germany)를 가지고, 습도 제어된 방 내에서 20℃에서 0.1　s-1 내지 100　s-1의 로그적 전단 속도를 가지고 측정하였다. 상기 pH는 pH 겔 전극 Metrohm (Herisau, Switzerland)으로 측정되고, Zeta 전위는 Zetasizer NanoZS (Malvern, Worcestershire, UK)을 사용하여 측정하였다.
큰 점도 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 그래프트 폴리머 HA-B2 및 HA-P2가 4℃에서 1 개월 동안 안정하다는 것을 나타낸다. HA 그래프트 폴리머는 높은 제타 전위를 갖는 산 pH를 나타내며, 이는 콜로이드성 안정성을 확보하는 것이다(표 2). pH를 중화하기 위하여, HA 그래프트 폴리머는 인비트로/인비보 실험에 대해 포스페이트-완충 염류(PBS)에서 용해되었다.
pH 제타 전위 [mV]
HA-B1 7.5 % (w/v) 6.38 -30.7 ± 2.5
HA-B2 0.5 % (w/v) 5.64 -28.5 ± 1.2
HA-P2 0.75 % (w/v) 5.73 -32.6 ± 1.6
Ostenil® (1 % w/v) (완충제됨) 6.99 -34.5 ± 4.0
실시예 9: 세포 생존력 분석
생존성 시험은 인간 활막 섬유아세포(synovial fibroblast)를 사용하여 수행하였다. 세포들을 96-웰 플레이트 내에 20,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 24h 후, HA 콘쥬게이트 (HA-B2 및 HA-P2)를 PBS 내에 용해시키고, 37℃에서 24h 동안 배양되었다. 50㎕의 0.5 % MTT 용액을 3h 동안 각 웰에 첨가하였다. 모든 웰을 45분동안 100μL의 DMSO과 함께 배양하고, 흡광도는 BioTeK Synergy Mx (Winooski, USA)으로 570nm(웰 당 8 포인트)에서 측정하였다.
PBS 중 HA-B2 0.75 %(w/v) 및 HA-P2 0.5 %(w/v)는 처치되지 않은 대조군에 비하여 세포 생존력이 감소하지 않았다.

Claims (23)

  1. 히알루론산 폴리머 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머의 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    여기서 상기 히알루론산 폴리머 및 상기 N-이소프로필아크릴아미드 염기는 화학식(II)의 적어도 하나의 링커를 통해 콘쥬게이트되며:
    Figure pct00024

    여기서 Ra 및 Rb 중 하나는 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머에 공유적으f로 연결되고, Ra 및 Rb 중 어느 하나는 히알루론산 폴리머에 공유적으로 연결되고, Ra 또는 Rb가 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머에 공유적으로 연결될 때, 이는 R1 와 등가이고, Ra 또는 Rb가 히알루론산 폴리머에 공유적으로 연결될 때, 이는 R3와 등가이고, 여기서 R 1 는 -(CH2)x-NH-(CH2)y-S-, -(CH2)x-NH-O-C(O)-(CH2)y-S-, -(CH2)x-NH-(CH2)y-C(O)-NH-(CH2)z-S-, -(CH2)x-O-C(O)-CR7R8-, -C(O)-(CH2)x-C(O)-NH-(CH2)y-S 및 선택적으로 치환된 폴리에틸렌 사슬로부터 선택된 기이고, 여기서 R 7 및 R 8 는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬기이고; R 3 는 -E-G-L1-기이고, 여기서 E는 없거나, -C(O)-NR9-, -C(O)-O- 및 -C(O)-로부터 선택되고, G 는 선택적으로 치환된 C1-C20 알킬, 선택적으로 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬, 선택적으로 치환된 아실아미노 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 아실 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 아미노카보닐 C1-C6 알킬 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알콕시로부터 선택된 링커 기이고, L 1 는 -NR10C(O)-, -C(O)-NR10-, -C(O)-O- 및 -C(O)- 로부터 선택되며, 여기서 R 9 및 R 10 는 H 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되며; A 는 선택적으로 치환된 C5-C10-시클로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬 링이고, 여기서 R 5 는 H, 선택적으로 치환된 알콕시 및 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기를 나타내며; x, y 및 z는 1 내지 20로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 (I)의 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00025

    여기서 M은 화학식(M1) 및 화학식(M2)의 모이어티로부터 선택된 기이며:
    Figure pct00026

    R 2 은 -B-(CH2)i-D 기이고, 여기서 B는 없거나 또는 -S-C(S)-S- 및 -S-로부터 선택된 기이고; D는 선택적으로 치환된 C1-C15 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐 C1-C4 알킬, 선택적으로 치환된 아미노 C1-C4 알킬, 선택적으로 치환된 아미노카보닐 C1-C6 알킬, -COOH 및 -NH2으로부터 선택된 기이고; p는 1 내지 500으로부터 독립적으로 선택된 정수이고; i는 0 내지 500으로부터 독립적으로 선택된 정수이고; R 6 는 치환의 정도에 따라 -COOH 및 R 3 로부터 선택되고; L은 제1항에 정의된 화학식 (II)의 링커이고, n은 1 내지 7,000으로부터 선택된 정수이다.
  3. 제1항 또는 제 2항에 있어서, 화학식(Ia)를 갖는 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00027

    여기서 L, R2, R6 및 p는 제1항 또는 제2항에 설명된 것과 같다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 링커 L가 이의 Rb 치환기를 통해 그래프트 폴리머의 HA 모이어티에 연결되는, 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 링커 L이 이의 Ra 치환기를 통해 그래프트 폴리머의 HA 모이어티에 연결되는, 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 x가 2 내지 10의 정수인 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 B가 없거나 또는 -S-C(S)-S- 인 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 L이 화학식(II')에 따른 기인 정수인 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00028

    여기서 R 11 및 R 12 는 H, 선택적으로 치환된 알콕시 및 선택적으로 치환된 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기를 나타내고; Ra 및 Rb 는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 설명된 것과 같다.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 L이 화학식(II'') 및 (III''')로부터 선택된 화학식(II)에 따른 기인 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00029

    여기서 Q는 없거나, 또는 다음 화학식의 기이며: -NH-C(O)-(CH2-CH2-O)1-4- CH2-CH2-; G1 는 PEG, 특히 (CH2-CH2-O)1-4-이고, R 11 및 R 12 는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 설명된 것과 같다.
  10. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그래프트 폴리머가 다음 군으로부터 선택되는 그래프트 폴리머 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00030

    Figure pct00031
    및
    Figure pct00032

    여기서 치환도가 약 0.5 내지 50이다.
  11. 히알루론산 폴리머 및 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머의 그래프트 폴리머의 제조방법으로서, 여기서 상기 히알루론산 폴리머 및 상기 N-이소프로필아크릴아미드계는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 설명된 화학식(II)의 적어도 하나의 링커 L에 의해 콘쥬게이트되며, 다음 단계를 포함하는 제조방법:
    (a) "클릭 화학" 반응에 참여할 수 있는 적어도 하나의 제1 기능기에 콘쥬게이트된 적어도 하나의 카르복실산 기를 갖는 HA 폴리머를 제공하는 단계;
    (b) 제1 기능기와 함께 "클릭 화학" 반응에 참여할 수 있는 적어도 하나의 제2 상보적 기능기를 갖는 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 기능기들 중 하나는 아지드 모이어티이고 다른 기능기는 상기 링커 L의 알킨-갖는 전구체인, 단계;
    (c) "클릭 화학" 반응을 통해 HA 폴리사카라이드의 적어도 하나의 제1 기능기와 N-이소프로필아크릴아미드계 폴리머의 적어도 하나의 제2 상보적 기능기를 반응시켜 본 발명의 그래프트 폴리머 조성물을 얻는 단계; 및
    (d) 그래프트 폴리머 조성물을 분리시키는 단계.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제11항에 의해 얻어질 수 있는 적어도 하나의 그래프트 폴리머 및 적어도 하나의 담체를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 여기서 상기 조성물이 히드로겔 또는 나노입자 조성물인 조성물.
  14. 제12항 또는 제12항에 있어서, 여기서 상기 조성물이 약제학적 조성물이고 상기 담체가 약제학적으로 허용가능한 담체인 조성물.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 여기서 상기 조성물이 세포 또는 세포 또는 조직 영양제를 더 포함하는 조직 배양 배지인 조성물.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 조성물이 복원 조직인, 조성물.
  17. 제12항 또는 제13항에 있어서, 여기서 상기 조성물이 화장료 조성물이고, 상기 담체가 화장료적으로 허용가능한 담체인, 조성물.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제11항의 방법에 따라 얻어질 수 있는 적어도 하나의 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물을 포함하는 연조직 필러.
  19. 다음 단계를 포함하는 유효 성분의 송달 시스템을 제조하는 방법:
    a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항 또는 제13항에 따른 그래프트 폴리머 또는 히드로겔을 겔 상태로 제공하는 단계;
    b) 송달될 유효 성분을 제공하는 단계;
    c) 상기 그래프트 폴리머 조성물 또는 히드로겔을 상기 유효 성분과 혼합하는 단계;
    d) 선택적으로 상기 혼합물의 온도를 증가시켜 나노입자 형성을 유도하는 단계;
    e) 상기 유효 성분이 부하된 얻어진 조성물, 히드로겔 또는 나노입자를 수집하는 단계.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르거나 제11항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물로서, 조직 변성, 관절성 병리학, 관절 질환, 눈 병리학, 종양 또는 혈관 기형, 피부 괴사 또는 상처, 비뇨기과 조직 벌킹 및 종양 또는 혈관 기형로부터 선택된 의학적 질병의 예방 또는 치료에 사용되는 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 그래프트 폴리머 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 히드로겔 또는 조성물의 용도로서 약물 송달 시스템의 제조, 인비트로 세포 또는 생물학적 조직 배양 또는 조직 가공 물질의 제조를 위해 사용되는 용도.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제11항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 적어도 하나의 그래프트 폴리머 또는 이의 조성물을 포함하는 키트.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제11항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 그래프트 폴리머 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 제형을 효과적인 함량으로 이것이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 관절성 병리학, 관절 질환, 눈 병리학, 피부 괴사 또는 상처, 비뇨기과 조직 벌킹 및 임의 조직 변성, 종양 또는 혈관 기형으로부터 선택된 의학적 질병을 예방, 치료 또는 완화시키는 방법.
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