JP2010512220A - ヒドロゲルを形成する新規な注入可能なキトサン混合物 - Google Patents

Abstract

約３０％〜約６０％の範囲のアセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンと、少なくとも約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンとを含むキトサン組成物であって、ｐＨおよび温度依存的ゲル化を受けてヒドロゲルを形成することを特徴とするキトサン組成物、ならびにその調製方法および使用。
【選択図】図３

Description

本発明は、正の電荷を帯びた多糖類ヒドロゲルの分野に関する。より具体的には、本発明は、アセチル化の程度および比率、アセチル化部位の均一または不均一分布、それらの分子量、溶解性、および生分解性が異なる少なくとも２種の異なるキトサンの組成物を含むｐＨ依存性の感熱性多糖類ヒドロゲル、ならびにその調製方法に関する。

ヒドロゲルは、水または他の生体液に分散した、高度に水和した高分子ネットワークである。

温度の上昇に伴い粘性が上昇するという固有の特性を示すヒドロゲルは、感熱性（または熱硬化性）ヒドロゲルとして公知である。かかるヒドロゲルは、非感熱性ヒドロゲルと比べて、付された部位でのより長い生存期間と合わせて、より簡単に適用できることが示されており、それゆえ持続放出性薬物送達システムとして有利である。

感熱性ヒドロゲルは、β−１，４グルコシド結合を介して連結されたＮ−アセチルグルコサミン単位からできている線状多糖類であるキチンの部分的から実質的までのアルカリＮ−脱アセチル化によって得られる、市販されている安価なポリマーであるキトサンなどの天然起源のポリマー（非特許文献１）から調製できることが知られている。この脱アセチル化プロセスは、一般に、熱くて濃い水酸化物溶液、通常水酸化ナトリウムを用いて行われる。

キチンは、甲殻綱、エビ、カニ、菌類などの海洋生物の細胞骨格および堅い殻に見出される天然に存在する生体高分子であり、セルロースおよびラミナリンに次いで３番目に最も豊富に存在する天然に存在する多糖類である。キチンは、化学的に不活性であり、不溶性であり、薄片、粉、タイルなどの形態で結晶構造を有する。

キトサンは、遊離アミン（−ＮＨ₂）基を含有し、一般にそのキチンポリマーのアセチル化度（ＤＡ）（脱アセチル化の逆数）として表される、Ｄ−グルコサミン単位に対するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の比率によって特徴付けることができる。このアセチル化度、および分子量（ＭＷ）の両方がキトサンの重要なパラメータであり、溶解性、生分解性および粘性などの特性に影響を及ぼす。

キトサンは、唯一の正の電荷を帯びた多糖類であり、これによってキトサンは生体接着性となり、キトサンは付与部位からの薬剤の放出を遅延させ（非特許文献２、非特許文献３）、そして細胞外膜のグリコサミノグリカンなどのアニオン性の天然化合物とのイオン塩相互作用を可能にする。

キトサンは、生体適合性であり、無毒性であり、かつ非免疫原性であり、このためキトサンを医学、薬学、化粧品および組織構築の分野で使用することが可能である。例えば、局所的な眼への適用および眼内注入または網膜の近くでの移植（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。さらに、キトサンは、特定の特異的酵素、例えばリゾチームによって代謝・切断され、それゆえ生腐食性（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）かつ生分解性であると考えることができる（非特許文献７、非特許文献８）。加えて、キトサンは、酵素ヒアルロニダーゼ、いわゆる「拡散因子（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）」の作用と類似して、上皮の密着結合を開くことによって浸透促進剤として作用することが報告されている（非特許文献９、非特許文献１０）。キトサンはまた、創傷治癒を促進し、加えて抗接着剤（病的な接着を防止する）として作用し（非特許文献１１、非特許文献１２）、そして抗菌効果（非特許文献１３、非特許文献１４）、抗真菌効果、および抗腫瘍性を示す。

キトサンの顕著な特性を考慮して、薬物の持続放出および再生医療の成長産業で使用するための新しいキトサンヒドロゲルに対するニーズが高まっている。

最近、イオン性多糖類ゲル（キトサン／有機リン酸化合物含水系など）の温度制御されたｐＨ依存的形成が記載されている（特許文献１）。キトサン水溶液はｐＨ依存性ゲル化系であるが、ポリオールまたは糖類の一リン酸二塩基性塩をキトサン水溶液に添加すると、さらに温度制御されたｐＨ依存性ゲル化が導かれる。固体の有機リン酸化合物塩は、酸性水溶液中で０．５〜４．０％（重量／体積）のキトサンの範囲内で、低温で加えられ、溶解される。キトサン／有機リン酸化合物水溶液は、最初は低温（４℃）で保存され、後に３０〜６０℃の温度範囲内で吸熱的にゲル化される。キトサン／有機リン酸化合物溶液は、所望のゲル化温度で迅速にゲルに変わる。

多くの相互作用が溶液／ゲル転移に関与している。例えば、この塩の塩基としての性質および作用に起因する静電的反発の減少の結果としてのキトサンの鎖間水素結合の増加、ならびにｐＨを上昇させることによって高められるはずであるキトサン−キトサン疎水性相互作用などである。温度が上昇する際に起こるゲル化プロセスは、主にキトサンの疎水性引力の強化に起因して起こり、これはグリセロール部分（可塑剤としての役割を果たす）およびキトサンの存在下でも示される。低温では、強いキトサン−水相互作用は、キトサン鎖を凝集から保護する。加熱の際に、水分子の覆い（ｓｈｅａｔｈ）は取り除かれ、これによって、整列したキトサン高分子の会合が可能になる。さらに、温度が上昇すると静電気力は減少するかも知れず、疎水性相互作用が、キトサン混合物のゲル化に主に寄与することが予想される。

透明なキトサン／グリセロホスフェートヒドロゲルが調製されており、これは、無水酢酸を用いた再アセチル化によるキトサンの脱アセチル化の修正を必要とする。前もって濾過されたキトサンの使用、無水酢酸の希釈および温度の低下が、効率および再現性を改善することが示されている（非特許文献１５）。キトサン／グリセロホスフェートヒドロゲルの濁度は、キトサンの脱アセチル化度によって、およびグルコースアミンモノマーの分布様式に影響を及ぼす再アセチル化の際の媒体の均一性によって調節されることが示されている。透明なキトサン／グリセロホスフェートヒドロゲルの調製には、３０〜６０％の脱アセチル化度を有する均一に再アセチル化されたキトサンが必要である。

キトサンを含むヒドロゲルは、薬物送達のために非常に有用である。それらは、局所（関節内）経路によって好都合に投与することができ、それらは低侵襲手順を用いて注入可能であり、ヒドロゲルを用いた薬物送達は高レベルの濃度の薬物を直接に標的部位に提供し、そしてそれらはその薬物の全身的副作用および毒性を最少にする。

キトサンミクロスフェアが薬物の送達のために開発されており、このミクロスフェアでは、薬物放出は調製されたミクロスフェアの粒径、水和度、膨潤比または生分解性によって制御される。キトサンを架橋してネットワークを形成することによって、抗癌剤、ペプチド、抗生物質製剤、ステロイドなどの薬物の送達のためのキトサンミクロスフェアを開発しようとする試みがなされた。

従来のキトサン架橋反応は、キトサンとジアルデヒドとの反応を含んできたが、このジアルデヒドは生理的に有毒である可能性がある。より低い細胞毒性を有する新規なキトサンネットワークが、ゲニピンと呼ばれる天然に存在する架橋剤を用いて合成された。このゲニピンは、求核攻撃によるゲニピンとキトサンとの複素環式結合およびアミド結合の形成による二元機能性架橋を提供する（非特許文献１６）。

キトサン／ポリオール塩の組合せに基づく感熱性、中性溶液の調製が、非特許文献１７によって記載されている。これらの配合物は生理的ｐＨを有し、生きた細胞および治療用タンパク質を封入するために室温未満で液体として保持することができ、それらは体温で、何らの化学変性も架橋もなく一体的なゲルを形成する。単一のアニオン性頭部を有するポリオール塩を添加すると、ゲル形成にとって好都合な相乗的な力、例えば水素結合、静電相互作用および疎水性相互作用に起因して、ゲルの形成がもたらされる。生体内に注入されたとき、その液体配合物は、その部位でゲルインプラントに変わる。この系は、生体内の生物活性増殖因子の送達のための容器−貯蔵場所、および組織工学用途用の生きた軟骨細胞のための封入マトリクスとして使用された。

キトサン−グリセロールホスフェート／血液インプラントは、組織の量を増加させることにより、そしてその生化学的組成および細胞構成を改善することによりマイクロフラクチャー欠損の硝子軟骨修復を改善することが示されている（非特許文献１８）。マイクロフラクチャー欠損は、骨髄由来の細胞が定着している血餅で満たされており、この血餅はキトサンの組み込みによって安定化されている。それゆえ、かかるインプラントを使用すれば、より良好な完全性、生化学的特性の改善、およびその修復組織のより長い存続期間がもたらされると予想される。

人工筋肉として、バイオセンサとして、または人工臓器構成要素としての重要な応用を有し得る均一なサブミクロンのキトサン繊維は、電界湿式紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｗｅｔ−ｓｐｉｎｎｉｎｇ）技術（非特許文献１９）によって調製することができる。

キトサンベースのゲルは、大量の新しく合成されたアニオン性プロテオグリカンを閉じ込めることによって、椎間板（ＩＶＤ）細胞の封入のための足場に変わり、かつ足場としての役割を果たすことが示されている（非特許文献２０）。それゆえ、かかるゲルは、ＩＶＤ変性の早期の段階の間に髄核構造領域の機能を修復するのを助けるための細胞ベースの補給のための適切な足場となるであろう。より高密度の、線維性コラーゲン線維は、線維輪の構造的代替物としての役割を果たすことができ、内因性細胞とのコロニー形成が可能である。

コラーゲンゲルは、これまでに、ゲルに包埋された培養された軟骨細胞を用いた関節軟骨欠損の修復のために有用であることが示されている（非特許文献２１）。より最近には、キトサンヒドロゲルは、軟骨再生、ならびに急性および慢性の軟骨欠損に関連する膝関節痛の予防のために有用であることが示されている。

かかるキトサンヒドロゲルの先進的な臨床製品は、ＢｉｏＳｙｎｔｅｃｈによって生産されているヒドロゲルであり、これは特許文献２に記載されている。ＢｉｏＳｙｎｔｅｃｈの感熱性キトサンヒドロゲルは、約８０−９０％の脱アセチル化度を有する市販のキトサンを、ポリオールの一リン酸二塩基性塩、特にβ−グリセロホスフェート（β−ＧＰ）で中和することによって調製される。β−ＧＰをキトサンに付加することで、キトサンの沈殿なしにｐＨを約７まで高めることができるようになり、かつそのｐＨで、生理的温度でヒドロゲルを形成できるようになる。

キトサンヒドロゲル（ＢＳＴ−ＣａｒＧｅｌ（商標））がＢｉｏＳｙｎｔｅｃｈによって生産されており、これは軟骨欠損を充填し軟骨修復のための最適環境を提供する。このキトサン可塑剤混合物は、患者自身の血液を生物学的成分の唯一の供給源として用いて、マイクロフラクチャー後の切除された軟骨欠損内に送達される。この混合物は欠損を充填し、８−１２分以内にその部位で固化し、軟骨再生のための有効な足場を提供する。次いで正常な軟骨細胞は、深部の中骨（ｄｅｅｐ ｉｎｎｅｒ ｂｏｎｅ）からマイクロフラクチャーの細孔を通って移動し、そのゲルで充填された病変に現れる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）。

第２のＢｉｏＳｙｎｔｅｃｈキトサンヒドロゲル、ＢＳＴ−ＤｅｒｍＯｎ（商標）は、創傷治癒を刺激して後押しするための局所治療として使用することができる。この製品は粘膜付着性バリアとして作用し、かつガス交換を許容し続けつつ、その創傷を密封して湿潤環境を維持することができる。

さらなるＢｉｏＳｙｎｔｅｃｈキトサンヒドロゲル、ＢＳＴ−ＩｎＰｏｄ（商標）は、踵痛の治療を意図している。これは、患者自身の脂肪体（ｐａｄ ｆａｔ）と一体化して生体力学的クッション特性および快適さを修復することによって足底脂肪体の快適さを持続的に修復することを意図した注入可能な製品である。

これらの有望な例は、いくつかの限界をも呈する。約１５−２０％ ＤＡのアセチル化度を有する市販されているキトサンを含むＢｉｏＳｙｎｔｅｃｈ製品は、望ましくない、より遅い分解速度をもたらすと考えられている。さらに、キトサンは、三次元的な足場を形成するために７．４という生理的ｐＨで細胞と混ざってそれを封入する能力が限られている。

ヒドロゲルのＢｉｏＳｙｎｔｈｅｃｈファミリーは限られた分解速度を有し、かかるヒドロゲルの形成には、グリセロホスフェートまたは類似の可塑性塩の存在が必要である。グリセロホスフェートは、生理活性成分の正電荷と反応して、それらの沈殿、またはそのヒドロゲルからのそれらの放出の乱れを導くことができる負の電荷を帯びた分子エンティティである。それゆえ、グリセロホスフェートの存在は、キトサン／グリセロホスフェートヒドロゲルとともに使用することができる薬物の範囲を狭め得る。

さらに、ヒドロゲルの特性（ゲル化時間および粘性など）の調節は、グリセロホスフェート濃度に依存し、それゆえグリセロホスフェートの溶解性によって制限される。特に、高濃度のグリセロホスフェートは、低ゲル化時間を有して、その投与後のヒドロゲルの急速な排泄を回避することが必要とされる。しかしながら、高濃度のグリセロホスフェートはヒドロゲルの粘性を低下させもする。それゆえ、ゲル化時間はヒドロゲルの粘稠度と釣り合いが取れていなくてはならず、特徴の所望の組合せである低ゲル化時間と高粘性の両方を有するヒドロゲルを得ることは不可能である。また、あまりに高濃度のグリセロホスフェートは、そのヒドロゲルの投与部位でヒドロゲルの沈殿を誘発する可能性がある。

さらに、感熱性キトサン／グリセロホスフェートゲルは濁っていることが見出され、従って、これは、それらの使用が特定の付与（眼投与または局所投与など）には不適切なものにする。

新規な種類のキトサンが同定されている。約３０％〜約６０％のアセチル化度を有する均一にアセチル化されたキトサンを生産するための市販のキトサンの再アセチル化が、グリセロールホスフェートを使用する必要性なしに、生理的ｐＨでの水および体液へのキトサンの溶解性を大きく増加させることが見出された。かかるキトサンは、細胞封入のために使用することができる澄んだ透明なゲルを生成する（Ｂｅｒｇｅｒに対する特許文献３）。

再アセチル化キトサンの調製で使用することができる市販のキトサンの例は、アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、米国、ミルウォーキーから入手される、非特許文献４によって報告されるサイズ排除クロマトグラフィ法によって測定された場合の１１００ｋＤａのＭＷ、および非特許文献２２によって報告されるＵＶ方法によって測定された場合の８３．２％の脱アセチル化度ＤＤを有する、医薬品等級および高ＭＷのキトサンである。しかしながら、８０〜９０％の脱アセチル化度および１０ｋＤａ以上の分子量を有する任意の市販のキトサンを使用することができる。市販のキトサンを溶解させるために使用される酸性媒体は、例えば酢酸であってよく、キトサンの可溶化の後に得られるキトサンの酸性溶液は、次いでアルコール、例えばメタノールで希釈してよい。

キトサンの均一な再アセチル化は、一方で、アミン基をアセチル基で置き換えることにより疎水性部位の数を増加させるという効果を有するが、他方で、キトサンに折り畳まる傾向を持たせる結晶構造は、大きく減少し、累積的にそのキトサンの溶解性を増加させる。再アセチル化は、そのポリマーの再折り畳みを防止し、直鎖を維持し、従ってｐＨに関連する溶解性の減少を防止する。

一般に、市販されているキトサンは、乾燥したキチンの薄片の脱アセチル化によって工業的に調製される（非特許文献２２）。脱アセチル化は、その薄片の表面でのキチン分子の非晶質帯で優先的に起こり、様々なブロックサイズの脱アセチル化単位分布を有する不均一なモノマーをもたらす（非特許文献２３）。それに対して、均一な条件下での再アセチル化キトサンは、脱アセチル化モノマーのランダム分布をとり、これはキトサンの結晶化度の減少を誘発し、ひいてはその溶解性を増加させる（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）。

応用についてのポリマーヒドロゲルの適性は、それらの生体適合性、機械的完全性、生理的ｐＨでのゲル形成のスピードおよび可逆性、ならびにそれらの低分子量および引き延ばされた寿命によって決定される。しかしながら、公知のキトサンヒドロゲルの種々の重要な特性（強度、分解速度、および放出プロファイルなど）に対してはほどんと制御することはできない。

米国特許第６，３４４，４８８号明細書 国際公開第９９／０７４１６号パンフレット 国際公開第０５／０９７８７１号パンフレット

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従って、キトサンを含み、かつゲルの物理的特性が必要に応じて操作できるヒドロゲルに対する広く認識されたニーズが存在し、そしてそれを手にすることは非常に有利であろう。

本発明は、多糖類ヒドロゲルを形成するためのｐＨおよび温度依存性組成物を提供する。

本発明の一態様によれば、キトサン組成物であって、約３０％〜約６０％の範囲のアセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンと、少なくとも約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１腫のキトサンとを含み、この組成物がｐＨおよび温度依存的ゲル化を受けてヒドロゲルを形成する組成物、が提供される。

本発明の別の態様によれば、約３０〜約６０％のアセチル化度を有する少なくとも１種の高度にアセチル化されたキトサンと、約７０％からの脱アセチル化度を有する少なくとも１種の高度に脱アセチル化されたキトサンとの組成物を含む安定なヒドロゲルの生産のための方法が提供される。この方法は、少なくとも１種の高度にアセチル化されたキトサンおよび少なくとも１種の高度に脱アセチル化されたキトサンを酸に溶解させて複合溶液を形成する工程と、この複合溶液のｐＨを６．５より上〜約７．２の値に調整する工程と、この複合溶液の温度を、ｐＨを約７．０から約７．６まで上げつつ約３７℃まで上昇させる工程と、を含む。

本発明のさらに別の態様によれば、約３０〜約６０％のアセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンと、約７０％からの脱アセチル化度を有する少なくとも１種の高度に脱アセチル化されたキトサンとの組成物を含むヒドロゲルを含む持続放出性薬物送達システムが提供される。

少なくとも２種のキトサン種のこの混合物から得られるキトサンゲルは、薬物を封入するキトサンのミクロスフェアおよび／またはそのゲルに包埋された電界紡糸されたキトサン繊維を任意に含んでよい。

後述される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、上記組成物のゲル化はｐＨ６．５より高いｐＨで起こる。

記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ゲル化は生理的ｐＨ近くおよび３７℃で起こる。

上記高度にアセチル化されたキトサンは、均一にアセチル化されているか、均一に脱アセチル化されているかのいずれかであってよい。任意にそして好ましくは、上記高度に脱アセチル化されたキトサンは、不均一に脱アセチル化されている。

上記高度にアセチル化されたキトサンおよび上記高度に脱アセチル化されたキトサンは、任意に、各々、全組成物の約０．１％〜約６％（重量／体積）の濃度で存在してよく、各々、約１０ｋＤａ〜約４０００ｋＤａの範囲の分子量を有してよい。任意にそして好ましくは、上記高度に脱アセチル化されたキトサンは、約２００ｋＤａより大きい分子量を有する。さらに任意にそして好ましくは、上記高度にアセチル化されたキトサンは、約６０ｋＤａより大きい分子量を有する。

上記ヒドロゲルの特性は、高度にアセチル化されたキトサンおよび高度に脱アセチル化されたキトサンの両方の分子量、脱アセチル化度ならびに脱アセチル化部位の分布を操作することにより制御することができる。これらの操作は、ゲル特性（例えば、ゲル化温度、密度もしくは空隙率、または水和度または疎水性度など）に影響を及ぼすであろう。このヒドロゲルの分解速度は、リゾチーム阻害薬トリ−Ｎ−アセチル−グルコサミンを上記高度にアセチル化されたキトサンに結合することによってさらに制御することができる。

本発明の組成物は、任意にさらに、負の電荷を帯びた多糖類（例えば、動物または植物由来のポリマーなど）を含んでいてよい。植物由来のポリマーの非限定的な例として、上記負の電荷を帯びた多糖類は、任意に海藻を含んでいてよい。あるいは、その負の電荷を帯びた多糖類は、任意にグリコサミノグリカン（例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸など）、または他の酸性ポリマー（硫酸デキストランなど）を含んでいてよい。

好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の組成物は、さらに薬物、ポリペプチドおよび細胞（動物細胞または植物細胞など）のうちの少なくとも１つを含んでいてよい。

上記組成物は、さらに乳化剤を含んでいてよい。任意に、上記キトサンおよびこの乳化剤は、ナノ粒子を形成してよい。

本発明のヒドロゲルは、任意に、例えば、薬物送達、細胞成長の支持体、骨構造の支持体、軟骨修復、組織再構成、創傷治癒、人工皮膚の生産、抗高脂血症薬およびコレステロール低下剤として、人工腎臓膜の形成、骨充填、ならびに例えば踵痛軽減に関する軟組織再構成などの応用において使用することができる。このヒドロゲルの形成のための組成物は、任意に注入または内視鏡的投与などの経路によって投与してよい。

このヒドロゲルは、任意に、埋め込み型装置の調製において使用するための、例えば組織修復、組織再構成、組織構築、および組織置換において使用するための生体適合性材料の調製において使用することができる。

いくつかの実施形態では、キトサンの抗接着性によって、このゲルは、例えば心肺手術および開腹手術などの応用における抗接着性装置として有用なものとなる。

好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、上記ヒドロゲルは、任意に、薬物送達装置の調製において使用することができる。この薬物送達装置は、任意に、包埋された薬物の持続放出を提供してよい。この系で使用するための薬物の非限定的な例としては、タンパク質（ＢＳＡもしくはヘモグロビンなど）または非タンパク質薬物（例えば、ＡＣＥ阻害薬または抗炎症薬など）が挙げられる。この薬物送達システムは、そのゲルの透明性に起因して、任意に、眼科用薬物送達システムとすることができる。しかしながらこの薬物送達システムはまた、任意に、泌尿器科への応用（膀胱尿管逆流現象など）のために、および化粧品への応用（例えば、しわ治療など）において実施されてもよい。

上記薬物は、任意に、１種以上のミネラル、ビタミン、食品添加物または天然エキス（例えば植物由来のエキスなど）をも含んでいてよい。このゲル自体は、任意に活性成分とともに、任意に食品添加物として使用することができる。

あるいは、上記ヒドロゲルは、任意に、三次元的ゲル構築物において内因性細胞を支持するために使用することもできる。さらなる代替的形態として、上記ヒドロゲルは、任意に、添加した増殖因子を伴いまたは伴わずに外因性細胞を包埋するために使用することができ、その上、上記細胞は代謝産物（増殖因子など）を提供してよい。またあるいは、上記ヒドロゲルは、任意に、細胞が、例えば、軟骨細胞、線維軟骨細胞、靭帯線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、腱細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞およびケラチノサイトである、細胞を付した人工マトリクスの生産において使用してよい。

本発明の好ましい実施形態によれば、活性成分を含有し、かつ約３０％〜約６０％の範囲のアセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンと、少なくとも約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンとを含むヒドロゲルに封入されたナノ粒子を含むキトサン組成物であって、このヒドロゲルがｐＨおよび温度依存的ゲル化によって形成されることを特徴とするキトサン組成物が提供される。任意に、この組成物は、さらに乳化剤を含む。また任意に、このヒドロゲルは、被験者に注入した際に形成される。

いくつかの実施形態によれば、キトサンゲルは、任意に、膣萎縮、ドライアイ、結膜炎乾燥（ｃｏｎｊｕｃｔｉｖｉｔｉｓ ｓｉｃｃａ）、上気道感染症後のドライノーズ（ｄｒｙ ｎｏｓｅ）などの応用における潤滑剤として、および種々の擦り傷のための一般的な無痛化剤として使用することができる。キトサンゲルはまた、任意に、局所注入または体外マッサージのいずれかによって、筋膜の疾患（線維筋痛症など）における抗炎症薬として使用することができる。

本発明は、物理的および化学的特性を正確に決定できるヒドロゲルを形成する組成物を提供することによって、多糖類ヒドロゲルを形成するための現在公知の組成物の欠点に成功裏に対処する。

特に定義しない限り、本願明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本願明細書に記載されるものと類似または均等な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は、以下に記載されている。不一致の場合には、定義を含めて本願明細書が支配する。加えて、上記材料、方法、および実施例は、例示としてのみのものであり、限定するものであるとは意図されていない。

本発明は、例のみとして、添付の図面を参照して、本願明細書に記載される。ここで図面を詳細に個別に参照することについて、示された特定の例は例としてのものであって、本発明の好ましい実施形態の例示的考察の目的のためのみのものであり、最も有用であり本発明の原理および概念的態様の説明が直ちに理解されると考えられるものを提供するために提供されているということを強調しておく。この点に関して、本発明の基本的理解のために必要なもの以上に詳細に本発明の構造上の詳細を示そうとはしておらず、記載は、本発明のいくつかの形態がどのように実際に具現化され得るかを当業者に対して明らかにする図面とともに解釈される。

２種の異なる種類のキトサンを含む液体組成物からの本発明に係るヒドロゲルの形成を示す図である。 本発明の原理に係るキトサン１型および２型を含む組成物の分解時間を示す図である。 異なる比でキトサン１型および２型を含む組成物の分解時間を示す図である。 溶離液中のμｇ／ｍｌによって測定した場合の本発明のヒドロゲルからのヘモグロビンの放出を示す図である。 光学密度（ＯＤ）によって測定した場合の本発明のヒドロゲルからのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の放出を示す図である。 本発明のヒドロゲルからのＢＳＡの放出を示す棒グラフである。 本発明のヒドロゲルの分解プロファイルを示す図である。 ＢＳＡの放出プロファイルと本発明のヒドロゲルの分解プロファイルとを統合して示す図である。 本発明のヒドロゲルを用いて処置したラットから採取した創床組織診の病理組織学を示す図である。 本発明のヒドロゲルを用いて処置したラットから採取した創床組織診の病理組織学を示す図である。 処置の結果のグラフである。 回旋筋腱板損傷についてラットに対して行った生体内実験の結果を示す図である。 回旋筋腱板損傷についてラットに対して行った生体内実験の結果を示す図である。

本発明者らは、少なくとも２種の異なる種類のキトサン（この異なる種類はそれらのアセチル化／脱アセチル化度およびアセチル化単位の均一性のレベルに従って分類される）を含む組成物が、１種のキトサンを含むヒドロゲルと比べて、種々の物理的および化学的特性に対するより大きな程度の制御が可能であるヒドロゲルを提供することを見出した。

約７０−１００％の脱アセチル化度（ＤＤ）（すなわち、約３０％までのＤＡ）まで脱アセチル化されているキトサン、例えば市販されているキトサンは、１型キトサンと名付けることができる。これらのキトサンは、生理的ｐＨでは不溶性であり、リゾチームによってほとんど認識されず、生分解が遅いという結果になる。この種類のキトサンによって形成されるゲルは、低アセチル化度を有し、多くの疎水性相互作用とともに高密度の水素結合を形成する。分解速度は、脱アセチル化度の関数であることが示されている。キトサンの分解は、細胞増殖およびリモデリングに影響を及ぼす。

（約３０％〜約６０％のアセチル化度を有する）高度に均一に脱アセチル化または再アセチル化されたキトサンは、２型と名付けられる。かかるキトサンは、リゾチームによって直ちに消化／分解され、これにより制御された薬物放出が可能になる。キトサンの脱アセチル化度が３０％より低い場合には、そのキトサンは、酸性条件に不溶であってその結果として本発明では使用できない、キチンに近いポリマーとなる。６０％を超える脱アセチル化度では、キトサンの沈殿が起こる。

キトサンの脱アセチル化度は、Ｒ．Ａ．ＭｕｚａｒｅｌｌｉおよびＲ．Ｒｉｃｈｅｔｔｉ， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．５，４６１−４７２，１９８５またはＲ．Ａ．ＭｕｚａｒｅｌｌｉおよびＲ．Ｒｉｃｈｅｔｔｉ， 「Ｃｈｉｔｉｎ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ ３８５−３８８，１９８６による文献に記載されているような分光光度法によって測定することができる。手短に言えば、例えば後者の方法では、キトサンは１％ 酢酸に可溶化され、ＤＤは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン溶液を標品として使用して、２００、２０１、２０２、２０３および２０４ｎｍのＵＶによってそのＮ−アセチル−グルコサミン含有量を測定することによって測定される。

好ましい実施形態によれば、本発明は、約３０％〜約６０％のアセチル化度を有する少なくとも１種の高度にアセチル化されたキトサンと、少なくとも約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１種の高度に脱アセチル化されたキトサンとの組合せを含む多糖類ヒドロゲル組成物に関する。

高度にアセチル化された２型キトサンは、静電相互作用、水素相互作用および疎水性相互作用を介して、１型ファミリーの高度に脱アセチル化されたキトサンと相互作用することができる。相互作用の程度は、ｐＨが高くなるにつれて大きくなる。両種のキトサンの溶液を含む組成物は、生理的ｐＨで、グリセロホスフェートを必要とせずに、安定なゲルを形成することができる。

１型キトサンは、生理的ｐＨよりも低い約６．５のｐＨで沈殿する。高度に疎水性の均一なキトサン２型とキトサン１型との相互作用は、水素結合および疎水性結合の形成によって不均一にアセチル化された１型キトサンのこの沈殿を防止し、約ｐＨ６．７から安定な溶液の形成、および約ｐＨ７．０以上での安定な半固体ヒドロゲルの形成を可能にする。

形成される二次的な結合によって、不均一なキトサン鎖の封入が可能になり、そのｐＫａ値よりも大きいｐＨでのその溶解性を維持する。一般に、かかる二次的鎖相互作用は、ゲル形成に関与する主要な分子力である（Ｃｈｅｎｉｔｅら、２０００；Ｂｅｒｇｅｒら、２００５）。

１型キトサンは、主にゲルの安定性、強度および剛性に寄与し、ゆっくりとした分解を提供するが、２型キトサンはゲルの柔らかさ、弾性および急速可溶化に寄与する。１型および２型キトサンの異なる分解プロファイルは、さらに後述の実施例２で考察され、図２に示される。

ゲルの物理的および化学的特性は、そのキトサンの分子量および／またはそれらのアセチル化度を上げるまたは下げることにより、ならびに異なる供給源由来のキトサンの天然のアセチル化の多様性によって変えられる。ゲルの特性はさらに、再アセチル化の種類（すなわち、均一または不均一）を選択することにより、または脱アセチル化／アセチル化部位の分布のパターンをマッピングする（ｍａｐｐｉｎｇ）ことにより、制御することができる。

好ましくは、上記高度にアセチル化されたキトサンは均一にアセチル化されている。さらに好ましくは、上記高度に脱アセチル化されたキトサンは不均一に脱アセチル化されている。

キトサンの分子量を大きくするとその粘性が上昇し、その結果、そのポリマーは高度に水和され、高度に疎水性となる。かかるポリマーから形成されるゲルは、それゆえ高められた強度、およびより大きい保水力を有する。これは、ゆっくりとした分解速度、ゆっくりとした薬物放出、および改善された機械特性をもたらす。好ましくは、この高度にアセチル化されたキトサンおよび高度に脱アセチル化されたキトサンの各々は、約１０ｋＤａ〜約４０００ｋＤａの分子量を有する。キトサンの分子量は、例えばＯ．Ｆｅｌｔ，Ｐ．Ｐｕｒｒｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｍａｙｅｒ，Ｂ．Ｐｌａｚｏｎｎｅｔ，Ｐ．ＢｕｒｒｉおよびＲ．ＧｕｒｎｙによってＩｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１８０，１８５−１９３（１９９９）で報告されているようにして、サイズ排除クロマトグラフィによって容易に測定することができる。ＭＷの上限は投与の容易さによって決定され、これは選択された応用に依存する。

アセチル化度を高くすると、０−３０％ ＤＡの範囲では疎水性の上昇が起こるが、より高い値、例えば３０−６０％ ＤＡでは、このポリマーは、ＤＡの量が高くなるにつれてますます可溶性になり始める。さらに、アセチルグルコサミン基の数を増加させると、リゾチームに対する認識部位の増加に起因して、体内での分解速度が上昇する。従って、身体からのヒドロゲルの放出速度は、キトサンのアセチル化度を変えることによって制御することができる。

分子量、脱アセチル化度およびアセチル化部位の分布の変更は、ゲル形成が起こる条件（ｐＨ、温度など）；溶解性；生分解性；タンパク質、活性医薬成分または他の化学物質との反応性の程度；疎水性／親水性；水和度；ならびにゲルの生物学的特性および生体適合性特性（細胞成長、増殖および生存に対する効果、炎症メディエーターまたは抗炎症メディエーターとして機能するためのキトサンの能力、および創傷治癒の促進または減速に対するキトサンの効果など）に影響を及ぼす。

例えば、より高分子量の１型キトサンは、より高い疎水性およびより高い粘性を有し、その結果、より高い分子間相互作用に起因してより強靭なゲルをもたらす。より高いＤＤＡの１型キトサンは、より低い分解速度を有する。より高い結晶化度を有する１型キトサンは、その結晶形が不溶性であるという事実に起因して、より低い分解速度を有する。従って、当業者は、得られるゲル混合物の特性を予測することができ、それゆえ、異なる種類のキトサンの特有の組合せを用いて、所望の特徴を有するゲルを創出することができるであろう。

好ましくは、高度にアセチル化されたキトサンおよび高度に脱アセチル化されたキトサンの各々は、全組成物の約０．１％〜６％（重量／体積）の濃度で存在する。

本発明の組成物は、体温および生理的ｐＨでゲルを形成する。本発明のゲルは、グリセロホスフェートを必要としない。

本発明のヒドロゲルは、ＢｉｏＳｙｎｔｅｃｈによって特許取得されたキトサン／βＧＰベースのヒドロゲルよりも、ゲル強度、分解速度、および放出速度を制御するより大きな可能性を提供し、そしてゲルの特性を制御する可能性、およびそれらをはるかに広範囲の化学的および物理的用途のニーズに合わせる可能性を広げる。

本発明に係る多糖類ヒドロゲルは、任意に、キトサンと、グリコサミノグリカン（例えば、ヒアルロン酸またはコンドロイチン硫酸）などの負の電荷を帯びた多糖類とのハイブリッドを含んでいてよい。

ヒアルロン酸を添加すると、安定なゲルを形成するための１型キトサンおよび２型キトサンを含む組成物の沈殿を引き起こすことが見出された。

本発明のヒドロゲルはさらに、異なる分子量または脱アセチル化度を有し、従って生成するヒドロゲルに対する制御を拡張する１型または２型のいずれかから選択される第３のキトサンを含んでいてよい。

このように、これらの２種のキトサンに基づく異なる組成物および混合物は、広範囲の応用（例えば薬剤または薬物の持続放出のための薬物またはタンパク質送達システム、種々の粘稠度の足場材料（細胞成長を後押しするためのゲル、または骨構造支持体を含む）；軟骨修復；組織再構成；無瘢痕治癒およびマクロファージ活性化を促進する創傷包帯材において；人工皮膚の生産のために；抗高脂血症薬（ｈｉｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ａｇｅｎｔ）および低コレステロール低下剤（ｈｉｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｍｉｃ ａｇｅｎｔ）として；人工腎臓膜として；骨充填のために；および踵痛軽減など）のために適切な特性を有する半固体ゲルを提供するために使用することができる。

このゲルは、皮下に、腹腔内に、筋肉内にまたは生物学的結合組織、骨欠損部、骨折箇所、関節腔、身体導管（ｂｏｄｙ ｃｏｎｄｕｉｔ）または体腔、眼の結膜嚢、または固形腫瘍内に、その部位で形成され得る。

この多糖類ゲル溶液は、注入または内視鏡的投与によって動物またはヒトの身体内に導入することができる。

薬物、ポリペプチド、生きた微生物、動物またはヒトの細胞は、ゲル化に先立ち、この多糖類ゲル内に組み込むことができる。

本発明によれば、化粧品、薬理学、医学および／または手術において使用される生体適合性の分解性材料を生産するための多糖類ゲルの使用も提供される。

このゲルは、動物あるいはヒトのいずれかにおける組織ならびに／または臓器の修復、再構成および／もしくは置換のための埋め込み型装置またはインプラントの中に、全体として、または構成成分として、組み込まれていてもよい。

このゲルは、埋め込み型、経皮型または皮膚用薬物送達システムの全体として、または構成成分として使用してよい。

このゲルは、眼科用インプラントまたは薬物送達システムの全体として、または構成成分として使用してよい。

このゲルは、生物工学によって作られたハイブリッド材料および組織等価物の処理および培養に適用される細胞を付した人工マトリクスを生産するために使用してよい。

この付された細胞は、軟骨細胞（関節軟骨）、線維軟骨細胞（関節半月）、靭帯線維芽細胞（靭帯）、皮膚線維芽細胞（皮膚）、腱細胞（腱）、筋線維芽細胞（筋肉）、間葉系幹細胞、ケラチノサイト（皮膚）、およびニューロン、ならびに脂肪細胞または骨髄細胞からなる群から選択されてよい。実際、増殖できる任意の組織由来の細胞は、任意に、かかる構築物の中に包埋されてよい。

創傷治癒にとっての主な障害は生物膜の存在である。生物膜は、少なくとも８０％の、通常はキトサンと同様に正の電荷を帯びている細胞外高分子から構成されている。キトサンは、任意に、生物膜破壊物質（ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）として使用することができ、従って、創傷の衛生を助けて微生物の破壊に対する生物膜の阻害効果を制限する。ラクトフェリンと混合されたキトサンゲルは、任意に、任意の慢性創傷または慢性になり得る創傷において生物膜を破壊するための持続放出の貯蔵場所として作用することができる。キシリトールと混合されたキトサンゲルはまた、任意に、特異的生物膜破壊物質であり得る。

本発明によれば、動物またはヒトの生理的位置での骨様、線維軟骨様または軟骨様組織のその部位での形成のための支持体、担体、再構成装置または代用品として作用する注入可能または埋め込み型のゲル生体用材料としての、付された多糖類ゲルの使用もまた、提供される。

例えば、本発明に係るキトサンゲルは、眼の治療のための持続薬物送達システムとして有用であり得る。キトサン化合物の眼球刺激試験に基づく結果から、キトサン製剤は、その優れた許容度（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）に基づき、眼科用ゲルとして使用するのに適していることが示された（Ｍｏｌｉｎａｒｏら、２００２）。

本発明のさらなる実施形態によれば、高度にアセチル化された１型キトサンおよび高度に脱アセチル化された２型キトサンを含む持続放出性薬物送達ヒドロゲルシステムが提供される。

本発明の薬物送達システムのいずれも、実に広範な薬物の送達のために使用することができ、その薬物としては、鎮痛薬、麻酔薬、抗ざ瘡薬（ａｎｔｉａｃｎｅ ａｇｅｎｔ）、抗加齢薬、抗菌薬、抗生物質、火傷治療薬（ａｎｔｉｂｕｒｎ ａｇｅｎｔ）、抗うつ薬、抗皮膚炎薬、抗浮腫薬（ａｎｔｉｅｄｅｍｉｃ）、抗ヒスタミン薬、駆虫薬、抗過剰角質薬（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｌｙｔｅ ａｇｅｎｔ）、抗炎症薬、抗刺激剤、抗高脂血症薬、抗微生物薬、抗真菌薬（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、抗酸化剤、鎮痒薬、乾癬治療薬、抗酒さ薬（ａｎｔｉｒｏｓａｃｅａ ａｇｅｎｔ）、抗脂漏薬、消毒薬、抗腫脹薬（ａｎｔｉｓｗｅｌｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、抗ウイルス薬、抗酵母剤（ａｎｔｉｙｅａｓｔ ａｇｅｎｔ）、心血管治療薬、化学療法薬、コルチコステロイド、殺菌剤、ホルモン、ヒドロキシ酸、角質溶解薬、ラクタム、殺ダニ剤（ｍｉｔｏｃｉｄｅ）、非ステロイド系抗炎症薬、シラミ駆除剤、プロゲスチン、胃酸過多治療薬（ｓａｎａｔｉｖｅ）、疥癬虫殺虫剤、および血管拡張薬が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のさらなる実施形態によれば、約３０〜約６０％のアセチル化度を有する少なくとも１種の高度にアセチル化されたキトサンと、約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１種の高度に脱アセチル化されたキトサンとの組成物を含む安定なヒドロゲルの生産のための方法が提供される。この方法は、高度にアセチル化されたキトサンをＨＣｌ溶液に溶解させる工程と、高度に脱アセチル化されたキトサンをＨＣｌ溶液に溶解させる工程と、高度にアセチル化されたキトサンの溶液を高度に脱アセチル化されたキトサンの溶液と混合して複合溶液を形成する工程と、この複合溶液のｐＨを中性ｐＨに調整する工程と、この複合溶液の温度を約３７℃まで上昇させる工程とを含む。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の記載で示された詳細または実施例により例示された詳細への適用に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態をとり得るし、または種々の方法で実践もしくは実施することができる。また、本願明細書で用いられる表現および専門用語は説明のためのものであり、限定するものと見なされるべきではないということも理解されたい。

本願明細書で使用する場合、用語「約」は±１０％を指す。

本願明細書で使用する場合、本発明の組成物に関しての用語「擬熱硬化性（ｐｓｅｕｄｏ−ｔｈｅｒｍｏｓｅｔｔｉｎｇ）」は、温度はその組成物のゲル化を誘発せず、むしろ、温度が上昇したときに、ゲル化時間を劇的に短縮する触媒として作用することを意味する。

本願明細書で使用する場合、用語「中和された」は６．８−７．２のｐＨを意味する。

（実施例１：キトサンヒドロゲルの調製）
１５％のアセチル化度および６５ＫＤａの分子量を有するキトサン３％（株式会社コーヨー、日本）を、０．９％ ＨＣｌと２４時間混合することによって溶解させ、１型キトサン溶液を形成した。

５１％脱アセチル化および２２０ＫＤａの分子量を有する３％の均一な脱アセチル化キトサン（株式会社コーヨー、日本）を、０．９％ ＨＣｌと２４時間混合することによって溶解させ、１型キトサン溶液を形成した。

この１型および２型キトサン溶液を以下の１型：２型の比、１：１、２：１および３：１に従って混合し、ｐＨ６．８まで滴定し、４℃で２４時間放置し、次いでさらに水酸化ナトリウムを用いて４℃でｐＨ７．２まで滴定した。生成した組成物は、室温で液体であった。温度を３７℃まで上昇させ、ｐＨを７．４まで上げると、この液体溶液は、図１に示すように、安定な半固体ゲルを形成した。

１ｇのこのゲルを、５０ｍｌのプラスチックチューブに入れた（１水準につき３個）。

１０％ ウシ血清培地の３ｍｌのアリコートを、所定の時間間隔（１日、２日、３日、４日、５日、６日、および７日）の間で各チューブに加えた。各時間間隔の終わりに、このゲルを、繰り返し５０ｍｌの蒸留水を加え、室温で数時間放置し、そしてその水を除去することにより、２４時間の期間にわたって３回洗浄した。この洗浄プロセスによって、全ての可溶の物質がこのゲルから除去された。

次いでこのゲルを凍結させ、凍結乾燥し、秤量した。重量分解を、図２ａに示すように、時間間隔の関数としてこの試料の重量の変化から算出した。

（実施例２：キトサンゲルの分解時間）
擬熱硬化性ヒドロゲル（３％）を、均一（２型）：不均一キトサン（１型） １：１重量／重量の比で調製した。血清酵素によるこのヒドロゲルの分解を図２ａおよび図２ｂに示す。

分解を、２日、４日、７日および１４日に、ゲル重量の減少によって測定した。

２つのはっきりと異なる種類の分解動力学が図２ａに示されており、それらは、３−６日以内に終結する急速相と、１４日後に部分的分解のみを示す緩慢相である。急速相は、高度に可溶性であり血清酵素によって直ちに認識される２型キトサンの分解を反映していると考えられる。緩慢な動力学相は、血清酵素によって直ちには認識されず消化されないキトサン１型キトサンに関連している。

グルコサミンポリマーの再アセチル化を制御することは、リゾチームによるキトサンの認識の程度を操作するため、およびその結果としてヒドロゲル分解の速度を操作するために非常に重要なツールである。この酵素の活性を制御する主な要因は、そのポリマー中のＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）の割合（％）である（Ｒａｎら ２００５）。この理由のために、キトサン２型の再アセチル化度を５０％から３５％に減少させると、分解速度が顕著に減少することになり、もっと緩い傾きになるはずである（図２）。他方、キトサン１型のアセチル化度を高くすると、そのポリマーのより急速な分解がもたらされる（図２）。２種のキトサンの適切な組合せを選択することで、この図に示された２つの傾きの代わりに、時間に対する単一の、直線的な分解曲線がもたらされると予測される。

ここで、１：１、２：１および３：１の１型：２型の比の１型キトサンおよび２型キトサンの混合物を示す図２ｂを参照する。図に示すように、このゲルの分解速度は、１型キトサンに対する２型キトサンの比の増加とともに増加した。

（実施例３：キトサンゲルによるタンパク質の持続放出）
本発明のキトサン擬熱硬化性ヒドロゲルの、持続放出ビヒクルとしての可能性を研究するために、ヘモグロビンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を溶質として使用した。これらの化合物は、タンパク質標準として十分に受け入れられている。上記キトサン混合物を含有する１ｍｌの溶液に、２５μｌのアリコートのＢＳＡまたは４０μｌのヘモグロビンを加え、それぞれ、上記ヒドロゲル中の１ｍｇ／ｍｌおよび４ｍｇ／ｍｌのタンパク質の最終濃度を得た。これらのタンパク質を３ｍｌ ＰＢＳ中で、３７℃で一週間インキュベートした。この培地を毎日入れ替え、そのヒドロゲルから放出されたタンパク質の量を、図３−７に示したように測定した。

高い量のヘモグロビンが最初に放出され、その放出速度は時間とともに減少した（図３）。初期バーストは示さなかった。ＢＳＡは、ヘモグロビンと同じプロファイルを示した（図４および図５）。直線に近い傾きが得られた（図４）。ＢＳＡを上記ゲルと混合することで、ゲルの安定性が改善し、キトサン混合物のみの分解速度と比べて低下した分解速度をもたらした（図６）。放出されたＢＳＡの量を、分解されたゲルの量に対して比較すると（図７）、そのタンパク質の放出速度は、ゲル分解速度より速いことが示された。

図７に示したデータは、毎日減少する放出速度を有するタンパク質放出プロファイルをもたらす１つの１型キトサンのアセチル化度および１つの分子量に関する。しかしながら、さらなる変動因子（この２種のキトサンの再アセチル化度および分子量など）を適切に選択することで、そのゲルの特徴を決定することが可能になり、そしてキトサン構造に対するこのタンパク質薬物の親和性を改善することが可能になる。かかる特定の組合せは、複合された拡散およびマトリクス分解速度を反映して、特定の薬物の一定の放出速度を提供することが予測されるであろう。

（実施例４：創傷包帯材としてのキトサンゲルの生体内研究）
高脂肪の飼料で飼育された場合に糖尿病の症状を発症することが知られているデブスナネズミ（Ｐｓａｍｍｏｍｙｓ ｏｂｅｓｕｓ）系統のラットを２型糖尿病のモデルとして使用した。これらの動物は、深刻な感染症、壊疽および敗血症を発症し、罹患率およびさらには死亡率に導くそれらの傾向に起因して、糖尿病の慢性皮膚潰瘍の刺激、および皮膚創傷治癒の研究についての優れたモデルであると考えられる。

以下のものは、皮膚潰瘍の治癒を検討するための一般的なパラメータである。
１．修復組織における血管新生出現の時期。
２．好中球活性の減少。
３．マクロファージ活性の促進。
４．創傷の完全な再上皮化による瘢痕創傷閉鎖の時期。
５．ケラチノサイト単層の形成。
６．線維芽細胞沈着性細胞外マトリクスネットワークの活性化による、表皮層および真皮層の結合。

生物学的包帯材としての役割を果たすキトサンベースのゲルが使用され、包帯をするまたは縫合する必要性が回避され、そして治癒を高めるために創床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）の直接の被覆が提供された。種々の治癒段階、特に創傷収縮−瘢痕の縮みおよび閉鎖の段階、が起こる速度を、８日間の期間にわたって研究した。

熟年の２５匹の雌のデブスナネズミラット（各々、体重１５０−１６０ｇ）を使用した。

１３匹の動物が、高脂肪の飼料の投与後に糖尿病を発症し、これは０日目の前４〜６週間から始まったことが判明した。

高脂肪の飼料で給餌した際に発症に対する抵抗性を示す通常の正常血糖（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）（正常血糖（ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉａ））を有する６匹の動物を、第１の対照として使用し、通常の低脂肪、低エネルギーの飼料で給餌した場合に正常血糖を有する６匹の動物を第２の対照として使用した。

０日目に、メトリココンバーター（Ｍｅｔｒｉｃｏｃｏｎｖｅｎｔｅｒ）−生産装置を用いて、頚部の剪毛した皮膚で、６ｍｍ直径の丸い全深さ（ｆｕｌｌ ｄｅｐｔｈ）のパンチ生検を、表皮、真皮および皮下組織を貫通して筋肉まで行った。

７匹の糖尿病の動物の傷害を、実施例１のキトサンベースのゲルをその創傷領域に投与することによって処置し、他方、さらに６匹の動物を未処置のまま残した。このゲルを、処置群の創傷領域に毎日再塗布した。

７日間の間、すべてのその動物を超接写撮影し、その創傷の大きさを３日ごとに測定した。体重および血糖値を、デジタル式血糖値計（Ａｓｃｅｎｓｉａ Ｅｌｉｔｅ ｏｆ Ｂａｙｅｒ）を用いて、ラットの尾に作った傷口からの血液一滴を吸収することにより、一週間に１回測定した。

７日後、これらの動物を犠牲にし、全深さの組織診を行った。皮膚を採取し、固定液に入れた。皮膚試料を、さらに、組織学的および免疫組織化学的染色手順のためにさらに処理し、処置した創傷と未処置の創傷との間の差を評価した。

結果を、図８ａおよび図８ｂならびに図９に示す。図に示すように、処置群は、対照群と比較して統計的に有意な創傷治癒の増加、および創傷治癒に必要とされる時間の減少を示した。

（実施例５：回旋筋腱板修復）
肩腱板断裂は、肩の痛みの一般的な源である。回旋筋腱板損傷の発生率は年齢とともに高まり、運動競技または外傷由来の傷害よりはむしろ、腱の変性によって最も頻繁に引き起こされる。推奨される治療は、リハビリテーションから断裂した腱の手術による修復まで様々である。最良の治療方法は患者ごとに異なり、実際に、多くの患者がその傷害の満足な修復を成就していない。

本発明は、いくつかの実施形態で、自己細胞を超音波制御下で肩腱板断裂に送達することができるようにする注入可能な製品を提供することにより、この背景技術のこれらの欠点を克服する。他の実施形態では、この注入可能な製品によって、例えば組織治癒のために、骨髄細胞の組み込みも同様に可能になる。

好ましくは、この手順は、局所麻酔を必要とする外来処置または通院処置として行われる。

上記ゲルの初期の液体特性によって、腱断裂領域への完全接着が可能になる。

生体内実験を、（手術により損傷した腱を使用して）腱損傷および修復についてラットに対して行った。損傷した腱を縫合し、本発明に係るゲルと骨髄細胞との混合物で処置した。対照動物には縫合だけを施した。２０匹の動物を３月間研究した。組織学的に明らかな腱の修復および筋萎縮の予防をともに達成した（結果は示さず）。

また、生体内実験を、ここでも手術により誘発した回旋筋腱板損傷について、ラットに対して行った。この損傷を上記のように処置した。手術後６週間の組織の組織学的薄片は、反対側の肩の未処置の対照の欠損と比べて、内因性細胞が隣接する組織から捕捉され、傷害を受けた部位の状態を改善したことを示す。例示的な結果を、図１０Ａ（処置）および図１０Ｂ（未処置）に示す。

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本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、限定するものとは意図されていない以下の実施例を検討すれば当業者には明らかになるであろう。さらに、本願明細書中でこれまでに記載され、そして添付の特許請求の範囲で請求されるとおりの本発明の種々の実施形態および態様の各々は、以下の実施例に実験的裏づけが見出される。

明確にするために別々の実施形態との関連で記載される本発明の特定の特徴は、１つの実施形態で組合せて提供されてもよいことは理解される。逆に、簡潔にするために１つの実施形態との関連で記載された本発明の種々の特徴は、別々に、またはあらゆる適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。

本発明はその具体的な実施形態に関連して記載されているが、多くの代替的態様、変更態様およびバリエーションが当業者には明らかであろうことは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨および広範な範囲内に含まれるすべてのかかる代替的態様、変更態様およびバリエーションを包含することが意図されている。本願明細書で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々個々の刊行物、特許および特許出願が具体的にかつ個々に参照により本願明細書に援用すると示されたのと同程度に、参照によりその全体が本願明細書に援用される。加えて、本願においてあらゆる引用文献を引用または同定しても、かかる引用文献が本発明に対する先行技術として利用できるということを承認したものであるとは解釈されないものとする。

Claims (56)

1. 約３０％〜約６０％の範囲のアセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンと、少なくとも約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンとを含むキトサン組成物であって、ｐＨおよび温度依存的ゲル化を受けてヒドロゲルを形成することを特徴とする、キトサン組成物。
2. 前記ゲル化がｐＨ６．５より高いｐＨで起こる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ゲル化が生理的ｐＨ近くおよび３７℃で起こる、請求項１に記載の組成物。
4. 前記高度にアセチル化されたキトサンが、均一にアセチル化されているか、または均一に脱アセチル化されているかのいずれかである、請求項１に記載の組成物。
5. 前記高度に脱アセチル化されたキトサンが不均一に脱アセチル化されている、請求項１に記載の組成物。
6. 前記高度にアセチル化されたキトサンおよび前記高度に脱アセチル化されたキトサンが、各々、前記全組成物の約０．２％〜約３％（重量／体積）の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
7. 前記高度にアセチル化されたキトサンおよび前記高度に脱アセチル化されたキトサンの各々が、約１０ｋＤａ〜約４０００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
8. 前記高度に脱アセチル化されたキトサンが、約６０ｋＤａよりも大きい分子量を有する、請求項７に記載の組成物。
9. 前記高度にアセチル化されたキトサンが、約２００ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項８に記載の組成物。
10. さらに、正の電荷を帯びた多糖類および負の電荷を帯びた多糖類の両方を含有するハイブリッドを含む、請求項１に記載の組成物。
11. 前記負の電荷を帯びた多糖類が、動物由来のポリマーおよび植物由来のポリマーからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記植物由来のポリマーが海藻に由来する、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記負の電荷を帯びた多糖類がグリコサミノグリカンである、請求項１０に記載の組成物。
14. 前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、および硫酸デキストランのような他の負の電荷を帯びたポリマーからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. さらに、薬物、ポリペプチド、および細胞のうちの１つを含む、請求項１に記載の組成物。
16. 前記細胞が、ヒト細胞および動物細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記薬物が、鎮痛薬、麻酔薬、抗ざ瘡薬、抗加齢薬、抗菌薬、抗生物質、火傷治療薬、抗うつ薬、抗皮膚炎薬、抗浮腫薬、抗ヒスタミン薬、駆虫薬、抗角質増殖分解薬、抗炎症薬、抗刺激剤、抗高脂血症薬、抗微生物薬、抗真菌薬、抗酸化剤、鎮痒薬、乾癬治療薬、抗酒さ薬、抗脂漏薬、消毒薬、抗腫脹薬、抗ウイルス薬、抗酵母剤、心血管治療薬、化学療法薬、コルチコステロイド、殺菌剤、ホルモン、ヒドロキシ酸、角質溶解薬、ラクタム、殺ダニ剤、非ステロイド系抗炎症薬、シラミ駆除剤、プロゲスチン、胃酸過多治療薬、疥癬虫殺虫剤、および血管拡張薬からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
18. 約３０〜約６０％のアセチル化度を有する少なくとも１種の高度にアセチル化されたキトサンと、約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１種の高度に脱アセチル化されたキトサンとの組成物を含む安定なヒドロゲルの生産のための方法であって、
    ａ）前記高度にアセチル化されたキトサンおよび前記高度に脱アセチル化されたキトサンを酸に溶解させて、複合溶液を形成する工程と、
    ｂ）前記複合溶液のｐＨを約６．６〜約７の値に調整する工程と、
    ｃ）前記ｐＨを少なくとも約７．０に上げつつ、前記複合溶液の温度を約３７℃に高める工程と、
    を含む方法。
19. 前記高度にアセチル化されたキトサンおよび前記高度に脱アセチル化されたキトサンを溶解させる工程が、同じ容器で、実質的に同時に行われる、請求項１８に記載の方法。
20. 前記高度にアセチル化されたキトサンおよび前記高度に脱アセチル化されたキトサンを溶解させる工程が別々の容器で行われて２つの溶液が形成され、かつ前記方法がさらに、前記２つの溶液を混合して複合溶液を形成する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
21. 薬物送達、細胞成長の支持体、骨構造支持体、軟骨修復、組織再構成、創傷治癒、人工皮膚の生産、抗高脂血症薬、コレステロール低下剤、人工腎臓膜の形成、骨充填、および軟組織再構成からなる群から選択される応用における、請求項１に記載のヒドロゲルの使用。
22. 前記組成物が、直接点滴、注入および内視鏡的投与からなる群から選択される経路によって投与される、請求項２１に記載の使用。
23. 埋め込み型装置の調製において使用するための生体適合性材料の調製における、請求項１に記載のヒドロゲルの使用。
24. 前記埋め込み型装置が、組織修復、組織再構成、組織構築、および組織置換からなる群から選択される応用のために使用される、請求項２３に記載の使用。
25. 薬物送達システムの調製における、請求項１に記載のヒドロゲルの使用。
26. 前記薬物送達システムが、包埋された薬物の持続放出を提供する、請求項２５に記載の使用。
27. 前記包埋された薬物が、鎮痛薬、麻酔薬、抗ざ瘡薬、抗加齢薬、抗菌薬、抗生物質、火傷治療薬、抗うつ薬、抗皮膚炎薬、抗浮腫薬、抗ヒスタミン薬、駆虫薬、抗角質増殖分解薬、抗炎症薬、抗刺激剤、抗高脂血症薬、抗微生物薬、抗真菌薬、抗酸化剤、鎮痒薬、乾癬治療薬、抗酒さ薬、抗脂漏薬、消毒薬、抗腫脹薬、抗ウイルス薬、抗酵母剤、心血管治療薬、化学療法薬、コルチコステロイド、殺菌剤、ホルモン、ヒドロキシ酸、角質溶解薬、ラクタム、殺ダニ剤、非ステロイド系抗炎症薬、シラミ駆除剤、プロゲスチン、胃酸過多治療薬、疥癬虫殺虫剤、および血管拡張薬からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用。
28. 前記薬物送達システムが、眼科用または泌尿器科用薬物送達システムである、請求項２７に記載の使用。
29. 浸潤性内因性細胞を三次元的ゲル構築物の中に定着させるための請求項１に記載のヒドロゲルの使用。
30. 代謝産物を提供するための外因性細胞を包埋するための請求項１に記載のヒドロゲルの使用。
31. 前記代謝産物が増殖因子である、請求項３０に記載の使用。
32. 細胞を付した人工マトリクスの生産における、請求項１に記載のヒドロゲルの使用。
33. 前記細胞が、軟骨細胞、線維軟骨細胞、靭帯線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、腱細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞およびケラチノサイトからなる群から選択される、請求項３２に記載の使用。
34. 約３０〜約６０％のアセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンと、約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１種の高度に脱アセチル化されたキトサンとの組成物を含むヒドロゲルを含む、持続放出性薬物送達システム。
35. 前記ヒドロゲルの特性が、前記高度にアセチル化されたキトサンおよび前記高度に脱アセチル化されたキトサンの操作によって制御される、請求項１に記載のキトサン組成物。
36. 前記操作によって制御される前記ヒドロゲルの前記特性が、ゲル化温度、密度および空隙率からなる群から選択される、請求項３５に記載のキトサン組成物。
37. 前記操作が、水和度および疎水性度からなる群から選択される特徴の操作を含む、請求項３５に記載のキトサン組成物。
38. 鎮痛薬、麻酔薬、抗ざ瘡薬、抗加齢薬、抗菌薬、抗生物質、火傷治療薬、抗うつ薬、抗皮膚炎薬、抗浮腫薬、抗ヒスタミン薬、駆虫薬、抗角質増殖分解薬、抗炎症薬、抗刺激剤、抗高脂血症薬、抗微生物薬、抗真菌薬、抗酸化剤、鎮痒薬、乾癬治療薬、抗酒さ薬、抗脂漏薬、消毒薬、抗腫脹薬、抗ウイルス薬、抗酵母剤、心血管治療薬、化学療法薬、コルチコステロイド、殺菌剤、ホルモン、ヒドロキシ酸、角質溶解薬、ラクタム、殺ダニ剤、非ステロイド系抗炎症薬、シラミ駆除剤、プロゲスチン、胃酸過多治療薬、疥癬虫殺虫剤、および血管拡張薬からなる群から選択される薬剤の送達のための、請求項３４に記載の持続放出性薬物送達システムの使用。
39. ＢＳＡ、およびヘモグロビンからなる群から選択されるタンパク質の送達のための、請求項３４に記載の持続放出性薬物送達システムの使用。
40. ＡＣＥ阻害薬および抗炎症薬からなる群から選択される非タンパク質薬剤の送達のための、請求項３６に記載の持続放出性薬物送達システムの使用。
41. 前記ヒドロゲルの分解速度が、リゾチーム阻害薬トリ−Ｎ−アセチル−グルコサミンを前記高度にアセチル化されたキトサンに結合することにより制御される、請求項１に記載の組成物。
42. さらに乳化剤を含む、請求項１に記載の組成物。
43. 前記キトサンおよび前記乳化剤がナノ粒子を形成する、請求項４２に記載の組成物。
44. 活性成分を含有し、かつ約３０％〜約６０％の範囲のアセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンと、少なくとも約７０％の脱アセチル化度を有する少なくとも１種のキトサンとを含むヒドロゲルに封入されたナノ粒子を含むキトサン組成物であって、前記ヒドロゲルがｐＨおよび温度依存的ゲル化によって形成されることを特徴とする、キトサン組成物。
45. さらに乳化剤を含む、請求項４４に記載のキトサン組成物。
46. 前記ヒドロゲルが、被験者に注入した際に生成する、請求項４５に記載のキトサン組成物。
47. 前記活性成分が、非共有結合相互作用で前記ナノ粒子と相互作用するためのタンパク質を含み、前記ナノ粒子が、注入された際に、前記被験者中でゆっくりと前記タンパク質を放出する、請求項４４から請求項４６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
48. 前記軟組織再構成が踵痛の軽減を提供することを含む、請求項２１に記載の使用。
49. 任意に１種以上の他の生物膜損傷剤と組み合わせた、生物膜破壊物質としての請求項１から請求項１７、請求項３５から請求項３７、および請求項４１から請求項４６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
50. 経口摂取のための１種以上の食品添加物の担体としての、請求項１から請求項１７、請求項３５から請求項３７、および請求項４１から請求項４６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
51. 手術の分野での使用のための抗接着装置としての、請求項１から請求項１７、請求項３５から請求項３７、および請求項４１から請求項４６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
52. メソセラピー応用のための注入薬としての、請求項１から請求項１７、請求項３５から請求項３７、および請求項４１から請求項４６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
53. 潤滑剤としての、請求項１から請求項１７、請求項３５から請求項３７、および請求項４１から請求項４６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
54. 肩腱板断裂および／または腱損傷への自己細胞の送達のための、請求項１から請求項１７、請求項３５から請求項３７、および請求項４１から請求項４６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
55. 超音波制御下で行われる、請求項５４に記載の使用。
56. さらに、腱損傷および／または回旋筋腱板損傷の修復のための自己細胞を含む、請求項１から請求項１７、請求項３５から請求項３７、および請求項４１から請求項４６のいずれか１項に記載の組成物。