WO2013119061A1 - 경피 전달용 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 경피 전달용 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 - Google Patents

경피 전달용 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 경피 전달용 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 Download PDF

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양정아
김혜민
최관용
신지혜
권정희
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Definitions

  • the present invention relates to formulations for transdermal delivery of drugs and methods for their preparation. More specifically, by using a carrier having biocompatibility, biodegradability and transdermal delivery properties, it can be applied to the transdermal drug delivery system of various protein drugs, chemical drugs and vaccines, can be safely applied to the human body, and also the bioactivity of the protein
  • the present invention relates to a method for preparing a transdermal delivery drug carrier and a transdermal delivery drug carrier and a use thereof, in which the bioconjugation efficiency is high and the medicinal time can be increased while maximizing.
  • Transdermal delivery system is a system that delivers the active drug through the skin, and there is no pain in the delivery of the drug by using it, the patient can administer the drug by himself, and it can be treated regardless of time and place. .
  • the patch form of the structure including the finely molded micro needles is difficult to manufacture and expensive, and the actual transdermal delivery system is necessary because appropriate equipment and stimulation are required when external stimulation is required to increase skin permeability. There is a problem that loses its advantages.
  • the present invention overcomes the problems of the prior art as described above, the hyaluronic acid-protein conjugate as a drug preparation for transdermal delivery with high bioconjugation efficiency and applicable to various water-soluble effective active ingredients while maintaining the maximum bioactivity of protein pharmaceuticals
  • a hyaluronic acid-protein conjugate prepared thereby and various uses thereof.
  • hyaluronic acid which is a biodegradable and biocompatible biopolymer, has a transdermal delivery property through the skin despite having a high molecular weight ol, so it is a transdermal drug delivery agent using hyaluronic acid having excellent transdermal delivery ability.
  • hyaluronic acid which is a biodegradable and biocompatible biopolymer, has a transdermal delivery property through the skin despite having a high molecular weight ol, so it is a transdermal drug delivery agent using hyaluronic acid having excellent transdermal delivery ability.
  • the presence of a hyaluronic acid receptor in the human skin cells confirmed that the proliferation of the cells can be controlled according to the concentration of the hyaluronic acid, using such properties as well as the therapeutic effect of the regeneration of the skin tissue, as well as the cosmetic composition
  • the present invention was completed by confirming that the present invention can be effectively applied.
  • the present invention can prevent reaction with other amino acids having different amine groups in the protein, for example, lysine, by performing a conjugation process under specific pH conditions when conjugating hyaluronic acid with a protein, which is a drug to be delivered. Therefore, in the state which maximizes the activity of a protein, bioconjugation efficiency and drug time can be improved.
  • HA-aldehyde hyaluronic acid -aldehyde
  • a hyaluronic acid-protein conjugate prepared by the above method is provided.
  • n is an integer of 5 to 5,000.
  • P represents a water soluble protein
  • n and 1 is an integer from 5 to 5,000
  • 1 is an integer of 1-100.
  • Hyaluronic acid used in one embodiment of the present invention not only has biocompatibility and biodegradable properties, but also has transdermal delivery properties, so that it can be safely applied to the human body and is used for transdermal drug delivery of various protein medicines and chemical medicines including antigenic proteins. It has the advantage of being applicable to the system (see Experimental Examples 8 to 13).
  • hyaluronic acid throughout the present specification refers to a polymer having a repeating unit represented by the following general formula 1, and includes all salt or derivative forms of hyaluronic acid It is used to mean.
  • m ′′ may be an integer of 50 to 10,000.
  • Hyaluronic acid derivatives are based on the basic structure of hyaluronic acid of the general formula (1), based on the amine group, aldehyde group, vinyl group, thiol group, allyloxy group, N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) It refers to all variants of hyaluronic acid in which functional groups such as N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldith io) propionate (SPDP) and N-hydroxysuccinimide (NHS) are introduced. .
  • functional groups such as N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldith io) propionate (SPDP) and N-hydroxysuccinimide (NHS) are introduced.
  • SPDP N-pyridyldith io
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • HA-spermidine HA-SPDP, HA-NHS and the like.
  • the hyaluronic acid-aldehyde substitution rate is defined as the molar ratio of the repeating unit in which an aldehyde group is formed by opening the ring structure of cellulose in the total hyaluronic acid repeating units, and by definition, a value greater than 0 or less than 1 or 0 mol 0/0 than it can be represented by a value of not more than 100 mol%.
  • the hyaluronic acid is present in most animals and can be safely applied to the human body as a polymer of a linear polysaccharide without biodegradability, biocompatibility, and immune response.
  • Hyaluronic acid can be used for various purposes because it plays several different roles in the body depending on the molecular weight.
  • the hyaluronic acid, salts of hyaluronic acid, or derivatives of hyaluronic acid to be used is not limited in configuration, but preferably has a molecular weight of 10,000 to 3,000,000 Dalton (Da) can be used.
  • Hyaluronic acid, a salt of hyaluronic acid, or a derivative of hyaluronic acid having a molecular weight in the above range is a drug Suitable for use in conjugates for delivery.
  • the first step is to prepare a hyaluronic acid-aldehyde (Formula 1), preferably hyaluronic acid (HA), a salt of hyaluronic acid, or a derivative of hyaluronic acid dissolved in water Thereafter, the reaction may be performed by reacting the oxidizing agent under dark conditions to open a ring structure of cellulose.
  • the manufacturing method according to the preferred embodiment of the present invention specifically binds an aldehyde group formed by opening a ring structure while leaving a carboxyl group which binds to a hyaluronic acid receptor in a hyaluronic acid unit and a protein which is an active ingredient. This can maximize the transdermal delivery properties of hyaluronic acid.
  • the oxidizing agent is not particularly limited as long as it can break the ring structure of hyaluronic acid, preferably sodium periodate (Sodium periodate, NaI0 4 ).
  • the oxidizing agent is added in a 1 to 10 mole fold per unit of hyaluronic acid (HA), a salt of hyaluronic acid, or a hyaluronic acid derivative, for 2 to 24 hours, more preferably 1 to It can be added for 5 mole times and reacted for 2 to 12 hours. If that was 10 mole 0/0 substituted when reacted for 3 hours by addition of 2 mole times by using the oxidizer, banung for 12 hours by the addition of 5 mole times to obtain the substituted derivatives 50 mol%.
  • HA hyaluronic acid
  • a salt of hyaluronic acid or a hyaluronic acid derivative
  • HA-aldehyde derivative having a substitution rate of 10 to 50 mol%. If the substitution rate is less than the above range, the amount of protein that can be bound is too small to achieve the desired effect, and if it exceeds the above range, the substitution rate is too high, making it difficult to interact with the HA receptor, thereby targeting effects. It is not desirable to have problems that are difficult to expect.
  • the step of purifying dialysis with distilled water may be further performed.
  • Step 2 is a step of preparing the hyaluronic acid-protein conjugate (Formula 2) by reacting the hyaluronic acid-aldehyde prepared through the first step with the N-terminus of the protein (Formula 2).
  • Solution preferably in sodium acetate buffer at pH 5 to 6.5.
  • the protein may be added to react the aldehyde group included in the haaluronic acid-aldehyde derivative with the N-terminal amine group of the protein.
  • the protein used in the second step can be used as the active protein itself without a separate preparation process, preferably the protein is dissolved in water to be used in an aqueous state Can be.
  • the protein bioconjugated to the hyaluronic acid-aldehyde can be used without particular limitation as long as it can be dissolved in an aqueous solution.
  • the protein drug may be a protein drug for preventing or treating a disease or a skin disease accompanied by long-term periodic drug treatment, and the protein drug may be, for example, human growth hormone, 'interferon alpha, erythropoietin, or trail (Tumor). necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), or insulin.
  • diseases or skin diseases in which long-term periodic drug therapy is climbing may be dwarfism, cancer, diabetes, burns, atopy, psoriasis, eczema, dermatitis, acne, or shingles.
  • the protein bioconjugated to the hyaluronic acid-aldehyde may be an antigenic protein.
  • the antigenic protein can be, for example, a protein of the pathogen, a recombinant protein, a glycoprotein, or a peptide.
  • the conjugate conjugated with the hyaluronic acid of the antigen protein stimulates the Langerhans cells and the dendritic cells, which are immune cells in the skin tissue, and can produce stronger immune reactions than the administration of the antigenic protein alone.
  • the effect as a composition is very excellent (see Experimental Example 15).
  • the protein may be reacted to bind 1 to 10 molecules per molecule of hyaluronic acid-aldehyde.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate in which the number of molecules in the above-described protein is bound can stay in the body for more than 24 hours to 96 hours depending on the substitution rate of the hyaluronic acid derivative, and the application of the hyaluronic acid-protein conjugate to the long-term drug delivery system is controlled. It is possible.
  • the hyaluronic acid-protein conjugate according to one embodiment of the present invention has particularly good transdermal delivery properties and can be applied as a therapeutic agent for skin diseases and / or cosmetics, and can be used as a transdermal delivery drug formulation for various protein drugs.
  • the reaction may be performed by adding sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ) together with the protein.
  • sodium cyanoborohydride may be reacted with an N-terminal amine group and an aldehyde of a hyaluronic acid derivative. After the reaction It serves to reduce double bonds.
  • the sodium cyanoborohydride is preferably reacted for 12 to 24 hours by adding 2 to 10 molar times of the aldehyde group according to the substitution rate of hyaluronic acid-aldehyde.
  • the aldehyde group since the aldehyde group has a very good reaction properties, preferably after the second step, it may further comprise a third step of blocking (blocking) the aldehyde group remaining without reacting with the protein.
  • the material used for the blocking may be used without particular limitation, as long as it can react with a carboxyl group or an aldehyde group, but may preferably be used using amines.
  • This blocking process can be represented by the following scheme 2.
  • the amines are linear or branched alkyl carbazite having 1 to 5 carbon atoms
  • alkyl carbazate or lower alkanolamines having 1 to 5 carbon atoms.
  • the alkyl carbazite may be preferably ethyl carbazate or tert butyl carbazate
  • the lower Alkanesamines include, for example, aminomethanol (MEA), aminomethanol, aminopropane (l-amino-2-propanol, or 1-amino-3-propanol), aminobutanol, or It may be aminopentanol, and preferably may be amino-ethanol.
  • the crab step 3 may be represented by the following reaction formula 3, preferably 5 to 10 with respect to the molar unit of the aldehyde group of the compound of formula (2). It can be added in molar times to react for 12 to 24 hours to prepare a compound of formula (3) in which aldehyde groups that remain unreacted with protein are blocked.
  • the reaction may be carried out for 12 to 24 hours by adding 5 to 10 moles times the molar unit of the aldehyde group of the compound of Formula 2.
  • 100% blocking is possible by adding amines in the above range, When added below the above range, there is a possibility that 100% blocking does not occur, which is not preferable.
  • alkyl carbazite when used as the amines, it can be preferably reacted under the conditions of pH 5 to 7, preferably for this purpose acetate buffer as used in the first step Can be used. '
  • the reaction may be preferably performed under conditions of pH 7 to 9, and for this purpose, a buffer such as phosphate buffer may be preferably used.
  • the method for preparing the hyaluronic acid-protein conjugate of the present application is applicable to the preparation of a drug delivery system through the bioconjugation of a water-soluble peptide and protein active ingredient, wherein the conjugation reaction proceeds in an aqueous solution and is soluble in the aqueous solution. .
  • Another preferred embodiment of the present invention provides a hyaluronic acid-protein conjugate of formula 2 prepared according to the above-described preparation method.
  • P represents a water soluble protein
  • n, and 1 is an integer from 50 to 10,000, and the sum of n and 1 is from 5 to
  • the hyaluronic acid-protein conjugate can be safely applied to the human body, and in response to specific amino acids of the protein to maximize the bioactivity of the protein, the bioconjugation efficiency is high, and the drug time can be effectively increased. It can be applied as a transdermal delivery formulation.
  • hyaluronic acid is a component contained in many cosmetics for moisturizing and wrinkle improvement, and exists in keratinocytes and dermis layers deep in the skin in the epidermis cell layer of the skin.
  • Skin cells such as fibroblasts, have a hyaluronic acid receptor so that proliferation is controlled according to the concentration of hyaluronic acid.
  • hyaluronic using hyaluronic acid dermal delivery properties with these acid-protein conjugates are applied to the skin disease treatment, dermal delivery of therapeutic protein drug formulations, cosmetics and vaccines, etc. are expected.
  • another preferred embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for transdermal delivery, a therapeutic agent for regeneration of skin cells, a cosmetic composition and a vaccine composition comprising a therapeutically effective amount of the hyaluronic acid-protein conjugate.
  • the therapeutically effective amount means an amount sufficient to have a beneficial effect or a desirable clinical or biochemical result, such as to alleviate, ameliorate, stabilize, return to, slow the progress of, or delay a disease state, and such an effective amount is one or more. Can be administered.
  • the pharmaceutical composition, cosmetic composition or vaccine composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier or cosmetically acceptable carrier, a carrier acceptable as a vaccine, preferred carriers and other additives used therein, Excipients, stabilizers and the like can be used by those skilled in the art as appropriately known in the art.
  • the above-mentioned proteins, hyaluronic acid, and therapeutically effective amounts may be applied in the same manner as described above, or may be appropriately adjusted by those skilled in the art.
  • the administration may preferably be transdermal administration, wherein the subject is Preferably it may be a mammal.
  • the drug conjugate of hyaluronic acid-bio of the present invention can proceed the conjugation reaction in an aqueous solution, and is applicable to various peptides and protein active ingredients which are water-soluble, and transdermal permeation delivery of hyaluronic acid as a biocompatible and biodegradable polymer. It is possible to maintain various properties as protein therapeutics, cosmetics and vaccines that are simple and safe for human application.
  • the conjugate since the N-terminus of the hyaluronic acid aldehyde derivative and the protein are specifically reacted at specific pH conditions, the conjugate is not reacted with amino acids having other amine groups so that the conjugate can be synthesized with enhanced protein activity. have. Therefore, the hyaluronic acid-protein conjugate of the present invention can be effectively used in the treatment of skin diseases, transdermal drug delivery of drugs, cosmetics, vaccines and the like.
  • FIG. 1 is a simplified chemical scheme of a hyaluronic acid derivative having an aldehyde group introduced therein according to an embodiment of the present invention and a method of preparing a hyaluronic acid-protein conjugate using the same.
  • Figure 2 is a 1H-NMR results of the HA-aldehyde-TBC derivative prepared by the method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3a shows the GPC results of hyaluronic acid-human enteric hormone (HA-hGH) conjugate and human growth hormone protein (hGH) prepared by the method according to Example 1 of the present invention and Figure 3b GPC results of the hyaluronic acid-ovalbumin (HA-OVA) conjugate prepared with the method according to Ovalbumin (OVA) are shown.
  • HA-hGH hyaluronic acid-human enteric hormone
  • hGH human growth hormone protein
  • Figure 4 shows the bioconjugation efficiency according to the number of human growth hormone molecules and the number of human growth hormone molecules contained in one hyaluronic acid chain of the hyaluronic acid-human growth hormone conjugate.
  • Figure 5 shows a comparison of the results of circular dichroism spectroscopy (CD) analysis of the human intestinal hormone and hyaluronic acid-human growth hormone conjugate.
  • CD circular dichroism spectroscopy
  • Figure 6a is hyaluronic acid-human growth hormone according to Example 1 of the present invention
  • the activity analysis results of the conjugate and human growth hormone are shown in the ratio of ELISA / Bradford assay
  • FIG. 6B shows the results of the activity analysis of the hyaluronic acid-ovalbumin conjugate and the opalbumin according to Example 2 in the ratio of ELISA / Bradford assay. It is shown.
  • Example 7 is a comparison of the hyaluronic acid-human growth hormone conjugate and human growth hormone stability in human serum according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 8 confirms the signaling activity of the hyaluronic acid-human growth hormone conjugate and human growth hormone IM-9 (human B lymphoblast) cells (A: measurement of cell signaling by concentration of human growth hormone, B: Cell signaling measurement results of HA-hGH conjugate containing 500 ng / ml hGH, C: graph quantitatively measured by measuring the band intensity of A and B).
  • Figure 9 shows the degree of JAK2 phosphorylation according to the treatment of hGH and HA-hGH conjugate to Detroit 551 cells, which are human skin cells (A: measurement of signal transduction by hGH receptor through measurement of JAK2 phosphorylation according to hGH treatment, B : Measurement result of signal transduction by hGH receptor by measuring JAK2 phosphorylation according to HA-hGH conjugate treatment, graph showing quantitatively by measuring band intensity of C: A, graph quantitatively by measuring band intensity of D: B ).
  • FIG. 10 shows the cell proliferation effect according to the concentration-specific treatment of (HEKn, Detroit 551) hyaluronic acid and hyaluronic acid-human growth hormone conjugate of human skin cells
  • A concentration when hyaluronic acid is treated to HEKn cells Cell proliferation effect by cell
  • B Cell proliferation effect by concentration when hyaluronic acid was treated to Detroit 551 cells
  • C Cell proliferation effect by concentration when hyaluronic acid-human growth hormone conjugate was treated to HEKn cells
  • D Concentration of Cell Proliferation when Detroit 551 Cells Treated with Hyaluronic Acid-Human Growth Hormone Conjugate).
  • Figure 11 is i.v. of the hyaluronic acid-human growth hormone conjugate according to Example 1 of the present invention. Pharmacokinetic analysis results after injection.
  • FIG. 12 is a hyaluronic acid-human growth hormone according to Example 1 of the present invention Results of transdermal characterization of conjugates and human intestinal hormones, hyaluronic acid (A: control, B: FITC, C: hGH-FITC, D: HA-FITC, E: HA-hGH-FITC).
  • FIG. 13 shows the results of transdermal permeation of hyaluronic acid-ovalbumin conjugates and ovalbumin and hyaluronic acid according to Example 2 of the present invention (A: PBS, B: FITC, C: OVA-FITC , D: HA-FITC, E: HA-OVA-FITC).
  • Example 14 shows the results of Pharmacokinetic analysis after transdermal delivery of hyaluronic acid-human growth hormone conjugate according to Example 1 of the present invention.
  • FIG. 15 is a blood misfire at 2 and 4 weeks after transdermal delivery of PBS, Ovalbumin, and Hyaluronic Acid-Ovalbumin as a result of transdermal vaccine characterization of the hyaluronic acid-ovalbumin conjugate according to Example 2 of the present invention Bumin antibody concentration was measured and measured by ELISA.
  • HA hyaluronic acid
  • sodium periodate NaI0 4
  • dialysis membrane was purified by distilled water for 3 days using a dialysis membrane having a molecular weight cutoff of 7000 Daltons, and then freeze-dried for 3 days.
  • Another HA-aldehyde derivative was obtained.
  • substitution rate is as follows
  • Hyaluronic acid-protein conjugates were prepared by adding sodium cyanoborohydride (NaCNB) at 5 molar times of the aldehyde according to the method of Experimental Example 1) and reacting for 24 hours.
  • the reacted solution was phosphate buffered saline (pH 7.4).
  • HA hyaluronic acid
  • NaI0 4 sodium periodate
  • dialysis membrane was purified by distilled water for 3 days using a dialysis membrane having a molecular weight cutoff of 7000 Daltons, and then lyophilized for 3 days to obtain an HA-aldehyde derivative.
  • ethyl carbazate was added to 5 mole times of aldehyde moth, followed by further reaction for 24 hours.
  • blocking was performed using ethyl carbazite, but amino ethanol may also be used, in which case 5 moles of aldehyde is used.
  • GPC analysis was performed under the following conditions to restrict separation from OVA, sodium cyanoborohydride, and ethyl carbazite, which did not react with HA-OVA, and then purified and purified HA-OVA using a centrifugal filter. Concentrated at 5000 g and the concentrated solution was stored at -70 cfC.
  • Measurement wavelength Dual detection at 210 nm and 280 nm.
  • the prepared HA-aldehyde derivative was prepared at a concentration of 5 mg / ml. After dissolving in OOmM, pH 5.2, acetate buffer, 5 mole times of tert butyl carbazate (TBC) and sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ) were added per unit of hyaluronic acid.
  • the substitution rate of HA ⁇ aldehyde was higher as the reaction time with sodium periodate was longer, and more specifically, when the reaction time was 3 hours, 6 hours, and 12 hours in Example 1, respectively, 10 If hayeoteul mole 0/0, and the reaction time in the case of example 2 showed a 20 mol%, and 50 mole percent substitution of 0 /., 3 hours showed a degree of substitution of 15 mole 0 /.
  • Example 1 The hyaluronic acid produced according to the-human growth hormone (HA-hGH) conjugate (NaI0 4 and by 3 hours of reaction to a human growth hormone in the HA-ald derivative having a degree of substitution of about 10 mole 0/0 HA (100kDa ) Conjugated at 6 mole times per molecule (chain): reaction rate of 95 mol% or more) and hyaluronic acid-ovalbumin (HA-OVA) conjugate prepared according to Example 2 for 3 hours with NaI0 4 GPC (Gel Permeation Chromatography) analysis of conjugates obtained by reacting Ovalbumin at 3 mole times per chain of HA (215kDa) to HA-ald derivatives having a substitution rate of about 15 mol% The formation of hyaluronic acid-protein conjugate was confirmed through.
  • the hyaluronic acid-protein.conjugates were GPC analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC). Analysis conditions are as follows.
  • OVA Waters Ultrahydrogel 500 + Waters Ultrahydrogel 1000 Mobile Phase: PBS (pH 7.4)
  • Measurement wavelength Dual detection at 210 nm and 280 nm. 2) Analysis result
  • GPC analysis of HA-hGH showed a peak at 14-15 minutes of retention time of high molecular weight hyaluronic acid at a wavelength of 280 nm as shown in FIG. 3A. It was confirmed that the protein was conjugated.
  • the results of GPC analysis of HA-OVA showed that the peak of the OVA shifted toward the higher molecular weight at 2H) nm at 31-32 saturation as shown in FIG. 3b, indicating that the protein was conjugated.
  • Protein content in the HA-protein conjugates prepared according to Examples 1 and 2 was determined by measuring the area under the peak in the GPC analysis of Experimental Example 2.
  • the hGH stock solution was prepared at a concentration of 1 mg / mL, and the hGH standard solution was prepared by diluting with distilled water.
  • the hGH standard solution was analyzed under the GPC analysis conditions of Experimental Example 2 to obtain a standard curve of the area under the GPC peak according to the hGH concentration.
  • HA-hGH conjugate prepared according to Example 1 (6 mole per HA (100kDa) chain of human growth hormone to HA-ald derivative having a substitution rate of about 10 mol% by reacting with NaI0 4 for 3 hours)
  • the conjugated reaction was carried out by fold, the area under the GPC peak obtained by analyzing the reaction coefficient (reaction rate of 95 mol% or more) under the same conditions was substituted into the standard curve to obtain the hGH content.
  • HA-OVA a standard solution was prepared as in the case of HA-hGH to obtain a standard curve, and the concentration of OVA was calculated by calculating the concentration of OVA remaining without reaction before purification.
  • Protein (hGH) content in the HA-hGH conjugate prepared according to Example 1 was found to increase with the number of molecules of the anti-ungungkin protein per molecule of HA in the feed (feed).
  • the number of molecules of the antiungungkin protein per HA was changed to 1, 4, 6, and 8, the average number of molecules bound to each molecule was 1, 4, 6, and 8. That is, the bioconjugation efficiency (%) of the protein was 95% or more regardless of the number of molecules (Fig. 4).
  • the bioconjugation efficiency (%) in the HA-OVA conjugate prepared according to Example 2 was about 80% at the number of molecules 3 and 65% at the number of molecules.
  • Circular dichroism was performed using hGH solution and HA-hGH conjugate solution based on the hGH concentration (0.25mg / ml). Analysis conditions are as follows.
  • UV spectrophotometer JASCO J-715
  • Quartz cuvette 2 mm path length
  • the human growth hormone conjugate about 10 mol%, banung time between 20 mole 0/0, and 35 mole 0/0 (NaIO 4, respectively 8 hours for chapter humanity to HA-ald derivative having a degree of substitution of 1 is the same as manufacturing and
  • hormones for HA (100kDa) 1 molecule (chain) per 6 mole times put banung when Kin conjugate: banung rate 95 mol
  • hGH human growth hormone
  • HA-hGH hyaluronic acid-human growth hormone conjugate
  • the activity of hyaluronic acid-human growth hormone conjugate was analyzed by the ratio of ELISA / Bradford assay.
  • the ELISA / Bradford assay ratio was 70% or more.
  • Bradford assay is a method for measuring protein lysine
  • ELISA is an assay method for quantifying by interacting with hGH-binding antibody.
  • the ratio of hyaluronic acid-human growth hormone conjugate Activity can be measured, as shown in Figure 6a it can be seen that more than 70% of the protein present in the conjugate has activity.
  • Standard curve was prepared in the same manner as in Experiment 5 except for using the Ovalbumin standard solution prepared by diluting the stock solution of lmg / ml of Ovalbumin solution to 0.6, 1.2, 2.5, 5, 10 and 20 ug / ml, respectively. Was obtained.
  • Ovalbumin Ovalbumin
  • HA-OVA hyaluronic acid-Ovalbumin conjugate
  • Each well of a 96 well plate was coated with an OVA antibody (Anti-ovalbumin antibody, Millipore) for one hour, coated, and washed three times with 300 ul / well using a washing solution. Dilute OVA 1 mg / ml standard solution to create a reference solution between 0, 0.6, 1.2, 2.5, 5, 10, 20 ng / ml, and dilute each sample with PBS to fall in the range of 0-20 ng / ml. It was. After loading 50ul of each diluted standard solution and sample in 96 wells, the mixture was reacted for 1 hour at room temperature.
  • OVA antibody Anti-ovalbumin antibody, Millipore
  • the activity of hyaluronic acid-ovalbumin conjugate was analyzed by the ratio of ELISA / Bradford assay.
  • the ELISA / Bradford assay of the hyaluronic acid-ovalbumin conjugate was found to be 80% or more.
  • Bradford assay and ELISA were the same as those mentioned in Experiment 5, and as shown in FIG. 6B, more than 80% of the proteins present in the hyaluronic acid-ovalbumin conjugate were active. . 7. Serum Stability Analysis of Hyaluronic Acid-Human Growth Hormone Conjugates (In vitrei)
  • HA-hGH conjugate (20/6: Aldehyde substitution rate is 20 mol% and HA 6 hGH molecules per chain bound) Dissolve each sample and hGH in human serum (Sigma-aldrich) at the same level to achieve a hGH concentration of 1 mg / mL. Incubated at C for 120 hours. At the appointed time, some samples were sampled, diluted 1000-fold in PBS, and frozen to prevent human serum effects. Biological activity of each sample was measured using the hGH ELISA kit (roche) according to the roche manufacturer's protocol. 2) Analysis result
  • the HA-hGH conjugate is more stable in human serum than human growth hormone (hGH), and in particular, the amount of binding of hGH molecules to HA may increase. It was found to increase.
  • IM-9 cells which are human B lymphoblasts, have hGH receptors, which, when bound to hGH, cause phosphorylation of JAK2 (Janus kinase 2, Janus kinase 2).
  • IM-9 cells (Korea Cell Line Bank) containing 10% (v / v) FBS and 25 mM HEPES
  • RPMI 1640 Incubated in RPMI 1640 (GIBCO). All cells were cultured in a standard tissue culture dish and the culture dish was
  • phosphorylated JAK2 was quantified by Western blot to determine the concentration of hGH that best signals cell signaling.
  • HA-hGH conjugate with NaI0 4 at the same concentration for 3 hours Human growth hormone was added to the HA-ald derivative at 6 mole times per HA (lOOkDa) chain, and the anti-ungkin conjugate was added to the cells to determine whether signal transduction occurred in the same manner.
  • Laemmli Nature, 227, 680-685 (1970); the antibodies used in the experiment are purchased from santacruz biotechnology co.).
  • FIG. 8C is a graph quantitatively measuring the band intensity as a result of the western blot of 8A and 8B. Therefore, it was confirmed that hGH has biological activity even after conjugation to HA.
  • Detroit 551 a normal human skin normal fibroblast, was cultured in DMEM (GIBCO) containing 10% FBS and 25 mM HEPES. All cells were cultured in a standard tissue culture dish and the dish was stored in a 37 ° C. incubator maintained at 5% CO 2 (g) and relative humidity.
  • HGH and conjugated HA-hGH gate to Detroit 551 cells (NaI0 4 and 3 hours banung to about 10 mole 0/0 percent substitution a with HA-ald humans derivative GH all HA (100kDa) 6 mole per one molecule (chain) of fold into reaction when Kin conjugate: the degree of phosphorylation of the JAK2 response rate 95 mol 0/0 or more) by processing by the concentration cell signaling (signaling cell) was confirmed by Western blotting in the same manner as in example 7.
  • FIGS. 9A and 9B are graphs showing the concentrations of the signaling materials according to the concentrations and quantifying band intensities resulting from Western blots in FIGS. 9A and 9B.
  • the HA-hGH conjugate binds to the HA receptor and / or the hGH receptor of human skin cells and has a cellular signaling effect.
  • Human neonatal epidermal keratinocytes, HEKn cells were cultured in EpiLife medium (Invitrogen) containing 1% human keratinocyte growth supplement (HKGS)-Detroit 551 (ATCC) with 10% FBS.
  • DMEM fetal calf serum
  • All cells were cultured in a standard tissue dish and the dish was stored in an rc incubator maintained at 5% CO 2 ( g ) and relative humidity 96-well plate HA-hGH containing 3 * 10 3 cells (A: HEKn B: Detroit 551) in each well of the well plate and seeding different concentrations of hyaluronic acid and hGH after 24 hours conjugate (NaI0 4 and 3 hours banung to about 10 mole 0/0 percent substitution of Keene stitching incorporated during 6 mole-fold into reaction per HA (100kDa) 1 molecule (chain) of human growth hormone in the HA-ald derivative having the: reaction rate 95 mol% or more), and then check the extent of cell proliferation.
  • WTS-1 (TaKaRa) was treated in the cells after 48 hours in order to convert WTS-1 (tetrazolium salt) into formazan by mitochondria dehydrogenase in living cells. Since the change in absorbance of the medium solution occurs, the 96 well plate treated with WST-1 was placed at 37 ° C. for 1 hour, and then the absorbance at 450 nm was measured. 2) Analysis result
  • PBS, hGH, and HA-hGH conjugates were prepared in lmg / ml solution on the basis of hGH via tail vein of SD rat (female, 6 weeks old, 200g), and then each dose of 300ul was administered. Blood samples were collected from the blood samples and the blood levels of each sample were measured using the hGH ELISA kit (roche) according to the manufacturer's method.
  • hGH blood levels dropped to baseline 24 hours prior, but provided in the form of HA-hGH conjugates.
  • High blood levels In particular, the blood concentration of the HA-hGH conjugate (20/6), in which 20% aldehyde having a high aldehyde substitution rate was introduced, did not fall to the baseline even on day 3, and according to one embodiment of the present invention
  • the protein drug is provided in the form, the half-life of the drug is long, and it can be confirmed that the drug may last long.
  • Fluesesin isothio-cyanate (FITC), hGH-FITC, HA-FITC, HA-hGH-FITC conjugates were prepared.
  • the hGH-FITC and HA-hGH-FITC conjugates tagged with FITC take precedence
  • FITC was mixed with 5 molar times the protein (hGH) with a dodotox hGH solution and reacted for 3 hours. Thereafter, the FITC was not prepared by using PD10 column.
  • nucleomethylenediamine is bonded to the carboxy group of HA using EDC as a catalyst to introduce an amine group and then react with FITC under the same conditions as HA-hGH.
  • EDC EDC
  • FITC tagged HA-FITC was prepared.
  • the prepared sample was applied with lOOul at a concentration of hng / ml based on FITC on 1 cm X lcm area of the dorsal skin of the mouse. After 1 hour, skin tissues were collected and fixed with OCT compound, a freeze embedding agent, and cryosectioned to 30um thickness to confirm transdermal permeability of each sample through fluorescence analysis of confocal microscopy tissue. It was.
  • Hairless Balb / c mice female, 6 weeks old, 20 g
  • PBS fluorescein isothio-cyanate
  • OVA-FITC fluorescein isothio-cyanate
  • HA-FITC HA-OVA-FITC conjugates
  • FITC-tagged OVA-FITC and HA-OVA-FITC conjugates first dissolve FITC in pH 9 phosphate buffer at a concentration of 2 mg / ml, then mix with OVA solution so that FITC is 10 moles of protein (OVA). Reaction was initiated. After mixing with OVA solution, reaction was performed for 12 hours in a complete solution of sodium carbonate at pH 9. After dialysis to excess water was prepared by purification of the unreacted FITC.
  • nucleomethylenediamine was conjugated to the carboxy group of HA using EDC as a catalyst to introduce an amine group, and then reacted with FITC under the same conditions as HA-OVA.
  • the prepared sample was applied 50ul at the concentration of lmg / ml on the basis of FITC on 1cm X lcm area of the dorsal skin of the mouse. After 1 hour, the skin tissue was collected and fixed with OCT compound, a freeze embedding agent, and cryosectioned to 30um thickness, followed by fluorescence analysis of confocal microscopy.
  • the transdermal delivery formulation has been shown to have a bioavailability (corresponding to more than 20% of the subcutaneous injection formulation), which is less efficient than the injection because the transdermal delivery must pass through the skin tissue layer In view of the absence, it can be seen to have a very good effect as a transdermal delivery formulation.
  • the convenience of the patient it is very effective in that the convenience of the patient can be greatly improved than the periodic injection, and the effect on the skin can be more than 20% of the injection only. .
  • the benefits can be highlighted when long-term periodic treatment such as dwarfism is required.
  • mice Female, 8 weeks old, 20g
  • 50ul of 10mg / ml solution was applied to the area of 1cm x 1cm with 10mg / ml of PBS, OVA and HA-OVA conjugates.
  • Blood samples were taken two and four weeks after transdermal delivery, respectively, and the anti-OVA IgG antibody concentration was quantified by ELISA.
  • Ovalbumin was coated on each well of a 96 well plate for one hour, coated, and washed three times at 300 ul / well using a washing solution.
  • Dilute Mouse anti-OVA antibody standard solution (Sigma Aldrich) to make a reference solution between 0, 3, 6, 12.5, 25, 50, 100, 200ng / ml, and place each sample in the range of 0-20ng / ml.
  • washing solution washing solution
  • goat anti-mouse IgG antibody-HRP solution goat anti-mouse IgG antibody-HRP solution (Millipore)
  • 50 ul of TMB solution was treated and absorbance was measured at 450 nm.
  • Anti-OVA IgG antibody concentration was measured by substituting the measured absorbance value into the standard curve of the reference solution.

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Abstract

본 발명은 약물의 경피 전달을 위한 제형 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 생체 적합성, 생분해성 및 경피 전달 특성을 갖는 전달체를 이용함으로써 백신을 비롯한 다양한 단백질 의약품 및 화학 의약품의 경피 약물 전달 시스템에 적용 가능하고, 인체에 안전하게 적용할 수 있으며, 또한 단백질의 생체 활성도를 최대화한 상태로, 생접합 효율이 높고, 약효 시간을 증대할 수 있는 경피 전달용 약물 전달체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 경피 전달용 약물 전달체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
경피 전달용 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 경피 전달용 히알루론산-단백질 컨쥬게이트
【기술분야】
본 발명은 약물의 경피 전달을 위한 제형 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 생체 적합성， 생분해성 및 경피 전달 특성을 갖는 전달체를 이용함으로써 다양한 단백질 의약품, 화학 의약품 및 백신의 경피 약물 전달 시스템에 적용 가능하고， 인체에 안전하게 적용할 수 있으며， 또한 단백질의 생체 활성도를 최대화한 상태로， 생접합 효율이 높고, 약효 시간을 증대할 수 있는 경피 전달용 약물 전달체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 경피 전달용 약물 전달체 및 이의 용도에 관한 것이다.
【배경기술】
경피 전달 시스템은 피부를 통하여 유효 약효 성분올 전달하는 시스템으로 이를 이용하여 약물전달을 할 경우 고통이 없고 환자 스스로 약물의 투여가 가능하며， 시간과 장소에 구애받지 않고 치료를 할 수 있다는 장점이 있다.
하지만 신체에서 외부 물질의 오염에 대한 1차 방어막인 피부조직을 통과하여 체내로 들어갈 수 있는 유효약효 성분의 양이 적기 때문에 활발하게 웅용되지 못하고 있었다.
따라서, 최근에는 피부조직 장벽 (barrier)의 투과도를 높여 체내로 전달되는 약물의 양올 늘리기 위하여 마이크로 크기의 침을 이용한 패치시스템이나 전기장, 초음파 등의 외부 자극을 이용하는 경피 약물 전달 시스템에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나 세밀하게 성형된 마이크로 침을 포함하는 구조의 패치형태는 제작이 어렵고 가격이 비싸다는 단점이 있으며, 피부 투과도를 높이기 위해 외부 자극을 이용해야 하는 경우 적절한 장비와 자극이 필요하기 때문에 실질적인 경피 전달 시스템의 장점을 잃게 되는 문제가 있다.
그러므로， 피부 투과율이 높고 별도의 장비 내지 자극을 요하지 않으면서 약물을 경피로 전달할 수 있는 효과적인 시스템의 개발이 필요하다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 극복하여, 단백질 의약품의 생체 활성도를 최대한으로 유지하면서 생접합 효율이 높고 다양한 수용성 유효 약효 성분에 적용 가능한 경피 전달용 약물 제제로서의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법, 이에 의해 제조된 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 다양한 용도를 제공하기 위한 것이다.
【기술적 해결방법】
본 발명자들의 연구 결과, 생분해성， 생적합성이 뛰어난 생체 고분자인 히알루론산의 경우 고분자량올 가짐에도 불구하고 피부를 통한 경피 전달 특성이 있어 이처럼 경피 전달능력이 우수한 히알루론산을 이용하여 경피 약물 전달 제제로 응용하게 되면 주사보다 간편하고, 높은 효율로 약물전달이 가능함을 확인하였다. 또한 인간의 피부세포에는 히알루론산의 리셉터가 존재하여 히알루론산의 농도에 따라 세포의 증식이 조절될 수 있음을 확인하였으며, 이와 같은 특성을 이용하여 피부 조직의 재생 등의 치료 효과는 물론이고 화장료 조성물로서도 효과적으로 응용 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명은 특히， 전달하고자 하는 약물인 단백질과 히알루론산을 접합할 때 특정 pH 조건 하에 접합 공정을 수행함으로써 단백질 내 다른 아민기를 갖는 예컨대, 리신 (lysine) 등과 같은 다른 아미노산과의 반웅을 방지할 수 있고 따라서, 단백질의 활성을 최대화한 상태로, 생접합 효율 및 약효 시간을 증대할 수 있다.
이에 본 발명의 일 구현예에 따라, 하기 화학식 1의 히알루론산 -알데하이드 (HA-aldehyde)를 제조하는 제 1단계; 및 상기 히알루론산-알데하이드를 수용성 단백질의 N-말단과 반응시키는 계 2단계를 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 제조방법이 제공된다.
또한 본 발명의 다른 일 구현예에 따라, 상기 제조방법에 의해 제조된 하기 화학식 2의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트가 제공된다.
[화학식 1]
Figure imgf000005_0001
상기 화학식 1에서,
m과 n의 합은 50 내지 10,000의 정수이고
n은 5 내지 5,000의 정수이다.
Figure imgf000005_0002
상기 화학식 2에서,
P 는 수용성 단백질을 나타내고，
m, n, 및 1의 총 합은 50 내지 10,000의 정수이고
n과 1의 합은 5 내지 5,000의 정수이고,
1은 1 내지 100의 정수이다.
이하, 본 발명의 바람직한 일 구현 예에 따른 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 사용되는 히알루론산은 생체 적합성 및 생분해성 특성을 가질 뿐만 아니라 경피 전달 특성을 가지고 있어, 인체에 안전하게 적용할 수 있으며 항원 단백질을 비롯한 다양한 단백질 의약품 및 화학 의약품의 경피 약물 전달 시스템에 적용 가능하다는 장점이 있다 (실험예 8 내지 13 참조).
한편, 명시적인 기재가 없는 한, 본 명세서 전체에서 '히알루론산 (Hyaluronic acid, HA)'은 하기 일반식 1로 표현되는 반복단위를 갖는 고분자를 지칭하며, 히알루론산의 염 또는 유도체 형태를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
[일반식 1]
Figure imgf000006_0001
상기 일반식 1에서, m"은 50 내지 10,000 의 정수일 수 있다.
'히알루론산 유도체 '는 상기 일반식 1의 히알루론산 기본 구조를 기반으로 하여 아민기， 알데하이드기, 바이닐그룹, 치올기， 알릴옥시그룹， N-숙신이미딜 -3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트 (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldith io)propionate, SPDP), N-하이드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS) 등의 기능기가 도입되어있는 히알루론산의 모든 변형체를 지칭한다. 예컨데 HA-디아미노부탄 (HA-diaminobutane),
HA-핵사메틸렌디아민 (HA-hexamethylenediamine), HA-알데하이드 (HA-aldehyde), HA-아디픽산 디하이드라지드 (HA-Adipic Acid Dihydrazide, HA-ADH), HA-2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드 (ΗΑ-2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride), HA-스페르민 (HA-Spermine),
HA-스페르미딘 (HA-spermidine),HA-SPDP,HA-NHS 등이 될 수 있다.
그리고, '히알루론산 -알데하이드 치환율 '은 전체 히알루론산 반복단위 중 셀를로오스의 고리 구조가 오픈 (open)되어 알데하이드기가 형성된 반복단위의 몰 비율로 정의되며, 정의상 0 초과 1 이하의 수치 또는 0몰0 /0 초과 100몰% 이하의 수치로 표현될 수 있다.
상기 히알루론산은 대부분의 동물에 존재하며 생분해성， 생적합성, 면역반웅이 없는 선형적인 다당류의 고분자로서 인체에 안전하게 적용할 수 있다. 히알루론산은 체내에서 분자량에 따라 여러 가지 다른 역할을 수행하기 때문에 여러 가지 용도로 사용될 수 있다.
한편, 상기 구현예에 따른 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법에 있어서, 사용되는 히알루론산， 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게는 분자량이 10,000 내지 3,000,000 달톤 (Da)인 것을 사용할 수 있다. 상기와 같은 범위의 분자량을 갖는 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 약물 전달을 위한 컨쥬게이트에 사용되기에 적합하다.
이하 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 제조방법을 하기 반응식 1을 참조하여 각 단계별로 구체적으로 설명한다.
[반웅식 1]
ll 2 계 단백질 (|
NaCNBH3
Figure imgf000007_0001
학식 1
Figure imgf000007_0002
상기 반응식 1에서， m", m, n, 1, 및 P는 각각 상기 일반식 1， 화학식 1， 및 화학식 2에서 설명한 것과 같다.
제 1단계는 히알루론산 -알데하이드 (HA-aldehyde)(화학식 1)를 제조하는 단계로서， 바람직하게는 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 히알루론산의 염， 또는 히알루론산의 유도체를 물에 용해시킨 후， 산화제와 암 (dark) 조건하에 반응시켜 셀롤로오스의 고리 (ring) 구조를 여는 단계를 포함하여 이루어지는 것일 수 있다. 이처럼, 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 제조방법은 히알루론산 단위체 중 히알루론산 수용체 (receptor)와 결합하는 부위인 카르복실기를 남겨둔 채 고리 구조를 오픈하여 형성된 알데하이드기와 활성성분인 단백질을 특이적으로 결합시킴으로써 히알루론산의 경피 전달 특성을 최대화할 수 있다.
상기 산화제는 히알루론산의 고리 구조를 깰 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며， 바람직하게는 소듐 퍼리오데이트 (Sodium periodate, NaI04)일 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 산화제는 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 히알루론산의 염， 또는 히알루론산 유도체의 단위체당 1 내지 10 몰 (mole) 배로 첨가하여 2 내지 24 시간 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 5 몰 (mole) 배로 첨가하여 2 내지 12 시간 동안 반응시킬 수 있다. 상기 산화제를 이용하여 2 mole배를 첨가하여 3시간을 반응시킨 경우 10몰0 /0 치환되었으며， 5 mole배를 첨가하여 12시간 동안 반웅시킨 경우 50몰% 치환된 유도체를 얻을 수 있다.
상술한 범위 내로 산화제와 반응 시킴으로써 치환율이 10 내지 50 몰%인 HA-알데하이드 유도체를 제조할 수 있다. 치환율이 상기 범위에 미달할 경우, 결합 가능한 단백질의 양이 너무 적어 원하는 효과를 층분히 낼 수 없으며, 상기 범위를 초과할 경우 치환율이 지나치게 높아 HA 수용체와 상호작용을 하기가 어려워 표적화 (targeting) 효과를 기대하기 힘든 문제가 있어 바람직하지 않다.
상기 산화제와의 반응 이후에， 바람직하게는 증류수에 대해 투석하여 정제하는 공정을 더욱 수행할 수 있다.
계 2단계는 상기 제 1단계를 거쳐 제조된 히알루론산-알데하이드를 단백질의 N-말단과 반웅시켜 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 (화학식 2)를 제조하는 단계로서, 바람직하게는 pH 5 내지 7의 완층용액, 바람직하게는 pH 5 내지 6.5의 소듐 아세테이트 버퍼 내에서 이루어질 수 있다. 상기와 같은 범위를 갖는 pH 조건 하에 접합 공정을 수행함으로써 단백질 내 다른 아민기를 갖는 예컨대, 리신 (lysine) 등과 같은 다른 아미노산과의 상기 히알루론산-알데하이드간의 반응을 방지할 수 있고 따라서, 단백질의 활성을 최대화한 상태로, 생접합 효율 및 약효 시간을 증대할 수 있다.
상세하게는 상기 히알루론산-알데하이드를 상기 완충용액에 용해시킨 후, 단백질을 첨가하여 하알루론산 -알데하이드 유도체 내 포함된 알데하이드기와 단백질의 N-말단의 아민기를 반웅시킬 수 있다.
단백질의 N-말단기에는 아민기가 존재하므로， 제 2단계에서 사용되는 단백질은 별도의 준비 과정이 없이 활성성분인 단백질 자체로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 단백질은 물에 용해시켜 수용액 상태로 사용할 수 있다.
상기 히알루론산-알데하이드에 생접합되는 단백질은 수용액 상에서 용해될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고 사용 가능하다. 바람직하게는 장기간 주기적인 약물치료가 동반되는 질병 또는 피부 질환을 예방， 치료하기 위한 단백질 약물일 수 있으며, 이러한 단백질 약물은 예컨대 인간성장호르몬, '인터페론알파, 에리스로포에틴 (erythropoietin), 트레일 (Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), 또는 인술린일 수 있다. 또한 장기간 주기적인 약물치료가 등반되는 질병 또는 피부질환은 바람직하게는 왜소증， 암, 당뇨병, 화상, 아토피, 건선， 습진, 피부염, 여드름, 또는 대상포진 일 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 히알루론산-알데하이드에 생접합되는 단백질은 항원 단백질일 수 있다. 항원 단백질은 예컨대, 병원체의 단백질, 재조합 단백질， 당단백질， 또는 펩티드일 수 있다.
항원 단백질이 히알루론산과 결합된 컨쥬게이트는 피부 조직 내 면역세포인 랑게르한스 세포 (Langerhans cell)와 수지상세포 (dendritic cell)를 자극하여 항원단백질만을 투여한 경우에 비해 보다 강력한 면역 반웅을 일으킬 수 있어 백신 조성물로서의 효과가 매우 우수하다 (실험예 15 참조). 바람직하게는 상기 단백질은 히알루론산 -알데하이드 1 분자당 1 내지 10개 분자수로 결합되도록 반웅시킬 수 있다. 상기와 같은 범위 내의 분자수의 단백질이 결합된 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 히알루론산 유도체의 치환율에 따라 체내에서 24시간 내지 96시간 이상 머무를 수 있으며， 이를 조절함으로써 약효장기지속성 약물전달 시스템으로의 응용이 가능하다. 본 발명의 일 구현예에 따른 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 특히 경피 전달 특성이 좋아 피부질환 치료제 및 /또는 화장품으로 응용 가능하며, 그 외에도 다양한 단백질 의약품의 경피 전달 약물 제제로의 웅용이 가능하다.
또한 바람직하게는 상기 단백질과 함께 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaCNBH3)를 첨가하여 반응시킬 수 있는데, 소듐 시아노보로하이드라이드는 상기 단백질의 N-말단의 아민기와 히알루론산 유도체의 알데하이드기가 반응한 후 생기는 이중 결합을 환원시 키는 역할을 한다. 상기 소듐 시아노보로하이드라이드는 바람직하게는 히 알루론산-알데하이드의 치환율에 따라 알데하이드기의 2 내지 10 몰 배로 첨가하여 12 내지 24 시간 동안 반응시 킬 수 있다.
한편, 알데하이드기는 반웅성 이 매우 좋은 특성 이 있으므로 바람직하게는 상기 제 2단계 이후에 , 단백질과 반응하지 않고 남아있는 알데하이드기를 블로킹 (blocking)하는 제 3단계를 더욱 포함할 수 있다.
이처 럼 반응에 관여하지 않고 남아있는 알데하이드기를 블로킹 함으로써， 남아있는 알데하이드기가 히 알루론산 유도체에 결합된 단백질의 다른 아민기와 반웅하는 것을 방지할 수 있으며， 또한 본 발명의 일 구현예에 따른 히 알루론산-단백질 접 합체가 체내에 들어간 이후 상기 알데하이드기와 체내에 존재하는 다양한 단백질이 비특이 적 (non-specific)으로 반웅하는 것을 방지할 수 있는 등, 원치 않는 반응을 효과적으로 방지 할 수 있어 목적하는 반웅의 효율을 보다 향상시 킬 수 있다.
상기 블로킹을 위해 사용되는 물질은 카르복실기나 알데하이드기와 반웅할 수 있는 것 이면 특별히 제한되지 않고 사용 가능하나, 바람직하게는 아민류를 사용하여 이투어 질 수 있다. 이와 같은 블로킹 과정은 하기 반응식 2로 나타낼 수 있다.
Figure imgf000010_0001
상기 아민류는 탄소수 1 내지 5인 직 쇄 또는 분지쇄 알킬 카바자이트
(alkyl carbazate), 또는 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민일 수 있다.
상기 알킬 카바자이트는 바람직하게는 에틸 카바자이트 (ethyl carbazate) 또는 터트 부틸 카바자이트 (tert butyl carbazate) 일 수 있으며 , 상기 저급 알칸을아민은 예컨대 아미노메탄올 (aminomethanol 또는 MEA), 아미 노에 탄올 (aminomethanol), 아미노프로판을 (l-amino-2-propanol, 또는 1 -amino-3-propanol), 아미노부탄올 (aniinobutanol), 또는 아미노펜탄올 (aminopentanol)일 수 있으며， 바람직하게는 아미노에 탄올일 수 있다.
아민류로서 알킬 카바자이트, 예컨대 에 틸 카바자이트를 사용하는 경우, 게 3단계는 하기 반웅식 3과 같이 나타낼 수 있으며， 바람직하게는 화학식 2의 화합물의 알데하이드 기 의 몰 유닛에 대해 5 내지 10 몰 배로 첨가하여 12 내지 24 시 간 동안 반웅시 켜， 단백질과 반웅하지 않고 남아있는 알데하이드기가 블로킹 된 화학식 3의 화합물을 제조할 수 있다.
Figure imgf000011_0001
또한 아민류로서， 알칸올아민, 예컨대 아미노에탄을을 사용할 경우， 바람직하게는 상기 화학식 2의 화합물의 알데하이드 기 의 몰 유닛에 대해 5 내지 10 몰 배로 첨가하여 12 내지 24 시간 동안 반응시 킬 수 있다.
아민류를 상기 범위 내로 첨가함으로써 100% 블로킹 이 가능하며 , 상기 범위 미만으로 첨가할 경우 100% 블로킹 이 되지 않을 가능성 이 있어 바람직하지 않다.
한편, 상기 아민류로서 , 알킬 카바자이트를 사용하는 경우 바람직하게는 바람직하게는 pH 5 내지 7의 조건 하에 반응시킬 수 있으며， 이를 위해 바람직하게는 상기 제 1단계에 사용된 것과 같은 아세테이트 버 퍼를 사용할 수 있다. '
또한 알칸을아민올 사용하는 경우 바람직하게는 pH 7 내지 9의 조건 하에 반응시 킬 수 있으며 , 이를 위해 바람직하게는 포스페이트 버퍼 (Phosphate buffer) 같은 버퍼를 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이， 본원의 히 알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법은 컨쥬게이션 반응이 수용액 상에서 진행되어， 수용액에 용해 가능한 수용성 펩타이드 및 단백질 활성 성분의 생접 합을 통한 약물 전달 시스템 준비에 응용 가능하다.
본 발명 의 바람직한 다른 일 구현예는 상술한 제조방법에 따라 제조된 하기 화학식 2의 히 알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제공한다.
[화학식 2]
Figure imgf000012_0001
상기 화학식 2에서
P 는 수용성 단백질을 나타내고,
m, n， 및 1의 총 합은 50 내지 10,000의 정수이고, n과 1의 합은 5 내지
5,000의 정수이고, 1은 1 내지 100의 정수이다.
상기 히 알루론산-단백질 컨쥬게이트는 인체에 안전하게 적용할 수 있으며 , 또한 단백질의 특정 아미노산과 반웅하여 단백질의 생체 활성도를 최대화한 상태로, 생접합 효율이 높고， 약효 시 간을 증대할 수 있어 효과적 인 경피 전달 제형으로 응용될 수 있다.
한편, 히 알루론산은 보습 및 주름 개선을 위하여 화장품에도 다수 포함되어 있는 성분으로， 피부의 표피 (epidermis) 세포층에 존재하는 각질세포 (keratinocyte) 및 피부 깊숙한 진피 (dermis) 층에 존재하는 섬유아세포 (fibroblast) 등의 피부세포는 히알루론산의 수용체를 가지고 있어 히알루론산의 농도에 따라 증식이 조절된다. 또한 피부 조직에는 다양한 면역 세포가 존재하고 있어 이를 자극하였을 때 면역 반웅 활성화에 기여하므로 보다 강력한 면역반응을 일으킬 수 있는 효과적인 경피 전달용 백신 조성물로 적용될 수 있다. 따라서 ' 이러한 경피 전달 특성이 있는 히알루론산을 이용한 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 피부질환 치료제， 단백질 치료제의 경피 전달 약물제제, 화장품 및 백신 등으로의 응용이 기대된다.
따라서 본 발명의 바람직한 또 다른 일 구현예는, 상기 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 치료학적 유효량으로 포함하는 경피 전달용 약학 조성물, 피부세포의 재생을 위한 치료제, 화장료 조성물 및 백신 조성물을 제공한다.
상기 치료학적 유효량이란 유리한 효과 또는 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과, 예컨대 질병 상태의 완화， 개선, 안정, 복귀， 진행올 늦추거나 지연시키기에 층분한 양을 의미하며, 이러한 유효량은 1희 또는 그 이상으로 투여될 수 있다.
바람직하게는 상기 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 백신 조성물은 각각 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 화장용으로 허용 가능한 담체, 백신으로 허용 가능한 담체를 더욱 포함할 수 있으며, 이에 사용되는 바람직한 담체 및 그 밖의 첨가제, 부형제, 안정화제 등은 당 분야에서 널리 알려진 것을 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 바람직한 일 구현예는, 상술한 바와 같은 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 제조방법으로 화학식 2의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 치료학적 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 전달방법을 제공한다. 상기 단백질， 히알투론산, 및 치료학적 유효량 등에 대해서는 앞서 언급한 것을 동일하게 적용하거나, 당업자가 적절히 조정하여 적용할 수 있다.
상기 투여는 바람직하게는 경피 투여일 수 있으며， 상기 대상은 바람직하게는 포유류일 수 있다.
본 발명 의 히 알루론산-바이오 의 약품 접합체는， 수용액 상에서 컨쥬게이션 반응을 진행할 수 있어 , 수용성 인 다양한 펩타이드 및 단백질 활성 성분에 적용 가능하고， 생체적합성 , 생분해성 고분자인 히 알루론산의 경피투과 전달 특성을 유지하여 간편하고 인체에 적용하기 안전한 단백질 치료제， 화장품 및 백신으로의 다양한 응용이 가능하다. 또한 히 알루론산 알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단기가 특정 pH 조건에서 특이 적으로 반웅하여 접 합하기 때문에 단백질의 다른 아민기를 가지는 아미노산과 반웅하지 않아 단백질의 활성을 높인 상태로 접 합체를 합성할 수 있다. 따라서 본 발명의 히 알루론산-단백질 컨쥬게이트는 피부질환 치료제, 단백질 치료제의 경피 전달 약물제제， 화장품， 백신 등으로 효과적으로 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1는 본 발명의 일 구현예에 따른 알데하이드기가 도입된 히 알루론산 유도체 및 이를 이용한 히 알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 화학적 스킴을 간략히 도시 한 것 이다.
도 2는 본 발명의 실시 예에 따른 방법으로 제조된 HA-aldehyde-TBC 유도체의 1H-NMR 결과이다.
도 3a는 본 발명의 실시 예 1에 따른 방법으로 제조된 히 알루론산-인간성 장호르몬 (HA-hGH) 컨쥬게이트와 인간성장호르몬 단백질 (hGH)의 GPC 결과를 나타낸 것 이며 도 3b는 실시 예 2에 따른 방법으로 제조된 히 알루론산-오발부민 (HA-OVA) 컨쥬게이트와 오발부민 (OVA)의 GPC 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 히 알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트의 하나의 히 알루론산 체인에 포함된 인간성장호르몬 분자수 및 인간성장호르몬 분자수에 따른 생접합 효율을 나타낸 것이다.
도 5는 인간성 장 호르몬과 히 알루론산-인간성장 호르몬컨쥬게이트의 원편광 이색성 분광 분석 (Circular Dichroism, CD) 분석 결과를 비교하여 나타낸 것 이다.
도 6a는 본 발명 의 실시 예 1에 따른 히 알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트와 인간성장 호르몬의 활성도 분석 결과를 ELISA/Bradford assay의 비율로 나타낸 것이며 도 6b는 실시예 2에 따른 히알루론산-오발부민 컨쥬게이트와 오발부민의 활성도 분석 결과를 ELISA/Bradford assay의 비율로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1에 따른 히알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트와 인간성장 호르몬의 인간 혈청 내 안정성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 히알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트와 인간성장 호르몬의 IM-9 (human B lymphoblast) 세포에의 신호전달 활성을 확인한 것이다 (A: 인간성장호르몬의 농도별 세포 신호전달 측정결과, B: 500ng/ml의 hGH를 포함하는 HA-hGH 컨쥬게이트의 세포 신호전달 측정결과， C: A 및 B의 밴드 강도를 측정하여 정량적으로 나타낸 그래프).
도 9는 인간 피부 세포인 Detroit 551 세포에 대한 hGH와 HA-hGH 컨쥬게이트 처리에 따른 JAK2 인산화 정도를 확인한 것이다 (A: hGH 처리에 따른 JAK2 인산화 측정을 통한 hGH 수용체에 의한 신호전달 측정결과, B: HA-hGH 컨쥬게이트 처리에 따른 JAK2 인산화 측정을 통한 hGH 수용체에 의한 신호전달 측정결과， C: A 의 밴드 강도를 측정하여 정량적으로 나타낸 그래프 ,D:B 의 밴드 강도를 측정하여 정량적으로 나타낸 그래프).
도 10은 인간 피부 세포의 (HEKn, Detroit 551) 히알루론산과 히알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트의 농도별 처리에 따른 세포 증식 효과를 확인한 것이다 (A: HEKn세포에 히알루론산을 처리했을 때의 농도별 세포 증식 효과, B: Detroit 551 세포에 히알루론산을 처리했을 때의 농도별 세포 증식 효과， C: HEKn 세포에 히알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트를 처리했을 때의 농도별 세포 증식 효과, D: Detroit 551 세포에 히알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트를 처리했을 때의 농도별 세포 증식 효과).
도 11은 본 발명의 실시예 1에 따른 히알투론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트의 i.v. injection 후의 약리 특성 분석 (Pharmacokinetic analysis) 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 1에 따른 히알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트와 인간성 장 호르몬， 히 알루론산의 경피투과 특성 분석 결과를 나타낸 것 이다 (A: control, B: FITC, C: hGH-FITC, D: HA-FITC, E: HA-hGH-FITC). 도 13은 본 발명의 실시 예 2에 따른 히 알루론산-오발부민 컨쥬게 이트와 오발부민, 히 알루론산의 경피투과 특성 분석 결과를 나타낸 것이다 (A: PBS, B: FITC, C: OVA-FITC, D: HA-FITC, E: HA-OVA-FITC).
도 14는 본 발명의 실시 예 1에 따른 히 알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트의 경피 전달 후의 약리 특성 분석 (Pharmacokinetic analysis) 결과를 나타낸 것 이다.
도 15는 본 발명의 실시 예 2에 따른 히 알루론산-오발부민 컨쥬게이트의 경피 백신 특성 분석 결과로 PBS, 오발부민, 히 알루론산 -오발부민을 경피 전달하였을 때 2주, 4주 후의 혈중 오발부민 항체 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 것 이다.
【발명의 실시를 위 한 형 태】
이하， 발명의 다양한 실시 예에 대해 설명하기로 한다. 다만， 이는 발명의 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 발명 의 권리 범위가 제한되는 것은 아니다.
<실시 예 : 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 >
실시예 l. HA-hGH 컨쥬게이트의 제조
히 알루론산 (HA) (MW=100kDa)을 10mg/ml의 농도로 물에 녹인 후 소듐 퍼 리오데이트 (Sodium periodate, NaI04)를 히 알루론산 단위 체당 1 몰 (mole)배로 첨가해 각각 3시간, 6시간, 12시간 동안 빛을 차단한 상태로 반응시 킨 후 분획분자량 (Molecular weight cutoff)이 7000 달톤인 투석 막을 이용하여 증류수에 대하여 3일 동안 투석하여 정제한 후 3일간 동결건조시켜 치환율이 다른 HA-알데하이드 유도체를 얻었다.
상기에서 얻어진 HA-알데하이드 유도체를 10mg/ml의 농도로 lOOmM, pH 5.5의 아세테이트 버퍼 에 녹인 후, LG 생명과학에서 제공 받은 수용액 상태의 인간성 장호르몬을 HA 1 분자 (chain)당 각각 1개, 4개, 6개, 8개가 결합되도록 첨가하였다. HA-알데하이드 유도체의 치환율 (치환율은 하기 실험예 1의 방법에 따라 분석함)에 따라 알데하이드의 5 몰 배로 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaCNB )를 첨가하여 24시간 동안 반웅시켜 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제조하였다. 이후 반응하지 않고 남아있는 알데하이드를 블로킹 (blocking)하기 위하여 에틸 카바자이트 (ethyl carbazate)를 알데하이드의 5 몰 배로 넣어준 후 24시간 동안 더 반웅 시켰다. 본 실시예에서는 에틸 카바자이트를 사용하여 블로킹하였으나, 아미노 에탄올 (amino ethanol)을 사용할 수도 있으며 이 경우 알데하이드의 5 몰 배로 아미노 에탄을을 넣어준 후 NaOH를 이용하여 H를 8로 올린 후 12시간 동안 더 반웅시킨다.
반응시킨 용액을 pH 7.4의 인산완충식염수 (Phosphate buffered saline
(PBS))에 대하여 투석한 후 -70c 에 보관하였다. 실시예 2.HA-OVA 컨쥬게이트의 제조 .
히알루론산 (HA) (MW=215kDa)을 10mg/ml의 농도로 물에 녹인 후 소듐 퍼리오데이트 (Sodium periodate, NaI04)를 히알루론산 단위체당 2 몰 (mole)배로 첨가해 3시간 동안 빛을 차단한 상태로 반응시킨 후 분획분자량 (Molecular weight cutoff)이 7000 달톤인 투석막을 이용하여 증류수에 대하여 3일 동안 투석하여 정제한 후 3일간 동결건조시켜 HA-알데하이드 유도체를 얻었다.
상기에서 얻어진 HA-알데하이드 유도체를 8mg/ml의 농도로 lOOtnM, pH 5의 아세테이트 버퍼에 녹인 후, 오발부민 (Ovalbumin)(Sigma-Aldrich)을 HA 1 분자 (chain)당 3개, 6개가 결합되도록 첨가하였다. HA-알데하이드 유도체의 치환율 (치환율은 하기 실험예 1의 방법에 따라 분석함)에 따라 알데하이드의 5 몰 배로 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaCNBH3)를 첨가하여 24시간 동안 반응시켜 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제조하였다. 이후 반웅하지 않고 남아있는 알데하이드를 블로킹 (blocking)하기 위하여 에틸 카바자이트 (ethyl carbazate)를 알데하이드꾀 5 몰 배로 넣어준 후 24시간 동안 더 반응 시켰다. 본 실시예에서는 에틸 카바자이트를 사용하여 블로킹하였으나, 아미노 에탄올 (amino ethanol)을 사용할 수도 있으며 이 경우 알데하이드의 5 몰 배로 아미노 에 탄올을 넣어준 후 NaOH를 이용하여 pH 를 8로 을린 후 12시간 동안 더 반웅시 킨다. . 하기와 같은 조건으로 GPC 분석을 실시하여 HA-OVA을 반응하지 않은 OVA, 소듐 시아노보로하이드라이드, 에 틸 카바자이트 등으로부터 분리 정 제한 후, 분리 정제된 HA-OVA을 원심분리 필터를 이용하여 5000 g에서 농축하고 농축된 용액을 -70cfC에 보관하였다.
<GPC 분석 조건 >
핍프: Waters 1525 binary HPLC pump
흡광도 측정기： Waters 2487 dual λ absorbance detector
샘플러 : Waters 717 plus auto-sampler
컬럼 : Waters Ultrahydrogel 500 + Waters Ultrahydrogel 1000
이동상: PBS (pH 7.4)
유속: 0.5 mL/min.
측정 파장: 210 nm와 280 nm로 이증 측정 (dual detection).
<실험예 >
1. 히 알루론산 알데하이드 유도체의 치환율 분석
1) 분석 방법
실시 예 1의 HA-hGH 컨쥬게이트 제조과정과 실시 예 2의 HA-OVA 컨쥬게이트 제조과정 중 제조된 HA-알데하이드 유도체의 치환율을 분석하기 위해, 제조된 HA-알데하이드 유도체를 5mg/ml의 농도로 lOOmM, pH 5.2의 아세테이트 버퍼 에 녹인 후 히 알루론산 단위 체당 각각 5 몰 배의 터트 부틸 카바자이트 (Tert butyl carbazate, TBC)와 소듐 시 아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaCNBH3) 를 첨가하여 24시간 반웅 시켜 HA-알데하이드 유도체 내 포함된 알데하이드기에 TBC가 결합된 HA-알데하이드 -TBC를 제조한 후 MWCO 7000 투석 막을 이용하여 증류수에 대하여 3일간 투석 한 후 3일간 동결건조하여 1H-NMR (DPX300, Bruker, Germany)으로 알데하이드의 치환율을 분석하였다. 2) 분석 결과 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 1)에서 제조된 HA-알데하이드 -TBC 유도체의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크 외에도 , δ= 1.2 ~ 1.4ppm에 9개의 수소를 나타내는 TBC의 3개의 메틸 (methyl) 피크가 나타났다. 정량분석올 위해 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명 (methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준 (internal standard)로 정했다.
실시예 1， 실시예 2에 따른 HA-알데하이드의 치환율은 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 δ = 1.2 ~ 1.4 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. 이러한 Ή-NMR 분석 결과를 통해 HA-알데하이드의 치환율을 계산해 본 결과 소듐 퍼리오데이트와의 반웅 시간을 조절하여 10~50 몰%의 치환율을 조절하여 얻을 수 있음을 확인하였다. 즉， HAᅳ알데하이드의 치환율은 소듐 퍼리오데이트와의 반웅 시간을 길게 할수록 높게 나타났으며， 보다 구체적으로 실시예 1의 경우 반웅시간을 3시간, 6시간, 및 12시간으로 하였을 경우, 각각 10 몰0 /0， 20 몰 %， 및 50 몰 0/。의 치환율을 나타냈으며, 실시예 2의 경우 반응시간을 3시간으로 하였을 경우 15몰 0/。의 치환율을 나타냈다.
2. 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 GPC분석
1)분석 방법
실시예 1에 따라 제조된 히알루론산-인간성장 호르몬 (HA-hGH) 컨쥬게이트 (NaI04와 3시간 반응시켜 약 10 몰0 /0의 치환율을 가지는 HA-ald 유도체에 인간성장호르몬을 HA(100kDa) 1 분자 (chain)당 6 mole배로 넣어 반웅시킨 접합체: 반웅률 95 몰% 이상)와 실시예 2에 따라 제조된 히알루론산-오발부민 (HA-OVA) 컨쥬게이트 (NaI04와 3시간 반웅시켜 약 15 몰%의 치환율을 가지는 HA-ald 유도체에 오발부민을 HA(215kDa) 1 분자 (chain)당 3 mole배로 넣어 반웅시킨 접합체: 반웅률 80 몰% 이상)의 GPC(Gel Permeation Chromatography) 분석을 통해 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 형성을 확인하였다. HPLC(High performance liquid chromatography)를 사용하여 히알루론산-단백.질 컨쥬게이트를 GPC 분석하였다. 분석 조건은 하기와 같다.
<GPC분석 조건 > 펌프: Waters 1525 binary HPLC pump
흡광도 측정기 : Waters 2487 dual λ absorbance detector
샘플러 : Waters 717 plus auto-sampler
컬럼 : (hGH) Waters Ultrahydrogel 500 + Waters Ultrahydrogel 250
(OVA) Waters Ultrahydrogel 500 + Waters Ultrahydrogel 1000 이동상: PBS (pH 7.4)
유속: 0.5 mL/min.
측정 파장: 210 nm와 280 nm로 이중 측정 (dual detection). 2) 분석 결과
HA-hGH의 GPC 분석 결과 도 3a에서 볼 수 있는 바와 같이 280nm의 파장에서 고분자량의 히 알루론산의 체류 시 간 (retention time) 인 14~15분 대에서 피크가 나타나 히 알루론산 (HA)에 단백질이 컨쥬게이션 되 었음을 확인하였다. 또한 HA-OVA의 GPC 분석 결과 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 2H)nm에서 OVA의 피크가 고분자량 쪽으로 시프트되어 31~32 분 대에서 나타나 단백질이 컨쥬게이션 되 었음을 확인하였다.
3. 히 알루론산-단백질 컨쥬게이트의 정량분석
1) 분석 방법
상기 실시 예 1 및 실시 예 2에 따라 제조된 HA-단백질 컨쥬게이트 내의 단백질 함량은 상기 실험 예 2의 GPC 분석 결과에서 피크 아래의 면적을 측정해 구하였다.
HA-hGH의 경우, 1 mg/mL 농도로 hGH 원액을 준비한 뒤 , 증류수에 회석시 켜 hGH 표준용액을 준비하였다. hGH 표준용액을 상기 실험 예 2의 GPC 분석 조건으로 분석하여 hGH 농도에 따른 GPC 피크 아래 면적 의 표준곡선 (standard curve)를 구하였다. 상기 실시 예 1에 따라 제조된 HA-hGH 컨쥬게이트 (NaI04와 3시간 반응시켜 약 10 몰%의 치환율을 가지는 HA-ald 유도체에 인간성장호르몬을 HA(100kDa) 1 분자 (chain)당 6 mole배로 넣어 반응시 킨 접 합체 : 반웅율 95 몰% 이상)를 같은 조건에서 분석해 얻어진 GPC 피크 아래 면적 을 표준곡선에 대입해 hGH 함량을 구했다. HA-OVA의 경우에는 HA-hGH와 마찬가지로 표준 용액을 준비해서 표준 곡선올 구하고 정제 전 반웅하지 않고 남아 있는 OVA의 농도를 계산하여 반웅한 OVA의 함량을 구하였다. 상기 실시 예 2에 따라 제조된 HA-OVA 컨쥬게이트의 경우 도 3b와 같이 반웅하지 않은 OVA 피크가 36~37분 정도에 나타나므로 그 면적을 표준곡선에 대입 함으로써 반응하지 않은 OVA 함량을 통해 컨쥬게이트 내의 OVA 함량올 계산하였다.
2) 분석 결과
실시 예 1에 따라 제조된 HA-hGH 컨쥬게이트 내의 단백질 (hGH) 함량은 피드 (feed) 내에서 HA 한 분자 당 반웅시 킨 단백질의 분자수에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. HA 한 분자당 반웅시 킨 단백질의 분자수를 1, 4, 6, 8개로 변화시켰을 때 , ΗΑ 한 분자 당 결합한 단백질의 평균 분자수는 1， 4, 6, 8개로 조절 가능했다. 즉, 단백질의 생접합 효율 (Bioconjugation efficiency)(%)은 분자수에 상관없이 95% 이상으로 나타났다 (도 4). 실시 예 2에 따라 제조된 HA-OVA 컨쥬게이트 내의 생접합 효율 (Bioconjugation efficiency)(%)은 분자수 3일 때 80% 내외 , 분자수 6일 때 65% 내외로 나타났다.
4. 히알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트의 CD 분석
1) 분석 방법
hGH 농도를 기준으로 하여 (0.25mg/ml) hGH 용액과 HA-hGH 컨쥬게이트 용액을 이용하여 원편광 이 색성 분광 분석 (Circular Dichroism)을 하였다. 분석 조건은 하기와 같다.
< CD 분석 조건 >
UV 분광광도계 (UV spectrophotometer): JASCO J-715
측정 조건: 25 °C, 200~250 nm, N2 분위기
석 영 큐빗 (A quartz cuvette): 2 mm 경로 길이 (path length)
미가공 데이터 (Raw data): 반응시간 1초에 따라 0.2 mm 간격
2) 분석 결과
도 5에서 볼 수 있듯이 , hGH의 스펙트럼과 HA-hGH 컨쥬 게이트의 CD의 피크 (peak)가 일치하는 것으로 나타나， 인간성장 호르몬의 2차 구조가 히 알루론산과 접합된 상태에서도 유지되는 것을 알 수 있었다.
5. 히알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트의 활성도 분석
1) 분석 방법
lmg/ml의 인간성장 호르몬 용액의 원액을 각각 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 50 ug/ml의 농도로 회석시켜 인간성장 호르몬 표준용액을 준비하고, Bradford assay를 이용하여 표준곡선을 구하였다. 즉, 인간성 장 호르몬 표준용액과 쿠마쉬 블루 시 약 (Coomassie® Protein Assay Reagent)을 1 :1의 부피 비율로 섞은 후 상온에서 10분간 반응 (incubation)시 킨 후에 595nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 구하였다.
이후 상기 실시 예 1에 따라 준비된 히 알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트 (각각 약 10 몰%, 20 몰0 /0， 및 35 몰0 /0(NaIO4와의 반웅시간을 8시간으로 한 것 외에는 실시 예 1과 동일하게 제조함)의 치환율을 가지는 HA-ald 유도체에 인간성 장호르몬을 HA(100kDa) 1 분자 (chain)당 6 mole배로 넣어 반웅시 킨 접합체 : 반웅율 95 몰0 /0 이상)와 인간성장호르몬을 100 배로 희석하여 같은 조건에서 Bradford assay로 흡광도를 측정 한 후 표준곡선에 대 입해 인간성 장호르몬의 함량을 구했다.
다음으로, 앞서 Bradford assay를 찍은 인간성장호르몬 (hGH) 및 각 히 알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트 (HA-hGH) 샘플과 인간성장호르몬 표준 용액을 10000배 희석하여 ELISA를 통해 활성도를 가진 인간성장호르몬의 함량을 구했다. 즉, hGH l mg/ml 표준 용액올 회석하여 0, 1, 2, 5， 10, 20ng/ml 사이의 기준용액을 만들고， 상기 각 샘플을 0， 1, 2， 5, 10, 20ng/ml 범위 에 들어가도록 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 희석하였다. 다음으로 hGH 항체가 깔려 있는 96well에 각 기준용액과 샘플을 희석 한 용액을 200ul씩 로딩 (loading)한 뒤 37°C에서 한 시간 동안 반응시 켰다. 이후 세척 액 (Washing solution)을 이용하여 250ul/well로 5번 세척 해주고 anti-hGH-DIG 용액을 200 ul/well로 로딩 한 뒤 37°C에서 1시간 동안 반응시 켰다. 다시 5번을 세척 하고 anti-DIG-POD 이차 항체 (secondary antibody)를 200ul/well에 처리 해준 뒤 37°C에서 한 시간 동안 반응시 켰다. 이후 세척을 다섯 번 더 한 뒤에 POD substrate(peroxidase) 용액을 200 ul 넣고 빛을 차단한 상태로 20분간 반응시 킨 뒤 405nm에서 흡광을 측정하였다. 측정된 흡광도의 값을 기준용액의 표준곡선에 대입하여 항체와 상호작용을 하는 샘플의 농도를 측정하였다. ELISA 에 사용된 모든 물질은 hGH ELISA kit(roche) 내 포함된 것을 사용하였다,
ELISA/Bradford assay의 비율을 통하여 히 알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트의 활성도를 분석하였다.
2) 분석 결과
도 6a에서 볼 수 있듯이 히 알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트의
ELISA/Bradford assay의 비율이 70% 이상으로 나타남을 알 수 있었다.
구체적으로 Bradford assay는 단백질의 리신 (lysine)을 측정하는 assay 방법 이고 ELISA는 hGH와 결합하는 항체와의 상호작용을 통하여 정량하는 assay 방법으로서， 이 비율을 통하여 히 알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트의 활성도를 측정할 수 있는데, 도 6a에 나타난 바와 같이 컨쥬게이트 내 존재하는 단백질 중에서 70% 이상이 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
6. 히알루론산-오발부민 컨쥬게이트의 활성도 분석
1) 분석 방법
lmg/ml의 오발부민 용액의 원액을 각각 0.6， 1.2, 2.5, 5, 10, 20 ug/ml의 농도로 희석시켜 제조한 오발부민 표준용액을 사용한 것 외에는 상기 실험 예 5와 동일한 방법으로 표준곡선을 구하였다.
이후 상기 실시 예 2에 따라 준비된 히 알투론산-오발부민 컨쥬게이트 (각각 약 15 몰0 /0의 치환율을 가지는 HA-ald 유도체에 오발부민을 HA(215kDa) 1 분자 (chain)당 3 mole배, 6mole배로 넣어 반응시 킨 접합체)와 오발부민을 1000 배로 회석하여 같은 조건에서 Bradford assay로 흡광도를 측정 한 후 표준곡선에 대입해 오발부민의 함량을 구했다.
다음으로， 앞서 Bradford assay를 찍은 오발부민 (OVA) 및 각 히 알루론산-오발부민 컨쥬게이트 (HA-OVA) 샘플과 오발부민 표준 용액을 1000배 회석하여 ELISA를 통해 활성도를 가진 오발부민의 함량을 구했다.
96 well plate의 각 well에 OVA 항체 (Anti-ovalbumin antibody, Millipore)를 한 시간 동안 로딩 하여 코팅하고 세척 액 (Washing solution)을 이용하여 300ul/well로 3번 세척해주었다 . OVA 1 mg/ml 표준 용액을 회석하여 0, 0.6, 1.2, 2.5, 5, 10, 20ng/ml 사이의 기준용액을 만들고， 상기 각 샘플을 0 - 20ng/ml 범위에 들어가도록 PBS를 이용하여 희석하였다. 96 well에 각 기준용액과 샘플을 희석 한 용액을 50ul씩 로딩 (loading)한 뒤 상온에서 한 시간 동안 반응시 켰다. 이후 세척 액 (Washing solution)을 이용하여 300ul/well로 3번 세척 해주고 anti-OVA-HRP 용액 (Thermo Scientific)을 100 ul/well로 로딩 한 뒤 상온에서 1시간 동안 반웅시 켰다. 다시 3번을 세척 하고 ΤΜΒ(3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine) 용액을 50 ul 넣고 빛올 차단한 상태로 20분간 반응시켰다. Stop solution (2N 황산 용액)을 처리하고 450nm에서 흡광을 측정하였다. 측정된 흡광도의 값올 기준용액의 표준곡선에 대입하여 항체와 상호작용을 하는 샘플의 농도를 측정하였다.
ELISA/Bradford assay의 비율을 통하여 히 알루론산-오발부민 컨쥬게이트의 활성도를 분석하였다.
2) 분석 결과
도 6b에서 볼 수 있듯이 히 알루론산-오발부민 컨쥬게이트의 ELISA/Bradford assay의 비율이 80% 이상으로 나타남올 알 수 있었다. Bradford assay와 ELISA에 대해서는 상기 실험 예 5에서 언급한 것과 같으며 , 따라서 도 6b에 나타난 바와 같이 , 히 알루론산-오발부민 컨쥬게이트 내 존재하는 단백질 중에서 80% 이상이 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 7. 히 알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트의 혈청 안정성 (serum stability) 분석 {In vitrei)
1) 분석 방법
제조된 히 알루론산-단백질 컨쥬게이트의 혈청 안정성을 알아보기 위하여 히 알루론산에 결합되지 않은 hGH와, 다음의 샘플을 사용하였다.
- HA-hGH 컨쥬게이트 (20/6: 알데하이드기 치환율이 20 몰% 이며 HA 한 분자 (chain) 당 6개의 hGH 분자가 결합한 것) 위의 샘플과 hGH를 hGH 농도가 1 mg/mL가 되도록 동일하게 맞추어 각각 인간 혈청 (human serum)(Sigma-aldrich)에 용해시 켜 37 °C에서 120시간 동안 배양했다. 정해진 시간이 되 었을 때 일부를 샘플링 해 인간 혈청 의 영향을 막기 위해 PBS에 1000배로 희석 한 후 냉동시켰다. 각 샘플의 생물학적 활성도는 hGH ELISA kit(roche)를 이용하여 roche 제조사의 기준 프로토콜 (protocol)을 따라 측정하였다. 2) 분석결과
도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 , 인간성장 호르몬 (hGH)보다 HA-hGH 컨쥬게이트가 인간 혈청 내에서 더 오랫동안 안정 한 것을 확인할 수 있었으며 , 특히 HA에 대한 hGH 분자의 결합량이 증가할수톡 안정성 이 더욱 높아지는 것을 알 수 있었다.
8. 히알루론산-인간성장 호르몬 컨쥬게이트의 세포 신호전달 활성 테스트 (Cell signaling activity test) (in vitro)
1) 분석 방법
IM-9 세포는 인간 B 림프아세포 (human B lymphoblast)로서, hGH 수용체를 가지고 있어 hGH가 수용체에 결합하게 되면 JAK2(Janus kinase 2, 야누스 카이 네이즈 2)가 인산화되는 특성 이 있으므로， 이를 이용하여
HA-hGH 접합체의 생물학적 활성도를 확인하였다.
IM-9 세포 (한국세포주은행)를 10%(v/v) FBS와 25 mM HEPES가 함유된
RPMI 1640(GIBCO)에서 배양하였다. 모든 세포는 표준 조직 배양접시 (standard tissue culture dish)에서 배양하였으며 배양접시 (culture dish)는
5% C02(g)와 상대 습도가 유지되는 37 °C 배양기 (incubator)에 보관하였다.
IM-9 세포에 hGH를 농도별로 처리하여 37 °C에서 24시간 배양한 뒤 인산화된 JAK2를 웨스턴 블롯 (Western blot)을 통하여 정 량하여 세포 신호전달이 가장 잘 일어나는 hGH의 농도를 확인하였고, 이와 같은 농도로 HA-hGH 컨쥬게이트 (NaI04와 3시간 반웅시 켜 약 10 몰%의 치환율을 가지는 HA-ald 유도체에 인간성장호르몬을 HA(lOOkDa) 1 분자 (chain)당 6 mole배로 넣어 반웅시 킨 접 합체 : 반웅율 95 몰% 이상)를 세포에 처 리하여 마찬가지로 신호전달이 일어나는지 확인하였다 (참고문헌: Laemmli, Nature , 227 , 680-685 (1970); 실험에 사용된 항체는 santacruz biotechnology co.에서 구매).
2) 분석결과
도 8A 내지 8C에서 볼 수 있는 바와 같이， 인간성장 호르몬을 500ng/ml의 농도로 처 리하였을 때 세포 신호전달이 가장 잘 일어남을 확인할 수 있었으며 (도 8의 A), 같은 농도의 hGH를 포함하는 HA-hGH 컨쥬게이트를 처 리하였을 때도 세포 신호전달이 일어나는 것을 확인할 수 있었다 (도 8의 B). 도 8C는 8A 및 8B의 웨스턴 블롯 결과로 나타난 밴드 강도 (band intensity)를 측정하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 따라서 , hGH가 HA에 접합된 후에도 생물학적 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 9. 인간 피부 세포 Detroit 551 세포에 hGH 및 HA-hGH 컨쥬게이트 처리에 따른 JAK2 의 인산화
1) 분석 방법
정상 인간 피부섬유아세포 (human skin normal fibroblast)인 Detroit 551 (ATCC)를 10% FBS와 25 mM HEPES가 포함된 DMEM(GIBCO)에서 배양하였다. 모든 세포는 표준 조직 배양접시에서 배양하였으며 배양접시는 5% C02(g)와 상대 습도가 유지되는 37 °C 배양기에 보관하였다. Detroit 551 세포에 hGH와 HA-hGH 컨쥬게이트 (NaI04와 3시간 반웅시켜 약 10 몰0 /0의 치환율을 가지는 HA-ald 유도체에 인간성장호르몬올 HA(100kDa) 1 분자 (chain)당 6 mole배로 넣어 반응시 킨 접합체 : 반응율 95 . 몰0 /0 이상)를 농도별로 처 리하여 세포 신호전달 (cell signaling)에 따른 JAK2의 인산화 정도를 실험 예 7과 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 통하여 확인하였다.
2) 분석결과
JAK2의 인산화는 상술한 바와 같이 hGH가 hGH 수용체에 결합할 때 일어나는 현상이다. 도 9A에 나타난 바와 같이 , Detroit 551 세포에 hGH를 처 리 했을 때 JAK2가 인산화되어 hGH 수용체에 의 한 신호전달이 일어나는 것을 확인할 수 있었으며， 도 9B에 나타난 바와 같이 HA-hGH 접합체를 처 리 했을 때 역시 JAK2가 인산화되어 HA 수용체에 의한 신호전달이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 도 9C, 9D는 농도에 따른 신호전달 물질의 농도를 도 9A와 9B에서 웨스턴 블롯 결과로 나타난 밴드 강도 (band intensity)를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
이처 럼 HA-hGH 컨쥬게이트는 인간 피부 세포의 HA 수용체 및 /또는 hGH 수용체에 결합하여 세포 신호전달 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
10. HA-hGH 컨쥬게이트 처리에 따른 인간 피부 세포주의 증식 측정 1) 분석방법
인간 신생아의 표피 각질세포 (human neonatal epidermal keratinocyte인 HEKn 세포 (Invitrogen)를 1% HKGS (human keratinocyte growth supplement) ]- 포함된 EpiLife 배지 (Invitrogen)에서 배양하였다. Detroit 551 (ATCC)는 10% FBS와 25 mM HEPES가 포함된 DMEM(GIBCO)에서 배양하였다. 모든 세포는 표준 조직 배양접시에서 배양하였으며 배양접시는 5% C02(g)와 상대 습도가 유지되는 rc 배양기 에 보관하였다. 96-웰 플레이트 (well plate)의 각 웰에 3*103 개의 세포 (A: HEKn B: Detroit 551)를 분주 (seeding)한 후, 24 시간 지난 후 각각 다른 농도의 히 알루론산과 hGH를 포함하는 HA-hGH 컨쥬게이트 (NaI04와 3시간 반웅시켜 약 10 몰0 /0의 치환율을 가지는 HA-ald 유도체에 인간성장호르몬을 HA(100kDa) 1 분자 (chain)당 6 mole배로 넣어 반응시 킨 접 합체 : 반응율 95 몰% 이상)를 처 리하였다. 다음으로 세포 증식 정도를 확인하기 위해 48 시간 이후에 WTS-l(TaKaRa)를 세포에 처 리하였다. 살아있는 세포에서 미토콘드리아 (mitochondria)의 탈수소효소 (dehydrogenase)에 의해 WTS-l(tetrazolium salt)가 포르마잔 (formazan)으로 변환됨으로써 배지 용액에 대한 흡광도의 변화가 일어나게 되므로, WST-1를 처 리 한 96 웰 플레이트를 37°C에서 1 시간 동안 둔 후, 450nm 파장에 대한 흡광도를 측정하였다. 2) 분석결과
도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, HA-hGH 컨쥬게이트의 농도 변화에 따라 세포 증식이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
HA* 10ug/ml의 고농도로 처리하였을 때， HEKn 세포의 경우 20%의 증식효과를 (도 10의 A), Detroit 551 세포의 경우 60%의 증식효과를 각각 보였으나 (도 10의 B), 이렇게 HA 농도가 높은 경우 접합된 hGH의 농도가 너무 높아져서 hGH의 신호전달을 방해할 수 있기 때문에, HA-hGH 켠쥬게이트의 경우 HA와 hGH의 효과를 적절히 보기 위한 저 농도 조건에서 실험을 진행하였다.
저 농도 조건에서 측정시, HA 수용체는 존재하지만 hGH 수용체는 존재하지 않는 HEKn 세포 (도 10의 C)의 경우 HA-hGH 접합체의 농도 증가에 따른 세포 증식 효과의 차이가 비교적 작게 나타났으나, 이와 달리 hGH 수용체와 HA 수용체가 모두 존재하는 것으로 확인된 Detroit 551 세포 (도 10의 D)의 경우 HA-hGH 컨쥬게이트의 농도가 증가할수록 세포 증식이 보다 잘 일어남을 확인할 수 있었으며, 특히 신호전달이 장 잘 일어나는 인간성장호르몬 농도인 500ng/ml 로 HA-hGH 컨쥬게이트를 처리하였을 때 가장 세포증식 효과가 우수함 (약 40% 증식)올 확인할 수 있었다. 11. 히알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트의 약리 (PK) 특성 분석
(In vivo)
1) 분석 방법
SD rat (암컷， 6주령, 200g)의 꼬리 정맥을 통해 PBS, hGH, HA-hGH 컨쥬게이트를 hGH 기준으로 lmg/ml 용액으로 준비하여 300ul 용량을 각각 투여한 후， 정해진 시간이 되었을 때 꼬리 정맥에서 혈액을 채취해 각 샘플의 혈중농도를 hGH ELISA kit(roche)를 사용해 제조사의 방법에 따라 측정하였다.
2) 분석 결과
도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, hGH 혈중농도는 24시간 이전에 기준선 (baseline)으로 떨어졌으나， HA-hGH 컨쥬게이트의 형태로 제공될 경우 혈중 농도가 높게. 유지 되 었으며 , 특히 알데하이드 치환율이 높은 20%의 알데하이드가 도입되 어 있는 HA-hGH 컨쥬게이트 (20/6)의 혈중농도는 3일째에도 기준선으로 떨어지지 않아， 본 발명의 일 실시 예에 따른 컨쥬게이트 형 태로 단백질 약물이 제공될 경우, 약물의 체내 반감기가 길어져 약효가 오래 갈 수 있음올 확인할 수 있었다.
12. 히 알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트의 경피 약물 전달 특성 분석
1) 분석 방법
털이 없는 (Hairless) Balb/c 마우스 (암컷, 6 주령 , 20g)와 PBS,
FITC(fluorescein isothio-cyanate), hGH-FITC, HA-FITC, HA-hGH-FITC 컨쥬게이트를 준비하였다.
FITC가 태깅된 hGH-FITC 및 HA-hGH-FITC 컨쥬게이트는 우선
FITC를 2mg/ml의 농도로 pH 9 인산염 버퍼에 녹인 후 FITC가 단백질 (hGH)의 5 몰 배가 되도톡 hGH 용액과 섞은 후 3시간 동안 반응을 시 켰다. 이후 PD10 컬럼올 이용하여 반웅하지 않은 FITC를 정 제하여 준비하였다.
아민기가 없는 Free HA의 경우 FITC와 반응하기 위해서 HA의 카복시 그룹에 핵사메틸렌디아민 (Hexamethylenediamine)을 EDC를 촉매로 이용하여 접 합하여 아민 그룹을 도입한 뒤 상기 HA-hGH와 같은 조건으로 FITC와 반웅시 켜 FITC가 태깅된 HA-FITC를 준비하였다. 준비된 샘플을 마우스의 등쪽 피부 1cm X lcm 면적에 FITC기준으로 hng/ml의 농도로 lOOul를 발라주었다. 1시간 이후에 피부 조직올 채취 하여 동결용 포매제인 OCT compound로 고정한 후 30um 두께로 동결절단 (cryosectioning)하여 공초점 현미 경 (confocal microscopy) 조직의 형광분석을 통해, 각 샘플의 경피 투과율을 확인하였다.
2) 분석 결과
도 12(A: control, B: FITC, C: hGH-FITC, D: HA-FITC, E: HA-hGH-FITC)에서 볼 수 있는 바와 같이 , HA와 결합하지 않은 FITC(B), hGH-FITC(C)의 경우 피부조직층을 통과하지 못하여 피부조직의 바깥부분에서 만 형 광이 관찰되지 만 HA와 결합을 형성 한 HA-FITC(D), HA-hGH-FITC(E)의 경우 피부조직 내부에도 고르게 형광이 분포되는 것으로 나타나 HA의 경피 전달 특성을 확인할 수 있었다. 또한 이 러 한 결과를 통하여 친수성 단백질인 인간성장 호르몬이 접 합된 HA의 유도체 (E)의 경우에도 HA와 마찬가지로 우수한 경피 전달 특성을 가지는 것을 확인하였다.
13. 히알루론산-오발부민 컨쥬게이트의 경피 약물 전달 특성 분석
1) 분석 방법
털이 없는 (Hairless) Balb/c 마우스 (암컷, 6 주령 , 20g)와 PBS, FITC (fluorescein isothio-cyanate), OVA-FITC, HA-FITC, HA-OVA-FITC 컨쥬게이트를 준비하였다.
FITC가 태깅 된 OVA-FITC 및 HA-OVA-FITC 컨쥬게이트는 우선 FITC를 2mg/ml의 농도로 pH 9 인산염 버퍼 에 녹인 후 FITC가 단백질 (OVA)의 10 몰 배가 되도록 OVA 용액과 섞은 후 3시간 동안 반응을 시 켰다. OVA 용액과 섞은 후 pH 9의 sodium carbonate 완층 용액에서 12시간 동안 반웅을 시켰다. 이후 과량의 물에 투석하여 반응하지 않은 FITC를 정제하여 준비하였다.
아민기가 없는 Free HA의 경우 FITC와 반웅하기 위해서 HA의 카복시 그룹에 핵사메틸렌디아민 (Hexamethylenediamine)을 EDC를 촉매로 이용하여 접합하여 아민 그룹을 도입한 뒤 상기 HA-OVA과 같은 조건으로 FITC와 반웅시켜 FITC가 태깅 된 HA-FITC를 준비하였다. 준비 된 샘플을 마우스의 등쪽 피부 1cm X lcm 면적에 FITC기준으로 lmg/ml의 농도로 50ul를 발라주었다. 1시간 이후에 피부 조직을 채취하여 동결용 포매제인 OCT compound로 고정 한 후 30um 두께로 동결절단 (cryosectioning)하여 공초점 현미 경 (confocal microscopy)의 형광분석을 통해, 피부조직 단면에서 물질의 경피투과율올 확인하였다. 2) 분석 결과 도 13 (A: PBS, B: FITC, C: OVA-FITC, D: HA-FITC, E: HA-OVA-FITC)에서 볼 수 있는 바와 같이， HA와 결합하지 않은 FITC(B), OVA-FITC(C)의 경우 피부조직층을 통과하지 못하여 피부조직의 바깥부분에서 만 형광이 관찰되지만 HA와 결합을 형성 한 HA-FITC(D), HA-OVA-FITC(E)의 경우 피부조직 내부에도 고르게 형광이 분포되는 것으로 나타나 HA의 경피 전달 특성을 확인할 수 있었다. 또한 이 러 한 결과를 통하여 친수성 단백질인 오발부민이 접합된 HA의 유도체 (E)의 경우에도 HA와 마찬가지로 우수한 경피 전달 특성을 가지는 것을 확인하였다. 14. 히 알루론산-인간성장호르몬 컨쥬게이트의 약리 (PK) 특성 분석
(In vivo)
1) 분석 방법
SD 랫트 (암컷, 6주령 , 200g)의 등 피부의 털을 깍은 후 3cm x 3cm의 면적에 PBS, hGH, HA-hGH 컨쥬게이트를 각각 hGH 농도 기준으로 1.5mg/ml을 용액을 300ul 바른 후, 정해진 시간이 되었을 때 꼬리 정맥에서 혈액을 채취해 각 샘플의 혈중농도를 hGH ELISA kit (roche)를 사용해 측정하였다. 또한 경피전달 효율을 피하 주사시와 비교하기 위해, HA-hGH 컨쥬게이트를 위와 같은 용량으로 피하 주사 형 태로 투입한 후, 동일한 방법으로 시간별 혈중 농도를 축정하였다.
2) 분석 결과
도 14에서 볼 수 있는 바와 같이 , HA와 결합되지 않은 hGH의 경우 피부조직층을 통과하지 못하여 혈중농도가 기준선 (baseline)으로 나타났지 만， 경피 전달된 HA-hGH 컨쥬게이트 (10/6)의 경우 혈중농도가 Cmax: 20ng/ml 정도인 것으로 나타나 혈액에서 hGH가 검출되 었음을 확인할 수 있었으며， 따라서 HA-hGH의 형 태로 경피 전달할 경우 hGH가 피부조직층을 통과하여 혈중으로 효과적으로 전달될 수 있음을 알 수 있었다.
또한 상기 경피 전달 제형은 피하주사 제형의 20% 이상에 해당하는 생물학적 가용능 (bioavailability)을 갖는 것으로 나타났으며， 이는 경피 전달시 피부조직층을 통과해야 하기 때문에 주사제형에 비해 효율이 낮을 수 밖에 없는 점을 감안할 때, 경피 전달제형으로서는 매우 우수한 효과를 갖는 것으로 볼 수 있다. 뿐만 아니 라， 환자의 편의성을 고려할 때 주기 적 인 주사를 맞는 것 보다, 피부에 바르는 것만으로 주사의 20% 이상의 효과를 볼 수 있다는 점은 환자의 편의가 크게 증진될 수 있다는 점에서 매우 효과적 이다. 특히 왜소증 등 장기간의 주기 적 인 치료를 받아야 하는 경우, 그 장점 이 더욱 부각될 수 있다.
15. 히알루론산-오발부민 컨쥬게이트의 경피 백신 특성 분석 (/i v/ )
1) 분석 방법
Balb/c 마우스 (수컷， 8 주령， 20g) 등 피부의 털을 깎은 후 1cm x 1cm의 면적에 PBS, OVA, HA-OVA 컨쥬게이트를 각각 OVA 농도 기준으로 10mg/ml 용액을 50ul 발랐다. 경피 전달 후 각각 2주와 4주 뒤 혈액 샘플을 채취하여 Anti-OVA IgG 항체 농도를 ELISA로 정량하였다.
구체적으로, 96 well plate의 각 well에 오발부민을 한 시간 동안 로딩하여 코팅 하고 세척 액 (Washing solution)을 이용하여 300ul/well로 3번 세척 해주었다 . Mouse anti-OVA 항체 표준 용액 (Sigma Aldrich)을 희석하여 0, 3， 6, 12.5, 25, 50, 100, 200ng/ml 사이의 기준용액을 만들고, 상기 각 샘플을 0 - 20ng/ml 범위에 들어가도록 PBS를 이용하여 희석하였다. 96 well에 각 기준용액과 샘플을 희석 한 용액을 50ul씩 로딩 (loading)한 뒤 상온에서 한 시간 동안 반웅시 켰다. 이후 세척 액 (Washing solution)을 이용하여 300ul/well로 3번 세척 해주고 goat anti-mouse IgG antibody-HRP 용액 (Millipore)을 100 ul/well로 로딩 한 뒤 상온에서 1시간 동안 반응시 켰다. 다시 3번을 세척하고 TMB 용액을 50 ul 넣고 빛을 차단한 상태로 20분간 반응시켰다. Stop solution (2N 황산 용액)을 50 ul 처 리하고 450nm에서 흡광올 측정하였다. 측정 된 흡광도의 값을 기준용액의 표준곡선에 대 입하여 혈중 anti-OVA IgG 항체 농도를 측정하였다.
2) 분석 결과
도 15에서 볼 수 있듯이 같은 용량， 같은 농도의 OVA과 HA-OVA을 경피 전달하였올 때 HA-OVA 컨쥬게이트 형 태로 경피 전달된 경우, OVA만을 경피 전달한 경우에 비해 2주 뒤에는 5배, 4주 뒤에는 15배 정도 높은 농도의 항체를 생성하게 함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 HA-OVA 컨쥬게이트가 OVA에 비해 표피꽈 진피에 효과적으로 전달되었기 때문으로 생각된다. 피부 조직 깊숙이 투과한 HA-OVA 컨쥬게이트는 피부 조직 내 면역 세포인 랑게르한스 세포 (Langerhans cell)와 수지상세포 (dendritic cell)를 자극하여 효과적으로 면역 반응을 일으킨다. 이러한 결과를 바탕으로 HA-OVA 컨쥬게이트를 비롯한 HA-백신 컨쥬게이트는 우수한 경피 전달 특성으로 인해 항체 생성률을 현저히 높일 수 있음을 확인할 수 있으며, 따라서 환자 편의성과 더불어 백신 효과를 현저히 향상시킬 수 있는 뛰어난 백신 전달체로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
하기 화학식 1의 히알루론산 -알데하이드 (HA-aldehyde)를 제조하는 제 1단계; 및
상기 히알루론산-알데하이드를 수용성 단백질의 N-말단과 반응시키는 제 2단계를 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 제조방법:
Figure imgf000034_0001
상기 화학식 1에서
m과 n의 합은 50 내지 10,000의 정수이고, n은 5 내지 5,000의 정수이다.
【청구항 2]
제 1항에 있어서, 상기 제 1단계는
히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체를 산화제와 암 (dark) 조건하에 반웅시켜 샐를로오스의 고리 (ring) 구조를 여는 단계를 포함하여 이루어지는 것인, 제조방법.
【청구항 3】
제 2항에 있어서，
상기 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 분자량이 10,000내지 3,000,000 달톤 (Da)인 제조 방법.
【청구항 4】
제 2항에 있어서,
상기 산화제는 소듐 퍼리오데이트 (Sodium periodate)인， 제조방법.
【청구항 5】
제 2항에 있어서,
상기 산화제는 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 히알루론산의 염， 또는 히알루론산 유도체의 단위체당 1 내지 10 몰 (mole) 배로 첨가하여 2 내지 24 시간 동안 반응시키는 것인， 제조방법.
【청구항 6】
제 1항에 있어서,
상기 히알루론산-알데하이드는 10 내지 50몰%의 알델하이드기 치환율올 갖는 것인, 제조방법.
【청구항 7]
제 1항에 있어서,
상기 제 2단계는 pH 5 내지 7의 완충용액 내에서 이루어지는 것인， 제조방법.
【청구항 8】
제 1항에 있어서,
상기 완층용액은 pH5 내지 6.5의 소듐 아세테이트 버퍼인, 제조방법.
【청구항 9】 - 제 1항에 있어서， 상기 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는
상기 히알루론산 -알데하이드 한 분자에 1 내지 10개 분자수의 단백질이 결합된 것인， 제조방법.
【청구항 10】
제 1항에 있어서, 상기 제 2단계 이후에，
상기 단백질과 반응하지 않고 남아있는 알데하이드기를 아민류를 이용하여 블로킹하는 제 3단계를 더욱 포함하는, 제조방법.
【청구항 11】
제 10항에 있어서,
상기 · 아민류는 탄소수 1 내지 5인 직쇄 또는 분지쇄 알킬 카바자이트 (alkyl carbazate), 또는 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민인， 제조방법.
【청구항 12】
제 11항에 있어서，
상기 알킬 카바자이트는 에틸 카바자이트 또는 터트 부틸 카바자이트이고, 상기 알칸올아민은 아미노메탄올 (aminomethanol), 아미노에 .탄을 (aminomethanol), 아미노프로판올 (aminopropanol), 아미노부탄올 (aminobutanol), 또는 아미노펜탄을 (aminopentanol)인, 제조방법.
【청구항 13]
제 10항에 있어서,
상기 아민류는 알킬 카바자이트이고， 알데하이드 기의 몰 유닛에 대해 5 내지 10 몰 배로 첨가하여 12 내지 24 시간 동안 반웅시키는 것인, 제조방법.
【청구항 14】
제 10항에 있어서,
상기 아민류는 알칸올아민이고, 알데하이드 기의 몰 유닛에 대해 5 내지 10 몰 배로 첨가하여 12 내지 24 시간 동안 반웅시키는 것인, 제조방법.
【청구항 15]
겨 U항에 있어서,
상기 수용성 단백질은 인간성장호르본, 인터페론알파, 에리스로포에틴 (erythropoietin), 트레일 (Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), 오발부민 또는 인슐린인, 제조방법 .
【청구항 16】
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조되는 하기 화학식 2의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트. ᅳ
Figure imgf000036_0001
상기 화학식 2에서
P 는 수용성 단백질을 나타내고,
m, n, 및 1의 총 합은 50 내지 10,000의 정수이고， n과 1의 합은 5 내지 5,000의 정수이고, 1은 1 내지 100의 정수이다.
【청구항 17】
제 16항의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 포함하는 경피 전달용 약학 조성물.
【청구항 18】 제 16항의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 포함하는 화장료 조성물.
【청구항 19]
제 16항의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 포함하는 경피 전달용 백신 조성물.
【청구항 20】
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 하기 화학식 2의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 치료학적 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 전달방법:
Figure imgf000037_0001
상기 화학식 2에서
P 는 수용성 단백질을 나타내고，
m, n, 및 1의 총 합은 50 내지 10,000의 정수이고, n과 1의 합은 5 내지
5,000의 정수이고， 1은 1 내지 100의 정수이다.
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