CN106103493A - 硫酸软骨素纯化方法 - Google Patents

硫酸软骨素纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106103493A
CN106103493A CN201580014744.1A CN201580014744A CN106103493A CN 106103493 A CN106103493 A CN 106103493A CN 201580014744 A CN201580014744 A CN 201580014744A CN 106103493 A CN106103493 A CN 106103493A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phase
sample
organic solvent
ethanol
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580014744.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106103493B (zh
Inventor
M·德罗萨
C·斯基拉尔迪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Altergon SA
Original Assignee
Altergon SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Altergon SA filed Critical Altergon SA
Publication of CN106103493A publication Critical patent/CN106103493A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106103493B publication Critical patent/CN106103493B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0066—Isolation or extraction of proteoglycans from organs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及纯化从动物软骨中获得的硫酸软骨素的下游工业方法，所述方法生产了完全符合在药物领域中使用该化合物所需的规范的产品。

Description

硫酸软骨素纯化方法
本发明涉及用于纯化从动物软骨中获得的硫酸软骨素(CS)的工业方法，所述方法提供了完全符合在药物领域中使用该化合物所需的规范的产品。具体而言，所开发的方法通过现代分析技术证明其能够消除角质素，角质素是一种糖胺聚糖，存在于从不同类型的动物来源通过各种提取方法获得的所有CS制备物中。
定义
糖胺聚糖类(GAG)是指多糖的复杂家族，其是细胞外基质的基本组分。
术语[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→]是指由D-葡糖醛酸(D-GlcA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(D-GalNAc)通过β-糖苷键(1-3)连接形成的二糖。
术语[4)-α-L-IduA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→]是指由L-艾杜糖醛酸(L-IduA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(D-GalNAc)通过β-糖苷键(1-3)连接形成的二糖。
术语硫酸软骨素(CS)是指具有不同分子量的不同硫酸酯化的糖胺聚糖类，其存在于各种动物组织中。CS的糖骨架是由重复地通过β-糖苷键(1→4)连接的二糖单元[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→]构成。缩写CS是指所述多糖的酸形式和成盐形式。
缩写CS-A型是指特征为普遍是CS-A类型二糖单元[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc4SO3 --(1→]的CS。
术语硫酸软骨素/硫酸皮肤素缩写为CS/DS，也称为CS-B型，但不要与二糖结构变体CS-B混淆，是指具有不同分子量的不同硫酸酯化的糖胺聚糖类，存在于各种动物组织中，其中糖骨架是由通过β-(1→4)糖苷键连接的不同数量的二糖单元4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→]和[4)-α-L-IduA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→]构成。缩写CS或CS-B型是指所述多糖的酸形式和成盐形式。
缩写CS-C型是指特征为普遍是CS-C类型的二糖单元[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc6SO3 --(1→]的CS。
术语硫酸角质素(KS)是指具有不同分子量的不同硫酸酯化的糖胺聚糖类，存在于各种动物和鱼的组织中。KS的糖骨架是由二糖单元[3)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→]构成。缩写KS是指所述多糖的酸形式和成盐形式。
缩写CS/KS是指目前市场中被KS污染的CS产品。
现有技术
硫酸软骨素(CS)是由通过β-糖苷键(1→4)连接的重复的二糖单元[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→]构成的糖胺聚糖。当某些在多糖链上的-β-D-GlcA单元被-α-L-IduA-替代时，使用术语CS-B型(不要与结构变体二糖CS-B混淆)，也称为硫酸皮肤素(缩写为CS/DS)。
根据硫酸化位点，有多种类型的软骨素/皮肤素的结构二糖。
在体内，不同类型的CS在聚合期间被特异性的磺基转移酶进行硫酸酯化，随后共价连接到特定的蛋白质上，作为蛋白聚糖类被分泌到细胞外基质中。它们是多种结缔组织例如软骨、皮肤、血管和骨骼中普遍存在的成分(Abu,K.&Seno,N.,The Basis ofCarbohydrate Chemistry,1993,142–177,Japan:Kodansha)。
CS在活的生物体中广泛存在，其中它在多种生物学过程中起到重要作用。具体而言，CS作为生长因子、细胞因子、炎症趋化因子、粘附分子和脂蛋白的调节物，通过特定的糖结构域与所述蛋白质的配体发生相互作用而发挥作用(Malavaki C.等人,Connect TissueRes 2008,49,133–139)。
表1显示了由不同生物体纯化的CS的主要类型的结构参数。具体而言，对于来自动物来源的CS(牛、猪、鸡)，所述分子量参数相当类似，但是与海洋来源的CS(鲨鱼、鳐鱼(Skate)、鱿鱼)相当不同，后者具有比前者更高的分子量。海洋来源的CS样品还具有高于1的电荷密度，这是因为存在二硫酸化的二糖，而动物来源的CS样品(牛、猪、鸡)具有小于1的电荷密度。
牛 猪 鸡 鳐鱼 鱿鱼 鲨鱼
Mn(KDa) 12-17 9-14 8-13 27-34 60-80 25-40
Mw(KDa) 20-26 14-20 16-21 50-70 80-120 50-70
多分散性 1.8-2.2 1.4-1.8 1.6-2.0 1.2-2.5 0.8-1.3 1.0-2.0
CS-O 6 6 8 3 13 3
CS-C 33 14 20 39 15 44
CS-A 61 80 72 43 50 32
CS-D ND ND ND 13 0 18
CS-E ND ND ND 1 22 2
CS-B ND ND ND 1 0 1
电荷密度 0.90-0.96 0.92-0.96 0.90-0.94 1.08-1.20 1.00-1.20 1.15-1.25
表1–来自不同生物体的纯化的CS的主要类型的结构数据
考虑到所述多种功能，CS已被用于药物、营养品和药用化妆品的产品中(Koga,T.,New Food Industry,1989,31,4–7；Park,D.C.&Kim,S.B.,Fisheries Research,1998,12,30–39；Cho,S.M.等人,Food Hydrocolloids,2004,18,573–579；Cho,S.Y.等人,Biological&Pharmaceutical Bulletin,2004,27,47–51；Takuo,N.等人,Recent Patentson Food,Nutrition&Agriculture,2010,2,61–74)。
CS目前是多种抗关节炎药物的活性成分。CS对于决定软骨的生物机械性能起到显著贡献，因为其润滑关节并且提供对压缩应力的机械抗力。
最近描述了CS的多种潜在的药物应用，部分地取决于硫酸化的类型(Hiraoka等人，Glycobiology 2001,11(6),495–504；Malavaki C.等人,Connect Tissue Res 2008,49,133–139；Lauder R.M.,Complement Ther Med 2009,17:56–62.)。
最近的研究已经证明，CS在肿瘤进展和转移灶形成中起到重要作用。具体而言，在肿瘤细胞中，已发现CS分子的链长和硫酸化位点的改变(Smetsers等人，J InvestDermatol 2004,122(3):701–716)。这使得CS可用作卵巢肿瘤的早期诊断的生物标志物(Pothacharoen等人，J Cell Sci 2006,113,193–205)。
表2–CS的潜在的医疗和药物应用(Schiraldi,C.等人,Applied Microbiologyand Biotechnology,2010,87,1209–1220)。
这些特性已经使CS多年来成为重要的药理学手段，对其生产的兴趣增加，而其生产目前是基于包括从不同动物组织中提取的技术。具体而言，CS是从鲨鱼软骨、牛气管和一些猪屠宰的副产品中提取。由于纯化所要求的高等级，该方法是非常复杂和昂贵的，包括使用酶、抗生素以及大体积的有机溶剂。所述加工也受困于许多与不愉快的加工气味以及高污染的废水产生有关的操作困难；而且，在提取方法中使用动物组织作为原材料可能导致在物种间传播病毒和朊病毒感染(Schiraldi等人，2010)。
从动物来源的软骨材料制备CS已经在科技文献和专利文献中详细描述。所有方法经常包括以下步骤：软骨匀浆；蛋白聚糖基质的化学降解(碱水解)和/或酶降解(由Novozyme制备的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和中性蛋白酶)，以便将蛋白质组分与碳水化合物组分分离；过滤除去不溶性残余物；使用溶剂(常用乙醇)的多个沉淀过程，以纯化/回收目的多糖；使用离子交换树脂的色谱分离；使用活性炭脱色；干燥并将干燥产物研磨；包装。
CS作为药物和营养品的用途已经与原材料特定的纯度标准有关，该标准以相当类似的方式由各国的管理部门来定义。目前，根据美国和欧洲药典，测定CS含量的标准实验是光度滴定法，采用十六烷基三甲基溴化铵作为滴定剂进行测定。该滴定方法在0.5-0.75mg的CS标准品(Sigma)之间具有线性，但是它已经被证明在其他GAG或核酸存在的情况下，出现具有估计过高的终点的滴定曲线(http://siga.ufjf.br/Reeport Laboratório de Análise de Glicoconjugados–UFJF)。这些结果表明，该滴定方法具有低特异性，因为在其他阴离子化合物存在时其可能高估CS的定量。在美国和欧洲药典中描述的其他方法包括红外光谱法、测定特定的旋光率以及醋酸纤维素上的电泳，所有这些方法，正如下文所述，目前都在测定基于GAG的制剂中表现出它们的较多局限性。
在过去的几年里，GAG的重要科学价值和其潜在的应用、表征这些多糖的新的和更复杂的方法、以及用于分离各种类型的GAG的新策略的开发(Pomin,V.H.等人，Carbohydrate Polymers,2012,90,839–846)，已经证明了最初由监管当局使用的限定用于药物和营养制品的CS商业制剂的纯度水平的分析方法是不足的，而且甚至美国和欧洲药典所建议的参考标准品都不是纯的，它被硫酸角质素(KS)所显著污染，硫酸角质素是多种不同分子量的硫酸酯化的糖胺聚糖类的混合物，其结构是基于由β-糖苷键(1→3)连接的二糖单元[3)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→]。
Pomin等人(Carbohydrate Polymers,2012,90,839–846)分析了用于口服施用的17个商业批次的CS，其中3个来自牛软骨，另外14个来自鱼软骨，标准品是美国和欧洲药典所示的参考产品。这些作者所采用的分析方法是琼脂糖凝胶电泳；在强阴离子交换树脂(SAX)和尺寸排阻树脂(SEC)上的HPLC；用特定的GAG-裂解酶的可消化性；估计的糖醛酸水平；1D和2D NMR。具体而言，作者(表3)发现，平均而言，KS占从鲨鱼软骨获得的制剂中发现的总GAG的约16％，在同样来自鲨鱼软骨的欧洲药典标准品中获得了类似结果。
如表3所示，大量的KS存在于海洋来源的CS中，这导致与所标称的量相比CS含量明显降低，意味着该产品不符合尤其是作为药物的用途，药物用途需要高水平纯度(Volpi,N.,J.Pharm.Sci.,2007,96,3168–3180)。
Pomin等人证实，他们所开发的类似于美国和欧盟药典推荐的醋酸纤维素电泳的琼脂糖凝胶电泳无法证明KS污染，因为这种GAG与CS共迁移。此外，SEC-HPLC无法证明KS在CS制剂中存在，而SAX-HPLC证明是用于识别KS污染的最适当的方法，因为CS和KS具有足够不同的洗脱时间，但是二者并未不同到能够防止峰的部分重叠，这能够导致对污染的错误定量评价。用于识别在CS制剂中存在KS的最充分的、但非定量的方法是1D 1H-NMR，因为在KS的4.68和4.37-4.30ppm特征峰处显示良好分辨的分离基团的信号(Limtiaco,J.等人，2012,Analytical Methods,4,1168–1172；Pomin,V.H.等人,2010,Analytical Chemistry,82,4078–4088；Rudd,T.R.等人,2011,The Analyst,136,1390–1398,Zhang,T.等人,2009,J.Pharmaceutical Science,98,4017–4026)。
表3–在从鲨鱼和牛软骨获得的CS口服制剂以及欧洲和美国药典标准品的批次中CS和KS的比例。所述的比例是从HPLC-SAX曲线的积分获得的(Pomin,V.H.等人，Carbohydrate Polymers,2012,90,839–846)。
在所发现的KS污染数据基础上，Pomin等人指出，需要对美国和欧洲药典所规定的方法进行复查，以提供在CS商业制剂中存在的生物活性成分的量的更准确定义。
开发能够鉴定KS污染的新分析方法显然需要对CS制备方法的实质性考察，以便将KS污染水平降低到CS作为药物和营养品使用时所能容忍的限度内。
Galeotti F.等人(Analytical Biochem,2013,YABIO 1157926.12.13)定义了从来自鲨鱼软骨的CS/KS的商业制剂选择性沉淀CS和KS的条件，其将用乙酸钠饱和的乙醇逐步加入含有33mg/mL CS/KS的溶液中。用1体积的乙醇完成软骨素的单独沉淀。在该研究中，作者声称用甲醇、丙醇或丙酮的沉淀不能使KS选择性地除去。之前，在描述用乙醇在2％NaCl存在下沉淀110mg/mL的糖胺聚糖类混合物时，同一研究组(Volpi N.,JChromatography B,1996,685,27-34)指出，CS的完全沉淀只有在1.2-1.6体积时才能获得。
所有目前工业生产CS的方法都是基于不足以证明KS污染的产品纯度标准。在短期内，只要监管机构(它们已经意识到这些问题)调整标准品和鉴定方法以考虑新的分析机会，这就会使目前市场上所有CS产品都不适合于药物应用，并且对用于制备营养品和药用化妆品而言明显效价偏低。
因此，尽管迄今开发了很大数量的提取/纯化方法，但目前仍在进行工业研究以得到生产CS、尤其是药品级CS的新方法，其符合监管机构正在调整的CS规范的新纯度标准，尤其是有关KS污染方面，它仍旧包含在当前药典的分析方法中。
在此背景下，开发适用于目前被KS污染的各种CS产品(CS/KS)的简单的纯化方法代表了重要且适时的工业目标。
发明描述
更合适的研究方法学的开发证明，当前市场中CS制剂的KS污染问题的程度甚至比Pomin等人(Carbohydrate Polymers,2012,90,839–846)报道的更为严重和更广泛，不仅影响从海洋来源的原材料获得的CS产品，而且影响了从其他动物来源(牛、猪、家禽等)获得的产品，虽然影响程度略小。
已经发现了一种方法，其以有限的成本并且利用现有的机器设备类型，从市场上目前的CS/KS制品开始，使KS通过在工业水平的最终处理或者现有开发方法的针对性修改而除去，从而将CS的产品规范恢复到监管机构将在近期内在国际水平所要求的值，尤其是对于药品级的CS。
所述方法与使用溶剂的分步沉淀的现有工艺相比属于完全不同的类型，其特征是相当可观的操作通用性，而且设计简单，没有对于工业规模化而言显著的困难。该方法的特征在于以下步骤：1)制备在水中的CS/KS溶液，并测定其电导率；2)加入盐，直到电导率达到该方法的目标临界值；如果开始时单独存在的CS/KS已经保证了该数值，则不加入盐；3)向该水溶液中逐步加入计算量的有机相，其由一种或多种彼此混溶且与步骤1所述的水量混溶的溶剂组成；当完成加入有机溶剂时，最初的单相系统变为两相，CS浓缩在密相(densephase)中，而KS浓缩在轻相(light phase)中；4)使用2-3体积的乙醇，通过将CS从密相中沉淀和将KS从密度略小的相中沉淀而进行回收。
用于鉴定在工业水平上最佳纯化条件的系统化处理方法包括：对于某一类型的CS/KS(“相同类型”是指CS被KS污染的水平之间的差异必须落在不超过2-3％的区间内)和对于给定的有机溶剂而言，所述水溶液(其包含CS/KS和任何加入的盐)的电导率或浓度的图形构建显示为诱导形成用于该纯化方法的两液相系统所需的有机相的量的函数。当CS/KS的类型和所选择的有机溶剂的性质已经确立时，有可能从针对该类型有机溶剂所构建的图形来确定导致构成纯化方法基础的两个液体相形成的数值对(水溶液电导率与有机溶剂的量)。低于所述参数的值(较低的电导率数值或更少量的溶剂)会导致低回收率或不发生相分离，而较高的电导率数值或更大量的溶剂会将CS和KS二者都转移到密相中，导致该纯化方法失去效力。
当确定了进行该纯化方法所期望的CS/KS浓度时，可确定所加入盐(如果存在的话)的量，该量能够使电导率达到诱导两液相形成的临界值。
当已选择了所用有机溶剂的类型，并且通过根据构成该纯化方法基础的两个液体相分离所需的有机相的量而构建含有CS/KS的水溶液的电导率图形，从而在实验中确定了操作条件时，该方法能够根据工业上的便利性以不同方式实施。
方法A)–当所用有机溶剂的类型和量已经确定时，该水溶液应当具有的电导率数值可以通过所述图形发现。如果在溶液中仅有CS/KS的情况下就能达到该数值，则将有机溶剂在搅拌下加入水相。最初通常是单相系统，只有在加入全部有机溶剂后才观察到两液相形成，这决定了将CS分配到密相，而KS到轻相。如果在溶液中仅有CS/KS的情况下达不到水相的临界电导率数值，则加入盐，直到达到所需电导率，随后如上文所述加入有机溶剂。
方法B)–当包含CS/KS和任何加入的盐的水溶液的电导率数值已经确立时，可通过所述图形发现所用的溶剂量，并且如方法A)所述将溶剂加入水溶液。
可用于本发明的CS/KS纯化方法的有机溶剂的实例有甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丙酮、乙腈以及其混合物。
本发明的方法不仅提供了符合监管机构即将执行的最严格规范的CS，而且提供了大量的KS，KS到目前为止还是市场上无法获得的产品，但已经假定了其重要用途，尤其是在眼科领域中(US 5,141,928；US 6,159,954)，而且作为具有免疫原活性的化合物，其目前已经在体外得到证实(Meller等人，Clin Chim Acta 1995,236,195-204；Nakano T.,Carbohydr Polym,2014,99,547-552)。
所述的分离方法产生了接近于理论值的回收率以及>98％的纯度。
所述CS/KS纯化方法优选在中性pH下进行，其在产率和纯度方面都得到最佳结果。
所述两相系统在搅拌下维持两种KS溶质最佳地重新分配到轻相、而CS分配到密相中的时间并不重要。如果所述时间是仅1.5小时或者18小时，它们的产率和纯度水平的变化很小。
类似地，进行所述方法的温度也不是很重要；其能够在较宽的温度范围内(例如4-25℃)进行，而对产率或纯度没有实质性影响。
所述纯化方法可用于通过不同方法以及采用不同来源的软骨而获得的CS/KS。
通过在特别高的CS/KS浓度下操作，通过将密相稀释到原始处理的样品浓度后进行后续的相同纯化循环，可获得更好的纯化。
现在已经令人惊讶地发现，所述CS/KS纯化方法除了将CS与KS分离之外，还显著降低了致热原的含量。
采用所述方法首次制备了纯的CS和KS标准品，其是监管机构准备发布的新的产品规范应用的必要条件。
以下实施例更详细地描述了本发明。
实施例1-CS/KS、CS和KS样品的FPLC分析
该分析型制备色谱方法使CS/KS样品在百分之几毫克规模上被分离，获得目前市场上得不到的纯度超过99％的样品，并且可用作监管机构最近可能确立的所有验证方法的参照标准品。所制备的标准品用于下文所述的鉴定CS和KS纯度所用分析方法的所有校准。
该方法使用了用强阴离子交换剂官能化的HiLoad Q琼脂糖26/10 HP GEHealthcare柱，该柱装在配有紫外/可见光检测器的Akta Explorer 100 Amersham色谱(GEHealthcare)上。使用两种缓冲液的线性梯度作为洗脱剂系统：缓冲液A–20mM乙酸钠,pH7.4,0.5M NaCl；缓冲液B-20mM乙酸钠,pH 7.4,3.0M NaCl。CS和KS的最佳分离条件是：线性梯度0-100％的B在A中的溶液，在106分钟内；流速2mL/min；紫外检测215nm。将溶解在5mL缓冲液A中的300mg样品进行分析。在所述分析条件下，未截留的分析物的洗脱时间是50分钟，CS的洗脱时间193min，KS的洗脱时间是268min。
使用海洋来源的CS/KS样品，得到了具有>99％纯度水平的CS和KS标准品，回收对应于CS和KS的两个峰的洗脱物，其通过3KDa截留值的膜进行超滤，以除去盐和冻干物。由此获得的样品按照下面实施例2-4所述进行鉴定。
实施例2-CS和KS通过SEC-TDA进行鉴定
根据商品化的CS/KS产品以及如实施例1所述获得的CS和KS标准品的分子量、分子量分布、多分散性和固有粘度，使用尺寸排阻色谱(Viscotek,LabService Analytica,意大利)进行鉴定，该色谱包括两个模块和专用管理软件：
模块GPCmax VE 2001是集成系统，其由用于凝胶过滤色谱(GPC)的特定的泵(能够确保溶剂的恒定且搏动性流动的等度泵)、在线溶剂脱气装置和自动进样器组成；
模块TDA302(三元检测器阵列)是集成系统，其由维持柱温的恒温器和三检测器形成，所述三检测器由折光率(RI)检测器、具有4个毛细管桥的粘度计(VS)检测器和光散射(LS)检测器组成，所述光散射检测器由两部分组成，即直角光散射(RALS)检测器和新的低角光散射(LALS)检测器，所述直角光散射检测器的特征在于极佳的信噪比；
OmniSECTM是管理GPCmax和TDA的软件(Windows环境)，其能使聚合物溶液根据聚合物的浓度、平均绝对分子量、多分散性指数、分子大小(水动力学半径和旋光半径)和固有粘度进行鉴定。对于CS，其dn/dc值(对于分析物浓度变异的通过折光率检测器测定的信号强度的无穷小变异)为0.1466mL/g，对于KS，该值为0.1000mL/g(Swann D.A.等人，JBiological Chemistry,1984,259,12,7693-7700)。
色谱柱：Viscotek色谱系统装配了TSK-胶GMPWXL前置柱(Tosoh Bioscience,目录号08033,6.0x 4.0cm,平均粒度12μm)和两个串联放置的TSK-胶GMPWXL柱(TosohBioscience,意大利，目录号8-08025,基于羟基化的聚甲基丙烯酸酯材料，孔径平均粒度13μm,7.8x 30.0cm)。
粘度计柱：TOSOH08033前置柱和TOSOH08025柱，二者由Viscotek-LabServiceAnalytica S.r.l.,Via Emilia,51/c,40011,Anzola Emilia(BO,意大利)销售。
这些是用于CE和KS样品的分析鉴定的色谱条件：流动相0.1M NaNO3；温度40℃，流速0.6mL/min；运行时间50min。
实施例3-CS/KS、CS和KS通过酸水解以及HPLC-Dionex单糖分析的鉴定
为了评价商品化的CS/KS产品的组成以及如实施例1所述获得的CS和KS的纯度水平，根据样品的酸水解和构成单个糖胺聚糖链的二糖单元的单糖的色谱分析设计了分析方法：对于CS，采用乙酰半乳糖胺(GalNAc)和葡糖醛酸(GlcA)，对于KS，采用葡糖胺(GlcN)和半乳糖(Gal)。
使用所述糖的标准品的预实验证明，在水解过程中，所述两个氨基糖被部分地脱乙酰化，各自产生两个不同的峰，而GlcA和Gal分别产生一个峰和三个峰。
该分析方法就整体而言允许样品以95-100％的效率被水解，获得分别构成CS和KS链的二糖单元的两个单糖浓度的等摩尔测定。根据所述组分糖的摩尔浓度，考虑到根据动物组织来源的二糖的不同平均分子量值以及各分子的硫酸化和结合钠的程度影响，减去水分含量，可以确定样品中存在的CS和KS的重量百分比。
酸水解-CS/KS、CS和KS样品经历酸水解。在标准方法中，将50mg样品溶解在用MQ水制备的0.5mL的1M HCl中。在100℃、于搅拌下进行水解18小时；接着将样品用5M NaOH中和，通过阴离子交换色谱分析。
经离子交换色谱进行单糖HPLC分析-采用脉冲电流计(HPAEC-PAD)检测，将水解产物通过阴离子交换色谱分析，使用具有自动进样器和双泵的离子色谱(ICS 3000,Dionex,Italy)，装配有Carbopac PA1柱(4x 287.5mM,Dionex,Italy)和前置柱。色谱分离持续41min(0-12min从1到4mM NaOH，12-14min 4mM NaOH，14-16min 4-100mM NaOH，16-30min100mM NaOH，30-39min 100-1mM NaOH，39-41min 1mM NaOH)。
CS和KS的校准使用FPLC的纯化标准品进行，其包含≤2％的KS对CS的残余污染以及CS对KS的残余污染，其如上文所述进行水解。
在KS的情况下，将GlcN和Gal及其衍生物的峰面积之和作为水解的KS标准品的已知量的函数进行绘图，从而获得所述校准的截距，而在CS的情况下，将GalNAc和GlcA及其衍生物的峰面积之和作为CS标准品的已知量的函数进行绘图，从而获得所述校准的截距。
样品中的KS浓度(g/L)是通过以下方法确定：将GlcN和Gal及其衍生物的代表性峰的面积相加，并与水解的KS标准品的校准截距相比而计算浓度；而样品中的CS浓度(g/L)是通过以下方法确定：将GalNAc和GlcA及其衍生物的代表性峰的面积相加，并与水解的CS标准品的校准截距相比而计算浓度。最后，通过计算所得浓度与总计的百分浓度的比率而发现KS和CS的百分率。
实施例4-通过GAG的甲醇解、甲基糖苷类的乙酰化作用以及所得的乙酰化甲基糖 苷类的GC-MS分析来鉴定CS/KS、CS和KS
为了评价商品化的CS/KS产品的组成以及如实施例1所述获得的CS和KS的纯度水平，设计了分析方法，其包括：用HCl将GAG进行甲醇解，所得甲基糖苷进行乙酰化，以及它们的GC-MS分析。在标准方法中，将10mg样品进行甲醇解(1mL MeOH/HCl 1.25M,80℃,20h)，将所得甲基糖苷用乙酸酐(50μL)和吡啶(50μL)在100℃进行乙酰化30分钟。乙酰化的甲基糖苷样品通过GC-MS(Agilent Technologies,GC 6850°,MS 5973N)在毛细管柱(Zebron ZB-5,Phenomenex,30m x 0.25mm i.d.)上进行分析，使用流速1mL/min的氦气(载气)，采用以下温度程序：150℃持续3min，以3℃/min实现150℃→240℃。MS检测条件是：电子撞击离子化源70eV，四级杆分析仪，捕获范围40-450Da。
甲醇解决定了：通过裂解糖苷键而彻底解聚，产生相应的甲基糖苷(在GlcA的情况下，形成了α和β甲基糖苷二者)；GalNAc和GlcNAc的脱乙酰化；除去全部硫酸酯基团。
反应混合物用GC-MS分析。通过与已知标准品比较保留时间和碎片情况来确认糖类。
样品中的CS、KS和DS的百分摩尔组成根据对应于单个甲基糖苷的峰下面积的比例进行计算，所述面积按照甲基糖苷的标准样品的分析响应进行标准化。因此，在正确的分析中，Gal和GlcN甲基糖苷的摩尔浓度相等，并对应于KS的摩尔浓度，GlcA甲基糖苷α和β的摩尔浓度之和对应于CS的摩尔浓度，IduA甲基糖苷的摩尔浓度对应于DS的摩尔浓度，GalN甲基糖苷的摩尔浓度对应于CS+DS的浓度之和。
实施例5–图形构建，其中CS/KS水溶液的电导率显示为获得纯化CS/KS所需的2-丙醇体积的函数。
使用海洋来源的CS/KS样品，其特征是CS含量为78％，且KS含量为22％；制备以下的浓度范围为50-250g/L的溶液(1L)，测定它们的电导率值。将2-丙醇加入各溶液，直到它们分离为两个液体相，得到密相的干残余物百分比，其优选落入形成该纯化方法对象的CS/KS混合物中CS百分比的±8范围内(对于所分析的样品，密相的干残余物是70-86％)。对于CS/KS样品以及密相的干残余物二者，残留的水分含量视为相同，估计为12-15重量％。
构建两个图形，分别显示CS/KS电导率值或浓度值，它们是获得具有密相所述特征的相分离所需的2-丙醇体积的函数。对于作为CS/KS浓度函数的2-丙醇体积的图，发现的所有点都在方程截距y＝-0.0053x+1.7227(R2＝0.9491)上校整，对于作为溶液电导率函数的2-丙醇体积的图，发现的所有点都在方程截距y＝-2x+0.0593(R2＝0.9743)上校整。
在工业水平上对此类CS/KS的操作条件的设计中，一旦限定了受CS/KS或CS/KS浓度影响的电导率数值，实现两个液相分离所需加入的2-丙醇体积就可由此自动定义，所述液相分离导致CS纯度>95％。同样，一旦确定了所用的2-丙醇体积，就能够明确地确定CS/KS溶液必须具备的电导率或浓度。在过程中，如果待处理的溶液具有低于达到预期电导率值所必需的CS/KS浓度，则通过加入NaCl或其他盐来达到该值。表4显示了实验数据。所获得的CS和KS样品如实施例1、3、4中所述那样进行分析。
表4–使用2-丙醇作为有机溶剂对海洋来源的CS/KS(CS 78.4％；KS 21.6％)的纯化。
实施例6-图形构建，其中CS/KS水溶液的电导率显示为获得纯化CS/KS所需的乙醇 体积的函数。
使用海洋来源的CS/KS样品，其特征是CS含量为78％，且KS含量为22％；制备浓度范围为120-250g/L的溶液(1L)，测定它们的电导率值。将乙醇加入各溶液，直到它们分离为两个液体相，得到形成该纯化方法对象的CS/KS混合物中密相干残余物±8％的CS％的百分比(对于所分析的样品，密相的干残余物是70-86％)。对于CS/KS样品以及密相的干残余物二者，残留的水分含量视为相同，估计为12-15重量％。
构建两个图形，分别显示CS/KS电导率值或浓度值，它们是获得具有密相所述特征的相分离所需的乙醇体积的函数。对于作为CS/KS浓度函数的乙醇体积的图，发现的所有点都在方程截距y＝-0.0049x+2.344(R2＝0.9661)上校整，对于作为溶液电导率函数的乙醇体积的图，发现的所有点都在方程截距y＝-0.0658x+3.0284(R2＝0.9885)上校整。
在工业水平上对此类CS/KS的操作条件的设计中，一旦限定了受CS/KS或CS/KS浓度影响的电导率数值，实现两个液相分离所需加入的乙醇体积就可由此自动定义，所述液相分离导致CS纯度>95％。同样，一旦确定了所用的乙醇体积，就能够明确地确定CS/KS溶液必须具备的电导率或浓度。在过程中，如果待处理的溶液具有低于达到预期电导率值所必需的CS/KS浓度，则通过加入NaCl或其他盐来达到该值。表5显示了实验数据。所获得的CS和KS样品如实施例1、3、4中所述那样进行分析。
*由溶液中CS/KS的存在而产生的电导率值
表5-使用乙醇作为有机溶剂对海洋来源的CS/KS(CS 78.4％；KS 21.6％)的纯化。
实施例7–使用不同的溶剂混合物纯化CS/KS
用不同溶剂纯化海洋来源的CS/KS(CS 78.4％；KS 21.6％)。将NaCl加入每个样品含有120g/L CS/KS(电导率18.8mS/cm)的1L水溶液样品中，直到对于以下显示为A到C的溶剂而言最终电导率为25.6mS/cm(约87.5mM NaCl)，以及对于溶剂D到E而言最终电导率为37.1mS/cm(约290mM NaCl)。将以下溶剂在剧烈搅拌下依次加入所制备的溶液中：A)2-丙醇0.75L；B)1-丙醇0.75L；C)2-丙醇/2-丁醇1.00/0.25，体积0.75L；D)乙醇1L；E)丙酮。
在加入有机溶剂后，最初的均质系统分离为两个液相，其中CS选择性地在密相中富集，而KS在轻相中蓄积。该两相系统在搅拌下于室温保持18小时，随后放置分层。在剧烈搅拌下通过加入2-3体积的乙醇使这两个相沉淀；沉淀物在真空下干燥，分别得到白色微晶粉末形式的CS和KS。表6显示了实验结果。所得到的CS和KS样品按照实施例1、3、4所述进行分析。
如表6的数据所示，所开发的方法依赖于溶剂的性质，但是该方法的多样性通常允许操作参数(CS/KS浓度、溶剂性质、离子强度)的优化。
*所处理的CS/KS的量是100。
表6–使用不同的溶剂混合物对海洋来源的CS/KS(CS 78.4％；KS 21.6％)的纯化
实施例8-盐的化学性质对CS/KS样品纯化的影响
使用不同盐来达到临界电导率值，以纯化海洋来源的CS/KS(CS78.4％；KS21.6％)。向三个包含120g/L的CS/KS水溶液的1L样品(电导率18.8mS/cm)中加入以下物质：A)NaCl、B)CaCl2、C)K2SO4，直到最终电导率为25.6mS/cm。在剧烈搅拌下将0.75L的2-丙醇加入所制备的三个溶液中。在加入有机溶剂后，最初的均质系统分离为两个液相，其中CS选择性地在密相中富集，而KS在轻相中蓄积。该两相系统在搅拌下于室温保持18小时，随后放置分层。在剧烈搅拌下通过加入2-3体积的乙醇使这两个相沉淀；沉淀物在真空下干燥，分别得到白色微晶粉末形式的CS和KS。表7显示了实验结果。所得到的CS和KS样品按照实施例1、3、4所述进行分析。
*所处理的CS/KS的量是100。
表7–使用不同盐对海洋来源的CS/KS(CS 78.4％；KS 21.6％)的纯化。
如表7的数据所示，所开发的方法依赖于用来达到获得两液相分离所需电导率的盐的性质，但是该方法的多样性通常允许操作参数(CS/KS浓度、溶剂性质、离子强度)的优化。
实施例9–pH对CS/KS样品纯化的影响
在不同pH值下纯化海洋来源的CS/KS(CS78.4％；KS 21.6％)。分别使用1M的HCl和NaOH水溶液，将两个样品的CS/KS(120g/L)调节到pH 4.1(19.6mS/cm)和8.1(18.9mS/cm)。向所述水溶液加入NaCl，直到最终电导率为25.6mS/cm；然后在剧烈搅拌下加入0.75L的2-丙醇，直到溶液分离为两个液体相。在加入有机溶剂后，最初的均质系统分离为两个液相，其中CS选择性地在密相中富集，而KS在轻相中蓄积。该两相系统在搅拌下于室温保持18小时，随后放置分层。在剧烈搅拌下通过加入2-3体积的乙醇使这两个相沉淀；沉淀物在真空下干燥，得到白色微晶粉末形式的CS和KS。表8显示了实验结果。所得到的CS和KS样品按照实施例1、3、4所述进行分析。
从表8的数据可见，该CS/KS纯化方法依赖于溶液的pH，在中性pH值下对于产率和纯度而言结果最佳。所得到的CS和KS样品按照实施例1、3、4所述进行分析。
*所处理的CS/KS的量是100。°120g/L的CS/KS溶液的pH。
表8–在不同pH值下对海洋来源的CS/KS(CS 78.4％；KS 21.6％)的纯化。
实施例10–温度对CS/KS样品纯化方法的影响
为了验证温度对CS/KS纯化方法的关键性，制备溶于1L水中的两个海洋来源的CS/KS样品(CS 78.4％；KS 21.6％)(120g/L；18.8mS/cm)。向这两个溶液中加入NaCl，达到最终电导率为25.6mS/cm。然后在4℃和25℃下操作，在剧烈搅拌下加入0.75L的2-丙醇。在加入有机溶剂后，最初的均质系统分离为两个液相，其中CS选择性地在密相中富集，而KS在轻相中蓄积。该两相系统在搅拌下分别于4℃和25℃保持18小时。随后收集两相，在剧烈搅拌下通过加入2-3体积的乙醇使这两个相沉淀；沉淀物在真空下干燥，分别得到白色微晶粉末形式的CS和KS。表9显示了实验结果。所得到的CS和KS样品按照实施例1、3、4所述进行分析。
从表9的数据可见，所开发的方法边际性地依赖于温度性质，在25℃下操作对于纯度而言获得最佳结果。
*所处理的CS/KS的量是100。
表9-不同温度下对海洋来源的CS/KS(CS 78.4％；KS 21.6％)的纯化。
实施例11-使用乙醇作为有机溶剂，CS/KS浓度对纯化方法的影响
为了评价在纯化过程中CS/KS浓度的临界因子，制备了如表10中所示浓度的六个1L的CS/KS样品。将NaCl加入样品A-C中，得到38-40mS/cm范围的最终电导率。随后将乙醇在剧烈搅拌下加入该溶液中，乙醇的量足以在最初均质的水-醇溶液中引发两个液相分离并具有CS在密相且KS在轻相中的选择性富集。将该两相系统在室温下持续搅拌18小时，并随后放置分层。收集各个样品的两相，并通过加入2-3倍体积的乙醇在剧烈搅拌下沉淀，并将沉淀物真空干燥，分别得到白色微晶粉末形式的CS和KS。表10显示了实验结果。将得到的CS和KS样品如实施例1、3和4中所示进行分析。如表10中的数据所示，浓度发挥了关键作用，特别是就纯度而言。较低的浓度能够获得纯度>96％的CS。
*100是所处理的CS/KS的量。
表10-使用不同浓度的CS/KS对海洋来源的CS/KS(CS 78.4％；KS 21.6％)的纯化。
实施例12-CS/KS样品纯化过程中再平衡时间的影响
为了评价通过在剧烈搅拌下维持两个分离的相获得的两相系统的再平衡时间在纯化CS/KS样品方法中的临界因子，制备两个海洋来源的CS/KS样品(CS 78.4％；KS21.6％)(120g/L；18.8mS/cm)，并溶于1L水中。向两个溶液中加入NaCl，直至最终的电导率为25.6mS/cm。在25℃下操作，随后在剧烈搅拌下加入0.75L的2-丙醇。加完有机溶剂后，最初的均质系统分离为两个液相，其中CS选择性的在密相富集，而KS在轻相积聚。将该两相系统在25℃分别持续搅拌1.5小时和18小时。随后收集两相，并在剧烈搅拌下通过加入2-3倍体积的乙醇进行沉淀；将沉淀物真空干燥，分别得到白色微晶粉末形式的CS和KS。实验结果如表10中所报告。将所得的CS和KS样品如实施例1、3和4中所示进行分析。如表11中的数据所显示，所开发的方法取决于两相再平衡时间的适度范围，在更长时间下获得了轻度提高的回收率和纯度。
*100是所处理的CS/KS的量。
表11-使用对两个分离相的不同的系统再平衡时间对海洋来源的CS/KS(CS78.4％；KS 21.6％)的纯化。
实施例13-CS/KS提取来源对纯化过程的影响
为了评价待纯化的CS/KS样品天然的固有临界因子，对三种海洋来源的样品和两种猪来源的样品进行分析。制备五个样品的1L水溶液(120g/L；18.8mS/cm)。将NaCl加入样品中，直至最终的电导率为25.6mS/cm。在25℃下操作，随后在剧烈搅拌下加入0.75L的2-丙醇。加入有机溶剂后，最初的均质系统分离为两个液相，其中CS选择性的在密相富集，而KS在轻相积聚。将该两相系统持续搅拌18小时。随后收集不同样品的两相，并在剧烈搅拌下通过加入2-3体积乙醇进行沉淀；将沉淀物真空干燥，分别得到白色微晶粉末形式的CS和KS。表12显示了实验结果。将所得的CS和KS样品如实施例1、3和4中所述进行分析。
*100是所处理的CS/KS的量。
表12-从海洋和猪来源提取的CS/KS的纯化。
数据证实，在纯化过程中所用的无论任何CS/KS类型都可以使用本文所提出的方法。显而易见，起始产品越少被KS污染，最终纯化的CS就越纯，如猪来源的样品的纯度数据所示，其在最初已经比海洋来源的那些样品纯度更高。
实施例14-来自轻相的CS的再纯化
为了提高所获得的纯度水平，特别是当使用非常高浓度的CS/KS时，可以直接使密相经历再次纯化过程。将其首先用水稀释，以获得在第一次纯化过程中最初所用的浓度，随后重复整个纯化方法。
*100是所处理的CS/KS的量。
表13-CS/KS样品纯化方法，包括使用2-丙醇的第一个纯化步骤和将密相稀释两次(约110g/L)并进行与第一次相同的第二次循环的第二个步骤。

Claims (9)

1.从包含硫酸软骨素(CS)和硫酸角质素(KS)的水溶液中分离它们的方法，该方法包括在诱导形成两个液相的离子强度条件下向水溶液中加入与水混溶的有机溶剂，所述两个液相是：密相，其中浓缩了CS；和轻相，其中浓缩了KS。
2.根据权利要求1的方法，其包括：
a)制备CS/KS的水溶液并测定其电导率；
b)任选的加入能够解离为单价或多价离子的盐，以预调电导率值；
c)逐步加入一种或多种与水混溶的有机溶剂的量，以便诱导具有CS在密相中浓缩和KS在轻相中浓缩的相分离。
3.根据权利要求1或2的方法，其中与水混溶的有机溶剂选自甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、丙酮、乙腈或其混合物。
4.根据权利要求3的方法，其中所述有机溶剂是乙醇或2-丙醇。
5.根据权利要求1或2的方法，其中任选加入的盐是氯化钠。
6.根据权利要求1的方法，其中每种具体的有机溶剂的体积百分比通过将该百分比与所测定的电导率值或水溶液浓度相关联的图形来确定。
7.根据权利要求1的方法，其中包含CS的密相经历进一步的纯化过程。
8.根据权利要求7的方法，其中所述密相用水稀释，随后加入有机溶剂直到两个液相重新形成：密相，其中浓缩了CS；和轻相，其中浓缩了KS。
9.根据权利要求1-8的方法，其中CS和KS分别从两个液相中通过以下方法回收：用两体积的乙醇沉淀CS并将沉淀物干燥；加入氯化钠使KS沉淀并将沉淀物干燥。
CN201580014744.1A 2014-03-21 2015-03-20 硫酸软骨素纯化方法 Active CN106103493B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITMI2014A000486 2014-03-21
ITMI20140486 2014-03-21
PCT/EP2015/055882 WO2015140281A1 (en) 2014-03-21 2015-03-20 Chondroitin sulphate purification method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106103493A true CN106103493A (zh) 2016-11-09
CN106103493B CN106103493B (zh) 2019-04-19

Family

ID=50733188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580014744.1A Active CN106103493B (zh) 2014-03-21 2015-03-20 硫酸软骨素纯化方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10221252B2 (zh)
EP (1) EP3119814B1 (zh)
CN (1) CN106103493B (zh)
CA (1) CA2943232C (zh)
ES (1) ES2843492T3 (zh)
HU (1) HUE053192T2 (zh)
RU (1) RU2693262C2 (zh)
WO (1) WO2015140281A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112321750A (zh) * 2020-12-09 2021-02-05 美泰科技（青岛）股份有限公司 一种通过调节料液电导率控制硫酸软骨素含量的方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105777938B (zh) * 2016-03-28 2018-08-07 山东众山生物科技有限公司 一种从硫酸软骨素粗提物中去除硫酸角质素的方法
US20210132040A1 (en) * 2017-02-21 2021-05-06 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Analytical method for glycosaminoglycans

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141928B1 (en) 1989-12-20 1995-11-14 Brujo Inc Ophthalmic medication
RU2061485C1 (ru) * 1992-12-28 1996-06-10 Васюков Сергей Ефимович Способ выделения хондроитинсульфата из животных тканей
ATE256137T1 (de) 1994-12-01 2003-12-15 Seikagaku Kogyo Co Ltd Keratansulfatoligosaccharid-fraktion und sie enthaltendes medikament
RU2458134C1 (ru) 2010-12-27 2012-08-10 ФГУП Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ФГУП ПИНРО) Способ получения хондроитина сульфата из тканей морских гидробионтов
WO2013006906A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Dermatan sulphate, pharmaceutical compositions and process for producing same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FABIO GALEOTTI等: "Selective removal of keratan sulfate in chondroitin sulfate samples by sequential precipitation with ethanol", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
RODEN L等: "Isolation and Characterization of Connective Tissue Polysaccharides", 《METHODS IN ENZYMOLOGY》 *
SWEET M B E等: "Proteoglycan Synthesis by Articular Chondrocytes in Agarose Culture", 《SOUTH AFRICAN JOURNAL OF SCIENCE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112321750A (zh) * 2020-12-09 2021-02-05 美泰科技（青岛）股份有限公司 一种通过调节料液电导率控制硫酸软骨素含量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
RU2693262C2 (ru) 2019-07-01
US20170022295A1 (en) 2017-01-26
EP3119814B1 (en) 2020-12-16
RU2016137266A3 (zh) 2018-09-28
HUE053192T2 (hu) 2021-06-28
US10221252B2 (en) 2019-03-05
WO2015140281A1 (en) 2015-09-24
CA2943232A1 (en) 2015-09-24
CA2943232C (en) 2022-07-12
ES2843492T3 (es) 2021-07-19
CN106103493B (zh) 2019-04-19
EP3119814A1 (en) 2017-01-25
RU2016137266A (ru) 2018-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Restaino et al. A multi-analytical approach to better assess the keratan sulfate contamination in animal origin chondroitin sulfate
Carbonero et al. Lentinus edodes heterogalactan: Antinociceptive and anti-inflammatory effects
Novoa-Carballal et al. By-products of Scyliorhinus canicula, Prionace glauca and Raja clavata: A valuable source of predominantly 6S sulfated chondroitin sulfate
Liu et al. Compositional analysis and structural elucidation of glycosaminoglycans in chicken eggs
CN105131153A (zh) 绵羊依诺肝素钠化合物的制备方法及其化合物与应用
CN106103493B (zh) 硫酸软骨素纯化方法
Tuvikene et al. Funorans from Gloiopeltis species. Part I. Extraction and structural characteristics
Laremore et al. Domain structure elucidation of human decorin glycosaminoglycans
Wang et al. Chicken leg bone as a source of chondroitin sulfate
Restaino et al. Chondroitin sulfate: are the purity and the structural features well assessed? A review on the analytical challenges
WO2019064231A1 (en) HIGH MOLECULAR WEIGHT CHITOSAN, METHOD FOR PRODUCING THE SAME AND USES THEREOF
Mirzayeva et al. Screening of the chemical composition and identification of hyaluronic acid in food supplements by fractionation and fourier-transform infrared spectroscopy
JP2004043645A (ja) 低分子化糖の製造方法
Ibram et al. Comparison of extraction methods of chitin and chitosan from different sources
CA2835691C (en) Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof
Felz Structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge
US6342367B1 (en) Method for the preparation of chondroitin sulfate compounds
Liu et al. Mass balance analysis of contaminated heparin product
Im et al. Glycosaminoglycans from earthworms (Eisenia andrei)
Xu et al. Quantitative analysis of acidic polysaccharides using hydrophilic interaction chromatography and mass spectrometry after acid hydrolysis
Hickey Extraction and characterization of bioactive carbohydrates with health benefits from marine resources: macro-and microalgae, cyanobacteria, and invertebrates
Kalitukha et al. Hydrocolloids from the Mushroom Auricularia heimuer: Composition and Properties
AU2020103108A4 (en) Prawn head heparinoid, preparation method thereof, and use thereof in preparation of anticoagulant
Liu et al. Changes of the Physicochemical Properties and Structural Characteristics of Alkali-Extracted Polysaccharides from Agrocybe cylindracea Across the Growth Process
Schiano di Visconte et al. Novel Capsular Polysaccharide from Lobochlamys segnis

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1230634

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant