ES2843492T3 - Método de purificación del sulfato de condroitina - Google Patents

Abstract

Un método para la separación de sulfato de condroitina (CS) y sulfato de queratán (KS) a partir de una solución acuosa que los contiene, que comprende la adición a la solución acuosa de un solvente orgánico miscible en agua en condiciones de fuerza iónica que induce la formación de dos fases líquidas, una fase densa en donde se concentra el CS y una fase ligera en donde se concentra el KS, y el porcentaje en volumen de cada solvente orgánico específico se determina mediante un gráfico que correlaciona dicho porcentaje con el valor de conductividad medido o con la concentración de la solución acuosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de purificación del sulfato de condroitina

La presente invención se refiere a un proceso industrial para la purificación del sulfato de condroitina (CS) obtenido a partir de cartílago animal, que proporciona un producto totalmente conforme con las especificaciones requeridas para usar dicho compuesto en el campo farmacéutico. En particular, el proceso desarrollado permite la eliminación del queratán, un glucosaminoglucano que, como demuestran las modernas técnicas de análisis, está presente en todas las preparaciones de CS obtenidas por diversos métodos de extracción a partir de diferentes tipos de fuente animal.

Definiciones

Glucosaminoglucanos (GAG) significa la familia compleja de polisacáridos, que son componentes fundamentales de la matriz extracelular.

El término [4)-p-D-GlcA-(1— 3)-p-D-GalNAc-(1 — ] significa el disacárido formado por ácido D-glucurónico (D-GlcA) y N-acetil-D-galactosamina (D-GalNAc), unido con un enlace p-glucosídico (1-3).

El término [4)-a-L-IduA-(1— 3)-p-D-GalNAc-(1— ] significa el disacárido formado por ácido L-idurónico (L-IduA) y N-acetil-D-galactosamina (D-GalNAc), unido con un enlace p-glucosídico (1-3).

El término sulfato de condroitina (CS) significa glucosaminoglucanos sulfatados de diferentes pesos moleculares, que están presentes en varios tejidos animales. La cadena principal del sacárido de CS consiste en unidades de disacárido [4)-p-D-GlcA-(1— 3)-p-D-GalNAc-(1— ] enlazadas repetidamente con enlaces p-glucosídicos □ (1— 4). La abreviatura CS se refiere tanto a la forma ácida como a la forma salificada de dichos polisacáridos.

La abreviatura CS-tipo A significa un CS caracterizado por la prevalencia de unidades de disacárido tipo CS-A [4)-p-D-GlcA-(1— 3)-p-D-GalNAc4SO3'-(1 — ];

El término sulfato de condroitina/dermatán, abreviado como CS/DS, también conocido como CS-tipo B, que no debe confundirse con la variante estructural de disacárido CS-B, significa glucosaminoglucanos sulfatados de diferentes pesos moleculares, presentes en varios tejidos animales, en donde la cadena principal del sacárido consiste en diferentes cantidades de unidades de disacárido 4)-p-D-GlcA-(1— 3)-p-D-GalNAc-(1— ] y [4)-a-L-IduA-(1— 3)-p-D-GalNAc-(1— ], unidos con enlaces glucósidos p-(1— ^4). La abreviatura CS o CS-tipo B se refiere tanto a la forma ácida como a la forma salificada de dichos polisacáridos.

La abreviatura CS-tipo C significa un CS caracterizado por la prevalencia de unidades de disacárido tipo CS-C [4)-p-D-GlcA-(1— 3)-p-D-GalNAc6SOa--(1— ].

El término sulfato de queratán (KS) significa glucosaminoglucanos sulfatados diversamente de diferentes pesos moleculares, que están presentes en varios tejidos de animales y peces. La cadena principal de los sacáridos de KS consiste en unidades de disacáridos [3)-p-D-Gal-(1— 4)-p-D-GlcNAc-(1— ]. La abreviatura KS se refiere tanto a la forma ácida como a la forma salificada de estos polisacáridos.

La abreviatura CS/KS significa los productos CS contaminados con KS actualmente en el mercado.

Técnica anterior

El sulfato de condroitina (CS) es un glucosaminoglucano que consiste de unidades de disacárido repetidas de [4)-p-D-Gal-(1— 3)-p-D-GlcNAc-(1— ]. enlazadas con enlaces p-glucosídicos (1— 4). Cuando algunas unidades -p-D-GlcA se sustituyen en la cadena de polisacárido por -a-L-IduA-, se usa el término CS-tipo B (que no debe confundirse con la variante estructural del disacárido CS-B), también llamado sulfato de dermatán (abreviado a CS/DS).

En dependencia de los sitios de sulfatación, existen varios tipos de disacáridos estructurales de condroitinas/dermatanos. In vivo los diversos tipos de CS, durante la polimerización, son sulfatados por sulfotransferasas específicas y después, unidos covalentemente a proteínas específicas, se secretan en la matriz extracelular como proteoglicanos. Son ingredientes ubicuos de varios tejidos conectivos, como cartílago, piel, vasos sanguíneos y huesos (Abu, K. & Seno, N., The Basis of Carbohydrate Chemistry, 1993, 142-177, Japón: Kodansha).

El CS se distribuye copiosamente en los organismos vivos, en donde juega un papel central en los procesos biológicos. En particular, el CS actúa como regulador de factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión y lipoproteínas, por medio de interacciones con los ligandos de dichas proteínas a través de dominios sacáridos específicos (Malavaki C., y otros, Connect Tissue Res 2008, 49, 133-139).

La Tabla 1 muestra los parámetros estructurales de los tipos principales de CS purificados por diferentes organismos. En particular, los parámetros de masa molecular son bastante similares para el CS de origen animal (bovino, porcino, pollo), pero bastante diferente a partir de los de origen marino (tiburón, raya, calamar), al tener este último una masa molecular superior al primero. Las muestras de CS de origen marino también tienen una densidad de carga superior a 1, debido a la presencia de disacáridos disulfurados, mientras que las muestras de CS de origen animal (bovino, porcino, pollo) tienen una densidad de carga inferior a 1.

T l 1 - D r r l l rin i l i rifi r ir if r n r ni m

En vista de estas múltiples funciones, el CS se ha usado en productos farmacéuticos, nutracéuticos y cosmecéuticos (Koga, T., New Food Industry, 1989, 31, 4-7; Park, D.C. & Kim, S.B., Fisheries Research, 1998,12, 30-39; Cho, S.M., y otros, Food Hydrocolloids, 2004, 18, 573-579; Cho, S.Y., y otros, Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2004, 27, 47-51; Takuo, N., y otros, Recent Patents on Food Nutrition & Agriculture, 2010, 2, 61-74).

Actualmente, el CS es el ingrediente activo de numerosos fármacos antiartritis. El CS contribuye de manera significativa a determinar las propiedades biomecánicas del cartílago, ya que lubrica las articulaciones y confiere resistencia mecánica a los esfuerzos de compresión.

Recientemente se describieron varias aplicaciones farmacéuticas potenciales del CS, en parte en dependencia del tipo de sulfatación (Hiraoka y otros Glycobiology 2001, 11(6), 495-504; Malavaki C., y otros, Connect Tissue Res 2008, 49, 133-139; Lauder R.M., Complement Ther Med 2009, 17:56-62.).

Estudios recientes han demostrado que el CS juega un papel importante en la progresión tumoral y la formación de metástasis. En las células tumorales en particular, se han encontrado alteraciones de la longitud de la cadena y las posiciones de sulfatación de la molécula de CS (Smetsers y otros, J Invest Dermatol 2004, 122(3):701-716). Esto ha permitido usar el CS como biomarcador para el diagnóstico precoz de los tumores de ovario (Pothacharoen y otros, J Cell Sci 2006, 113, 193-205).

Tabla 2 - Aplicaciones médicas y farmacéuticas potenciales de la CS (Schiraldi, C., y otros, Applied Microbiology and Biotechnolo 2010 87 1209-1220.

Estas características han hecho del CS un importante medio farmacológico durante muchos años, al aumentar el interés en su producción, que actualmente se basa en técnicas de extracción a partir de diversos tejidos animales. En particular, el CS se extrae a partir del cartílago de tiburón, la tráquea bovina y algunos subproductos del sacrificio de cerdos. Debido al alto grado de purificación requerido, este proceso es muy complejo y costoso, involucrando usar enzimas, antibióticos y volúmenes considerables de solventes orgánicos. El procesamiento también adolece de considerables dificultades operativas asociadas con el olor desagradable del procesamiento y la producción de aguas residuales altamente contaminantes; además, usar tejidos animales como materia prima en el proceso de extracción puede conducir a la transmisión de infecciones virales y priónicas entre especies (Schiraldi y otros, 2010).

La producción de CS a partir de materiales cartilaginosos de origen animal se describe en detalle en la literatura científica y de patentes. Todos los procesos suelen implicar las siguientes etapas: homogeneización del cartílago; degradación química (hidrólisis alcalina) y/o degradación enzimática (tripsina, papaína, alcalasa y neutrasa fabricadas por Novozyme) de la matriz de proteoglicanos para separar el componente proteico a partir del componente carbohidrato; filtración para eliminar residuos insolubles; una pluralidad de procesos de precipitación con solventes, normalmente etanol, para purificar/recuperar el polisacárido de interés; separación cromatográfica con resinas de intercambio iónico; decoloración con carbón activado; secado y trituración del producto seco; empaque.

Usar el CS como medicamento y nutracéutico se ha asociado con criterios de pureza específicos para la materia prima definidos de manera bastante similar por las autoridades reguladoras de varios países. En la actualidad, de acuerdo con las farmacopeas de EE. UU. y de la u E, la prueba estándar para determinar el contenido de CS es un método de titulación fotométrica realizado con bromuro de hexadeciltrimetilamonio como agente de titulación. El método de titulación presenta una linealidad entre 0,5 y 7,5 mg del estándar CS (Sigma), pero se ha demostrado que en presencia de otros GAG o ácidos nucleicos, existen curvas de titulación con criterios de valoración sobreestimados (http://siga.ufjf.br/ Reeport Laboratório de Análise de Glicoconjugados - UFJF). Estos resultados indican que el método de titulación tiene baja especificidad, porque puede sobrestimar la cuantificación de CS en presencia de otros compuestos aniónicos. Otros métodos especificados por las farmacopeas de EE. UU. y de la UE incluyen la espectroscopía infrarroja, la determinación del poder rotatorio específico y la electroforesis en acetato de celulosa, todos los cuales métodos, como se indica más abajo, exhiben ahora sus considerables limitaciones para determinar el grado de pureza de las preparaciones basadas en GAG.

En los últimos años, el gran interés científico en los GAG y sus posibles aplicaciones, el desarrollo de enfoques nuevos y más sofisticados para la caracterización de estos polisacáridos y el desarrollo de nuevas estrategias para separar los diversos tipos de GAG, han demostrado (Pomin, VH y otros, Carbohydrate Polymers, 2012, 90, 839-846) que los métodos de análisis usados originalmente por las autoridades reguladoras para definir el grado de pureza de las preparaciones comerciales de CS destinadas al uso farmacéutico y nutracéutico son inadecuados, y que incluso los estándares de referencia propuestos por las farmacopeas de los EE.Uu . y la UE no son puros, sino significativamente contaminados con sulfato de queratán (KS), una mezcla de glucosaminoglucanos sulfatados diversamente con diferentes pesos moleculares, cuya estructura se basa en unidades de disacárido [3)-p-D-Gal-(1— 4)-p-D-GlcNAc-(1— ] unido con enlaces p-glucosídicos (1 -3 ).

Pomin y otros (Carbohydrate Polymers, 2012, 90, 839-846) analizó 17 lotes comerciales de CS para el uso oral, 3 de los cuales se obtuvieron a partir de cartílago bovino y 14 a partir de cartílago de pescado, y los estándares indicados como productos de referencia por las farmacopeas de EE. UU. y de la UE. Las metodologías de análisis adoptadas por estos autores fueron la electroforesis en gel de agarosa; el HPLC sobre resinas de intercambio aniónico fuertes (SAX) y resinas de exclusión por tamaño (SEC); la digestibilidad con GAG-liasas específicas; los niveles estimados de ácido urónico; la RMN ID y 2D. En particular, los autores (Tabla 3) encontraron que, en promedio, el KS representa aproximadamente el 16 % del total de GAG que se encuentran en las formulaciones obtenidas a partir del cartílago de tiburón, y obtuvieron un hallazgo similar con el estándar de la Farmacopea de la UE, también obtenido a partir del cartílago de tiburón.

Como se muestra en la Tabla 3, grandes cantidades de KS están presentes en el CS de origen marino, lo que conduce a una reducción considerable en el contenido de CS en comparación con la cantidad indicada y significa que el producto es incompatible con el uso, especialmente como medicamento, que requiere un alto grado de pureza Volpi, N., J. Pharm. Sci., 2007, 96, 3168-3180).

Pomin y otros demostraron que la electroforesis en gel de agarosa desarrollada por ellos, de manera similar a la electroforesis en acetato de celulosa recomendada por las farmacopeas de EE. UU. y la UE, no puede demostrar la contaminación por KS, porque este GAG comigra con el CS. Además, el SEC-HPLC no puede demostrar la presencia de KS en las formulaciones de CS, mientras que el SAX-HPLC demostró ser el método más apropiado para identificar la contaminación de KS, ya que el CS y el KS tienen tiempos de elución suficientemente diferentes, pero no tan diferentes como para prevenir el solapamiento parcial de los picos, lo que puede causar evaluaciones cuantitativas erróneas de la contaminación. Un método suficientemente diagnóstico, pero no cuantitativo, para identificar la presencia de KS en las formulaciones de CS es la 1H-RMN ID, como lo indican los grupos aislados bien resueltos de señales a 4,68 y 4,37-4,30 ppm característicos del KS (Limtiaco, J. y otros, 2012, Analytical Methods, 4, 1168-1172; Pomin, V.H., y otros, 2010, Analytical Chemistry, 82, 4078-4088; Rudd, T.R. y otros, 2011, TheAnalyst, 136, 1390-1398, Zhang, T., y otros, 2009, J. Pharmaceutical Science, 98, 4017-4026).

Tabla 3 - Proporciones de CS y KS en lotes de formulaciones orales de CS obtenidas a partir de cartílago de tiburón y bovino, y estándares de farmacopea de la UE y EE. UU. Las proporciones se obtuvieron a partir de las integrales de los erfiles HPLC-SAX Pomin V.H. otros Carboh drate Pol mers 2012 9 839-846.

Sobre la base de los datos encontrados de la contaminación por KS, Pomin y otros indican la necesidad de una revisión de las metodologías especificadas en las farmacopeas de Ee .UU. y de la UE, para proporcionar una definición más correcta de la cantidad de ingrediente bioactivo presente en las formulaciones comerciales de CS.

El desarrollo de nuevos métodos de análisis capaces de identificar la contaminación por KS obviamente requiere una revisión sustancial de los métodos de producción de CS para reducir los niveles de contaminación por KS dentro de límites compatibles con el uso de CS como medicamento y nutracéutico.

Galeotti F. y otros (Analytical Biochem, 2013, YABIO 1157926.12.13) definen las condiciones de precipitación selectiva de CS y KS a partir de preparaciones comerciales de CS/KS obtenidas a partir de cartílago de tiburón mediante la adición gradual de etanol saturado con acetato de sodio a una solución que contiene 33 mg/mL de CS/KS. La precipitación de condroitina sola se completa con 1 volumen de etanol. En el mismo estudio, los autores afirman que la precipitación con metanol, propanol o acetona no permite la eliminación selectiva de KS. Anteriormente, el mismo grupo (Volpi N., J Chromatography B, 1996, 685, 27-34), al describir la precipitación de 110 mg/mL de mezclas de glucosaminoglucanos con etanol en presencia de NaCl al 2 %, indicó que la precipitación completa de CS solo se obtiene entre 1,2 y 1,6 volúmenes.

Roden L y otros, Methods in Enzymology, Vol 28, 1 de enero de 1973, 73-140 describe la separación de CS y KS mediante fraccionamiento con etanol con la formación de dos fases, precipitado y sobrenadante.

Sweet M B E y otros, South African J. of Science, vol. 83(2), 1 de marzo de 1987, 153-156, describe un método para la separación de CS a partir de KS en etanol seguido de cromatografía.

Todos los métodos actuales de producción industrial de CS se basan en criterios de pureza del producto inadecuados para demostrar la contaminación por KS. A corto plazo, tan pronto como las autoridades reguladoras, que ya son conscientes de los problemas, hayan adaptado los estándares y los métodos de caracterización para tener en cuenta las nuevas oportunidades de análisis, esto convertirá a todos los productos de CS ahora en el mercado en inadecuados para usar en la industria farmacéutica y en muy poco titulados para usar en la producción de nutracéuticos y cosmecéuticos.

Así, a pesar de la gran cantidad de métodos de extracción/purificación desarrollados hasta la fecha, actualmente se está investigando industrialmente sobre nuevos procesos que producen un CS, especialmente en lo que respecta al grado farmacéutico, que cumple con los nuevos estándares de pureza a los que las autoridades reguladoras están ajustando las especificaciones de CS, especialmente en relación con la contaminación por KS, que todavía no se incluye entre los métodos de análisis en la Farmacopea actual.

En este contexto, el desarrollo de un proceso de purificación simple, aplicable a los diversos productos de CS contaminados por KS (CS/KS) actualmente existentes, representa un objetivo industrial importante y de actualidad.

Descripción de la invención

El desarrollo de metodologías de investigación más adecuadas demuestra que el alcance del problema de la contaminación por KS de las preparaciones de CS actualmente en el mercado es aún mayor y más extendido de lo informado por Pomin, y otros, (Carbohydrate Polymers, 2012, 90, 839-846), lo que afecta no solo a los productos de CS obtenidos a partir de materias primas de origen marino sino también, aunque en menor medida, a los obtenidos de otras fuentes animales (bovinos, porcinos, aves de corral, etc.).

Ahora se ha encontrado un método que, a un coste limitado y con los tipos de maquinaria ya existentes, a partir de las preparaciones CS/KS actualmente en el mercado, permite eliminar el KS mediante un tratamiento final o modificaciones específicas de los procesos actualmente desarrollados a nivel industrial, lo que restituye así las especificaciones de producto del CS a valores que, en el corto plazo, serán exigidos a nivel internacional por las autoridades reguladoras, especialmente para el CS de grado farmacéutico.

El proceso, que es de un tipo completamente diferente a las técnicas actuales de precipitación fraccionada con solventes, se caracteriza por una considerable versatilidad operativa, y una vez diseñado es simple y no presenta dificultades significativas para el escalado industrial. El proceso se caracteriza por las siguientes etapas: 1) preparación de una solución de CS/KS en agua y medición de su conductividad; 2) adición de una sal hasta que la conductividad alcance el valor crítico de interés para el proceso; no se añade la sal si la sola presencia de CS/KS ya garantiza dicho valor desde el principio; 3) adición gradual a esta solución acuosa de una cantidad calculada de fase orgánica, que consiste de uno o más solventes miscibles juntos y con la cantidad de agua especificada en la etapa 1; cuando se ha completado la adición del solvente orgánico, el sistema inicialmente monofásico se convierte en un sistema bifásico líquido, con una concentración de CS en la fase densa y una concentración de KS en la fase ligera; 4) recuperación por precipitación, con 2-3 volúmenes de etanol, a partir del CS de la fase más densa y el KS de la fase menos densa, y el porcentaje en volumen de cada solvente orgánico específico se determina mediante una gráfica que correlacione dicho porcentaje con el valor de conductividad medido o a la concentración de la solución acuosa.

Un enfoque sistemático para identificar las condiciones óptimas de purificación a nivel industrial implica, para un cierto tipo de CS/KS ("mismo tipo" significa que las diferencias entre los niveles de contaminación del CS por el KS deben estar dentro de un intervalo que no exceda de 2-3 %) y para un solvente orgánico dado, la construcción de un diagrama en donde la conductividad o concentración de la solución acuosa, que contiene CS/KS y cualquier sal añadida, se muestra como una función de la cantidad de fase orgánica necesaria para inducir la formación de las dos fases líquidas útiles para el proceso de purificación. Cuando se han establecido el tipo de CS/KS y la naturaleza del solvente orgánico seleccionado, es posible identificar a partir del gráfico construido para ese tipo de solvente orgánico el par de valores (conductividad de la solución acuosa y cantidad de solvente orgánico) que conduce a la formación de las dos fases líquidas que forman la base del proceso de purificación. Los valores que caen más abajo de dichos parámetros (valores de conductividad más bajos o cantidades más pequeñas de solvente) conducen a recuperaciones bajas o a la ausencia de separación de fases, mientras que los valores de conductividad más altos o cantidades mayores de solvente orgánico convierten tanto el CS como el KS en la fase densa, lo que provoca que el proceso de purificación pierda su eficacia.

Cuando se ha establecido la concentración de CS/KS a la que se desea realizar el proceso de purificación, se determina la cantidad de sal (si la hay) que debe añadirse para llevar la conductividad al valor crítico que induce la formación de las dos fases líquidas.

Cuando se ha seleccionado el tipo de solvente orgánico a usar y se han definido experimentalmente las condiciones de operación con la construcción de la gráfica de conductividad de la solución acuosa que contiene CS/KS de acuerdo con la cantidad de fase orgánica necesaria para inducir la separación de las dos fases líquidas que forman la base del proceso de purificación, esto puede realizarse de diferentes formas, de acuerdo con la conveniencia industrial.

Método A) - Cuando se ha establecido el tipo y la cantidad de solvente orgánico a usar, en el gráfico puede encontrarse el valor de conductividad que debe tener la solución acuosa. Si este valor se alcanza con la presencia de CS/KS solos en solución, la fase orgánica se añade a la fase acuosa con agitador. Inicialmente siempre existe un sistema monofásico, y solo después de la adición de todo el solvente orgánico se observará la formación de dos fases líquidas que determina la compartimentación del CS en la fase densa y del KS en la fase ligera. Si el valor crítico de conductividad de la fase acuosa no se alcanza con la presencia de CS/KS solo en solución, se añade una sal hasta que se alcanza la conductividad deseada, y después se añade el solvente orgánico como se describió anteriormente.

Método B) - Cuando se ha establecido el valor de conductividad de la solución acuosa que contiene CS/KS y cualquier sal añadida, la cantidad de solvente que se usará se encuentra en el gráfico y el solvente se añade a la solución acuosa como se describe para el método A).

Los ejemplos de solventes orgánicos que pueden usarse en el proceso de purificación de CS/KS de acuerdo con la invención son metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetona, acetonitrilo y mezclas de estos.

El proceso de acuerdo con la invención no solo proporciona un CS con especificaciones compatibles con las regulaciones más estrictas que pronto serán implementadas por las autoridades reguladoras, sino también grandes cantidades de KS, un producto que hasta ahora no está disponible en el mercado, para el cual pueden postularse importantes aplicaciones, especialmente en el campo oftalmológico (US 5,141,928; US 6,159,954) y como un compuesto con actividad inmunogénica, hasta ahora demostrado in vitro (Meller y otros, Clin Chim Acta 1995, 236, 195-204; Nakano T., Carbohydr Polym, 2014, 99, 547-552).

Los procesos de separación reivindicados producen recuperaciones cercanas a los valores teóricos y de pureza> 98 %.

El proceso de purificación de CS/KS se realiza preferentemente a un pH neutro, que produce los mejores resultados en términos de rendimiento y pureza.

El momento en que las dos fases se mantienen bajo agitador para permitir una redistribución óptima de los dos solutos de KS en la fase ligera y de CS en la fase densa no es crítico. Los rendimientos y el grado de pureza varían poco si dicho tiempo es sólo de 1,5 h o 18 h.

De manera similar, la temperatura a la que se realiza el proceso no es muy crítica; puede realizarse en un amplio intervalo de temperatura (por ejemplo, a partir de 4 a 25 °C) sin ningún efecto sustancial sobre el rendimiento o la pureza.

El proceso de purificación reivindicado es aplicable al CS/KS obtenido por diferentes métodos y mediante el uso del cartílago a partir de diferentes fuentes.

Al operar a concentraciones de CS/KS particularmente altas, pueden obtenerse mejores purificaciones al volver a someter la fase densa a un ciclo de purificación idéntico subsecuente, después de diluirla a la concentración de la muestra tratada originalmente.

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que el proceso de purificación de CS/KS, en paralelo con la separación del CS a partir de KS, también reduce significativamente el contenido de pirógenos.

La aplicación del método reivindicado ha producido por primera vez estándares de CS y KS puros, requisito previo para la aplicación de las nuevas especificaciones de producto que las autoridades reguladoras se están preparando para emitir.

Los siguientes ejemplos describen la invención con más detalle.

Ejemplo 1 - Análisis de FPLC de las muestras CS/KS, CS y KS

Esta metodología de cromatografía preparatoria analítica permite separar muestras de CS/KS en la escala de centésimas de mg, poniendo a disposición muestras con una pureza superior al 99 %, no disponibles actualmente en el mercado, y que se pueden usar como estándares de referencia para todos los procesos de validación que es probable que establezcan las autoridades reguladoras en el futuro inmediato. Los estándares preparados se usan para todas las calibraciones de los métodos de análisis usados para caracterizar la pureza del CS y del KS que se describen más abajo.

El método usa una columna HiLoad Q Sepharose 26/10 HP GE Healthcare funcionalizada con un intercambiador de anión fuerte, montada en un cromatógrafo Akta Explorer 100 Amersham (GE Healthcare) equipado con un detector UV/Vis. Se usa un gradiente lineal de dos tampones como sistema eluyente: tampón A - acetato de sodio 20 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M; tampón B - acetato de sodio 20 mM, pH 7,4, NaCl 3,0 M. Las condiciones para la separación óptima del CS y del KS son: gradiente lineal 0-100 % de B en A en 106 min; régimen de flujo 2 ml/min; detección UV a 215 nm. Se analizan muestras de 300 mg disueltas en 5 mL de tampón A. En las condiciones de análisis descritas, el tiempo de elución del analito no retenido es de 50 min, el de CS es de 193 min y el de KS es de 268 min.

Mediante el uso de una muestra de CS/KS de origen marino se obtienen patrones de CS y KS con un grado de pureza> 99 %, al recuperar los eluidos que corresponden a los dos picos de CS y KS, que se ultrafiltran a través de membranas con un corte de 3 KDa para eliminar las sales y liofilizados. Las muestras así obtenidas se caracterizan como se indica en los ejemplos 2-4 más abajo.

Ejemplo 2 - Caracterización del CS y del KS por SEC-TDA

La caracterización, en términos de masa molecular, distribución de peso molecular, polidispersidad y viscosidad intrínseca, de los productos comerciales CS/KS y de los estándares CS y KS obtenidos como se describe en el ejemplo 1, se realizó con un cromatógrafo de exclusión por tamaño (Viscotek, LabService Analytica, Italia) que consiste de dos módulos y un software de gestión dedicado:

el módulo GPCmax VE 2001 es un sistema integrado que consiste de una bomba específica para cromatografía de filtración en gel (GPC) (bomba isocrática capaz de garantizar un flujo de solvente constante y sin pulsaciones), un desgasificador de solvente en línea y un automuestreador;

el módulo TDA302 (Serie de Triple Detector) es un sistema integrado formado por un horno con termostato para la columna y un detector triple, que consiste de un detector de índice de refracción (RI), un detector de viscosímetro (VS) con 4 puentes capilares y un detector de dispersión de luz (LS) que a su vez consiste en dos partes, un detector de dispersión de luz de ángulo recto (RALS) caracterizado por una excelente relación señal/ruido, y el nuevo detector de dispersión de luz de ángulo bajo (LALS);

El OmniSECTM es un software para la gestión del GPCmax y TDA (entorno Windows), que permite caracterizar una solución de polímero en términos de concentración, peso molecular absoluto medio, índice de polidispersidad, tamaño molecular (radio hidrodinámico y de rotación) y viscosidad intrínseca del polímero. El valor dn/dc (variación infinitesimal en la intensidad de la señal medida por el detector de índice de refracción al variar la concentración del analito) es 0,1466 mL/g para el CS y 0,1000 mL/g para el KS (Swann DA y otros J Biological Chemistry, 1984, 259, 12, 7693-7700).

Columnas de cromatografía: el sistema de cromatografía Viscotek está equipado con una precolumna TSK-gel GMPWXL (Tosoh Bioscience, Cat. Núm. 08033, 6,0 x 4,0 cm, tamaño promedio de partícula 12 pm) y 2 columnas TSK-gel GMPWXL colocadas en serie (Tosoh Bioscience, Italia, Cat. Núm. 8-08025, material basado en polimetacrilato hidroxilado, tamaño de los poros de 100-1000 A, tamaño medio de partícula 13 pm, 7,8 x 30,0 cm).

columna de viscosímetro: Precolumna TOSOH08033 y columna TOSOH08025, ambas comercializadas por Viscotek -LabService Analytica S.r.l., Via Emilia, 51/c, 40011, Anzola Emilia (BO, Italia).

Estas son las condiciones de cromatografía usadas para la caracterización analítica de las muestras de CE y KS: fase móvil 0,1 M NaNO3; temperatura 40 °C, régimen de flujo de 0,6 ml/min; tiempo de ejecución 50 min.

Ejemplo 3 - Caracterización del CS/KS, CS y KS por hidrólisis ácida y análisis HPLC-Dionex de monosas

Para evaluar la composición de productos comerciales de CS/KS y el grado de pureza del CS y KS obtenidos como se describe en el ejemplo 1, se diseñó un protocolo analítico basado en la hidrólisis ácida de la muestra y el análisis cromatográfico de las monosas que constituyen las unidades de disacárido de las cadenas de glucosaminoglucanos simples: galactosamina acetilada (GalNAc) y ácido glucurónico (GlcA) para el CS y glucosamina (GlcN) y galactosa (Gal) para el KS.

Las pruebas preliminares con patrones de dichos azúcares demuestran que durante la hidrólisis los dos aminoazúcares se desacetilan parcialmente, generando cada uno dos picos diferentes, mientras que el GlcA y Gal generan uno y tres picos respectivamente.

El protocolo de análisis en su conjunto permite hidrolizar la muestra con una eficiencia del 95-100 % y obtener una determinación equimolar de la concentración de las dos monosas que constituyen las unidades de disacárido de las cadenas de CS y KS respectivamente. A partir de las concentraciones molares de los azúcares constituyentes, es posible determinar el porcentaje en peso del CS y KS presentes en las muestras, menos el contenido de agua, al considerar diferentes valores de peso molecular medio de las unidades de disacáridos de acuerdo con el tejido animal de origen y el efecto del grado de sulfatación y sodiación de las moléculas individuales.

Hidrólisis ácida - Las muestras de CS/KS, CS y KS se someten a hidrólisis ácida. En un procedimiento estándar, se disuelven 50 mg de muestra en 0,5 ml de HCl 1 M preparado con agua MQ. La hidrólisis se realiza a 100 °C durante 18 h con agitador; después, las muestras se neutralizan con NaOH 5 M y se analizan mediante cromatografía de intercambio aniónico.

Análisis HPLC de monosas mediante cromatografía de intercambio iónico - Los productos de la hidrólisis se analizan mediante cromatografía de intercambio aniónico con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD), mediante el uso de un cromatógrafo iónico (ICS 3000, Dionex, Italia) con automuestreador y bomba doble equipada con una columna Carbopac PA1 (4 x 287,5 mM, Dionex, Italia) y precolumna. La separación cromatográfica dura 41 min (0-12 min a partir de 1 a 4 mM NaOH, 12-14 min 4 mM NaOH, 14-16 min 4 a 100 mM NaOH, 16-30 min 100 mM NaOH, 30-39 min 100-1 mM de NaOH, 39-41 min de 1 mM de NaOH).

La calibración del CS y KS se realiza con estándares purificados para FPLC, que contienen contaminación residual para el CS por KS y para el KS por CS <2 %, que se hidrolizan como se describió anteriormente.

Las intersecciones de calibración se obtienen, en el caso de KS, al trazar la suma de las áreas de los picos de GlcN y Gal y sus derivados como una función de cantidades conocidas del estándar de KS hidrolizado, mientras que en el caso del CS la intersección de calibración se obtiene al trazar la suma de las áreas de los picos de GalNAc y GlcA y sus derivados en función de las cantidades conocidas del estándar CS.

La concentración (g/L) del KS en las muestras se determina al sumar las áreas de los picos representativos de GlcN y Gal y sus derivados y calcular la concentración en comparación con el intercepto de calibración del estándar de KS hidrolizado, mientras que la concentración (g/L) de CS en las muestras se determina al sumar las áreas de los picos representativos para GalNAc y GlcA y sus derivados y calcular la concentración en comparación con la intercepción de calibración del estándar de CS hidrolizado. Finalmente, los porcentajes de KS y CS se encuentran al calcular las relaciones de las concentraciones obtenidas con la suma total de las concentraciones porcentuales.

Ejemplo 4 - Caracterización de CS/KS, CS y KS mediante metanólisis de GAGs, acetilación de metil glicósidos y análisis GC-Ms de los metil glicósidos acetilados obtenidos

Para evaluar la composición de los productos comerciales de CS/KS y el grado de pureza del CS y KS obtenidos como se describe en el ejemplo 1, se ha diseñado un protocolo analítico que involucra la metanólisis de GAGs con HCl, la acetilación de los metil glicósidos obtenidos y su análisis con GC-MS. En un procedimiento estándar, 10 mg de las muestras se someten a metanólisis (1 mL de MeOH/HCl 1,25 M, 80 °C, 20 h) y los metil glicósidos obtenidos se acetilan con anhídrido acético (50 j L) y piridina (50 j L) a 100 °C durante 30 min. Las muestras de metil glicósido acetilado se analizan por GC-MS (Agilent Technologies, Gc 6850 °, MS 5973N) en una columna capilar (Zebron ZB-5, Phenomenex, 30 mx 0,25 mm di), mediante el uso de un régimen de flujo de 1 ml/min de helio (gas portador) con el siguiente programa de temperatura: 150 °C durante 3 min, 150 °C ^240 °C a 3 °C/min. Las condiciones de detección de MS son: fuente de ionización electrónica a 70eV, analizador cuadrupolo, intervalo de adquisición 40-450 Da.

La metanólisis determina: la despolimerización completa por escisión de los enlaces glucósidos, lo que genera los correspondientes metil glucósidos (en el caso de GlcA se forman tanto a como p metil glucósido); la desacetilación de GalNAc y GlcNAc; la eliminación de todos los grupos sulfato.

Las mezclas de reacción se analizan con GC-MS. Los azúcares se identifican al comparar el tiempo de retención y la fragmentación con los de los estándares conocidos.

La composición molar porcentual de CS, KS y DS en la muestra se calcula a partir de la relación entre las áreas subyacentes a los picos correspondientes a los metil glicósidos individuales, normalizada en relación con la respuesta analítica de las muestras estándares de metil glicósidos. Así, en un análisis correcto, las concentraciones molares de los metil glicósidos de Gal y GlcN son iguales y corresponden a la del KS, la suma de las concentraciones molares de los metil glicósidos a y p de GlcA corresponden a la del CS, la del metil glicósido de IduA corresponde a la del DS, y la concentración molar de metil glicósido de GalN corresponde a la suma de las concentraciones de CS DS.

Ejemplo 5 - Construcción de un gráfico en donde se muestra la conductividad de la solución acuosa de CS/KS en función del volumen de 2-propanol requerido para obtener la purificación de CS/KS.

Se usa una muestra de CS/KS de origen marino, caracterizada por un contenido de CS del 78 % y un contenido de KS del 22 %; se preparan las siguientes soluciones (1 L) con concentraciones en el intervalo de 50-250 g/L, y se mide su valor de conductividad. Se añade 2-propanol a cada solución hasta que se separan en dos fases líquidas, dando un % de residuo seco de la fase densa que preferentemente cae en el intervalo ± 8 del % de CS en la mezcla CS/KS que forma el tema del proceso de purificación (para la muestra analizada, residuo seco de la fase densa entre 70 y 86 %). Tanto para la muestra de CS/KS como para el residuo seco de la fase densa, el contenido de agua residual se considera equivalente y se estima entre el 12-15 % en peso.

Se construyen dos gráficos que muestran los valores de conductividad de CS/KS o los valores de concentración respectivamente en función de los volúmenes de 2-propanol necesarios para obtener la separación de fases con estas características de la fase densa. Todos los puntos encontrados están alineados en una intersección de la ecuación y = -0,0053x 1,7227 (R2 = 0,9491) para la gráfica de los volúmenes de 2-propanol en función de la concentración de CS/KS y en una ecuación de intersección y = -2x 0,0593 (R2 = 0,9743) para la gráfica de los volúmenes de 2-propanol en función de la conductividad de la solución.

En el diseño de las condiciones de operación a nivel industrial para este tipo de CS/KS, una vez definido un valor de la conductividad impartida por CS/KS o la concentración de CS/KS, el volumen de 2-propanol que debe añadirse para obtener la separación en dos fases líquidas que conduce a un CS con una pureza> 95 % se define por tanto automáticamente. De manera similar, una vez establecido el volumen de 2-propanol a usar, puede establecerse de forma inequívoca la conductividad o la concentración que debe tener la solución de CS/KS. En proceso, si la solución a tratar tiene una concentración de CS/KS menor a la necesaria para alcanzar el valor de conductividad deseado, dicho valor se alcanza mediante la adición de NaCl u otras sales. La Tabla 4 muestra los datos experimentales. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4.

Tabla 4 - Purificación de CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) mediante el uso de 2-propanol como solvente or ánico.

Ejemplo 6 - Construcción de una gráfica en donde se muestra la conductividad de la solución acuosa de CS/KS en función del volumen de etanol requerido para obtener la purificación de CS/KS

Se usa una muestra de CS/KS de origen marino, caracterizada por un contenido de CS del 78 % y un contenido de KS del 22 %; se preparan soluciones (1 L) con concentraciones en el intervalo de 120-250 g/L, y se mide el valor de su conductividad. Se añade etanol a cada solución hasta que se separan en dos fases líquidas dando un % de residuo seco de la fase densa ± 8 % del % de CS en la mezcla CS/KS que constituye el objeto del proceso de purificación (para la muestra analizada, el residuo seco de la fase densa entre 70 y 86 %). Tanto para la muestra de CS/KS como para el residuo seco de la fase densa, el contenido de agua residual se considera equivalente y se estima entre el 12 y el 15 % en peso.

Se construyen dos gráficos que muestran los valores de conductividad o la concentración de CS/KS en función de los volúmenes de etanol necesarios para obtener la separación de fases con estas características de la fase densa. Todos los puntos encontrados están alineados en una intersección de la ecuación y = -0,0049x 2,344 (R2 = 0,9661) para la gráfica de los volúmenes de etanol en función de la concentración de CS/KS y en una intersección de la ecuación y = -0,0658x 3,0284 (R2 = 0,9885) para la gráfica de los volúmenes de etanol en función de la conductividad de la solución.

En el diseño de las condiciones de operación a nivel industrial para este tipo de CS/KS, una vez definido un valor de la conductividad impartida por CS/KS o la concentración de CS/KS, el volumen de etanol a añadir para obtener la separación de las dos fases líquidas que conduce a un CS con una pureza> 95 % se define automáticamente. De manera similar, una vez establecido el volumen de etanol a usar, puede establecerse de forma inequívoca la conductividad o la concentración que debe tener la solución de CS/KS. En proceso, si la solución a tratar tiene una concentración de CS/KS menor a la necesaria para alcanzar el valor de conductividad deseado, dicho valor se alcanza mediante la adición de NaCl u otras sales. La Tabla 5 muestra los datos experimentales. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4.

Tabla 5 - Purificación de CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) mediante el uso de etanol como solvente or ánico.

Ejemplo 7 - Purificación de CS/KS mediante el uso de diferentes mezclas de solventes

El CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) se purifica con diferentes solventes. Se añade NaCl a cinco muestras de 1 L de solución acuosa, cada una de las cuales contiene 120 g/L de CS/KS (conductividad 18,8 mS/cm), hasta que la conductividad final sea de 25,6 mS/cm (aproximadamente 87,5 mM NaCl) para los solventes indicados más abajo como AC y 37,1 mS/cm (aproximadamente 290 mM de NaCl) para los solventes D-E. Los siguientes solventes se añaden en secuencia con agitador vigoroso a las soluciones así preparadas: A) 2-propanol 0,75 L; B) 1-propanol 0,75 L; C) 2-propanol/2-butanol 1,00/0,25 en volumen 0,75 L; D) etanol 1 L; E) acetona.

Después de la adición del solvente orgánico, el sistema inicialmente homogéneo da lugar a una separación en dos fases líquidas en donde el CS se concentra selectivamente en la fase más densa, mientras que el KS se acumula en la fase ligera. El sistema bifásico se mantiene en agitador durante 18 h a temperatura ambiente y después se deja estratificar. Las dos fases se precipitan con agitador vigoroso añadiendo 2-3 volúmenes de etanol; el precipitado se seca al vacío para obtener CS y KS respectivamente en forma de polvos microcristalinos blancos. La Tabla 6 muestra los resultados experimentales. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4.

Como indican los datos de la Tabla 6, el proceso desarrollado depende de la naturaleza del solvente, pero la versatilidad del proceso siempre permite optimizar los parámetros de operación (concentración de CS/KS, naturaleza del solvente, fuerza iónica).

Tabla 6 - Purificación de CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) mediante el uso de diferentes mezclas de solventes

Ejemplo 8 - Efecto de la naturaleza química de la sal sobre la purificación de las muestras de CS/KS

El CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) se purifica mediante el uso de diferentes sales para alcanzar el valor crítico de conductividad. Se añade lo siguiente, respectivamente, a tres muestras de 1 L de solución acuosa que contienen 120 g/L de CS/KS (conductividad 18,8 mS/cm): A) NaCl, B) CaCl2, C) K2SO4 hasta que la conductividad final sea de 25,6 mS/cm. Se añaden 0,75 L de 2-propanol con agitador vigoroso a lastres soluciones así preparadas. Después de la adición del solvente orgánico, el sistema inicialmente homogéneo da lugar a una separación en dos fases líquidas en donde el CS se concentra selectivamente en la fase más densa, mientras que el KS se acumula en la fase ligera. El sistema bifásico se mantiene en agitador durante 18 h a temperatura ambiente y después se deja estratificar. Las dos fases se precipitan con agitador vigoroso añadiendo 2-3 volúmenes de etanol; el precipitado se seca al vacío para obtener CS y KS respectivamente en forma de polvos microcristalinos blancos. La Tabla 7 muestra los resultados experimentales. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4.

Tabla 7 - Purificación de CS/KS de ori en marino CS 784 % KS 216 % mediante el uso de diferentes sales.

Como lo indican los datos de la Tabla 7, el proceso desarrollado depende de la naturaleza de la sal usada para alcanzar la conductividad necesaria para obtener la separación en dos fases líquidas, pero la versatilidad del proceso siempre permite optimizar los parámetros de operación (concentración CS/KS, naturaleza del solvente, fuerza iónica).

Ejemplo 9 - Efecto del pH sobre la purificación de las muestras de CS/KS

Purificación de CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) a diferentes valores de pH. Se ajustan dos muestras de CS/KS (120 g/L) a pH 4,1 (19,6 mS/cm) y 8,1 (18,9 mS/cm), mediante el uso de soluciones acuosas 1 M de HCl y NaOH respectivamente. Se añade NaCl a las soluciones acuosas hasta que la conductividad final es de 25,6 mS/cm; después se añaden 0,75 L de 2-propanol con agitador vigoroso hasta que la solución se separa en dos fases líquidas. Tras la adición de solvente orgánico, el sistema inicialmente homogéneo da lugar a la formación de dos fases líquidas en donde el CS se concentra selectivamente en la fase más densa, mientras que el KS se acumula en la fase ligera. El sistema bifásico se mantiene en agitador durante 18 h a temperatura ambiente y después se deja estratificar. Las dos fases se precipitan con agitador vigoroso añadiendo 2-3 volúmenes de etanol; el precipitado se seca al vacío para obtener CS y KS en forma de polvos microcristalinos blancos. La Tabla 8 muestra los resultados experimentales. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4.

Como puede verse a partir de los datos de la Tabla 8, el proceso de purificación de CS/KS depende del pH de la solución, con resultados que son mejores en términos de rendimiento y pureza a valores de pH neutros. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4.

T l - P rifi i n K ri n m rin 4 K 21 if r n l r H

Ejemplo 10 - Efecto de la temperatura en el proceso de purificación de las muestras de CS/KS

Para verificar la criticidad de la temperatura en el proceso de purificación de CS/KS, se preparan dos muestras de CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) (120 g/L; 18,8 mS/cm) disueltas en 1 L de agua. Se añade NaCl a las dos soluciones hasta una conductividad final de 25,6 mS/cm. Operando a 4 y 25 °C, se añaden después 0,75 L de 2-propanol con agitador vigoroso. Después de la adición del solvente orgánico, el sistema inicialmente homogéneo da lugar a una separación en dos fases líquidas en donde el CS se concentra selectivamente en la fase más densa, mientras que el KS se acumula en la fase ligera. El sistema bifásico se mantiene en agitador durante 18 h a 4 y 25 °C respectivamente. Después se recogen las dos fases y se precipitan con agitador vigoroso añadiendo 2-3 volúmenes de etanol; los precipitados se secan al vacío para obtener CS y KS respectivamente en forma de polvos microcristalinos blancos. La Tabla 9 muestra los resultados experimentales. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4.

Como indican los datos de la Tabla 9, el proceso desarrollado depende marginalmente de la naturaleza de la temperatura, obteniéndose los mejores resultados en términos de pureza operando a 25 °C.

Tabla 9 - Purificación de CS/KS de ori en marino CS 784 % KS 216 % a diferentes tem eraturas

Ejemplo 11 - Efecto de la concentración de CS/KS en el proceso de purificación mediante el uso de etanol como solvente orgánico

Para evaluar los factores críticos de la concentración de CS/KS en el proceso de purificación, se preparan seis muestras de 1 L de CS/KS de la concentración que se muestra en la Tabla 10. Se añade NaCl a las muestras A-C para obtener una conductividad final que varía entre 38 y 40 mS/cm. Después se añade etanol a las soluciones, bajo fuerte agitador, en una cantidad suficiente para inducir la separación en dos fases líquidas en la solución agua-alcohol originalmente homogénea, con una concentración selectiva de CS en la fase densa y KS en la fase ligera. El sistema bifásico se mantiene en agitador durante 18 h a temperatura ambiente y después se deja estratificar. Se recogen las dos fases de cada muestra y se precipitan bajo fuerte agitador añadiendo 2-3 volúmenes de etanol y el precipitado se seca al vacío, obteniendo CS y KS respectivamente en forma de polvos microcristalinos blancos. La Tabla 10 muestra los resultados experimentales. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4. Como se verá a partir de los datos de la Tabla 10, la concentración juega un papel crítico, especialmente en lo que respecta al grado de pureza. Las concentraciones más bajas permiten obtener CS con una pureza> 96 %.

Tabla 10 - Purificación de CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) mediante el uso de diferentes concentraciones de CS/KS.

Ejemplo 12 - Efecto del tiempo de reequilibrio en el proceso de purificación de las muestras CS/KS

Para evaluar los factores críticos en el proceso de purificación de muestras de CS/KS en el tiempo de reequilibrio del sistema bifásico obtenido al mantener el sistema de dos fases separadas bajo agitador vigoroso, se preparan y se disuelven en 1 L de agua dos muestras de CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) (120 g/L; 18,8 mS/cm). Se añade NaCl a las dos soluciones hasta que la conductividad final sea de 25,6 mS/cm. Operando a 25 °C, se añaden después 0,75 L de 2-propanol con agitador vigoroso. Después de la adición del solvente orgánico, el sistema inicialmente homogéneo da lugar a una separación en dos fases líquidas en donde el CS se concentra selectivamente en la fase más densa, mientras que el KS se acumula en la fase ligera. El sistema bifásico se mantiene en agitadora 25 °C durante 1,5 y 18 h respectivamente. Después se recogen las dos fases y se precipitan con agitador vigoroso añadiendo 2-3 volúmenes de etanol; los precipitados se secan al vacío para obtener CS y KS respectivamente en forma de polvos microcristalinos blancos. Los resultados experimentales se informan en la Tabla 10. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizan como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4. Como emerge a partir de los datos de la Tabla 11, el proceso desarrollado depende modestamente del tiempo de reequilibrio de las dos fases, obteniéndose recuperaciones y pureza ligeramente mejores en tiempos más largos.

Tabla 11 - Purificación de CS/KS de origen marino (CS 78,4 %; KS 21,6 %) mediante el uso de diferentes tiempos de r ili ri l i m r l f r

Ejemplo 13 - Efecto de la fuente de extracción del CS/KS en el proceso de purificación

Para evaluar los factores críticos inherentes a la naturaleza de la muestra de CS/KS a purificar, se analizan tres muestras de origen marino y dos de origen porcino. Se prepararon soluciones de 1 L en agua de las cinco muestras (120 g/L; 18,8 mS/cm). Se añade NaCl a las soluciones hasta que la conductividad final es de 25,6 mS/cm. Operando a 25 °C, se añaden después 0,75 L de 2-propanol con agitador vigoroso. Después de la adición del solvente orgánico, el sistema inicialmente homogéneo da lugar a una separación en dos fases líquidas en donde el CS se concentra selectivamente en la fase más densa, mientras que el KS se acumula en la fase ligera. El sistema bifásico se mantiene en agitador durante 18 h. Después se recogen las dos fases de las diversas muestras y se precipitan con agitador vigoroso añadiendo 2-3 volúmenes de etanol; los precipitados se secan al vacío para obtener el CS y KS respectivamente en forma de polvos microcristalinos blancos. La Tabla 12 muestra los resultados experimentales. Las muestras de CS y KS obtenidas se analizaron como se indica en los ejemplos 1, 3 y 4.

T l 12 - P rifi i n K x r í r ir f n m rin r in

Los datos demuestran que el método reivindicado puede usarse independientemente del tipo de CS/KS empleado en el proceso de purificación. Obviamente, cuanto menos contaminado está el producto de partida por el KS, más puro será el CS final purificado, como se desprende a partir de los datos de pureza de las muestras de origen porcino, que ya son inicialmente más puras que las de origen marino.

Ejemplo 14 - Repurificación del CS a partir de la fase ligera

Para mejorar el grado de pureza obtenido, en particular cuando se usan concentraciones muy altas de CS/KS, la fase densa puede someterse directamente al proceso de purificación nuevamente. Primero se diluye con agua para obtener la concentración usada originalmente en el primer proceso de purificación, y después se repite todo el proceso.

Tabla 13 - Proceso de purificación de las muestras de CS/KS que implica una primera etapa de purificación mediante el uso de 2-propanol y una segunda etapa en donde la fase densa se diluye dos veces (aproximadamente 110 g/L) y se m n n i l i n i l rim r

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la separación de sulfato de condroitina (CS) y sulfato de queratán (KS) a partir de una solución acuosa que los contiene, que comprende la adición a la solución acuosa de un solvente orgánico miscible en agua en condiciones de fuerza iónica que induce la formación de dos fases líquidas, una fase densa en donde se concentra el CS y una fase ligera en donde se concentra el KS, y el porcentaje en volumen de cada solvente orgánico específico se determina mediante un gráfico que correlaciona dicho porcentaje con el valor de conductividad medido o con la concentración de la solución acuosa.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

a) la preparación de una solución acuosa de CS/KS y la determinación de su conductividad;

b) la adición opcional de una sal capaz de disociarse en iones monovalentes o polivalentes a un valor de conductividad preestablecido;

c) la adición gradual de una cantidad de uno o más solventes orgánicos miscibles en agua para inducir una separación de fases con la concentración de CS en la fase densa y de KS en la fase ligera.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en donde los solventes orgánicos miscibles en agua se seleccionan a partir de metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, acetona, acetonitrilo o mezclas de estos.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3 en donde el solvente orgánico es etanol o 2-propanol.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en donde la sal opcionalmente añadida es cloruro de sodio.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la fase densa que contiene el CS se somete a un proceso de purificación adicional.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6 en donde la fase densa se diluye con agua, posteriormente se añade solvente orgánico hasta la reformación de dos fases líquidas: una fase densa en donde se concentra el CS y una fase ligera en donde se concentra el KS.

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 en donde el CS y KS se recuperan respectivamente a partir de las dos fases líquidas al precipitar el CS con dos volúmenes de etanol y secar el precipitado, y precipitar el KS al añadir cloruro de sodio y secar el precipitado.