RU2693262C2 - Способ очистки хондроитин сульфата - Google Patents
Способ очистки хондроитин сульфата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2693262C2 RU2693262C2 RU2016137266A RU2016137266A RU2693262C2 RU 2693262 C2 RU2693262 C2 RU 2693262C2 RU 2016137266 A RU2016137266 A RU 2016137266A RU 2016137266 A RU2016137266 A RU 2016137266A RU 2693262 C2 RU2693262 C2 RU 2693262C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cholesterol
- phase
- organic solvent
- conductivity
- ethanol
- Prior art date
Links
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 title claims abstract description 177
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 66
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 53
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 17
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 220
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 169
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 167
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 111
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 17
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 16
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 15
- -1 CS contaminated cholesterol Chemical class 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 9
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 6
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 6
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 5
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 5
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 4
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 4
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N D-glucaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 2
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N l-iduronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241001146155 Emilia Species 0.000 description 1
- 235000002139 Emilia sonchifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 1
- 102000004896 Sulfotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090001033 Sulfotransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940124347 antiarthritic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108010009355 microbial metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000001374 small-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0066—Isolation or extraction of proteoglycans from organs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности. Способ очистки хондроитин сульфата (ХС) от кератан сульфата (КС) предусматривает получение водного раствора, содержащего ХС и КС, смешивание полученного водного раствора с органическим растворителем при условиях ионной силы, вызывающей образование плотной фазы, в которой концентрируется ХС, и легкой фазы, в которой концентрируется КС. Количество органического растворителя выбирают таким образом, что его введение приводит к образованию двух жидких фаз, плотной и легкой, а затем извлекают ХС из плотной фазы и КС из легкой фазы путем осаждения, при этом ХС осаждают с помощью этанола, а КС - путем добавления хлорида натрия. Изобретение позволяет улучшить степень очистки и более полно осуществить отделение хондроитин сульфата от кератан сульфата. 7 з.п. ф-лы, 13 табл., 14 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к промышленному способу очистки полученного из хрящей животных хондроитин сульфата (ХС), который предоставляет собой продукт, полностью соответствующий технологическим требованиям для использования указанного соединения в фармацевтической области. В частности, разработанный способ обеспечивает устранение кератана, гликозаминогликана, который, как показано с помощью современных технологий анализа, присутствует во всех препаратах ХС, полученных путем различных способов экстракции из различных типов животных источников.
Определения
Гликозаминогликаны (ГАГ) означают сложное семейство полисахаридов, которые являются основными составляющими внеклеточного матрикса соединительной ткани.
Термин [4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] означает дисахарид, образованный D-глюкороновой кислотой (D-GlcA) и N-ацетил-D-галактозамином (D-GalNAc), связанных β-гликозидной связью (1-3).
Термин [4)-α-L-IduA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] означает дисахарид, образованный L-идуроновой кислотой (L-IduA) и N-ацетил-D-галактозамином (D-GalNAc), связанных β-гликозидной связью (1-3).
Термин хондроитин сульфат (ХС) означает различным образом сульфатированные гликозаминогликаны различной молекулярной массы, которые присутствуют в различных животных тканях. Сахаридная главная цепь ХС состоит из дисахаридных звеньев [4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→], одно за другим связанными β-гликозидными связями (1→4). Сокращение ХС относится как к кислой форме, так и к образованной солью форме указанных полисахаридов.
Сокращение ХС-типА означает ХС, отличающийся преобладанием звеньев дисахарида типа ХС-А, [4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc4SO3 --(1→].
Термин хондроитин/дерматан сульфат, сокращенно ХС/ДС, так же известный как ХС-типВ (не надо смешивать со структурным вариантом дисахарида СХ-В) означает различным образом сульфатированные гликозаминогликаны различной молекулярной массы, которые присутствуют в различных животных тканях, в которых сахаридная главная цепь состоит из различного количества дисахаридных звеньев [4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] и [4-α-L-IduA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→], связанных β-(1→4) гликозидными связями. Сокращение ХС или ХС-типВ относится как к кислой форме, так и к образованной солью форме указанных полисахаридов.
Сокращение ХС-типС означает ХС, отличающийся преобладанием звеньев дисахарида типа ХС-С, [4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc6SO3 --(1→].
Термин кератан сульфат (КС) означает различным образом сульфатированные гликозаминогликаны различной молекулярной массы, которые присутствуют в различных тканях животных и рыб. Сахаридная главная цепь КС состоит из дисахаридных звеньев [3)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→]. Сокращение КС относится как к кислой форме, так и к образованной солью форме этих полисахаридов.
Сокращение ХС/КС означает загрязненные КС продукты ХС, продающиеся в настоящее время на рынке.
Уровень техники
Хондроитин сульфат (ХС) является гликозаминогликаном, состоящим из повторяющихся дисахаридных звеньев [4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→], связанных друг с другом β-гликозидными связями (1→4). Когда некоторые звенья -β-D-GlcA замещены на полисахаридной цепи -α-L-IduA-, используют термин ХС-типВ (не смешивать со структурным вариантом дисахарида ХС-В), также называемый дерматан сульфатом (сокращенно ХС/ДС).
В зависимости от центров сульфатирования, существуют различные типы структурных дисахаридов хондроитинов/дерматанов.
In vivo различные типы ХС в течение полимеризации сульфатируются конкретными сульфотрансферазами и затем, ковалентно связанные с конкретными белками, выделяются во внеклеточный матрикс в виде протеогликанов. Они являются универсальными составляющими различных соединительных тканей, таких как хрящи, кожа, кровеносные сосуды и кости (Abu K. & Seno N., The Basic of Carbohydrate Chemistry, 1993, 142-177, Japan: Kodansha).
ХС в изобилии распределяется в живых организмах, в которых он играет центральную роль в биологических процессах. В частности, ХС действует как регулятор факторов роста, цитокинов, хемокинов, адгезивных молекул и липопротеинов посредством взаимодействий с лигандами указанных белков посредством специальных сахаридных областей (Malavaki С., et al., Connect Tissue Res., 2008, 49, 133-139).
В таблице 1 показаны структурные параметры основных типов ХС, очищенных различными организмами. В частности, параметры молекулярной массы достаточно похожи для ХС из животных источников (бык, свинья, цыплята), однако сильно отличаются от ХС морского происхождения (акула, скат, кальмар), причем последний имеет большую молекулярную массу, чем первый. Образцы ХС морского происхождения также имеют плотность заряда более 1 из-за присутствия дисульфатированных дисахаридов, в то время как образцы ХС животного происхождения (бычьи, свиные, из цыплят) имеют плотность заряда менее 1.
Принимая во внимание эти разнообразные функции, ХС использовали в фармацевтических, нутрицевтических и косметических продуктах (Коgа Т., New Food Industry, 1989, 31, 4-7; Park D.С. & Kim S.В., Fisheries Research, 1998, 12, 30-39; Cho S.Y., et al., Food Hydrocolloids, 2004, 18, 573-579; Cho S.Y., et al., Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2004, 27, 47-51; Takuo N., et al., Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture, 2010, 2, 61-74).
ХС в настоящее время является активным ингредиентом множества противоартритных лекарств. ХС вносит значительный вклад в определение биомеханических свойств хряща, так как он смазывает суставы и обеспечивает механическую стойкость к сдавливающим напряжениям.
В последнее время было описано множество потенциальных фармацевтических применений ХС, частично зависящих от типа сульфатирования (Hiraoka et al., Glycobiology, 2001, 11(6), 495-594; Malavaki С., et al., Connect Tissue Res., 2008, 49, 133-139, Lauder R.M., Complement Ther. Med., 2009, 17, 56-62).
Недавние исследования показали, что ХС играет важную роль в развитии размеров опухоли и образовании метастазов. В опухолевых клетках, в частности, были обнаружены изменения длины цепи и положений сульфатирования молекулы ХС (Smetsers et al., J. Invest. Dermatol., 2004, 122(3), 701-716). Это позволяет использовать ХС в качестве биомаркера для ранней диагностики опухолей яичников (Pothacharoen et al., J. Cell Sci., 2006, 113, 193-205).
Эти характеристики на многие годы сделали ХС важными фармакологическими средствами, увеличивая интерес к их получению, которое в настоящее время основано на технологиях, включающих извлечение из различных тканей животных. В частности, ХС извлекают из хряща акулы, бычьей трахеи и некоторых побочных продуктов забоя свиней. Из-за требуемой высокой степени очистки этот способ является очень сложным и затратным, включая использование ферментов, антибиотиков и значительных объемов органических растворителей. Обработка также страдает от значительных эксплуатационных затруднений, связанных с неприятным запахом при обработке и получением сильно загрязняющих сточных вод, более того, использование тканей животных в качестве сырьевого материала в способе извлечения может привести к передаче вирусных и прионовых инфекций между видами (Schiraldi et al., 2010).
Получение ХС из хрящевых материалов животного происхождения подробно описывают в научной и патентной литературе. Все способы обычно включают следующие стадии: гомогенизация хряща, химическое разложение (щелочной гидролиз) и/или ферментативное разложение (трипсин, папаин, Alcalase и Neutrase, изготовленные Novozyme) протеогликанового матрикса для отделения белкового компонента от углеводного компонента, фильтрация для удаления нерастворимых остатков, множество способов осаждения с помощью растворителей, обычно этанола, для очистки/извлечения представляющих интерес полисахаридов, хроматографическое разделение с помощью ионообменных смол, обесцвечивание с помощью активированного угля, сушка и измельчение высушенного продукта, упаковка.
Использование ХС в качестве медикамента и нутрицевтика связано с конкретными критериями чистоты для сырьевого материала, определенных относительно похожими способами регулирующими органами различных стран. В настоящее время, согласно Фармакопеям США и ЕС, стандартным испытанием для определения содержания ХС является способ фотометрического титрования, проводимый с бромидом гексадецилтриметиламмония в качестве титрирующего раствора. Способ титрования показывает линейную зависимость между 0,5 и 7,5 мг стандарта ХС (Sigma), однако было показано, что в присутствии других ГАГ или нуклеиновых кислот существуют кривые титрования с завышенными точками эквивалентности (http://siqa.ufjf.br/Reeport Laboratorio de Analise de Glicoconjugados - UFJF). Эти результаты указывают, что способ титрования имеет низкую специфичность, потому что он может завышать количественную оценку ХС в присутствии других анионных соединений. Другие способы, указанные Фармакопеям США и ЕС, включают инфракрасную спектроскопию, определение удельного вращения плоскости поляризации и электрофорез на ацетате целлюлозы, причем все эти способы, как указано ниже, сейчас показывают их значительные ограничения при определении степени чистоты препаратов на основе ГАГ.
В последние несколько лет большой научный интерес к ГАГ и их возможным применениям, развитию новых и более усложненных подходов к определению характеристик этих полисахаридов и развитию новых стратегий для разделения различных типов ГАГ (Pomin V.Н. et al., Carbohydrate Polymers, 2012, 90, 839-846) продемонстрировал, что способы анализа, первоначально использованные регулирующими органами для определения чистоты промышленных препаратов ХС, предназначенных для фармацевтического и нутрицевтического применения, являются ненадлежащими, и что даже эталонные образцы, предложенные Фармакопеями США и ЕС, не являются чистыми, и значительно загрязнены кератан сульфатом (КС), смесью различным образом сульфатированных гликозаминогликанов с различными молекулярными массами, структура которых основана на дисахаридных звеньях [3)-β-D-Gal-(1→4)-(3-D-GlcNAc-(1→], связанных друг с другом 6-гликозидными связями (1→3).
Pomin V.Н. et al. (Carbohydrate Polymers, 2012, 90, 839-846) проанализировали 17 промышленных порций ХС для орального применения, 3 из которых были получены из бычьего хряща и 14 из хряща рыб, и стандартные образцы, указанные в качестве сравнительных продуктов Фармакопеями США и ЕС. Методологии анализа, принятые этими авторами, представляли собой электрофорез агарозного геля, ВЭЖХ на сильных анионообменных смолах (САО) и гельфильтрационных смолах (эксклюзионная хроматография, ЭксХ), перевариваемость с конкретными ГАГ лиазами, установленные уровни уроновой кислоты, одномерный и двумерный ЯМР. В частности, авторы (таблица 3) обнаружили, что в среднем КС представляет примерно 16% от всех ГАГ, обнаруженных в составах, полученных из хряща акулы, и получили похожие сведения со стандартом Фармакопеи ЕС, также полученным из хряща акулы.
Как показано в таблице 3, большое количество КС присутствует в ХС морского происхождения, что приводит к значительному уменьшению содержания ХС по сравнению с указанным количеством и означает, что данный продукт является несовместимым с применением, особенно в качестве медикамента, который требует высоких степеней чистоты (Volpi N., J. Pharm. Sci., 2007, 96, 3168-3180).
Pomin et al. показали, что разработанный ими электрофорез агарозного геля, аналогично электрофорезу ацетата целлюлозы, рекомендованному Фармакопеями США и ЕС, не способен показать загрязнение КС, потому что этот ГАГ совместно мигрирует с ХС. Более того, эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография, Экс-ВЭЖХ, неспособна показать присутствие КС в составах ХС, в то время как сильно анионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография, САО-ВЭЖХ, оказалась наиболее соответствующим способом для определения загрязнений КС, так как ХС и КС имеют достаточно различные времена элюирования, но не настолько различные, чтобы препятствовать частичному перекрыванию пиков, что может вызвать неправильные количественные оценки загрязнения. Достаточно диагностическим, но не количественным, способом определения присутствия КС в составах ХС является одномерный 1Н-ЯМР, как указано с помощью изолированных групп с хорошим разрешением сигналов при 4,68 и 4,37-4,30 частей на млн., характерных для КС (Limtiaco J. et al., 2012, Analytical Methods, 4, 1168-1172, Pomin V.H. et al., 2010, Analytical Chemistry, 82, 4078-4088, Rudd T.R. et al., 2011, The Analyst, 136, 1390-1398, Zhang T. et al., 2009, J. Pharmaceutical Science, 98, 4017-4026).
Доли были получены из интегралов профилей ВЭЖХ-САО (Pomin V.Н. et al., Carbohydrate Polymers, 2012, 90, 839-846).
На основе обнаруженных данных по загрязнению КС Pomin et al. указывают на необходимость пересмотра методологий, указанных Фармакопеями США и ЕС, для обеспечения более правильного определения количества биологически активного ингредиента, присутствующего в промышленных составах ХС.
Разработка новых способов анализа, способных определять загрязнение КС, очевидно требует существенного обзора способов получения ХС для уменьшения уровней загрязнения КС до пределов, совместимых с применением ХС в качестве медикамента и нутрицевтика.
Galeotti F. et al. (Analytical Biochem., 2013, YABIO 11579 26.12.13) определяют условия селективного осаждения ХС и КС из промышленных препаратов ХС/КС, полученных из хряща акулы, путем постепенного добавления этанола, насыщенного ацетатом натрия, в раствор, содержащий 33 мг/мл ХС/КС. Осаждение только хондроитина завершается с 1 объемом этанола. В том же исследовании авторы утверждают, что осаждение метанолом, пропанолом или ацетоном не обеспечивает селективного удаления КС. Ранее та же группа (Volpi N., J. Chromatography В, 1996, 685, 27-34) при описании осаждения 110 мг/мл смесей гликозаминогликанов с этанолом в присутствии 2% NaCl указывала, что полное осаждение ХС получают только при 1,2-1,6 объемов.
Все современные способы промышленного получения ХС основаны на критериях чистоты продукта, несоответствующих демонстрированию загрязнения КС. В ближайшее время, как только регулирующие органы, которые уже в курсе рассматриваемого вопроса, принявшие стандарты и способы определения характеристик, учтут новые возможности анализа, это сделает все продукты ХС, продаваемые сейчас на рынке, неподходящими для фармацевтического применения и подлежащими сильному титрованию для применения при получении нутрицевтиков и косметических средств.
Таким образом, несмотря на большое количество способов экстракции/очистки, разработанных до сих пор, в настоящее время проводят промышленное исследование новых способов, в которых получают ХС, особенно в отношении фармацевтического сорта, которые отвечают новым стандартам чистоты, в соответствии с которыми регулирующие органы устанавливают технические требования для ХС, особенно в связи с загрязнением КС, которые еще не включены в способы анализа современными Фармакопеями.
В этом контексте существующая в настоящее время разработка простого способа очистки, применимого в различных продуктах ХС, загрязненных КС (ХС/КС), представляется важной и актуальной промышленной целью.
Описание изобретения
Разработка более надлежащих методологий исследования показывает, что масштаб проблемы загрязнения КС препаратов ХС, продающихся в настоящее время на рынке, является даже еще большим и более широко распространенным, чем сообщали Pomin et al. (Carbohydrate Polymers, 2012, 90, 839-846), оказывая влияние не только на ХС продукты, полученные из сырьевых материалов морского происхождения, но также, хотя и в меньшей степени, на те, которые получены из других животных источников (крупный рогатый скот, свиньи, птица и т.п.).
Обнаружен способ, который при ограниченной стоимости и с уже существующими типами механического оборудования, исходя из существующих в настоящее время на рынке способов получений ХС/КС, обеспечивает удаление КС путем конечной обработки или целевых модификаций способов, разработанных в настоящее время на промышленном уровне, таким образом, возвращая технические требования к продукту ХС к значениям, которые в ближайшее время будут требоваться на международном уровне регулирующими органами, особенно для ХС фармацевтического сорта.
Данный способ, который совершенно отличен от современных технологий фракционного осаждения с помощью растворителя, отличается значительной эксплуатационной гибкостью и, будучи разработанным, является простым и не обладает значительными трудностями при увеличении масштаба производства до промышленного. Способ отличается следующими стадиями: 1) получение раствора ХС/КС в воде и измерение его проводимости, 2) добавление соли до тех пор, пока проводимость не достигнет критического значения, заданного в способе, при этом соль не добавляют, если присутствие только лишь ХС/КС уже гарантирует указанное значение на начальном этапе, 3) постепенное добавление к этому водному раствору расчетного количества органической фазы, состоящей из одного или более растворителей, смешиваемых друг с другом и с количеством воды, указанным на стадии 1, когда добавление органического растворителя завершено, изначально однофазная система становится двухфазной с концентрацией ХС в плотной фазе и концентрацией КС в легкой фазе, 4) извлечение путем осаждения 2-3 объемами этанола ХС из более плотной фазы и КС из менее плотной фазы.
Систематический подход для определения оптимальных условий очистки на промышленном уровне включает, для определенного типа ХС/КС («такой же тип» означает, что различия между уровнями загрязнения хондроитин сульфата кератан сульфатом должны попадать в интервал, не превышающий 2-3%) и для данного органического растворителя, построение диаграммы, на которой проводимость или концентрация водного раствора, содержащего ХС/КС и любые добавленные соли, показана в зависимости от количества органической фазы, требуемой чтобы вызвать образование двух жидких фаз, подходящих для способа очистки. Когда тип ХС/КС и природа выбранного органического растворителя установлены, таким образом возможно определить из построенного графика для данного типа органического растворителя пару значений (проводимость водного раствора и количество органического растворителя), которые приводят к образованию двух жидких фаз, образующих основу способа очистки. Значения, находящиеся ниже указанных параметров (более низкие значения проводимости или меньшее количество растворителя), приводят к низким извлечениям или отсутствию фазового разделения, при этом более высокие значения проводимости или большее количество органического растворителя превращает как ХС, так и КС в плотную фазу, вызывая потерю эффективности способа очистки.
Когда установлена концентрация ХС/КС, при которой требуется проводить способ очистки, определяют количество добавляемой соли (если она присутствует) для доведения проводимости до критического значения, которое вызывает образование двух жидких фаз.
Когда выбран тип используемого органического растворителя и экспериментально определены рабочие условия с помощью построения графика проводимости водного раствора, содержащего ХС/КС, в соответствии с количеством органической фазы, требуемой чтобы вызвать разделения двух жидких фаз, образующих основу способа очистки, его можно выполнить различными способами согласно промышленным возможностям.
Способ А). Когда установлены тип и количество используемого органического растворителя, значение проводимости, которое должен иметь водный раствор, можно найти на графике. Если этого значения достигают с помощью только лишь присутствия ХС/КС в растворе, органическую фазу добавляют в водную фазу при перемешивании. Изначально всегда существует однофазная система и только после добавления органического растворителя наблюдается образование двух жидких фаз, которое определяет разделение ХС в плотную фазу и КС в легкую фазу. Если критическое значение проводимости жидкой фазы не достигается только лишь присутствием ХС/КС в растворе, добавляют соль до тех пор, пока не достигнут требуемой проводимости, и затем добавляют органический растворитель, как описано ранее.
Способ В). Когда установлено значение проводимости водного раствора, содержащего ХС/КС и любые добавленные соли, количество используемого растворителя находят на графике и растворитель добавляют в водный раствор так, как описано для способа А).
Примерами органических растворителей, которые можно использовать в способе очистки ХС/КС по изобретению, являются метанол, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол, ацетон, ацетонитрил и их смеси.
Способ по изобретению не только обеспечивает ХС с характеристиками, отвечающими наиболее строгим правилам, которые скоро введут регулирующие органы, но также обеспечивает большое количество КС - продукта, который до сих пор не был доступен на рынке, но для которого можно предположить важные применения, особенно в области офтальмологии (US 5141928, US 6159954) и в качестве соединения с иммуногенностью, до сих пор показанной in vitro (Meller et al., Clin. Chim. Acta, 1995, 236, 195-204, Nakano Т., Carbohydr. Polym., 2014, 99, 547-552).
В заявленных способах разделения получают извлечения, близкие к теоретическим значениям, и чистотой >98%.
Способ очистки ХС/КС предпочтительно выполняют при нейтральном рН, при котором получают наилучшие результаты в показателях как выхода, так и чистоты.
Время, когда две фазы поддерживают при перемешивании для обеспечения оптимального перераспределения двух растворов КС в легкой фазе и ХС в плотной фазе, не является критичным. Выходы и степень чистоты немного изменяются, если указанное время составляет только 1,5 часа или 18 часов.
Аналогично, температура, при которой выполняют способ, не является очень критичной, его можно проводить в широком интервале температур (например, от 4 до 25°С) без какого-либо существенного влияния на выходы или чистоту.
Заявленный способ очистки применим к ХС/КС, полученным различными способами и с использованием хрящей из различных источников.
Действуя при особенно высоких концентрациях ХС/КС, лучшие очистки можно получить путем повторного подвергания плотной фазы следующему идентичному циклу очистки, после разбавления ее до концентрации первоначально обрабатываемого образца.
Неожиданно было обнаружено, что в способе очистки ХС/КС параллельно с отделением ХС от КС также значительно уменьшается содержание пирогена.
Заявитель заявленного способа впервые получил чистые стандарты ХС и КС, предпосылку для применения новых технических характеристик продукта, которые регулирующие органы подготавливают к выпуску.
В следующих примерах изобретение описано более подробно.
Пример 1. ЖЭХБ (жидкостная экспресс-хроматография белков) анализ образцов ХС/КС, ХС и КС
Аналитическая подготовительная методология хроматографии позволяет разделять образцы ХС/КС в масштабе сотых частей мг, делая доступными образцы с чистотой, превышающей 99%, в настоящее время не присутствующие на рынке, и подходящие в качестве стандартов для всех процессов валидации, которые регулирующие органы вероятно установят в ближайшем будущем. Приготовленные стандарты используют для всех используемых калибровок способов анализа для характеристики чистоты ХС и КС, описанных ниже.
В способе используют колонку HiLoad Q sepharose 26/10 HP GE Healthcare с сильным анионообменным фильтром, смонтированную на хроматографе Akta Explorer 100 Amersham (GE Healthcare), оборудованном детектором УФ/видимая область спектра. Линейный градиент двух буферных растворов используют в качестве системы элюента: буферный раствор А - 20 мМ ацетата натрия, рН 7,4, 0,5 М NaCl, буферный раствор В - 20 мМ ацетата натрия, рН 7,4, 3,0 М NaCl. Условиями для оптимального разделения ХС и КС являются: линейный градиент 0 - 100% B в А за 106 минут, расход 2 мл/мин, регистрация УФ 215 нм. Анализировали 300 мг образцы, растворенные в 5 мл буферного раствора А. При описанных условиях анализа время элюирования не удерживаемого анализируемого вещества составляет 50 мин, для ХС 193 мин и для КС 268 мин.
Используя образец ХС/КС морского происхождения, получают стандарты ХС и КС со степенью чистоты >99%, извлекая элюаты, соответствующие двум пикам ХС и КС, которые подвергают ультрафильтрации через мембраны с отсечкой при 3 кДа для удаления солей и лиофилизатов. Полученные таким образом образцы характеризуются тем, что указано в примерах 2-4 ниже.
Пример 2. Определение характеристик ХС и КС с помощью ЭксХ-ТДМ (эксклюзионная хроматография - тройная детекторная матрица)
Определение характеристик в показателях молекулярной массы, молекулярно-массового распределения, полидисперсности и характеристической вязкости промышленных ХС/КС продуктов и ХС и КС стандартов, полученных как описано в примере 1, проводили с помощью гельфильтрационного хроматографа (Viscotec, LabService Analytica, Italy), состоящего из двух модулей, и специально предназначенного управляющего программного обеспечения:
модуль GPCmax VE 2001 является объединенной системой, состоящей из специального насоса для эксклюзионной хроматографии (ЭксХ) (изократический насос, способный обеспечить постоянный, без пульсаций поток растворителя), дегазатора растворителя в режиме реального времени и автоматического дозатора,
модуль TDA302 (тройная детекторная матрица) является объединенной системой, образованной печью, термостатированной для колонки и тройного детектора, состоящего из детектора показателя преломления (ПП), вискозиметра (ВМ) с 4-мя капиллярными мостиками и детектора рассеяния света (PC), который, в свою очередь, состоит из двух частей, детектора прямоугольного рассеяния света (ДПРС), отличающегося превосходным отношением сигнала к шуму, и нового детектора рассеяния света под малым углом (РСМУ),
OmniSECTM является программным обеспечением GPCmax и TDA (операционная среда Windows), которое обеспечивает определение характеристик полимерного раствора в показателях концентрации, средней абсолютной молекулярной массы, показателя полидисперсности, молекулярного размера (гидродинамический и вращательный радиус) и характеристической вязкости полимера. Отношение dn/dc (отношение бесконечно малого изменения интенсивности сигнала, измеренного с помощью детектора показателя преломления, к бесконечно малому изменению концентрации анализируемого вещества) составляет 0,1466 мл/г для ХС и 0,1000 мл/г для КС (Swann D.A. et al., J. Biological Chemistry, 1984, 259, 12, 7693-7700).
Хроматографические колонки: хроматографическая система Viscotec оборудована предварительной колонкой TSK-gel CMPWXL (Tosoh Bioscience, Cat. No. 08033, 6,0×4,0 см, средний размер частиц 12 мкм) и 2-мя колонками TSK-gel CMPWXL, расположенными последовательно (Tosoh Bioscience, Italy, Cat. No. 8-08025, материал на основе гидроксилированного полиметакрилата, размер пор 100-1000 , средний размер частиц 13 мкм, 7,8×30,0 см).
Колонка вискозиметра: предварительная колонка TOSOH08033 и колонка TOSOH08025, обе проданные Viscotek - LabService Analytica S.r.l., Via Emilia, 51/c, 40011, Anzola Emilia (BO, Italy).
Хроматографическими условиями, используемыми для аналитического определения характеристик образцов ХС и КС, являются: подвижная фаза 0,1 М NaNO3, температура 40°С, расход 0,6 мл/мин, продолжительность 50 мин.
Пример 3. Определение характеристик ХС/КС, ХС и КС с помощью кислотного гидролиза и ВЭЖХ - Dionex анализа моносахаридов
Для оценки состава промышленных продуктов ХС/КС и степени чистоты ХС и КС, полученных как описано в примере 1, был разработан аналитический протокол, основанный на кислотном гидролизе образца и хроматографическом анализе моносахаридов, составляющих дисахаридные звенья одиночной цепи гликозаминогликанов: ацетилированного галактозамина (GalNAc) и глюкороновой кислоты (GlcA) для ХС и глюкозамина (GlcN) и галактозы (Gal) для КС.
Предварительные испытания со стандартами указанных сахаров показывают, что в течение гидролиза данные аминосахара частично деацетилируются, каждый образуя два различных пика, при этом GlcA и Gal соответственно образуют один и три пика.
Аналитический протокол в целом обеспечивает гидролиз образца с эффективностью 95-100% и, соответственно, получение эквимолярного определения концентрации двух моносахаридов, составляющих дисахаридные звенья цепей ХС и КС. На основе мольных концентраций составляющих сахаров можно определить процентную массовую долю ХС и КС, присутствующих в образцах, исключая содержание воды, учитывая различные значения средних молекулярных масс дисахаридных звеньев, в соответствии с тканью животного происхождения и воздействием степени сульфатирования и натрификации (sodiation) отдельных молекул.
Кислотный гидролиз
Образцы ХС/КС, ХС и КС подвергают кислому гидролизу. В стандартной процедуре 50 мг образца растворяют в 0,5 мл 1М HCl, приготовленного с водой, очищенной с помощью ионообменной смолы (MQ water). Гидролиз проводят при 100°С в течение 18 часов при перемешивании, образцы затем нейтрализуют 5М NaOH и анализируют с помощью анионообменной хроматографии.
ВЭЖХ анализ моносахаридов с помощью ионообменной хроматографии
Продукты гидролиза анализируют с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (ВЭАОХ-ИАД), используя ионный хроматограф (ICS 3000, Dionex, Italy) с автоматическим дозатором и двойным насосом, оборудованным колонкой Carbopac РА 1 (4×287,5 мМ, Dionex, Italy) и предварительной колонкой. Хроматографическое разделение продолжается в течение 41 мин (0-12 мин от 1 до 4 мМ NaOH, 12-14 мин 4 мМ NaOH, 14-16 мин от 4 до 100 мМ NaOH, 16-30 мин 100 мМ NaOH, 30-39 мин 100-1 мМ NaOH, 30-41 мин 1 мМ NaOH).
Калибровку ХС и КС проводят с помощью очищенных стандартов для ЖЭХБ, содержащих остаточное загрязнение хондроитин сульфата кератан сульфатом и кератан сульфата хондроитин сульфатом ≤2%, которые гидролизуют так, как описано ранее.
В случае КС калибровочные отрезки, отсекаемые на оси, получают путем вычерчивания суммы областей пиков GlcN и Gal и их производных в зависимости от известного количества гидролизованного стандарта КС, при этом в случае ХС калибровочный отрезок, отсекаемый на оси, получают путем вычерчивания суммы областей пиков GalNAc и GlcA и их производных в зависимости от известного количества стандарта ХС.
Концентрацию (г/л) КС в образцах определяют путем добавления областей репрезентативных пиков для GlcN и Gal и их производных и вычисления концентрации по сравнению с отсекаемым на оси калибровочным отрезком гидролизованного стандарта КС, при этом концентрацию (г/л) ХС в образцах определяют путем добавления областей репрезентативных пиков для GalNAc и GlcA и их производных и вычисления концентрации по сравнению с отсекаемым на оси калибровочным отрезком гидролизованного стандарта ХС. Окончательно процентные доли КС и ХС обнаруживают путем вычисления отношений полученных концентраций к общей сумме процентных концентраций.
Пример 4. Определение характеристик ХС/КС, ХС и КС с помощью метанолиза ГАГ, ацетилирования метил гликозидов и ГХ-МС анализа полученных ацетилированных метил гликозидов
Для оценки состава промышленных продуктов ХС/КС и степени чистоты ХС и КС, полученных как описано в примере 1, был разработан аналитический протокол, включающий метанолиз ГАГ с помощью HCl, ацетилирование полученных метил гликозидов и их анализ с помощью ГХ-МС (газовой хроматографии - масс-спектрометрии). В стандартной процедуре 10 мг образцов подвергают метанолизу (1 мл MeOH/HCl 1.25М, 80°С, 20 часов) и полученные метил гликозиды ацетилируют ангидридом уксусной кислоты (50 мкл) и пиридином (50 мкл) при 100°С в течение 30 минут. Ацетилированные образцы метил гликозидов анализируют с помощью ГХ-МС (Agilent Technologies, GC 6850°, MS 5973N) на капиллярной колонке (Zebron ZB-5, Phenomenex, 30 м × 0,25 мм внутренний диаметр), используя расход 1 мл/мин гелия (газ-носитель) со следующей температурной программой: 150°С в течение 3 минут, 150°С → 240°С при 3°С/мин. Условиями МС детектирования являются: электронный источник ионизации при 70 эВ, квадрупольный анализатор, интервал сбора и обработки данных 40-450 Да.
Метанолиз определяет: полную деполимеризацию путем разрыва гликозидных связей, образование соответствующих метил гликозидов (в случае GlcA образуются как α, так и β метил гликозид), деацетилирование GalNAc и GlcNAc, удаление всех сульфатных групп.
Реакционные смеси анализируют с помощью ГХ-МС. Сахара определяют путем сравнения времени задержки и фрагментации ими известных стандартов.
Процентный молярный состав ХС, КС и ДС в образце вычисляют из отношения областей, лежащих под пиками, соответствующими одиночным метил гликозидам, нормализованными относительно аналитического сигнала стандартных образцов метил гликозидов. Таким образом, при правильном анализе мольные концентрации Gal и GlcN метил гликозидов равны и соответствуют мольной концентрации КС, сумма мольных концентраций GlcA метил гликозидов α и β соответствует мольной концентрации ХС, мольная концентрация IduA метил гликозида соответствует мольной концентрации ДС и мольная концентрация GalN метил гликозида соответствует сумме концентраций ХС + ДС.
Пример 5. Построение графика, на котором показана проводимость водного раствора ХС/КС в зависимости от объема 2-пропанола, требуемого для получения очистки ХС/КС
Используют образец ХС/КС морского происхождения, отличающийся содержанием ХС 78% и содержанием КС 22%, приготавливают следующие растворы (1 л) с концентрациями в интервале 50-250 г/л и измеряют их значение проводимости. 2-пропанол добавляют к каждому раствору до тех пор, пока они не разделяться на две жидкие фазы, давая % сухого остатка плотной фазы, который предпочтительно попадает в интервал ±8% от % ХС в смеси ХС/КС, образуя объект способа очистки (для анализируемого образца сухой остаток плотной фазы составляет от 70 до 86%). Как для образца ХС/КС, так и для сухого остатка плотной фазы содержание остаточной воды считают эквивалентным и оценивают в 12-15 масс. %.
Строят два графика, показывающих значения проводимости ХС/КС или значения концентрации, соответственно, в зависимости от объемов 2-пропанола, которые необходимы для получения фазового разделения с этими характеристиками плотной фазы. Все обнаруженные точки выстраиваются вдоль уравнения прямой в отрезках у=-0,0053х+1,7227 (R2=0,9491) для графика объемов 2-пропанола в зависимости от концентрации ХС/КС и уравнения прямой в отрезках у=-2х+0,0593 (R2=0,9743) для графика объемов 2-пропанола в зависимости от проводимости раствора.
При разработке рабочих условий на промышленном уровне для этого типа ХС/КС, когда было определено значение проводимости, вызванной ХС/КС, или концентрации ХС/КС, таким образом автоматически определяют объем 2-пропанола, добавляемого для получения разделения на две жидкие фазы, что приводит к ХС с чистотой >95%. Аналогично, когда был установлен объем используемого 2-пропанола, можно однозначно определить проводимость или концентрацию, которую доложен иметь раствор ХС/КС. В способе, если обрабатываемый раствор имеет концентрацию ХС/КС ниже той, которая необходима для достижения требуемого значения проводимости, указанного значения достигают путем добавления NaCl или других солей. В таблице 4 показаны экспериментальные данные. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4.
Пример 6. Построение графика, на котором показана проводимость водного раствора ХС/КС в зависимости от объема этанола, требуемого для получения очистки ХС/КС
Используют образец ХС/КС морского происхождения, отличающийся содержанием ХС 78% и содержанием КС 22%, приготавливают растворы (1 л) с концентрациями в интервале 120-250 г/л и измеряют их значение проводимости. Этанол добавляют к каждому раствору до тех пор, пока они не разделяться на две жидкие фазы, давая % сухого остатка плотной фазы, ±8% от % ХС в смеси ХС/КС, образуя объект способа очистки (для анализируемого образца сухой остаток плотной фазы составляет от 70 до 86%). Как для образца ХС/КС, так и для сухого остатка плотной фазы содержание остаточной воды полагают эквивалентным и оценивают в 12-15 масс. %.
Строят два графика, показывающих значения проводимости ХС/КС или концентрации, соответственно, в зависимости от объемов этанола, которые необходимы для получения фазового разделения с этими характеристиками плотной фазы. Все обнаруженные точки выстраиваются вдоль уравнения прямой в отрезках у=-0,0049х+2,344 (R2=0,9661) для графика объемов этанола в зависимости от концентрации ХС/КС и уравнения прямой в отрезках у=-0,0658х+3,0284 (R2=0,9885) для графика объемов этанола в зависимости от проводимости раствора.
При разработке рабочих условий на промышленном уровне для этого типа ХС/КС, когда было определено значение проводимости, вызванной ХС/КС, или концентрации ХС/КС, таким образом автоматически определяют объем этанола, добавляемого для получения разделения на две жидкие фазы, что приводит к ХС с чистотой >95%. Аналогично, когда установлен объем используемого этанола, можно однозначно определить проводимость или концентрацию, которую доложен иметь раствор ХС/КС. В способе, если обрабатываемый раствор имеет концентрацию ХС/КС ниже той, которая необходима для достижения требуемого значения проводимости, указанного значения достигают путем добавления NaCl или других солей. В таблице 5 показаны экспериментальные данные. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4.
Пример 7. Очистка ХС/КС с использованием различных смесей растворителей
ХС/КС морского происхождения (ХС 78,4%, КС 21,6%) очищают с помощью различных растворителей. NaCl добавляют к пяти образцам водного раствора объемом 1 л, причем каждый содержит 120 г/л ХС/КС (проводимость 18,8 мСм/см), до тех пор, пока конечная проводимость не составит 25,6 мСм/см (примерно 87,5 мМ NaCl) для растворителей, указанных ниже как А-С, и 37,1 мСм/см (примерно 290 мМ NaCl) для растворителей D-Е. Следующие растворители последовательно добавляют при сильном перемешивании в приготовленные таким образом растворы: А) 2-пропанол 0,75 л, В) 1-пропанол 0,75 л, С) 2-пропанол/2-бутанол 1,00/0,25 в объеме 0,75 л, D) этанол 1 л, Е) ацетон.
Добавление органического растворителя вызывает разделение изначально гомогенной системы на две жидкие фазы, в которых ХС селективно концентрируется в более плотной фазе, при этом КС аккумулируется в легкой фазе. Двухфазную систему поддерживают при перемешивании в течение 18 часов при комнатной температуре и затем оставляют расслаиваться. Две фазы осаждают при сильном перемешивании путем добавления 2-3 объемов этанола, осадок сушат в вакууме с получением ХС и КС соответственно в форме белых микрокристаллических порошков. В таблице 6 показаны экспериментальные результаты. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4.
Как показывают данные таблицы 6, разработанный способ зависит от природы растворителя, однако универсальность способа всегда обеспечивает оптимизирование рабочих параметров (концентрация ХС/КС, природа растворителя, ионная сила).
Пример 8. Влияние химической природы соли на очистку образцов ХС/КС
ХС/КС морского происхождения (ХС 78,4%, КС 21,6%) очищают с использованием различных солей для достижения критического значения проводимости. Следующие соли добавляют соответственно в три образца водных растворов с объемом 1 л, содержащих 120 г/л ХС/КС (проводимость 18,8 мСм/см): A) NaCl, В) CaCl2, С) K2SO4, до тех пор, пока конечная проводимость не составит 25,6 мСм/см. 0,75 л 2-пропанола добавляют при сильном перемешивании в приготовленные таким образом три раствора. Добавление органического растворителя вызывает разделение изначально гомогенной системы на две жидкие фазы, в которых ХС селективно концентрируется в более плотной фазе, при этом КС аккумулируется в легкой фазе. Двухфазную систему поддерживают при перемешивании в течение 18 часов при комнатной температуре и затем оставляют расслаиваться. Две фазы осаждают при сильном перемешивании путем добавления 2-3 объемов этанола, осадок сушат в вакууме с получением ХС и КС соответственно в форме белых микрокристаллических порошков. В таблице 7 показаны экспериментальные результаты. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4.
Как показывают данные таблицы 7, разработанный способ зависит от природы соли, используемой для достижения проводимости, необходимой для получения разделения на две жидкие фазы, однако универсальность способа всегда обеспечивает оптимизирование рабочих параметров (концентрация ХС/КС, природа растворителя, ионная сила).
Пример 9. Влияние рН на очистку образцов ХС/КС
Очистка ХС/КС морского происхождения (ХС 78,4%, КС 21,6%) при различных значениях рН. Два образца ХС/КС (120 г/л) настраивают на рН 4,1 (19,6 мСм/см) и 8,1 (18,9 мСм/см), используя 1М водные растворы HCL и NaOH, соответственно. NaCl добавляют в водные растворы до тех пор, пока конечная проводимость не составит 25,6 мСм/см, затем добавляют 0,75 л 2-пропанола при сильном перемешивании до тех пор, пока раствор не разделится на две жидкие фазы. Добавление органического растворителя вызывает разделение изначально гомогенной системы на две жидкие фазы, в которых ХС селективно концентрируется в более плотной фазе, при этом КС аккумулируется в легкой фазе. Двухфазную систему поддерживают при перемешивании в течение 18 часов при комнатной температуре и затем оставляют расслаиваться. Две фазы осаждают при сильном перемешивании путем добавления 2-3 объемов этанола, осадок сушат в вакууме с получением ХС и КС соответственно в форме белых микрокристаллических порошков. В таблице 8 показаны экспериментальные результаты. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4.
Как можно видеть из данных таблицы 8, способ очистки ХС/КС зависит от рН раствора, с результатами, которые являются наилучшими в показателях как выхода, так и чистоты при нейтральных значениях рН. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4.
Пример 10. Влияние температуры на способ очистки образцов ХС/КС
Для подтверждения критического воздействия температуры на способ очистки ХС/КС приготавливают два образца ХС/КС морского происхождения (ХС 78,4%, КС 21,6%) (120 г/л, 18,8 мСм/см), растворенных в 1 л воды. NaCl добавляют в два раствора вплоть до конечной проводимости 25,6 мСм/см. Действуя при 4 и 25°С, затем добавляют 0,75 л 2-пропанола при сильном перемешивании. Добавление органического растворителя вызывает разделение изначально гомогенной системы на две жидкие фазы, в которых ХС селективно концентрируется в более плотной фазе, при этом КС аккумулируется в легкой фазе. Двухфазную систему поддерживают при перемешивании в течение 18 часов при 4 и 25°С, соответственно. Две фазы затем собирают и осаждают при сильном перемешивании путем добавления 2-3 объемов этанола, осадки сушат в вакууме с получением ХС и КС соответственно в форме белых микрокристаллических порошков. В таблице 9 показаны экспериментальные результаты. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4.
Как показывают данные в таблице 9, разработанный способ в малой степени зависит от температуры, причем наилучшие результаты в показателях чистоты получают при работе при 25°С.
Пример 11. Влияние концентрации ХС/КС на способ очистки с использованием этанола в качестве органического растворителя
Для оценки критических факторов концентрации ХС/КС в способе очистки приготавливают шесть образцов объемом в 1 л ХС/КС с концентрацией, показанной в таблице 10. NaCl добавляют в образцы А-С, чтобы получить конечную проводимость в интервале от 38 до 40 мСм/см. Затем в раствор добавляют этанол при энергичном перемешивании в количестве, достаточном чтобы вызвать разделения на две жидкие фазы в первоначально гомогенном растворе воды в спирте с селективной концентрацией ХС в плотной фазе и КС в легкой фазе. Двухфазную систему поддерживают при перемешивании в течение 18 часов при комнатной температуре и затем оставляют расслаиваться. Две фазы каждого образца собирают и осаждают при сильном перемешивании путем добавления 2-3 объемов этанола и осадок сушат в вакууме, получая ХС и КС соответственно в форме белых микрокристаллических порошков. В таблице 10 показаны экспериментальные результаты. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4. Как видно из данных таблицы 10, концентрация играет критическую роль, особенно в связи со степенью чистоты. Более низкие концентрации обеспечивают ХС с получаемой чистотой >96%.
Пример 12. Влияние времени восстановления равновесия в способе очистки образца ХС/КС
Для оценки критических факторов в способе очистки образцов ХС/КС во время восстановления равновесия двухфазной системы, полученной путем поддерживания системы двух отдельных фаз при сильном перемешивании, приготавливают два образца ХС/КС морского происхождения (ХС 78,4%, КС 21,6%) (120 г/л, 18,8 мСм/см) и растворяют в 1 л воды. NaCl добавляют в два раствора вплоть до конечной проводимости 25,6 мСм/см. Действуя при 25°С, затем добавляют 0,75 л 2-пропанола при сильном перемешивании. Добавление органического растворителя вызывает разделение изначально гомогенной системы на две жидкие фазы, в которых ХС селективно концентрируется в более плотной фазе, при этом КС аккумулируется в легкой фазе. Двухфазную систему поддерживают при перемешивании при 25°С в течение 1,5 и 18 часов, соответственно. Две фазы затем собирают и осаждают при сильном перемешивании путем добавления 2-3 объемов этанола, осадки сушат в вакууме с получением ХС и КС соответственно в форме белых микрокристаллических порошков. В таблице 11 показаны экспериментальные результаты. Полученные образцы ХС и КС анализируют так, как указано в примерах 1, 3 и 4. Как выходит из данных в таблице 11, разработанный способ зависит в умеренной степени от времени восстановления равновесия двух фаз, с немного лучшими извлечениями и чистотой, получаемыми при более длительных временах.
Пример 13. Влияние источника извлечения ХС/КС на способ очистки
Для оценки критических факторов, присущих природе подлежащего очистке образца ХС/КС, анализировали три образца морского происхождения и два образца животного (из свиней) происхождения. Приготавливали растворы в воде пяти образцов объемом 1 л (120 г/л, 18,8 мСм/см). NaCl добавляют в растворы вплоть до конечной проводимости 25,6 мСм/см. Действуя при 25°С, затем добавляют 0,75 л 2-пропанола при сильном перемешивании. Добавление органического растворителя вызывает разделение изначально гомогенной системы на две жидкие фазы, в которых ХС селективно концентрируется в более плотной фазе, при этом КС аккумулируется в легкой фазе. Двухфазную систему поддерживают при перемешивании в течение 18 часов. Две фазы различных образцов затем собирают и осаждают при сильном перемешивании путем добавления 2-3 объемов этанола, осадки сушат в вакууме с получением ХС и КС соответственно в форме белых микрокристаллических порошков. В таблице 12 показаны экспериментальные результаты. Полученные образцы ХС и КС анализировали так, как указано в примерах 1, 3 и 4.
Данные показывают, что заявленный способ можно использовать независимо от типа применяемого в способе очистки ХС/КС. Очевидно, что чем меньше исходный продукт загрязнен КС, тем чище будет конечный очищенный ХС, как выясняется из данных по чистоте для образцов свиного происхождения, которые всегда изначально более чистые, чем образцы морского происхождения.
Пример 14. Повторная очистка ХС из легкой фазы
Для улучшения степени полученной чистоты, в частности когда используют очень высокие концентрации ХС/КС, плотную фазу можно снова непосредственно подвергнуть способу очистки. Ее сперва разбавляют водой для получения концентрации, первоначально используемой в первом способе очистки, и затем повторяют весь способ.
Claims (11)
1. Способ очистки хондроитин сульфата (ХС) от кератан сульфата (КС), предусматривающий получение водного раствора, содержащего ХС и КС, смешивание полученного водного раствора с органическим растворителем при условиях ионной силы, вызывающей образование плотной фазы, в которой концентрируется ХС, и легкой фазы, в которой концентрируется КС, причем количество органического растворителя выбирают таким образом, что его введение приводит к образованию двух жидких фаз, плотной и легкой, а затем извлекают ХС из плотной фазы и КС из легкой фазы путем осаждения, при этом ХС осаждают с помощью этанола, а КС - путем добавления хлорида натрия.
2. Способ по п. 1, включающий:
а) определение проводимости водного раствора ХС/КС,
б) возможно, добавление соли, способной к диссоциации на моно- или поливалентные ионы до предварительно установленного значения проводимости,
в) постепенное добавление указанного количества указанного органического растворителя.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором смешиваемые с водой органические растворители выбирают из метанола, этанола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, ацетона, ацетонитрила или их смесей.
4. Способ по п. 3, в котором органическим растворителем является этанол или 2-пропанол.
5. Способ по п. 1 или 2, в котором, возможно, добавляемая соль является хлоридом натрия.
6. Способ по п. 1, в котором плотную фазу, содержащую ХС, подвергают дополнительному процессу очистки.
7. Способ по п. 6, в котором плотную фазу разбавляют водой, после чего добавляют органический растворитель до повторного образования двух жидких фаз: плотной фазы, в которой концентрируется ХС, и легкой фазы, в которой концентрируется КС.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором осадок ХС сушат.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ITMI20140486 | 2014-03-21 | ||
ITMI2014A000486 | 2014-03-21 | ||
PCT/EP2015/055882 WO2015140281A1 (en) | 2014-03-21 | 2015-03-20 | Chondroitin sulphate purification method |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016137266A RU2016137266A (ru) | 2018-04-24 |
RU2016137266A3 RU2016137266A3 (ru) | 2018-09-28 |
RU2693262C2 true RU2693262C2 (ru) | 2019-07-01 |
Family
ID=50733188
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016137266A RU2693262C2 (ru) | 2014-03-21 | 2015-03-20 | Способ очистки хондроитин сульфата |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10221252B2 (ru) |
EP (1) | EP3119814B1 (ru) |
CN (1) | CN106103493B (ru) |
CA (1) | CA2943232C (ru) |
ES (1) | ES2843492T3 (ru) |
HU (1) | HUE053192T2 (ru) |
RU (1) | RU2693262C2 (ru) |
WO (1) | WO2015140281A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105777938B (zh) * | 2016-03-28 | 2018-08-07 | 山东众山生物科技有限公司 | 一种从硫酸软骨素粗提物中去除硫酸角质素的方法 |
US20210132040A1 (en) * | 2017-02-21 | 2021-05-06 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Analytical method for glycosaminoglycans |
CN112321750A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-05 | 美泰科技(青岛)股份有限公司 | 一种通过调节料液电导率控制硫酸软骨素含量的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2061485C1 (ru) * | 1992-12-28 | 1996-06-10 | Васюков Сергей Ефимович | Способ выделения хондроитинсульфата из животных тканей |
RU2458134C1 (ru) * | 2010-12-27 | 2012-08-10 | ФГУП Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ФГУП ПИНРО) | Способ получения хондроитина сульфата из тканей морских гидробионтов |
WO2013006906A1 (en) * | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Dermatan sulphate, pharmaceutical compositions and process for producing same |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5141928B1 (en) | 1989-12-20 | 1995-11-14 | Brujo Inc | Ophthalmic medication |
CN1174557A (zh) | 1994-12-01 | 1998-02-25 | 生化学工业株式会社 | 硫酸角质素寡聚糖级分及含该级分的药剂 |
-
2015
- 2015-03-20 HU HUE15714774A patent/HUE053192T2/hu unknown
- 2015-03-20 ES ES15714774T patent/ES2843492T3/es active Active
- 2015-03-20 US US15/124,675 patent/US10221252B2/en active Active
- 2015-03-20 WO PCT/EP2015/055882 patent/WO2015140281A1/en active Application Filing
- 2015-03-20 EP EP15714774.5A patent/EP3119814B1/en active Active
- 2015-03-20 CN CN201580014744.1A patent/CN106103493B/zh active Active
- 2015-03-20 RU RU2016137266A patent/RU2693262C2/ru active
- 2015-03-20 CA CA2943232A patent/CA2943232C/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2061485C1 (ru) * | 1992-12-28 | 1996-06-10 | Васюков Сергей Ефимович | Способ выделения хондроитинсульфата из животных тканей |
RU2458134C1 (ru) * | 2010-12-27 | 2012-08-10 | ФГУП Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ФГУП ПИНРО) | Способ получения хондроитина сульфата из тканей морских гидробионтов |
WO2013006906A1 (en) * | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Dermatan sulphate, pharmaceutical compositions and process for producing same |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
GALEOTTI FABIO et al. "Selective removal of keratin sulfate in chondroitin sulfate samples by sequential precipitation with ethanol", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol.448, 01.12.2013, стр.113-115. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HUE053192T2 (hu) | 2021-06-28 |
WO2015140281A1 (en) | 2015-09-24 |
CN106103493B (zh) | 2019-04-19 |
CA2943232A1 (en) | 2015-09-24 |
CN106103493A (zh) | 2016-11-09 |
RU2016137266A3 (ru) | 2018-09-28 |
CA2943232C (en) | 2022-07-12 |
US10221252B2 (en) | 2019-03-05 |
EP3119814B1 (en) | 2020-12-16 |
ES2843492T3 (es) | 2021-07-19 |
RU2016137266A (ru) | 2018-04-24 |
EP3119814A1 (en) | 2017-01-25 |
US20170022295A1 (en) | 2017-01-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kidgell et al. | Ulvan: A systematic review of extraction, composition and function | |
Restaino et al. | A multi-analytical approach to better assess the keratan sulfate contamination in animal origin chondroitin sulfate | |
Novoa-Carballal et al. | By-products of Scyliorhinus canicula, Prionace glauca and Raja clavata: A valuable source of predominantly 6S sulfated chondroitin sulfate | |
de Alvarenga | Characterization and properties of chitosan | |
Volpi et al. | Analysis of glycosaminoglycan-derived, precolumn, 2-aminoacridone–labeled disaccharides with LC-fluorescence and LC-MS detection | |
Khan et al. | Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods | |
Liu et al. | Compositional analysis and structural elucidation of glycosaminoglycans in chicken eggs | |
RU2693262C2 (ru) | Способ очистки хондроитин сульфата | |
Galeotti et al. | Novel reverse-phase ion pair-high performance liquid chromatography separation of heparin, heparan sulfate and low molecular weight-heparins disaccharides and oligosaccharides | |
Liu et al. | An acidic polysaccharide from Patinopecten yessoensis skirt prevents obesity and improves gut microbiota and metabolism of mice induced by high-fat diet | |
Lin et al. | Purification and sequence characterization of chondroitin sulfate and dermatan sulfate from fishes | |
Laremore et al. | Domain structure elucidation of human decorin glycosaminoglycans | |
Václavíková et al. | Isotachophoretic determination of glucosamine and chondroitin sulphate in dietary supplements. | |
Šimek et al. | Analysis of hyaluronan and its derivatives using chromatographic and mass spectrometric techniques | |
Han et al. | Monosaccharide compositions of sulfated chitosans obtained by analysis of nitrous acid degraded and pyrazolone-labeled products | |
Zhang et al. | Isolation and structural characterization of glycosaminoglycans from heads of red salmon (Oncorhynchus nerka) | |
JP5927760B2 (ja) | 酸性糖鎖試料調製方法 | |
US6342367B1 (en) | Method for the preparation of chondroitin sulfate compounds | |
Mantovani et al. | Analytical methods for assessing chondroitin sulfate in human plasma | |
JP2000351790A (ja) | フコース含有オリゴ糖又はその組成物の製造法及びフコース含有オリゴ糖又はその組成物 | |
MX2013013325A (es) | Sulfato de controitina similar al de tiburon y proceso para la preparacion del mismo. | |
Liu et al. | Mass balance analysis of contaminated heparin product | |
CN105461761A (zh) | 一种可在线检测的全脱乙酰化壳寡糖不同聚合度单体的制备方法 | |
Felz | Structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge | |
Zhao et al. | Analysis of chondroitin sulfate from different sources of cartilage by electrophoretically mediated microanalysis |