CN114181275A - 一种人参皂苷Rg3、其制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人参皂苷Rg3的制备方法，包括以下步骤：将人参提取物与酒石酸水溶液混合后进行水解，得到人参皂苷Rg3。本发明以人参提取物为原料，以酒石酸为催化剂，以水为介质进行水解反应，使人参提取物中的人参皂苷高效转化为人参皂苷Rg3，提高得到的产物中人参皂苷Rg3的含量。本发明提供的方法简单、快速、高效，使用的原料为人参提取物，廉价易得，工艺步骤简单易操作。本发明还提供了该人参皂苷Rg3在制备具有抗衰老、损伤修复、美白和抗炎功效的化妆品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体是一种人参皂苷Rg3、其制备方法及其用途。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.meyer)是五加科人参属多年生草植物，主要成分包括人参皂苷、人参多糖、挥发油及多种微量元素等，其中人参皂苷是人参中最具有代表性的重要药理活性成分。研究表明，经过糖配基选择性水解获得的稀有人参皂苷比人参中所含主要人参皂苷具有更好的肌体吸收能力和药理活性，人参皂苷Rg3就是其中的典型代表。研究发现，人参皂苷Rg3最初是从红参中分离制备而得，最早于1980年日本学者北川勋首次制备并确定其分子式(C42H72O13)。人参皂苷Rg3是通过人参皂苷中的PPD(原人参二醇组皂苷：人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd)为原料，在C-20位的定向水解而得，水解过程如下式所示：
现代研究进展表示，人参皂苷Rg3具有有改善记忆力、抗疲劳、保护神经和抗细胞凋亡等药理活性，同时也有研究证明其具有抗氧化、抑制炎症反应和黑色素瘤细胞增殖等化妆品潜在价值。
由于人参皂苷Rg3并不天然存在于白参中，在红参中含量也较低，仅十万分之三。因此，如何高效富集人参皂苷Rg3成为近几年研究的重点。目前常用的制备人参皂苷Rg3的方法有物理法，包括加热加工法、γ照射法等；化学水解法，包括酸水解法或碱水解法等；微生物转化法以及酶法等。传统的物理法虽常用，但这种方法耗时长、且得率比较低；碱水解法通常需要伴随较高的压力，不节能高效；微生物转化法以及酶法虽专一性比较高，但因为其作用原理以及机制目前研究还不透彻，也仅仅停留在实验室转化阶段，大规模工厂化应用有局限。酸水解法是对皂苷组进行酸催化处理，所用方法耗时短、能较大程度的将皂苷组转化成人参皂苷Rg3。但是，现有技术在使用酸水解法制备人参皂苷Rg3时，一般以人参总皂苷或人参二醇组皂苷等纯度较高的原料制备，成本较高，难以实现规模化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种人参皂苷Rg3、其制备方法及其应用，本发明提供的制备方法以成本较低的人参提取物为原料制备人参皂苷Rg3，成本较低，适于规模化生产，且人参皂苷Rg3转化率较高。
本发明提供了一种人参皂苷Rg3的制备方法，包括以下步骤：
将人参提取物与酒石酸水溶液混合后进行水解，得到人参皂苷Rg3。
本发明以人参提取物为原料，以酒石酸为催化剂，以水为介质进行水解反应，使人参提取物中的人参皂苷高效转化为人参皂苷Rg3，提高得到的产物中人参皂苷Rg3的含量。本发明提供的方法简单、快速、高效，使用的原料为人参提取物，廉价易得，工艺步骤简单易操作。
在一个实施例中，所述人参提取物含有30％～60％的人参皂苷。在一个实施例中，所述人参提取物含有40％的人参皂苷。本发明对所述人参提取物的制备方法没有特殊限制，采取本领域技术人员熟知的方法对其进行提取即可。
本发明以酒石酸为催化剂，在一个实施例中，所述酒石酸为D,L-酒石酸。柠檬酸pKa1＝3.1，酒石酸pKa1＝3.0，乳酸pKa1＝3.86，L-谷氨酸pKa1＝2.13，但是人参皂苷Rg3含量在酒石酸的作用下较高，而在柠檬酸、乳酸和L-谷氨酸条件下并不高。
本发明以水为反应溶剂，不添加乙醇进行水解反应。
在一个实施例中，所述酒石酸在水中的质量浓度，即酒石酸水溶液的质量浓度为3％～9％。在一个实施例中，酒石酸水溶液的质量浓度为5％。
在一个实施例中，所述人参提取物与酒石酸水溶液的质量体积比为0.1g～1g：5mL～15mL。在一个实施例中，所述人参提取物与酒石酸水溶液的质量体积比为0.5g：10mL。
在一个实施例中，所述水解反应的温度为75℃～95℃，时间为1h～3h。在一个实施例中，所述水解反应的温度为80℃，时间为2h。
在一个实施例中，所述人参提取物含40％人参皂苷；
所述酒石酸的质量浓度为5％；
所述人参提取物与所述D,L-酒石酸水溶液的质量体积比为0.5g：10mL；
所述水解的温度为80℃，时间为2h。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的制备方法制备得到的人参皂苷Rg3，其中，人参皂苷Rg3的含量为60mg/g以上。所述人参皂苷Rg3实际上为混合物，包含人参皂苷Rg3。在一个实施例中，人参皂苷Rg3的含量为64mg/g以上。
本发明提供的人参皂苷Rg3具有抗衰老、损伤修复、美白和抗炎功效，可以用于制备具有抗衰老、损伤修复、美白和抗炎功效的化妆品中的应用。
本发明还提供了一种化妆品，包括上述技术方案所述的方法制备得到的人参皂苷Rg3。
本发明以人皮肤成纤维细胞为研究对象，通过ELISA检测以本发明提供的方法制备得到的人参皂苷Rg3对I型胶原蛋白含量的影响，结果表明，本发明提供的方法制备得到的人参皂苷Rg3对对成纤维细胞I型胶原蛋白的分泌有一定的促进作用，其作用效果随人参新原料浓度提高而增强；且与人参皂苷Rg3标准品相比，人参新原料作用效果更优。
附图说明
图1为人参皂苷Rg3的标准曲线；
图2为酸溶剂种类对人参皂苷Rg3含量的影响；
图3为乙醇浓度对人参皂苷Rg3含量的影响；
图4为酸浓度对人参皂苷Rg3含量的影响；
图5为水解温度对人参皂苷Rg3含量的影响；
图6为水解时间对人参皂苷Rg3含量的影响；
图7为酸水解前后人参皂苷Rg3含量对比；
图8为本发明实施例2及比较例制备的产品中人参皂苷Rg3含量柱状图；
图9为人参新原料对自然状态下成纤维细胞COL-I分泌量的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明提供的人参皂苷Rg3、其制备方法及其应用进行进一步说明。
实施例1
本实验拟通过单因素实验以及正交实验设计通过酸水解的方法对人参皂苷Rg3含量进行富集和优化，以期得到人参皂苷Rg3最佳的制备工艺条件。
1.实验材料
(1)实验仪器
高效液相色谱仪(Agilent 1260infinity2)，超声波控温清洗器(JP-080s)，电子天平(FA1204)，台式高速冷冻离心机(LD-LX-HR1850)，WP-UP-YJ-10实验室超纯水机，CS-700中草药专用粉碎机，DF-101s恒温水/油锅，RE-201D旋转蒸发仪。
(2)试剂和耗材
人参皂苷Rg3标准品(HPLC，20mg，阿拉丁)，超纯水，无水乙醇(国药)，DL-酒石酸(100g，adamas)，柠檬酸(500g，沃凯)，乳酸(500ml，adamas)，L-谷氨酸(沪试，100g)
(3)实验原料
含有人参皂苷40％的人参提取物粉末。
2.实验方法
(1)人参皂苷Rg3标准曲线绘制
精密称量经过干燥的无水人参皂苷Rg3标准品1mg置于烧杯中，加入5mL超纯水使之溶解完全。冷却后移入10mL容量瓶中，继续加入超纯水定容至刻度线，得到浓度为100μg/mL的人参皂苷Rg3标准品溶液。取一定体积的母液，配成浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的人参皂苷Rg3标准品稀释液。HPLC进样分析。以峰面积为纵坐标Y，人参皂苷Rg3标准溶液浓度为横坐标X，绘制人参皂苷Rg3标准曲线。
(2)酸水解法高效制备人参皂苷Rg3工艺条件优化
a)酸种类的影响
准确称量0.5g含有40％人参皂苷的人参提取物，分别加入10mL3％浓度的柠檬酸、DL-酒石酸、乳酸和L-谷氨酸的水溶液，在80℃的条件下加热水解0.5h。水解完成后，旋干溶液，再用10mL70％乙醇溶解，离心5min后得到上清液，稀释后，进行HPLC色谱分析。根据人参皂苷Rg3标准曲线确定其含量，经水解后制备的人参皂苷Rg3含量计算公式如下所示：
b)乙醇浓度的影响
选取乙醇浓度为0％、20％、40％、60％、80％、100％乙醇水溶液。准确称量0.5g含有40％人参皂苷的人参提取物，加入10mL不同浓度的乙醇水溶液、酸浓度为3％。在80℃的条件下加热水解0.5h。水解完成后，旋干溶液，再用10mL70％乙醇溶解，离心5min后得到上清液，稀释后，进行HPLC色谱分析，根据人参皂苷Rg3标准曲线确定其含量。
c)酸浓度的影响
选取酸浓度为3％、5％、7％、9％、11％。准确称量0.5g含有40％人参皂苷的人参提取物，依次加入不同浓度的由(a)筛选出来的未加乙醇的酸溶液，在80℃的条件下加热水解0.5h。水解完成后，旋干溶液，再用10mL70％乙醇溶解，离心5min后得到上清液，稀释一定的倍数，进行HPLC色谱分析，根据人参皂苷Rg3标准曲线确定其含量。
d)水解温度的影响
选取水解温度为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。准确称量0.5g含有40％人参皂苷的人参提取物，加入10mL3％酸溶液，依次在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的条件下加热水解0.5h。水解完成后，旋干溶液，再用10mL70％乙醇溶解，离心5min后得到上清液，稀释一定的倍数，进行HPLC色谱分析，根据人参皂苷Rg3标准曲线确定其含量。
e)水解时间的影响
选取水解时间为1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h。准确称量0.5g含有40％人参皂苷的人参提取物，加入10mL3％酸溶液。在80℃的条件下依次加热水解1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h。水解完成后，旋干溶液，再用10mL70％乙醇溶解，离心5min后得到上清液，稀释一定的倍数，进行HPLC色谱分析，根据人参皂苷Rg3标准曲线确定其含量。
(3)正交试验设计优化人参皂苷Rg3提取工艺
根据单因素试验的结果,选择乙醇浓度(A)、酸浓度(B)、水解温度(C)、水解时间(D)为参考因素,选择合适的水平因子，以人参皂苷Rg3含量为指标,进行L9(34)正交试验设计，对(2)酸水解法高效制备人参皂苷Rg3工艺条件进行优化。正交试验因素水平表如表1所示，表1为L9(34)正交试验因素水平表。
表1.L9(34)正交试验因素水平表
(4)HPLC检测
条件：C18色谱柱(150mm×3mm,2.7-micron with column)，流动相为乙腈(A)-(B)，梯度洗脱如表2所示，检测波长203nm，柱温30℃，流速0.5ml/min，进样量10μL。
表2.流动相梯度洗脱条件
| 时间(min) | A相(乙腈)％ | B相(水)％ |
| 0 | 20 | 80 |
| 20 | 40 | 60 |
| 30 | 60 | 40 |
| 34 | 60 | 40 |
| 40 | 20 | 80 |
| 45 | 20 | 80 |
2.实验结果
(1).人参皂苷Rg3标准曲线
如图1所示，图1为人参皂苷Rg3的标准曲线，所测得的数据经过回归分析，以峰面积为纵坐标(Y)，人参皂苷Rg3标准溶液浓度为横坐标(X)。得到回归方程为：Y＝6.6782X-9.，R2＝0.9996。在浓度0～100μg/mL的范围内，人参皂苷Rg3标准溶液浓度与峰面积线性关系良好。
(2).酸水解法高效制备人参皂苷Rg3工艺条件优化结果
(a)酸溶剂的影响
参见图2，图2为酸溶剂种类对人参皂苷Rg3含量的影响。如图2所示，通过研究四种不同的酸溶剂可以看出，DL-酒石酸转化人参皂苷Rg3的效果最佳，因此我们选择DL-酒石酸进行单因素实验。
(b)乙醇浓度的影响
如图3所示，图3为乙醇浓度对人参皂苷Rg3含量的影响，从图3可以看出，在乙醇浓度20％的范围内，人参皂苷Rg3含量差异不明显，但是随着乙醇浓度的进一步增加，人参皂苷Rg3含量呈现比较明显的下降趋势。
(C)酸浓度的影响
参见图4，图4为酸浓度对人参皂苷Rg3含量的影响，如图4所示，人参皂苷Rg3含量随酸浓度的增加而增加，5％以上开始呈现下降趋势。
(d)水解温度
如图5所示，图5为水解温度对人参皂苷Rg3含量的影响。图5的结果表明，在60-90min的时间范围内，人参皂苷Rg3含量随着温度的增加而增加；一旦温度继续增加，人参皂苷Rg3含量呈现下降趋势。
(e)水解时间
如图6所示，图6为水解时间对人参皂苷Rg3含量的影响，人参皂苷Rg3的含量随着水解时间的延长呈现平稳上升的趋势，当水解时间超过了2.0h后，人参皂苷Rg3的含量开始下降，收率降低。
(3).正交实验优化结果
借助正交试验设计助手，按L9(34)正交表进行酸水解法高效制备人参皂苷Rg3工艺优化实验。综合考察了影响人参皂苷Rg3的四个因素：乙醇浓度(A)、酸浓度(B)、水解温度(C)、水解时间(D)。正交实验结果如表3和表4所示，表3为酸水解法高效制备人参皂苷Rg3正交实验结果，表4为正交实验方差分析表。
表3.酸水解法高效制备人参皂苷Rg3正交实验结果
表4.正交实验方差分析表
由表3的极差结果可以看出，影响酸水解法高效制备人参皂苷Rg3含量多少的因素依次为C>A>B>D，即水解温度对人参皂苷Rg3制备的影响最大。综合极差分析表2以及方差分析表4，酸水解法高效制备人参皂苷Rg3最佳工艺条件为A1B1C1D1，即乙醇浓度为0％，酸浓度为5％，水解温度80℃，水解时间2h。
(4).酸水解前后人参皂苷Rg3含量对比
结果参见图7，图7为酸水解前后人参皂苷Rg3含量对比，由图7可知，经过一系列酸水解工艺优化，人参皂苷Rg3由水解前的6.84mg/g，增加到64.91mg/g，最大程度的制备并转化了人参皂苷Rg3。
3.实验结论
本实验对酸水解法高效制备人参皂苷Rg3的工艺条件进行正交实验设计优化，确定了最佳提取工艺条件：
(1)单因素实验研究了酸溶剂、乙醇浓度、酸浓度、水解温度、水解时间对人参皂苷Rg3含量的影响，各单因素实验的最佳条件分别为：选用DL-酒石酸，20％的乙醇浓度，5％酸浓度，水解温度90℃，水解时间2.0h。
(2)通过正交实验设计(L9(34))确定了酸水解法高效制备人参皂苷Rg3的工艺条件为：0％的乙醇浓度，5％酸浓度，水解温度80℃，水解时间2.0h。在最佳制备工艺条件下，酸水解转化的人参皂苷Rg3最高含量为64.91mg/g(n＝3)，RSD值为0.64％，工艺稳定性良好。
通过对比酸水解前后人参皂苷Rg3含量发现，经过最佳工艺处理后提取的人参皂苷Rg3含量为64.91mg/g，而酸水解前人参皂苷Rg3的含量仅仅为6.84mg/g，因此该优化工艺能起到高效制备并富集人参皂苷Rg3的效果。
实施例2
将0.5g含40％人参皂苷的人参提取物与10mL质量浓度为5％的D,L-酒石酸混合后在80℃下水解2h，水解完成后，旋干溶液，再用10mL70％乙醇溶解，离心5min后得到上清液，得到人参皂苷Rg3，进行3次平行实验验证，结果如表5所示，表5为验证结果。
表5.验证实验结果
由表5可知，人参皂苷Rg3的含量分别为65.07mg/g、65.22mg/g、64.44mg/g，人参皂苷Rg3平均提取量为64.91mg/g(n＝3)，RSD值为0.64％(n＝3),且与正交试验表中数据基本一致。因此该计算结果表明，在该最佳工艺条件下，人参皂苷Rg3含量最高，且该提取工艺稳定性良好。
对比例1
与实施例2的区别在于，将D,L-酒石酸替换为乙酸。
对比例2
与实施例2的区别在于，将D,L-酒石酸替换为柠檬酸，结果参见图8，图8为本发明实施例2及比较例制备的产品中人参皂苷Rg3含量柱状图，其中，添加柠檬酸转化人参皂苷Rg3结果为51.2mg/g，乙酸为38.8mg/g，相较于D,L-酒石酸64.91mg/g来说，富集效果较差。
应用例1
1.实验目的
本测试以人皮肤成纤维细胞为研究对象，通过ELISA检测实施例2制备得到的人参皂苷Rg3对I型胶原蛋白含量的影响，并与人参皂苷Rg3标准品进行对比，以期为功效宣称提供科学依据。
2.实验材料
2.1.主要仪器
酶标仪(普朗医疗，DNM-9606)、超净工作台(苏州净化，SW-CJ-2D)、二氧化碳恒温培养箱(IRM)、倒置显微镜(OLYMPUS，CKX53)、漩涡混合仪(IKA，VORTEX 2)
2.2.主要试剂
1×PBS缓冲液(Solarbio)，DMEM高糖培养基粉末(Gibco)，NaHCO3(国药集团)，FBS(Gibco)
2.3.培养基及溶液配制
(1)DMEM高糖培养基：将一袋DMEM高糖培养基粉末加至800mL纯化水中搅拌溶解，后加入NaHCO3 3.7g继续搅拌至粉末完全溶解，调PH至7.1-7.2后定容至1L，用0.22μm过滤器过滤除菌后密封放于4℃保存
(2)DMEM高糖完全培养基：向DMEM高糖培养基中加入FBS使其含量为10％。
2.4.样品信息
人参新原料为实施例2制备的人参皂苷Rg3，人参皂苷Rg3标准品购自阿拉丁，信息如表6所示
表6.待测样品信息
3.供试样品对自然状态下成纤维细胞I型胶原蛋白(COL-I)含量的影响
3.1.细胞接种：将人皮肤成纤维细胞悬液密度调整至0.9×105个/mL后接种于96孔板，100μL/孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h
3.2.待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液加至细胞，100μL/孔,阴性对照组加等量完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱内培养24h。
表7.样品试验浓度表
3.3.通过ELISA法检测COL-I含量，操作步骤如下：
A.预先计算好所需的酶标条，实验前30min拿出试剂盒，恢复至室温；
B.标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液将标准品倍比稀释为10,5,2.5,1.25,0.63,0ng/mL；
C.小心收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心(4℃，1000×g，20min)，取上清后，2倍稀释作为检测样本；
D.各反应孔中加入100μL标准品工作液及检测样本，各组均设2个复孔，于37℃孵箱孵育90min；
E.弃去液体，甩干，各反应孔中加入100μL生物素标记I型胶原α1抗体工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育60min；
F.弃去液体，甩干，各反应孔中加入300μL洗涤液，浸泡1-2min后甩干。重复4次；
G.各反应孔中加入100μL HRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育30min；
H.各反应孔中加入300μL洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。重复4次。
I.各反应孔中加入90μL显色剂至反应孔中，于37℃避光显色15min左右。
J.各反应孔中加入50μL终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值
K.根据标准品的己知浓度和所测OD值计算标准曲线回归方程(R2>0.99)，将样品孔的OD值代入计算所测样品的浓度，再乘稀释倍数即得到原样品的实际COL-I浓度。
3.4.统计分析：采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x±s表示，组间差异采用one-way ANOVA分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.5.COL-I含量检测结果：
COL-I是皮肤中含量最多的胶原蛋白，是构成胶原纤维的最主要成分，而胶原纤维是皮肤结构的支撑框架，对皮肤的外观状态起到至关重要的作用。通过ELISA检测人参新原料对自然状态皮肤成纤维COL-I产量的影响，评价其对正常皮肤状态下胶原含量的作用。各组细胞COL-I分泌量如表8所示。
表8.COL-I含量检测结果
采用GraphPad Prism 8.0绘图，各组COL-I含量变化趋势如图9所示，图9为人参新原料对自然状态下成纤维细胞COL-I分泌量的影响，其中，*：与阴性对照相比具有显著性差异(P<0.05)；**：与阴性对照相比具有极显著性差异(P<0.01)。
6.结论
通过ELISA检测I型胶原蛋白含量结果来看，人参新原料在该实验浓度范围内，对成纤维细胞I型胶原蛋白的分泌有一定的促进作用，其作用效果随人参新原料浓度提高而增强；且与人参皂苷Rg3标准品相比，人参新原料作用效果更优。因此这可以说明，富含高浓度人参皂苷Rg3的人参新原料具有明显的抗衰修护的化妆品功效。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人参皂苷Rg3的制备方法，包括以下步骤：
将人参提取物与酒石酸水溶液混合后进行水解，得到人参皂苷Rg3。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人参提取物含有30％～60％的人参皂苷。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酒石酸为D,L-酒石酸。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酒石酸水溶液的质量浓度为3％～9％。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人参提取物与酒石酸水溶液的质量体积比为0.1g～1g：5mL～15mL。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述水解的温度为75℃～95℃，时间为1h～3h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述人参提取物含40％人参皂苷；
所述酒石酸的质量浓度为5％；
所述人参提取物与所述D,L-酒石酸水溶液的质量体积比为0.5g：10mL；
所述水解的温度为80℃，时间为2h。
8.权利要求1～7任意一项所述的制备方法制备得到的人参皂苷Rg3，其中，人参皂苷Rg3的含量为60mg/g以上。
9.权利要求8所述的人参皂苷Rg3在制备具有抗衰老、损伤修复、美白和抗炎功效的化妆品中的应用。
10.一种化妆品，包括权利要求1～7任意一项所述的方法制备得到的人参皂苷。
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