CN110384736B - 酸桔酿造物、其制备方法及其医药应用 - Google Patents

酸桔酿造物、其制备方法及其医药应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酸桔酿造物、其制备方法及其医药应用。本发明的酸桔酿造物获取自酸桔果渣与酵母菌及根霉菌的共同培养。本发明的酸桔酿造物具有高含量的多酚及黄酮，从而展现优异的抗发炎效果。

Description

酸桔酿造物、其制备方法及其医药应用
技术领域
本发明关于一种酸桔酿造物，尤指一种酸桔酿造物的制备方法及其医药应用。
背景技术
酸桔(Citrus Sunki Hort.Ex.Tanaka)，属芸香科后生柑橘亚属小蜜柑类宽皮小橘，为新竹县新埔及关西地区特有的柑橘类作物，产期集中于10至12月。由于产期短，保存不易，且果实味酸涩，目前在产业面上的利用，仅有加工做为食物佐酱或果汁，在食品与生物技术产业上的整体应用性仍相当欠缺。为了提升酸桔的经济价值及产业利用性，本领域对于酸桔的衍生产品及其产业应用的认识一直有着很高的需求。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种酸桔酿造物及其制备方法，以开拓酸桔的产业价值。
本发明的另一个目的是提供一种酸桔酿造物的医药应用，提高酸桔的产业价值。
为达到上述目的，本发明提供一种酸桔酿造物，其包含图1所示的高效液相层析图谱；其中所述高效液相层析的条件为：固定相为碳18反相层析管柱，流动相为含0.1％甲酸的乙腈水溶液，且乙腈水溶液的乙腈浓度梯度为60分钟内由15％升至90％；以及测定波长为320nm。
本发明另外提供一种酸桔酿造物，其由以下步骤所制得：取得基质，其包含酸桔果渣及10至20重量百分浓度的糖类；其中所述重量百分浓度以所述基质的总重量为基础；以及将所述基质与酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及根霉菌(Rhizopus spp.)共同培养以取得所述酸桔酿造物。
本发明还提供一种酸桔酿造物的制备方法，其包含以下步骤：取得基质，其包含酸桔果渣及10至20重量百分浓度的糖类；其中所述重量百分浓度以所述基质的总重量为基础；以及将所述基质与酵母菌及根霉菌共同培养以取得所述酸桔酿造物。
本发明进一步提供一种所述酸桔酿造物在制备抗发炎的药物组合物中的用途。优选地，所述药物组合物包含有效量的本发明的酸桔酿造物以及药学上可接受的载剂。
优选地，所述酸桔果渣为新鲜酸桔的全果实无籽果渣。
更为优选地，所述新鲜酸桔的糖酸比为1.5至2。
优选地，在取得所述基质之前，将所述酸桔果渣置于40至80℃中40至60小时，以进行陈化反应。
优选地，在取得所述基质之前，干燥经所述陈化反应的所述酸桔果渣。
优选地，所述干燥为：除湿干燥、热风干燥、射频干燥、微波干燥、微波电浆干燥或其组合。
优选地，在取得所述基质之前，使经所述干燥的所述酸桔果渣经杀菌处理。
优选地，所述杀菌处理为：射频辅助热风杀菌、微波辅助热风杀菌或其组合。
优选地，所述酵母菌及所述根霉菌的总菌数为2×104至2×108cells/mL；其中cells/mL以所述共同培养的总体积为基础。
优选地，所述酵母菌及所述根霉菌的菌数比值为0.5至1。
优选地，所述根霉菌包含少根根霉菌(Rhizopus arrhizus var.arrhizus)和/或中华小孢根霉菌(Rhizopus microsporus var.chinensis)。
优选地，所述共同培养为厌氧培养。
优选地，所述共同培养后，进一步浓缩所述酸桔酿造物。
优选地，所述糖类为：蔗糖、果糖、麦芽糖或其组合。
优选地，所述酸桔酿造物包含1.5至4.5mg/g的总多酚；其中所述mg/g以所述酸桔酿造物的总重量为基础。
优选地，所述酸桔酿造物包含0.3至2.0mg/g的总类黄酮；其中所述mg/g以所述酸桔酿造物的总重量为基础。
综上所述，本发明提供一种新颖的酸桔酿造物及其制备方法。更进一步证实了所述酸桔酿造物的抗发炎医药应用。据此，通过本发明的实现，可提供酸桔的产业价值。
附图说明
图1示出了本发明酸桔酿造物样品1的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明的第一个方面涉及一种酸桔酿造物及其制备方法。在一个优选的实施方式中，本发明的酸桔酿造物具有如图1所示的高效液相层析(HPLC)图谱。
本发明的制备方法包含：取得基质，其包含酸桔果渣及10至20重量百分浓度的糖类；其中所述重量百分浓度以所述基质的总重量为基础；以及将所述基质与酵母菌及根霉菌共同培养以取得所述酸桔酿造物。
在一个实施方式中，本发明所述的“果渣”是指将酸桔全果实榨汁后所留残余结构，其可包含果皮、内膜及果肉。在一个优选的实施方式中，本发明所述“果渣”不包含果实中的籽。在一个实施方式中，本发明方法进一步包含去籽的步骤以取得全果实无籽果渣。在一个优选的实施方式中，所述酸桔的糖酸比为1.5至2。
在一个实施方式中，将所述酸桔果渣与所述糖类混合之前，将所述酸桔果渣置于40至80℃中40至60小时，以进行陈化反应。在一个优选的实施方式中，所述陈化反应为使所述酸桔果渣置于50至60℃中45至55小时。
在一个实施方式中，进一步将经所述陈化反应的所述酸桔果渣干燥。可行地，所述干燥包括但不限于：除湿干燥、热风干燥、射频干燥、微波干燥、微波电浆干燥或其组合。优选地，经所述干燥后，取得半干燥的酸桔果渣。所述半干燥是指所述酸桔果渣尚保留一定含量的水，而非处于无水或几乎无水的状态。
在一个实施方式中，进一步使经所述干燥的所述酸桔果渣经杀菌处理。优选地，所述杀菌处理包括但不限于：射频辅助热风杀菌、微波辅助热风杀菌或其组合。
在一个实施方式中，本发明所述的“取得基质”是指将所述酸桔果渣与糖类混合；其中混合的方式可采用本领域中公知的手段。在一个实施方式中，所述基质包含10至20重量百分浓度的所述糖类；其中所述重量百分浓度以所述基质的总重量为基础。在另一个实施方式中，所述基质包含界于选自下列数值之间的重量百分浓度的所述糖类：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；其中所述重量百分浓度以所述基质的总重量为基础。在一个实施方式中，所述糖类为：蔗糖、果糖、麦芽糖或其组合。
在一个实施方式中，所述共同培养中，所述酵母菌及所述根霉菌的总菌数为2×104至2×108cells/mL；其中cells/mL以所述共同培养的总体积为基础。在一个优选的实施方式中，所述共同培养中，所述酵母菌及所述根霉菌的菌数比值为0.5至1；在一个更为优选的实施方式中，所述酵母菌及所述根霉菌的菌数比值为0.5。
在一个实施方式中，所述根霉菌包含少根根霉菌、中华小孢根霉菌或其组合。在一个优选的实施方式中，所述根霉菌包含少根根霉菌及中华小孢根霉菌。
在一个实施方式中，所述共同培养为厌氧培养。在一个实施方式中，本发明所述的“厌氧培养”为如本领域中公知的定义。在一个实施方式中，本发明所述的“厌氧培养”是指含氧量不高于8％的培养状态。
在一个实施方式中，本发明所制得的酸桔酿造物包含1.5至4.5mg/g的总多酚；其中所述mg/g以所述酸桔酿造物的总重量为基础。在另一个实施方式中，所述酸桔酿造物包含0.3至2.0mg/g的总类黄酮；其中所述mg/g以所述酸桔酿造物的总重量为基础。在一个优选的实施方式中，本发明所制得的酸桔酿造物包含至2.0至3.5mg/g的总多酚，以及0.5至1.5mg/g的总类黄酮；其中所述mg/g以所述酸桔酿造物的总重量为基础。
本发明的第二个方面涉及一种抗发炎的药物组合物及酸桔酿造物在制备抗发炎的药物组合物中的用途。本发明所述的“抗发炎”是指预防、减轻或消除人体或动物体内局部或全面的发炎反应。所述药物组合物包含有效量的本发明的酸桔酿造物以及药学上可接受的载剂。本发明所述的“药学上可接受”是指不会负面影响所述药物组合物的活性成分的效果，不会与该活性成分产生不良反应，且不对被施予者产生药学上无法接受的不良副作用。所述药学可接受的载剂包括但不限于：水、醇、甘油、甲壳素、海藻酸盐、软骨素、维生素E、矿物质、二甲亚砜或其组合。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物可制剂成以经口、经鼻、经皮肤、肌肉注射、静脉注射或其组合的方式施用。在一个优选的实施方式中，根据所述药物组合物的剂型选择所述药学上可接受的载剂。
本发明所述的“有效量”是指足以发挥本发明所述的抗发炎效果的量。本领域普通技术人员应当可以理解，所述有效量可基于活体外试验或动物模型实验推算。此外，所述有效量亦可能因被施予者的身体状况及条件而有所变动。
以下实施例记载研发本发明所进行的试验，以进一步释明本发明的特征与优点。需要理解的是，所列实施例仅是示范性地例示本发明，不应用于限制本发明的专利申请范围。
实施例
实施例1：本发明酸桔酿造物的制备。
取约4.5公斤新鲜酸桔(本实验所用酸桔经测定具有糖酸比：1.86)，两次用水洗净后，将其全果实碎裂，并置入工厂型榨汁设备进行榨汁脱渣。再利用脱籽机去除榨汁后的果渣中残余的种籽，从而得到约1公斤无籽果渣。接着将得无籽果渣密封保存于培养室，在60℃下反应48小时(陈化反应)。然后，再使所述果渣在50℃下进行除湿干燥4小时；随后利用射频辅助热风杀菌技术，以热风50℃、频率40.68MHz、极板间距130cm的条件，将上述所得的半干燥果渣处理120秒，进行灭菌步骤。根据检测结果，经处理后的果渣与未经所述陈化反应、干燥及杀菌步骤处理的果渣相比，具有更少的总细菌数及霉菌数(表1)。
表1：
Figure GDA0003440106170000051
将所述酸桔果渣加入含15wt％蔗糖的蒸馏水(1.5升)，并搅拌均匀。接着再加入不同微生物(表2)以制得混合物。将所述混合物置于室温密封厌氧发酵30天，可得酒精度为约5％的发酵物。取1/2体积所述发酵物进行离心过滤后，收集上清液，再进行浓缩与干燥，可得约105克的淡褐色胶状酿造物，即为本发明的酸桔酿造物。
实施例2：检测本发明的酸桔酿造物的总多酚含量、总类黄酮含量及抗发炎效果。
检测本实验所得酸桔酿造物中所含总多酚含量及总类黄酮含量。本实验中所用检测方法大致为：
总多酚化合物含量分析：取1mL的0.2N Folin试剂，在试管中依次加入0.2mL 25至200ppm的待测样品或没食子酸以及0.8mL的7.5％碳酸钠溶液，均匀震荡混合后，在室温下静置30分钟，测定波长765nm下的吸光值变化。所测得待测样品的浓度则换算为以没食子酸的浓度表示。
总类黄酮含量分析：取待测溶液(100mL)，加入30mL的5％亚硝酸钠反应6分钟。然后加入5％硝酸铝再反应6分钟后，随即加入100mL的1M氢氧化钠，在10分钟后测定波长515nm下的吸光值变化。以芸香素(rutin)取代待测样品，重复上述分析步骤，以作为样品分析所需的标准曲线，并以“g芸香素/g干燥粉末”作为酸桔果渣总类黄酮含量单位的表示方式。
检测结果如表2所示。该结果显示，与微生物共同培养可提高酸桔酿造物的总多酚含量及总类黄酮含量，其中又以采用酵母菌、少根根霉菌及中华小孢根霉菌的组具有最高的总多酚含量及总类黄酮含量。
表2：
Figure GDA0003440106170000061
*样本1中三种菌株的菌数比例为1:1:1。
进一步地，检测与酵母菌、少根根霉菌及中华小孢根霉菌共同培养所得的酸桔酿造物(样品1)的抗发炎效果，并与未经共同培养的组(样品5)比较。对抗发炎效果的这一检测以脂多糖(LPS)诱发小鼠发炎反应的模式进行，其步骤大致为：将小鼠巨噬细胞株RAW264.7放入含有DMEM培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium，10％胎牛血清及NaHCO3(3.7g/L))的96孔板中培养过夜(5％CO2，37℃)。然后，将细胞分成两组：一组在培养液中添加1μg/mL的LPS；另一组不添加LPS作为对照组。接着，在两组中分别加入不同浓度(20、10 5、2.5、1.25、0.62、0.31μg/mL)的待测物，并共培养24小时。然后，取细胞上清液100μL与100μL格里斯试剂(v/v 1:1，1％磺胺和2.5％H3PO4中0.1％的N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐)在96孔板中混合5分钟，最后再用酶联免疫检测仪测量波长540nm下的吸收值，吸光值越高代表NO量越多。细胞存活率则以MTS方法测定，在上述实验的96孔板中加入MTS溶液(RPMI1640中16.7％的MTS)反应10分钟后，用酶联免疫检测仪测量波长490nm下的吸收值，最后计算个别待测物加LPS组相对于不加LPS组的细胞存活率。检测结果如下表3所示，样品1的一氧化氮抑制浓度为样品5的约1.6倍，显示本发明的酸桔酿造物确实具有抗发炎的优异效果。
表3：
Figure GDA0003440106170000071
实施例3：检测本发明的酸桔酿造物中所含主要化学成分。
为进一步确认本发明酸桔酿造物的主要化学性成分，利用高效液相层析设备，针对上述样品1及样品5，进行化学性指针成分分析。该高效液相层析的实验条件如下所述：
以1mL/分钟的流速及320nm的吸收波长分析60分钟，其分析条件如下：0.1～50分钟：15％→90％含0.1％甲酸的乙腈水溶液(ACN)；50.1～55分钟：90％ACN；55.1～60分钟：90％→15％ACN。
请参见图1。该附图示出了酸桔果渣酿造物经HPLC定性分析后的指纹图谱(320nm)，类黄酮类化合物1-5分别代表柚皮苷(naringin(1)；17.1分钟)、橙皮苷(hesperidin(2)；17.1分钟)、甜橙黄酮(sinensetin(3)；35.0分钟)、陈黄皮酮(nobiletin(4)；36.8分钟)及橘皮素(tangeretin(5)；38.9分钟)，其中化合物1和2为重叠信号。另外，与样品5相比，样品1中的类黄酮类化合物含量显著增加(表2)，此结果亦可支持本发明的酸桔酿造物与未经发酵处理的酸桔果渣相比，具有更好的抑制一氧化氮生成的抗发炎活性。

Claims (11)

1.一种酸桔酿造物，其包含附图1所示的高效液相层析图谱；其中所述高效液相层析的条件为：固定相为碳18反相层析管柱，流动相为含0.1％甲酸的乙腈水溶液，且所述乙腈水溶液的乙腈浓度梯度为60分钟内由15％升至90％；以及测定波长为320nm；
其中所述酸桔酿造物包含3.06±0.28 mg/g的总多酚及1.18±0.05 mg/g的总类黄酮，且所述总类黄酮包含柚皮苷、橙皮苷、甜橙黄酮、陈黄皮酮及橘皮素。
2.一种酸桔酿造物的制备方法，其包含以下步骤： 取得基质，其包含酸桔果渣；及 将所述基质与酵母菌及根霉菌共同培养以取得所述酸桔酿造物；
其中所述根霉菌是少根根霉菌及中华小孢根霉菌，
其中所述酵母菌：所述少根根霉菌：所述中华小孢根霉菌的菌数比为1：1：1。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中所述酸桔果渣为酸桔的全果实无籽果渣。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其中所述酸桔的糖酸比为1.5至2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其中在取得所述基质之前，将所述酸桔果渣置于40至80°C中40至60小时，以进行陈化反应。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中在取得所述基质之前，干燥经所述陈化反应的所述酸桔果渣。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其中所述酵母菌及所述根霉菌的总菌数为2×104至2×108 cells/mL；其中cells/mL以所述共同培养的总体积为基础。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述酵母菌及所述根霉菌的菌数比值为0.5至1。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其中所述基质进一步包含10至20重量百分浓度的糖类；其中所述重量百分浓度以所述基质的总重量为基础；所述糖类为：蔗糖、果糖、麦芽糖或其组合。
10.一种根据权利要求1所述的酸桔酿造物或根据权利要求2所述的方法所制得的酸桔酿造物在制备抗发炎的药物组合物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述药物组合物包含有效量的所述酸桔酿造物以及药学上可接受的载剂。
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