KR20020071390A

KR20020071390A - 미생물을 이용한 히알루론산의 제조방법

Info

Publication number: KR20020071390A
Application number: KR1020010011524A
Authority: KR
Inventors: 이종하; 박종호; 오승민
Original assignee: 이종하
Priority date: 2001-03-06
Filing date: 2001-03-06
Publication date: 2002-09-12

Abstract

가.청구범위에 기재된 발명이 속하는 분야

본 발명은 미생물을 이용한 히알루론산의 제조방법에 관한 것으로, 특히 생산물의 증가에 있다.

나.발명이 해결하려는 기술적과제.

본 발명은 히알루론 산의 생산량을 증가시키는 문제를 해결하고 있다.

여기서 제시된 결과는 다음을 통해 이룩된 것이다.

즉, 히알루론 산을 획득하는 방법에는 다음과 같은 과정들이 규정되어 있다.

다.발명의 해결방법의 요지.

사용균주를 Streptomyces violascense FERM BP-11132이라는 미생물을 이용항 배지조성과 최적화 발효조건을 구비하여 배양상층액을 회수하여 히알루론산을 정제토록 한 것이다.

라.발명의 중요한 용도.

미생물을 이용한 히알루론산의 제조

Description

미생물을 이용한 히알루론산의 제조방법{Manufacture method of hyluronic acid utilizing a microbe}

본 발명은 생화학 분야와 관련이 있는데 보다 구체적으로는 의술 분야와 화장품에서 점탄성 및 수분유지를 위한 수단으로서 사용되는 히알루론 산(HA)을 획득하는 방법에 관한 것이다.

종래에도 다양한 그람양성과 그람음성적인 미생물들로부터 히아루론산을 습득하는 방법들이 잘 알려져 있다.(미국 특허 번호 3988205호 일본 특허 번호 59-185150, 일본 특허번호 60-80949).

이러한 방법들의 결점은 목표로 하는 생산물의 산출량이 적다는 것이다(배양액의 2-4g/ℓ를 넘지 않는다).

즉 히알루론산을 제조하는 방법으로는 사용되는 미생물들로서 Streptococcus equi BP-879 또는 Streptococcus Zooepidemicus BP-878들이 사용되며 호기적 발효는 물로 이루어진 배양기 속에서 25-40℃, pH 6.5-8.0인 조건 하에서 24-48시간 동안 진행된다.

이 때 배양기는 질소와 탄소의 발생원들과 미네랄 소금, 세균성 효모 리소자임(lysozyme), 표면적으로는 활발한 물질들, 그리고 닭, 양, 말 또는 인간의 혈청을 함유한다.

목표로 하는 생산물은 이온 교환수지에서 크로마토그래피로 정제한다.

이 때에 분자량이 0.6-2·10^??D(달톤)이고 단백질 함유량이 0.05%미만이며 순수 점성률이 12-17.3 length/g인 히알루론산이 얻어진다.

그러나 이러한 방법이 가진 단점은 히알루론산의 산출량이 적다는데 있다. (5.2-5.8g/ℓ).

본 발명은 HA의 산출량을 높이는 문제를 해결하고 있다. 이러한 결과를 얻기 위하여 사용균주를 Streptomyces violascense FERM BP-11132이라는 미생물을 이용항 배지조성과 최적화 발효조건을 구비하여 배양상층액을 회수하여 히알루론산을 정제토록 한 것이다.

도 1은 본 발명의 제조공정을 도시한 블럭도이다.

이하 일 실시 예에 의거 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

우선 질소와 탄소의 발생원들과 미네랄 소금, 그리고 세균성 효모들을 함유하고 있는 물로 이루어진 배양기에서 생산되는 미생물을 온도 25-40℃, pH 6.5-8.0에서 호기(好氣)적 발효를 시킨다.

그후 원심분리기로 분리하여 균사체를 제거하고, 이온 교환수지(ion 交換樹脂)에서 위에 뜬 용액을 색층분석(chromatography)적으로 정제하여 생산하는 미생물로서는 Streptomyces violascense FERM BP-11132를 이용한다.

이때 발효는 36-96시간 동안 진행되며 배양기 속의 성분에는 질량%로 계산하여 카세인 1.0-2.0, 옥수수 전분 0.8-1.8, 고기로부터 추출한 추출물 0.6-1.2, 콩가루 0.5-1.0, 포도당 0..4-0.7, 염화 나트륨 0.4-0.6, 염화 마그네슘 0.3-0.5, 황산 아연 0.2-0.4, 염화 코발트 0.1-0.2들이 들어간다.

세균성 효모로서는 (곰팡이(버섯) Aspergillus oryzae 균사체로 된 환약으로 조제한 약제의 표본을 0.1-0.2g/ℓ씩 사용하고 이온 교환수지로서는 비스테로이드계 아미노 에틸셀룰로스를 사용한다.

크로마토그래피 정제에 앞서 위에 뜬 용액을 3-4용량의 아세톤으로 정련하고 침전물은 물에 녹인다.

기술상의 과정을 실현한 결과로 분자량이 1.8-2.4·10??D이고 단백질 함유량이 0.05%미만이며, 순수 점성률이 15-18length/g인 히알루론산이 얻어진다.

즉, 이러한 지수들에 따르면 이 히알루론산은 기존의 방법을 통해 획득되는 히알루론산의 표본에 뒤지지 않는다.

오히려 히알루론산의 산출량은 1.7-2.1배 증가하여 8.8-12.2g/ℓ가 된다.

실시 예 1.

질량%로 계산하여

카세인 1.0

옥수수 전분 0.8

고기 추출물 0.6

콩가루 0.5

포도당 0.4

NaCl 0.4

MgCl₂·6H₂ O.03

ZnSO₄·7H₂ O.02,

CoCl₂ 0.1

버섯 Aspergillus oryzae 균사체로 된 환약으로 조제한 약제 0.1g

pH6.5등을 함유하고 있는 0.5ℓ의 물로 이루어진 살균 배양기 속으로 배양균 Streptomyces violascense FERM BP-11132를 집어 넣고 호기적 환경(1분에 소독된 공기 0.5용량)에서 25℃로 36시간 동안 인공적으로 부화시킨다.

균사체들은 원심 분리기(3000용량/분, 15분)로 분리한다.

위로 뜬 용액 450㎖에 아세톤 1350㎖(용량3)를 첨가하고 1시간에 걸쳐 형성되는 침전물을 여과하여 100㎖의 물에 용해시킨다.

이 용액은 비스테로이드계 아미노 에틸셀룰로스로 된 소(小)기둥(1??40㎝)으로 통과시킨다.

기둥은 pH 7.4인 인산염으로 된 완충 용액으로 세척한다.

용출액(eluat)의 활발한 분류물(分溜物)들을 승화시켜서 건조하여 분자량이1.8·10^??D이고 단백질 함유량이 0.04%이며 순수 점성률이 15 length/g인 히알루론 산 4.4g(산출량 8.8g/ℓ)을 획득한다.

실시 예 2.

mac.%로 계산하여

카세인 1.5

옥수수 전분 1.4

고기 추출물 0.9

콩가루 0.75

포도당 0.55

NaCl 0.5

MgCl₂·6H₂ O.04

ZnSO₄·7H₂ O.03

CoCl₂ 0.15

버섯 Aspergillus oryzae 균사체로 된 환약으로 조제한 약제 0.1g

pH 7.2등을 함유하고 있는 0.5ℓ의 물로 이루어진 살균 배양기 속으로 배양균 Streptomyces violascense FERM BP-11132를 집어 넣고 호기적 환경(1분에 소독된 공기 0.5용량)에서 32℃로 66시간 동안 인공적으로 부화시킨다.

균사체들은 원심 분리기(3000용량/분)로 분리한다.

위로 뜬 용액 450㎖에 아세톤 1575㎖(용량3.5)를 첨가하고 1시간에 걸쳐 형성되는 침전물을 여과하여 100㎖의 물에 용해시킨다.

기둥은 pH 7.4인 인산염으로 된 완충 용액으로 세척한다.

용출액(eluat)의 활발한 분류물(分溜物)들을 승화시켜서 건조하여 분자량이 1.95·10^??D이고 단백질 함유량이 0.03%이며 순수 점성률이 16.5 length/g인 히알루론 산 5.25g(산출량 10.5g/ℓ)을 획득한다.

실시 예 3.

질량%로 계산하여

카세인 2.0

옥수수 전분 1.8

고기 추출물 1.2

콩가루 1.0

포도당 0.7

NaCl 0.6

MgCl₂·6H₂ O.05

ZnSO₄·7H₂ O.04

CoCl₂ 0.2

버섯 Aspergillus oryzae 균사체로 된 환약으로 조제한 약제 0.1g

pH8.0등을 함유하고 있는 0.5ℓ의 물로 이루어진 살균 배양기 속으로 배양균 Streptomyces violascense FERM BP-11132를 집어 넣고 호기적 환경(1분에 소독된 공기 0.5용량)에서 40℃로 96시간 동안 인공적으로 부화시킨다.

균사체들은 원심 분리기(3000용량/분)로 분리한다.

위로 뜬 용액 1800㎖에 아세톤 1350㎖(용량 4)를 첨가하고 1시간에 걸쳐 형성되는 침전물을 여과하여 100㎖의 물에 용해시킨다.

기둥은 pH7.4인 인산염으로 된 완충 용액으로 세척한다.

용출액(eluat)의 활발한 분류물(分溜物)들을 승화시켜서 건조하여 분자량이 2.4·10^??D이고 단백질 함유량이 0.04%이며 순수 점성률이 18 length/g인 히알루론 산 6.1g(산출량 12.2g/ℓ)을 획득한다.

출원된 대상과 기존의 방법들의 기술 및 경제적 지수들에 대한 비교 분석은 다음에 나오는 표를 통해 수행하였다.

HA 획득법	산출량, g/ℓ	분자량,D(달톤)	단백질 함유랑,%	순수 점성률lenght/g
기존의 방법(특허번호 5071751,미국)	5.2-5.8	0.6-10⁶	< 0.05	12-17.3
출원된 방법	8.8-12.2	1.8-2.4 ·10⁶	< 0.05	15-18

본 발명에서는 물리 및 화학적 지수들에 있어서 기존의 방법에 뒤지지 않으면서도 산출량(1.7-2.1배)을 많이 낼 수 있는 HA표본을 획득할 수 있게 해 준다.따라서

Claims

질소와 탄소의 발생원들과 미네랄 소금, 그리고 세균성 효모들을 함유하고 있는 물로 이루어진 배양기에서 생산되는 미생물을 온도 25-40℃, pH 6.5-8.0에서 호기(好氣)적 발효를 시킴. 원심분리기로 분리하여 균사체를 제거, 이온 교환수지(ion 交換樹脂)에서 위에 뜬 용액을 색증 분석(chromatography)적으로 정제함을 특징으로 하는 미생물을 이용한 히알루론산의 제조방법.
제1항에 있어서, 미생물로서는 Streptomyces violascense FERM BP-11132를 이용함을 특징으로 하는 미생물을 이용한 히알루론산의 제조방법.
제1항에 있어서, 발효는 36-96시간 안 진행되며 배양기속의 성분에는 질량%로 계산하여 카세인 1.0-2.0 옥수수 전분 0.8-1.8 고기로부터 추출한 추출물 0.6-1.2 콩가루 0.5-1.0 포도당 0..4-0.7 염화 나트륨 0.4-0.6 염화 마그네슘 0.3-0.5 황산 아연 0.2-0.4 염화 코발트 0.1-0.2 물을 사용함을 특징으로 하는 미생물을 이용한 히알루론산의 제조방법.
제1항에 있어서, 세균성 효모로서는 버섯 Aspergillus oryzae 균사체로 된 환약으로 조제한 약제 표본을 0.1-0.2g/ℓ씩 사용하고 이온 교환수지로서는 비스테로이드계 아미노 에틸셀룰로스를 사용함을 특징으로 하는 미생물을 이용한 히알루론산의 제조방법.
제1항에 있어서, 크로마토그래피 정제에 앞서 위에 뜬 용액을 3-4용량의 아세톤으로 정련하고 침전물은 물에 녹임을 특징으로 하는 미생물을 이용한 히알루론산의 제조방법.