JPS5867188A - 生物学的活性物質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、病原性菌として知られているボルデテラ（Ｂ
ｏｒｄｅｔ＊Ｉ１ｍ）属に属する微生物を利用した生物
学的活性物質の製法と、その際に使用される培地に関す
る。 ボルデテラ属に属する微生物としては、白日咳薗、パラ
百日咳菌、気管支歇１１１ｆＩ！ｌＩ等があり、これら
け穐々の生物学的活性物質を産生する。 例えば、百日咳Ｉ相曹の培養物（培養培地と菌体）から
は、各種糖尿病治療乃至予防薬としての展開が期待しう
るところの、インシュリン分泌増強活性物質（ｌ５ｌｅ
ｔ　ａｃｌｌｖａｔｌａｇ　ｐｒｏｌｅｌａ。 以下ＩＡＰと略記する）や、自日咳菌のワ）チンフンボ
ーネントとして注目されている１５６１球増加因子（Ｌ
ｅｍｃｏｃｙｔｏｓｌｉ　Ｐｒｏａ＋ｏｔ１ｍｇ　Ｆａ
ａｔｏｒ　。 以下ＬＰＦと略記する）等、医療上有効な生物学的活性
物質が得られる。 ところが、百日咳！相曹は相変化をおこし易く安定した
培養が−シ（、その結果曹の初原性。 ｗ４１１性、ＬＰＦ−生能あるいけ■＾Ｐ産体能が培養
条件によって着しく異なるという問題点があった。かか
る問題点を解消する試みが従来性なわれてきた。 例えば、ρワットら（Ｒｏｗａｌｔ鳶、ジャーナルオフ
　　ジェネラル　マイクロバイオρジー（Ｊ。 ｇａｍ、　　ＭＩｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ）　　　１　　
７　巻　、　　　！７Ｇ−２９６　　頁及び２會フ−３
！６買、１＠ｌｉ７年）によればボルデテラ属の微生物
、とりわけ百日咳Ｉ相菌の培養を抑制する因子としては
、以下のものが挙げられている。（１）システィ／の加
熱（オートクレーブ）処１１によって得られるコーイド
状サルファイド又はサルファー、（りカゼイン加水分解
物のオートクレーブ処１１により得られる過酸化水嵩又
は有機過酸化物、（Ｓ）曹が二次的に産生ずる不飽和ｌ
／ＩＩ肪蒙、とりわけオレイン酸。そしてこれらの抑制
効果を打消す培地への添加物とし

【、（１）Ｋ関しては
７に７′１７．赤血球又はその破砕物、活性脚、イオン
交換樹脂、（２１に関してはカタラーゼ、ヘミン、　　
Ｆｅ２Ｏ２、（１１に関してはスターチ、７ミρ−ス、
デキストリン等が挙げられているが、これら添加物の効
果は菌の飯種数が１×１０６個以下では不安定である。 また活性炭、イオン交換樹脂、ア！−一スなどの吸着剤
の添加も効果があるとされるが、培地中に不均一な部分
を形成しやすく必ずしも十分なものであるとは言えない
。赤血球、フルプｌンなどの添加物は、これらが−ント
的に組成変化１−やすくヌ１度性し易いので、保をに適
し且つ安定した培地を調製するには適切でｉｔない。 近年、ステナー（８１ａ１ｍａｒ　）及びシ！１ルテー
（１ｉｃｈｏｌｔｅ　）　Ｋよつ【この百日咳Ｉ相菌の
大量培養のための合成培地が開発された（ジャーナル　
オフ　ジェネラル　マイクロバイオ−ジーＪ、ｇ＊ａ、
ＭＩｃｒｏｂｌｏｌ　　　）　　６　　！１４．　　　
ｆｔ　　１　　１　−　２　２　０　　員。 １９７１年）このステナー・シールデー培地（以下ａｓ
−１地と略記する）は天然物由来の血液及びポリペプト
ン等、ρント差に度動のオニらねる添加物を含まな（・
ため、菌の培地組成を厳密にコントーールし得るので、
ｌＩ性状に変化をもたらすことなく、培養を行い得るこ
と、及び前述したＩＡＰもしくはＬＰＦの如き生物学約
活性物質の分−〇ｆｌｌＨＫ際し、不要な他種蛋白質の
爽雑を防ぎ帰る噂の特長を有すので近年百日咳ワクチン
及′び百日咳菌よりの生物学的活性物質な工秦約規模で
製造するのに広く用いられているが、攪拌下もしくけ静
置下の触体培養条件で、肴に嫉種サイズが１０テコｐニ
ー／ｌＩｊ以下の揚台、ＬＰＦの巌住能力等の点で安定
な住冑轡性が得られないという欠点を有する。また８１
Ｊｌｌ堆に＠天をＬ！−となるように加え【同化して得
た嘩天１１以下８８ム培地と略記する）では、１０１コ
ー息−数似下の播１１（シード）での：Ｉｐ五−形成は
曽められないという大ぎな欠陥を有する。 本発明者らは、従来技摺り欠点な改良し、ボルデテラ属
に属する微生物がら安定にがっ効率良く生物学的活性物
質を帰るべく鋭意研兜の結果、本発明に到達した。 即ち１本発明はボルデテラ属に属する微生物を、シクロ
デキストリン又はその誘導体を含有する培地で培養し、
培養物（培養培地と酸体）から生物学的活性物質を採取
することを！１とする、生物学的活性物質の製法と、そ
の際に使用される培地である。 本発明に２けるボルデテラ属に属する微生物ｔ°は、百
日咳菌・、パラｈ日＃；、ｌｆ、気管支敗血症菌ないう
。本発明において好ましく用いられるのは百日咳菌であ
り、なかでも百日咳１相謔が好ましい。 ボルデテラ属に属する微生物の曹学的性質反び培養条件
等に関しＣは、　Ｂｅｒｇｙｉ　Ｍｍａｕａｌ　ａｔＤ
＠ｔ＊ｒａ＋Ｉａａｔｌｖｓ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ　、＠　１１版、１９７４年、　Ｔｈｅ　Ｗｌｌｌｉ
ａａ＋ｉ　＆　Ｗｌｌｌｋｌａ＠Ｃｏ、発行やＪ。 ｌｘｐ　Ｍｇ２．　１　！　ｅ舎、第６！３−６６０員
。 １９６９年あるいは細菌学実習提要、第３版。 第ＪＩＯ′ｉＩ以下、昭和４７年、丸善発行等がありす
ｔ’に公知である。 シクーデキｙＬ）リンは、＃Ｉ粉あるいは澱粉の加水分
解物１（ｌａｃｌ目Ｉｌｓ　ｍａｃ・ｒａｎ・ａｎｓｙ
ｌａｓ＊（ｔｒａａｍｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｓ　）　　
等を作用さセて得られる、Ｄ−グ替コビラノース基が６
〜１０個α−Ｌ４グリコシド結合によって環状に結合し
た王冠状の分子である。そのうち主なものＧ言６ｆまた
は一個のＤ−ダリプビヲ／−ス基からなり。 それぞれト、β−１ｒ−シクロデキストリンと呼ばれて
いる０本発明におけるシクρデキス）ＩＩンとは、１記
α、β、ｒ等のシクロデキストリン又はそれらの混合物
をいう。 シターデキスＦリン分子は多数の１級及び２駿水−基を
有するので、単輪ｆｌＫ広く用いられている反応を適用
しｃ１１々の誘導体が得られる。 本発明におけるシクロデキストリン誘導体とはかかる方
法で得られる誘導体を意味し１例えば７４ノシクーデキ
ス目ンやア４ノデオキシシターデキストＵンの如き７９
ノ化鋺導体、７セチルシターデキストリンや＝トルシフ
−デキストリンの一−エステル化鱈導体、メチルシクー
デキストリン、エチルシクロデキストリン、プーピルシ
クｖ＝　ｆ　ｊＦストリン、カルボキシルメチルシフ−
デキストリンの如きエーテル化誘導体くエーテル什シク
ρデキヌトリン）がある。本発明において好ましいのは
エーテル化シクρデキストリンであり、中でもヘキサキ
ス（λ６−〇−ジメチル）α−シクーデキス％プ 好ましい。 本発明において培地とは、プイーンやペプトン水などの
従来公知の液状培地、あるいは歇状嶋地に鎌天、ゼラチ
ン、卵白、血清などを加えて固形にした従来公知の固形
培地を意味するが好ましいのはＳ８培地、及びこれに嘩
天を１〜２チ（Ｗ／Ｖ）程度添加し固化した８Ｂ培地で
ある。Ｓ８培地は、ｔｌあたり、グルタｌｙ麟ナトリク
Ａ、Ｉ−プｐリン、塩化ナトリクム。 リンＩｌ！水ｌＡηすＩ７ム、塩化カリワＡ、亀化マダ
ネシｆ）Ａ、塩化カルシクム、トリスヒトーキシメチル
７！ツメタンを、それぞれ１　Ｇ、　７．０．２４１５
、０．５．０．２．０．１．０．０２．■２５．９を含
む水ｍ液をＩＩＡ塩酸でｐＨ７，６に調整した後】２１
℃でｌｌｉ分間オートクレーブで滅菌して侍られる基礎
培地に、ｌ−シスチン、硫！１＃）鉄、７スコルビン際
、ニアシン、還元型グルタチオンな１７あたり、それぞ
れ４．１．２．０．４１　Ｏｇ含む溶液をミリホ７フィ
ルター（α４６μ）で除菌して得られるｍ液を、基礎培
地に対して１．０ｔＩ（Ｖ／Ｖ）の割合で加えて侮られ
る。 本発明において、前記培地に添加混合されるシクロデキ
ストリン又はその誘導体の量は、接極される菌のｉ＃に
依存するが、例えば、接種される脳が１０ｅ〜１０・プ
１＝　ニー／−の場合には、ｌｌ１７記培地Ｋ　１ｏ　
−５ｏ　ｏ　Ｏｔｔｌ／ｍ１．好ましくは１００〜１０
００μＩ／ｍ　の割合でシクロデキストリン又はその誘
導体を添加混合し、本発明において用〜・られる培地を
得る。かかるシクロデキストリン又はその誘導体の添加
培地、とりわけね加ｓ８培地は菌が安定に且つ効率良く
生育するのでｓｂｗ病治僚薬としての医薬効果が期待さ
れるＩ　ＡＰ、百日咳ワクチンコンポーネントとし

【期
待さねるＬＰＦ及び菌体ワクチン等の活性物質の製造上
極めて有利な培地である。 かかる培地を用いたボルデテラ属Ｋｊ！吋る微生物の培
養方法及び条件は特に隔室されるものではなく、従来公
知の方法及び条件を採用できるが、静置培養よりは振と
５培養の方が好ましく、培ｌＩ温度は３５℃前後、培養
時間は１０〜１００時間が適当である。 培養物（培養培地と菌体）から、生成された生物学的活
性物質を採取する方法１手段も％に制定されるものでは
なく、公知の方法２手段を利用できる。例えば、ＬＰＦ
を得るには、白日咳Ｉ相［・（ボルデテラ嗜バタシス東
浜株雪００μ９／―のメチルβ−シフ−デキストリンを
含むＳ８培地にて３５℃で１８時間培養し、盛られる培
＃液の遠心上清（ｐＨ＆６）を、　ｐ）ＩａＯのαＯＩ
Ｍリン酸ａｌＩＩＩ液で平衝化したハイドｐキシ７パタ
イトカヲムに通過ゼしめる。そ１−て、忰られる通過液
をｐＨｅｏ　　に読整した後、今度は、ｐＨａｏ　　の
Ｏ，ＯＩ　Ｍ　ＩＪン酪緩衝液で平拘什したハイドルキ
シアパタイトカラムに吸着させ、これを０．５　Ｍ塩化
ナトリウムを含む０１％７４９ン師Ｍ１１液＋１１Ｈ７
，０）で溶出して蛋白介助ｊを揚る。この蛋白分画をハ
ブトゲｐビ／−セファｇ−スを支持体とする７フイニテ
イークロマトグラフイーに吸着させ、　０．５　Ｍ　Ｎ
５Ｃｊ！　　及び３Ｍのチオシアン化カリウムを含む０
１Ｍトリス初鶴沿で脱着してり、ＰＦをイ’Ｊすること
ができる。 し下、実施例により本発明を詳述する。 実施例１ ホルデテラパタシス（Ｂｏｒｄｅｔｅ目ａ　ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）（Ｆ（日咳餉）Ｊ［浜株■相菌の凍結乾燥画
体を１チカザミノ酷溶液に懸濁させ、脱繊維属血１を２
０チ含むボルナ・ジャングー（Ｂｏｒｄｅｔ　−Ｇｅａ
ｇ＠ａ　）　　培地（ν下ＢＧ培地という）で３５℃、
３日間培養した。この菌を１白金耳かき取り、巣にＢＧ
培地で２４時間リフレッシュした菌をＳＳ培地に懸濁し
、接覆１１１懸濁液を得た。 この接ａｗｅ濁沿を、所定の濃度のＭｅβ−ＣＤを含む
６Ｓ培地に】Ｏマコロニー／蛇となる様に懸濁させ、静
置又は振と５条件下、３５℃で１８時間培養を行った。 培養後、培養液の濁度（〇ｍ−）を沖」定し、ｔＫに以
下の如き方法で産生されたＬＰＦを採増しその活性をｌ
ｌｉ定した。培養液の遠心上溝（ｐＨ＆６）を、ｐＨ８
，０の（ＬＯ３Ｍリン＠１ａｌＩＪ液で平衡化したハイ
ドルキシツバタイトカラムに通過せしめ、得られる通過
液をｐＨＩＩ　Ｏに調整した後、今度はｐＨ６０の仇０
１Ｍ！ｌン酌Ｎｉ術液で平衡化したハイドｐヤシアバタ
イートカーラムに吸着させ、これを０．６Ｍ塩化ナトリ
クムを酋むｏ、　Ｉ　Ｍ　１１７Ｗｉｌｔｔ衛ｍ　（ｐ
Ｈ７，０）　　”ｃｓ出ｔ、”ｃｚ自分画を得た。この
蛋白分−１をハプトグロビン−セフ７０−スを支持体と
する７フイニテイークｐ−ｆ）グラフィーに吸着させ、
Ｏ，Ｓ　Ｍ　ＮｓＣ／及び３Ｍのチオシアン化カリウム
を含む０．１　ＭトリスＭ術液で脱着してＬＰＦを得た
。 ＬＰＦ活性は、体験らの酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法、第
２８回毒素シンボジヮム（１９１１１年７月２３日〜２
４日、岩手県へ幡平）講演要旨集、第１４１〜＋　４４
ｊｉ参照）によって沖１足し、ＬＰＦの活性単位（ｕ）
は；ＯＤ４００ｍμが、単位容ｔ（ｌＬｔ）当りｏｌを
与える各サンプルの希釈倍数であられした。 結果を第１図忙示した。第１図から、Ｍｅβ−ＣＤ　は
、４！に振と５条件下で、菌体当りのＬＰＦｔ＋能を著
しく増大させていることがわがる。 なお、Ｍｅα−ＣＤ　　を用いた場合も、はは同様な結
果が得られた。 実施例２ 実施例１と同様の方法で得られた接種Ｗ懸濁液を、Ｍｅ
β−ＣＤ　　を５ｏｏμ９／＊含む８８培地１５０Ｍｔ
Ｋ＆、３　Ｘ　Ｉ　Ｑ’：１０ニ一／ｍとなる様に懸濁
させ、振と５条件下、３５℃で所定時間培質を行った。 培養時間と培ｌＩｌ液の濁度及び産生されたＬＰＦの量
（ＬＰＦ活性）との関係を第２図に示した。 なお、ＬＰＦ活性の測定は実施例１の茎合と同様にして
（工った。 第２図から、少なくとも培養時間が２０時間を越るとＭ
ｅβ−ＣＤの有無によって、培養水の濁度、即ち体育し
た菌の＃！！対量は大差がないが、産生されるＬＰＦの
′Ｉｋは著しく異なり、Ｍ６７７〜ＣＤの存在によって
百日咳蒙りＬＰＦ診生肚が著しく増大していることがわ
かる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、培地へのＭｅβ−ＣＤの添加誦と培養液の濁
度及び産生されたＬＰＦの量ＣＬＰＦ話性）との関係を
示す図である。１１℃２図は、絹地へのＭ・β−ＣＤＯ
）１加の有無の場合における。培養時間と培４に液の濁
度及びＬＰＦの量との関係を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌ　ボルデテラ（１ｏｒ４ｓｔｅｌｌａ）　ＪＩＫ属す
   る微生物を、シクロデキストリンスはその誘導体を含有
   する培地で培養し、培養物から生物学的活性物質な採取
   することを４Ｉ微とする、生物学的活性物質の製法。 ２　シクロデキストリンの誘導体がエーテル化シクロデ
   キスＦリンである１％許情求の範囲第１項記載の生物学
   的活性物質の製法。 東　エーテル化シクーデキストリンがメチルシクロデキ
   ストリンである。！許請求の範囲第！項紀１の生物学的
   油性物質の製法。 表　ボルデテラ属に属する微生物を培養し生物学約活性
   物質を＊生さセるための、シクーデャス）リン又はその
   １１４体を含有する培地。 艮　シクロデキストリン又はその誘導体を１０〜５ｏｏ
   ｏμｍｉ／１の割合で含有する、特許請求の範囲第４項
   記載の培地。