JPS6321469B2 - - Google Patents
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- JPS6321469B2 JPS6321469B2 JP60112286A JP11228685A JPS6321469B2 JP S6321469 B2 JPS6321469 B2 JP S6321469B2 JP 60112286 A JP60112286 A JP 60112286A JP 11228685 A JP11228685 A JP 11228685A JP S6321469 B2 JPS6321469 B2 JP S6321469B2
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、リンパ系細胞用培地に関し、詳しく
は、血清を実質的に含まないリンパ系細胞用培地
に関する。 〔従来の技術〕 リンパ系細胞を用いて有用な生理活性物質を得
ることを目的とした研究が活発化しており、特に
インターフエロン（IFN）やモノクロナール抗体
の開発については、癌の予防、治療への可能性を
秘めていることからその進歩には著しいものがあ
る。しかしながら、細胞培養上清液から生理活性
物質を大量に得、それを精製して利用するために
は技術的に大きな問題がある。 その一つは、細胞培養液に牛胎児血清（FBS）
などの血清を10％程度添加する必要があることで
ある。これらの血清は非常に高価であり、かつ原
因不明のロツト差があるため、大量に細胞を培養
するには問題があつた。さらに、これらの血清
は、多種類の異種蛋白を含むので、有用活性物質
を精製する際に大変な不都合が生じる。そこで血
清を含まない培地として、これまでに、血清の代
替として、インシユリン、トランスフエリン、表
皮性細胞増殖因子などの各種α増殖因子や血清ア
ルブミンなどの性格が明らかな蛋白を含む培地が
開発されてきた（D.Barnes、G.H.Sato、Cell、
22巻、649頁、1980年）。 また、細胞の増殖には血清の脂質成分が必要で
あり、脂質成分の担体としてサイクロデキストリ
ン（CD）が有効であることが知られている。 さらに動物細胞の無血清培養においてα−CD
と不飽和脂肪酸との抱接化合物は、血清アルブミ
ンの代替となることが知られている（特開昭56−
81600）。 いずれにしても従来知られているリンパ系細胞
を培養するための培地は、必ずしも大量にかつ細
胞を高密度で培養するためには充分満足できるも
のではなかつた。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従つて、この発明の目的は、リンパ系細胞を大
量かつ高密度で培養できる培地を開発することに
ある。 〔問題点を解決するための手段〕 我々は、以上のような問題点を踏まえ、鋭意検
討した結果、実質的に血清を含まず、0.05から２
ｇ／の範囲の２−、６−ジメチル−α−サイク
ロデキストリン（DM−α−CD）または２−、
６−ジメチル−β−サイクロデキストリン（DM
−β−CD）（以下DM−CD）を含む培地が、リ
ンパ系細胞の培養に適していることを見出した。 本発明における実質的な血清を含まない培地と
は、RPMI1640培地、ハムＦ−12培地、ダルベツ
コMEM培地などの培地を単独または混合した培
地又はこれらの改変培地に、血清を含まず、イン
シユリン、トランスフエリン、ステロイドホルモ
ンなどの各種増殖因子や、アルブミンなどの血清
蛋白成分を含有せしめた培地、具体的には、イス
コフ培地、RITC80−７培地、RITC57−１培地、
HB101培地などが含まれる。 本発明のDM−CDとは、グルコース残基の２
及び６位の水酸基がメチル化したグルコース単位
が６個（α）または７個（β）が環状になつたデ
キストリンであり、その培地中濃度範囲は、0.05
から２ｇ／、好ましくは0.1から１ｇ／であ
る。この範囲以下では、有意な効果が認められ
ず、これ以上では細胞に対する毒性が認められ
る。このDM−CDは、例えば、他の培地成分と
共に溶解後濾過滅菌して培地を調製することもで
きるが、DM−CDの粉末もしくは高濃度液を蒸
気加殺菌後、無血清培地に所定量を添加して用い
ることもできる。 本発明のリンパ系細胞としては、ヒト、マウ
ス、ラツト、ウシ、ハムスターなどの哺乳動物の
リンパ球または白血病由来細胞であつて、初代培
養細胞、リンパ腫、白血病、骨随腫瘍由来の細胞
株、リンパ球を片方の親細胞とするハイブリドー
マ、並びにウイルス等で変異した細胞株が含まれ
る。例えば、ヒト細胞では、BALL−１細胞、
UMCL細胞、ATL−２細胞、CCR−CEM細胞、
TALL−１細胞、RPMI1788細胞、HL−60細胞、
NALM−１細胞などがあげられ、動物細胞では、
Ｘ−5563細胞、BW5147細胞FS−６細胞やNS−
１細胞、SP−１細胞などを親株とするマウス脾
臓リンパ球のハイブリドーマなどがあげられる。 リンパ系細胞を培養する方法は、通常の浮遊細
胞培養用の容器または装置を用いればよく、細胞
を増殖させるための培養では、１〜５×105個／
mlの細胞密度で、37℃、５％CO2下、３〜５日間
培養させる。また、有用物質産生の効率的な培養
法としては、連続培養法がある。また、培地を交
換することによつて、細胞数５〜10×106／mlの
高密度で培養することも可能である。 〔発明の作用、効果〕 本発明による培地は、血清を含まないので、血
清を含むことによる種々の不都合がなく、また、
培地の保存安定性が高く、さらに、本発明の培地
を用いることにより５〜10×106／ml以上の細胞
密度で培養する高密度培養において、細胞の維持
率を有意に高め、インターフエロン、抗体などの
有用物質の産性を３〜５倍に増加せしめることが
できる。 実施例 １ 表１に示すRITC59−８培地に0.05％ヒト血清
アルブミン（HSA）を添加した培地を基礎培地
とし、これに各濃度DM−α−CD及びDM−β−
CDを添加した後、0.22μｍのメンブラン・フイル
ター（ミリポア社製）で濾過滅菌した。各々の培
地20mlをフアルコン社製3024フラスコに入れ、ヒ
ト臍帯血リンパ球をEpstain−Barrウイルスで変
異させ、INFを高単位に自発産生するUMCL細
胞を３×105個／mlの初発細胞濃度なるよう加え、
５％CO237℃にて４日間培養した。培養後、各々
の細胞密度をエオシンＹ染色法と血球計算盤にて
生細胞密度を計測した。培養後の細胞懸濁液の一
部を遠心分離により培養上清液を採取し、インタ
ーフエロン活性を測定した。
は、血清を実質的に含まないリンパ系細胞用培地
に関する。 〔従来の技術〕 リンパ系細胞を用いて有用な生理活性物質を得
ることを目的とした研究が活発化しており、特に
インターフエロン（IFN）やモノクロナール抗体
の開発については、癌の予防、治療への可能性を
秘めていることからその進歩には著しいものがあ
る。しかしながら、細胞培養上清液から生理活性
物質を大量に得、それを精製して利用するために
は技術的に大きな問題がある。 その一つは、細胞培養液に牛胎児血清（FBS）
などの血清を10％程度添加する必要があることで
ある。これらの血清は非常に高価であり、かつ原
因不明のロツト差があるため、大量に細胞を培養
するには問題があつた。さらに、これらの血清
は、多種類の異種蛋白を含むので、有用活性物質
を精製する際に大変な不都合が生じる。そこで血
清を含まない培地として、これまでに、血清の代
替として、インシユリン、トランスフエリン、表
皮性細胞増殖因子などの各種α増殖因子や血清ア
ルブミンなどの性格が明らかな蛋白を含む培地が
開発されてきた（D.Barnes、G.H.Sato、Cell、
22巻、649頁、1980年）。 また、細胞の増殖には血清の脂質成分が必要で
あり、脂質成分の担体としてサイクロデキストリ
ン（CD）が有効であることが知られている。 さらに動物細胞の無血清培養においてα−CD
と不飽和脂肪酸との抱接化合物は、血清アルブミ
ンの代替となることが知られている（特開昭56−
81600）。 いずれにしても従来知られているリンパ系細胞
を培養するための培地は、必ずしも大量にかつ細
胞を高密度で培養するためには充分満足できるも
のではなかつた。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従つて、この発明の目的は、リンパ系細胞を大
量かつ高密度で培養できる培地を開発することに
ある。 〔問題点を解決するための手段〕 我々は、以上のような問題点を踏まえ、鋭意検
討した結果、実質的に血清を含まず、0.05から２
ｇ／の範囲の２−、６−ジメチル−α−サイク
ロデキストリン（DM−α−CD）または２−、
６−ジメチル−β−サイクロデキストリン（DM
−β−CD）（以下DM−CD）を含む培地が、リ
ンパ系細胞の培養に適していることを見出した。 本発明における実質的な血清を含まない培地と
は、RPMI1640培地、ハムＦ−12培地、ダルベツ
コMEM培地などの培地を単独または混合した培
地又はこれらの改変培地に、血清を含まず、イン
シユリン、トランスフエリン、ステロイドホルモ
ンなどの各種増殖因子や、アルブミンなどの血清
蛋白成分を含有せしめた培地、具体的には、イス
コフ培地、RITC80−７培地、RITC57−１培地、
HB101培地などが含まれる。 本発明のDM−CDとは、グルコース残基の２
及び６位の水酸基がメチル化したグルコース単位
が６個（α）または７個（β）が環状になつたデ
キストリンであり、その培地中濃度範囲は、0.05
から２ｇ／、好ましくは0.1から１ｇ／であ
る。この範囲以下では、有意な効果が認められ
ず、これ以上では細胞に対する毒性が認められ
る。このDM−CDは、例えば、他の培地成分と
共に溶解後濾過滅菌して培地を調製することもで
きるが、DM−CDの粉末もしくは高濃度液を蒸
気加殺菌後、無血清培地に所定量を添加して用い
ることもできる。 本発明のリンパ系細胞としては、ヒト、マウ
ス、ラツト、ウシ、ハムスターなどの哺乳動物の
リンパ球または白血病由来細胞であつて、初代培
養細胞、リンパ腫、白血病、骨随腫瘍由来の細胞
株、リンパ球を片方の親細胞とするハイブリドー
マ、並びにウイルス等で変異した細胞株が含まれ
る。例えば、ヒト細胞では、BALL−１細胞、
UMCL細胞、ATL−２細胞、CCR−CEM細胞、
TALL−１細胞、RPMI1788細胞、HL−60細胞、
NALM−１細胞などがあげられ、動物細胞では、
Ｘ−5563細胞、BW5147細胞FS−６細胞やNS−
１細胞、SP−１細胞などを親株とするマウス脾
臓リンパ球のハイブリドーマなどがあげられる。 リンパ系細胞を培養する方法は、通常の浮遊細
胞培養用の容器または装置を用いればよく、細胞
を増殖させるための培養では、１〜５×105個／
mlの細胞密度で、37℃、５％CO2下、３〜５日間
培養させる。また、有用物質産生の効率的な培養
法としては、連続培養法がある。また、培地を交
換することによつて、細胞数５〜10×106／mlの
高密度で培養することも可能である。 〔発明の作用、効果〕 本発明による培地は、血清を含まないので、血
清を含むことによる種々の不都合がなく、また、
培地の保存安定性が高く、さらに、本発明の培地
を用いることにより５〜10×106／ml以上の細胞
密度で培養する高密度培養において、細胞の維持
率を有意に高め、インターフエロン、抗体などの
有用物質の産性を３〜５倍に増加せしめることが
できる。 実施例 １ 表１に示すRITC59−８培地に0.05％ヒト血清
アルブミン（HSA）を添加した培地を基礎培地
とし、これに各濃度DM−α−CD及びDM−β−
CDを添加した後、0.22μｍのメンブラン・フイル
ター（ミリポア社製）で濾過滅菌した。各々の培
地20mlをフアルコン社製3024フラスコに入れ、ヒ
ト臍帯血リンパ球をEpstain−Barrウイルスで変
異させ、INFを高単位に自発産生するUMCL細
胞を３×105個／mlの初発細胞濃度なるよう加え、
５％CO237℃にて４日間培養した。培養後、各々
の細胞密度をエオシンＹ染色法と血球計算盤にて
生細胞密度を計測した。培養後の細胞懸濁液の一
部を遠心分離により培養上清液を採取し、インタ
ーフエロン活性を測定した。
【表】
【表】
インターフエロン活性の測定方法は、WISH細
胞とVesicular stomatitis Virusを用い、マイク
ロタイタープレートにおける細胞変性阻止率を標
準ヒトインターフエロンを基準として測定した。
それらの結果を通常使用されている10％のウシ胎
児血清（FBS）を添加したRPMI1640培地を対照
培地として用いた結果と比べて表２に示す。 これらの結果から、DM−α−CDはUMCL細
胞の増殖とIFNの自発産生を増大せしめることが
認められる。
胞とVesicular stomatitis Virusを用い、マイク
ロタイタープレートにおける細胞変性阻止率を標
準ヒトインターフエロンを基準として測定した。
それらの結果を通常使用されている10％のウシ胎
児血清（FBS）を添加したRPMI1640培地を対照
培地として用いた結果と比べて表２に示す。 これらの結果から、DM−α−CDはUMCL細
胞の増殖とIFNの自発産生を増大せしめることが
認められる。
【表】
【表】
実施例 ２
実施例１に示す培地を調製し、各々100mlを用
いてBALL−１細胞を５×105個／mlの初発細胞
濃度となるように、ベルコ社製100ml用スピンナ
ー・フラスコに播き、５％CO2、37℃下回転数
80r.p.mで５日間培養した。培養後、実施例１と
同様に生細胞密度を計測し、培養後の細胞懸濁液
の一部を低速遠心分離により培養上清液を採取
し、ヒト免疫グロブリンＭ（IgM）をバイオラド
社製イムノフロー・キツトにより測定した。その
結果を、通常使用されている10％のFBSを添加
したRPMI1640培地を対照培地として用いた結果
と比べて、表３に示す。 これらの結果から、DM−α−CDまたはDM−
β−CDはBALL−１細胞の細胞増殖とIgM産生
を増大せしめることが認められる。
いてBALL−１細胞を５×105個／mlの初発細胞
濃度となるように、ベルコ社製100ml用スピンナ
ー・フラスコに播き、５％CO2、37℃下回転数
80r.p.mで５日間培養した。培養後、実施例１と
同様に生細胞密度を計測し、培養後の細胞懸濁液
の一部を低速遠心分離により培養上清液を採取
し、ヒト免疫グロブリンＭ（IgM）をバイオラド
社製イムノフロー・キツトにより測定した。その
結果を、通常使用されている10％のFBSを添加
したRPMI1640培地を対照培地として用いた結果
と比べて、表３に示す。 これらの結果から、DM−α−CDまたはDM−
β−CDはBALL−１細胞の細胞増殖とIgM産生
を増大せしめることが認められる。
【表】
実施例 ３
実施例１に示す培地を調製し、各々20mlを用い
てマウス白血病細胞X5563細胞を１×105個／ml
の初発細胞濃度となるようにフアルコン社製3024
フラスコに入れ、５％CO2、37℃下、４日間培養
した。培養後、実施例１と同様に生細胞密度を計
測した。その結果を10％のFBSを添加した
RPMI1640培地を対照培地として用いた結果と比
べて表４に示す。 これらの結果から、DM−α−CDまたはDM−
β−CDはX5563細胞の増殖を増大させること及
び血清アルブミンの必要量を低下せしめることが
認められる。
てマウス白血病細胞X5563細胞を１×105個／ml
の初発細胞濃度となるようにフアルコン社製3024
フラスコに入れ、５％CO2、37℃下、４日間培養
した。培養後、実施例１と同様に生細胞密度を計
測した。その結果を10％のFBSを添加した
RPMI1640培地を対照培地として用いた結果と比
べて表４に示す。 これらの結果から、DM−α−CDまたはDM−
β−CDはX5563細胞の増殖を増大させること及
び血清アルブミンの必要量を低下せしめることが
認められる。
【表】
実施例 ４
RITC59−８＋0.01％HSA培地を基礎培地と
し、DM−α−CDを添加した培地を調製した。
各々の培地20mlにUMCL細胞及びBALL−１細
胞を1.5×107個／mlに懸濁し、５％CO2濃度の保
温器中に設置したベルコ社製ロツキングプレート
にて15回／分の速度で、UMCL細胞は40時間、
BALL−１細胞は72時間揺動培養した。培養後、
各々の生細胞密度及びIFN産生並びにIgM産生量
を測定した。これらの結果を基礎培地に10及び20
％FBSを添加した培地を対照培地として用いた
結果と比較して表５に示す。 これらの結果からDM−α−CDまたはDM−β
−CDが細胞高密度培養における生細胞維持率と
物質産生を有意に増大せしめることが認められ
る。
し、DM−α−CDを添加した培地を調製した。
各々の培地20mlにUMCL細胞及びBALL−１細
胞を1.5×107個／mlに懸濁し、５％CO2濃度の保
温器中に設置したベルコ社製ロツキングプレート
にて15回／分の速度で、UMCL細胞は40時間、
BALL−１細胞は72時間揺動培養した。培養後、
各々の生細胞密度及びIFN産生並びにIgM産生量
を測定した。これらの結果を基礎培地に10及び20
％FBSを添加した培地を対照培地として用いた
結果と比較して表５に示す。 これらの結果からDM−α−CDまたはDM−β
−CDが細胞高密度培養における生細胞維持率と
物質産生を有意に増大せしめることが認められ
る。
Claims (1)
- １ 血清を実質的に含まず、0.05から２ｇ／の
範囲の２−、６−ジメチル−α−または−β−サ
イクロデキストリンを含有するリンパ系細胞用培
地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11228685A JPS61271986A (ja) | 1985-05-27 | 1985-05-27 | リンパ系細胞用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11228685A JPS61271986A (ja) | 1985-05-27 | 1985-05-27 | リンパ系細胞用培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61271986A JPS61271986A (ja) | 1986-12-02 |
| JPS6321469B2 true JPS6321469B2 (ja) | 1988-05-07 |
Family
ID=14582889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11228685A Granted JPS61271986A (ja) | 1985-05-27 | 1985-05-27 | リンパ系細胞用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61271986A (ja) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57138385A (en) * | 1981-02-18 | 1982-08-26 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Multiplying agent of lactobacillus bifidus |
| JPS57194787A (en) * | 1981-05-28 | 1982-11-30 | Ajinomoto Co Inc | Culture medium for animal cell |
| JPS5867182A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-04-21 | Teijin Ltd | 培養方法及び培地 |
| JPS5867188A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-04-21 | Teijin Ltd | 生物学的活性物質の製法 |
| JPS58179496A (ja) * | 1982-04-12 | 1983-10-20 | Takeda Chem Ind Ltd | ランカシジンの改良製造法 |
| JPS59184132A (ja) * | 1983-04-02 | 1984-10-19 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 百日ぜきワクチンの製造方法 |
-
1985
- 1985-05-27 JP JP11228685A patent/JPS61271986A/ja active Granted
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57138385A (en) * | 1981-02-18 | 1982-08-26 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Multiplying agent of lactobacillus bifidus |
| JPS57194787A (en) * | 1981-05-28 | 1982-11-30 | Ajinomoto Co Inc | Culture medium for animal cell |
| JPS5867182A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-04-21 | Teijin Ltd | 培養方法及び培地 |
| JPS5867188A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-04-21 | Teijin Ltd | 生物学的活性物質の製法 |
| JPS58179496A (ja) * | 1982-04-12 | 1983-10-20 | Takeda Chem Ind Ltd | ランカシジンの改良製造法 |
| JPS59184132A (ja) * | 1983-04-02 | 1984-10-19 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 百日ぜきワクチンの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61271986A (ja) | 1986-12-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |