SU1495374A1 - Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом - Google Patents
Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом Download PDFInfo
- Publication number
- SU1495374A1 SU1495374A1 SU874336184A SU4336184A SU1495374A1 SU 1495374 A1 SU1495374 A1 SU 1495374A1 SU 874336184 A SU874336184 A SU 874336184A SU 4336184 A SU4336184 A SU 4336184A SU 1495374 A1 SU1495374 A1 SU 1495374A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- cells
- strain
- medium
- growth
- serum
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к гибридомной технологии и может быть использовано при получении и культивировании гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела. Цель изобретени - получение штамма, способного продуцировать ростстимулирующие факторы гибридом в бессывороточной среде. Штамм LEBR 1/1 - SF получен в результате селекции трансформированных фибробластов подкожной соединительной ткани линии L на устойчивость к цитотоксическому действию бромистого этиди и характеризуетс свойствами, присущими клеткам мышиного происхождени . Штамм LEBR 1/1 - SF депонирован под номером ВСКК(П) N Д107. Клетки штамма способны к длительному размножению в среде без сыворотки, что обусловлено способностью клеток синтезировать собственные ростстимулирующие факторы.
Description
Изобретение относитс к гибридомной технологии и может быть использовано при получении и культивировании гибридных клеток, продуцирующих монокло- нальные антитела , примен емые в сельском хоз йстве, медицине и микробиологической промьшшенности.
Цель изобретени - получение штам ма клеток, способного продуцировать ростстимулирующие факторы гибридом в бессывороточной среде.
Штамм получен в результате селекции трансформированных фиброппастов. подкожной соединительной ткани линии L устойчивость к цитотоксическому действию бромистого этиди концентрации 1 мкг/мл и последующего суб- культивировани в среде без селективного агента и сыворотки крови в течение 1,5 года (111 пассажей). Штамм ,назван Lebr 1/1-Sf и депонирован под номером ВСКК (П) № 107 Д.
Стандартные услови выращивани . Штамм культивируют на смеси, состо щей из равных объемов ростовой среды Игла, модифицированной Дальбекко (ДМЕМ), и среды 199 без добавлени сьшортки крови. Культивирование провод т в инкубаторе при 37 С в герметических флаконах.
Культуральные свойства. Способ культивировани монослойный. При пересеве каждые 96 ч кратность рассева составл ет 1:3. Через 2 сут после пересева производ т смену культураль- ной среды. Дл пересева культуру пе4
со
СП
СО
ревод т в суспензию в конди1щониро- ванной среде с помощью резинового скребка и распредел ют так, чтобы кондиционированна среда составл ла 30% от объема свежей среды. При ука занных услови х культивировани посевна доза составл ет 1,0 10 клеток на 1 см
максимальна плотность попул ции равн етс 3,0 « 10 клеток ,
врем удвоени попул ции
на 1 см 48 ч.
При соблюдении описанных условий культивировани , клетки штамма хорошо распластьгоаютс на подлржке, имеют полигональную форму и образуют много слойные культуры.
Кариологическа характеристика штамма.
Анализ 100 метафазных пластинок хромосом, окрашенных по Гимза, показал , что число хромосом в клеткггх; штамма варьирует от 44 до 112, а мо- дальньш класс попул ции (58%) составл ют клетки с 56 хромосомами (40 од- но- и 16 двуплечих хромосом). Распределение клеток по числу хромосом представлено в таблице в процентах.
Маркерные признаки. К числу марткерньш признаков штамма относ тс / устойчивость к цитологическому действию бромистого этиди концентрации 1-5 мкг/мл и способность размножатьс в среде без сыворотки крови. Оба признака стабильно воспроизвод тс в р ду клеточных поколений и имеют генетическую природу. Наиболее ственным признаком клеток Lebr 1/1-S вл етс способность к длительному размножению в среде без сьторотки.
Название полезного вещества, продуцируемого штаммом, и его характе- ристика. Клетки Lebr 1/1-Sf синтезируют ростстимулируюш е факторы. Наличие таких факторов в среде, кондиционированной клетками штамма, установлено с помощью двух общеприн тых тестов. Присутствие ростстиму- лирующнх факторов обнаружено при клонировании минимально трансформированных клеток линии NRK в среде с агаром на облученной рентгеном (доза облучени 500 рад) культуре Lebr 1/1-Sf в отсутствии факторов сыворотки крови. В этих услови х эффективность клонировани клеток линии NRK составл ет 5 10 . Наличие рост стимулирующих факторов установлено также по увеличению интенсивности
0
0
5
включени Н-тимидина в стац юнарные культуры минимально трансформированных клеток линии ЗТЗ. С этой целью используют 9реду, корадиционированнук клетками штамма Lebr 1/1-Sf в течение 2 сут с момента пересева, Яераз- веденна кондиционированна среда, так же как и разбавленна в 2 или 4 раза, вызьгоает более чём 2-кратное увеличение включени Н-тимидина в стационарных культурах клеток ЗТЗ.
Среды, кондиционированные клетками Lebr 1/1-Sf, сохран ют полную ростстимулирующую активность по крайней мере в течение 3 нес хранени при - 20 С, Признак продукции фактора стабильно воспроизводитс в течение более чем 100 генераций, Рост- стимулируюш 1е факторы обнаруживают в культуральной среде. Концентраци общего белка через 2-3 сут в кондиционированной среде составл ет 2-, 5 мкг/мл,
Ростстимулирующую активность определ ют в тестах: стимул ци включени 3Н-тимидина в стационарной культуре минимально трансформированных клеток NIH ЗТЗ; индукци клонировани минимально трансформированных клеток NRK в среде с агаром, стимул ци размножени массовых культур гибридом- ных клеток в среде с пониженным содержанием сыворотки крови и увеличение эффективности клонировани гиб- ридомных клеток.
Способ криоконсервнровани . Клетки замораживают в смеси сред ДМЕМ и 199 (1:1 по объему) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого , скота и 10% DMSO, Режим замораживани : 1°С в 1 мин до -20°С, 5°С в 1 мин до -50°С и 10 С в 1 мин до . Клетки хран т в жидком азо- 5 те. Режим отогрева: вод на бан в течение 1 мин. (изнеспособ™ ность клеток после криоконсервации 75-80%.
Другие особенностей штамма. После подкожной инъекции 2-510 клеток на
5
0
0
5
мьш1ь опухоли формируютс у 20% мьшей линии СЗН.
Контаминации не обнаружено. Пример 1, Штамм Lebr 1/1-Sf используют дл получени кондиционированной среды, содержащей фактхэры, которые стимулируют размножение гибридом - продуцентов моноклональных антител. Кондиционированную среду
вании клеток Lebr 1/1-Sf на среде ДМЕМ и 199 (1:1 по объему) при 37°С через 2 сут после пересева. Среду отдел ют от клеток центрифугированием (5000 об/мин в течение 20 мин), хран т при - 20°С и используют дл культивировани гибридом - продуцентов моноклональных антител против антигенов эритроцитов крупного рогатого скота и свиней (штаммы 8Д9 и Д55). Дл этого сначала получают перито- неатальный эксудат мышей с помощью промывани брюшной полости мьпии линии BALB/c 5-ю мл ростовой среды следующего состава: среда ДМЕМ, содержаща 2 NLM глутамина, 1 мМ пиру- вата натри , 1 i;K неосновных аминокаждьп- день в течение 8 сут культивировани подсчитывают число клеток гибридомы в лунках и устанавливают титр антител в культуральнон жидкости . Титр антител определ ют с помощью реакции агглютинации эритроцитов.
Полученные результаты свидетельст10 вутот о том, что добавление к-среды в среду с пониженным содержанием сыворотки крови или ее полном отсутствии стимулирует размножение гибри- домных клеток: так величина макси15 мальвой плотности в среде с 2% сы- воротки составл ет 4,5 10 клеток на 1 мл, а в среде без сыворотки с питающим слоем МФ - 3,7 10 . , что незначительней отливаетс от таковой
кислот и 5 X 10- М 2-меркаптоэтанола 20 на среде с 10% сыворотки крови (5,2« (Гс) , После разбавлени до 24 мг Гс хЮ)... мере достижени максимальсуспен ию макрофагов (МФ) распредел ют по лункам двух 24-луночных панелей по 1,0-2,0 10 МФ в 0,5 мл среды на лунку и помещают в инкубатор (, 5-7% СО, 100% влажности). Через 1 сут после посева МФ клетки гибридомы осаждают центрифугированием (10 мин при 1000 об/мин), промыной плотности гибридомные клетки пересевают в среде, содержащей 25 или 50% к-среды и по крайней мере-в те- 25 чение 3 пассажей они сохран ют способность эффектно размножатьс в этих услови х. Титр антител в культу- ральной жидкости возрастает пропорционально количеству клеток гибридокаждьп- день в течение 8 сут культивировани подсчитывают число клеток гибридомы в лунках и устанавливают титр антител в культуральнон жидкости . Титр антител определ ют с помощью реакции агглютинации эритроцитов.
Полученные результаты свидетельствутот о том, что добавление к-среды в среду с пониженным содержанием сыворотки крови или ее полном отсутствии стимулирует размножение гибри- домных клеток: так величина максимальвой плотности в среде с 2% сы- воротки составл ет 4,5 10 клеток на 1 мл, а в среде без сыворотки с питающим слоем МФ - 3,7 10 . , что незначительней отливаетс от таковой
ной плотности гибридомные клетки пересевают в среде, содержащей 25 или 50% к-среды и по крайней мере-в те- чение 3 пассажей они сохран ют способность эффектно размножатьс в этих услови х. Титр антител в культу- ральной жидкости возрастает пропорционально количеству клеток гибридо
вают Гс, дел т на две части и повтор- в лукке и не зависит от содержано осаждают. Одну часть ресуспензиру-ни сыворотки крови в среде, при
ют в смеси, состо щей из равных объе-достижении максимальной плотности по-
нов Гс и к-среды, содержащей 2% эм-пул ции в среде без сыворотки титр
бриональной сыворотки крови, подсчи-ь оноклональных антител не отличаеттывают число клеток и после разбавле- .с от такового в среде с 10% сыворотни суспензии до концентрации 5 - 10ки крови,
клеток в 1 мл распредел ют по лункам Таким образом, использование
24 луночной панели, не содержащей МФк-среды штамма Lebr 1/1-Sf в качестве
(1 мл суспензии на лунку). Другуюисточника ростстимулирхтощих факторов,
часть ресуспензируют в к-среде и пос- Qпозвол ет не примен ть дорогосто щую
ле подсчета числа клеток и разбавле-эмбриональную сыворотку крови или ни до концентрации 1,0 10 клеток на 1 мл распредел ют по лункам 24-лу- ночной панели, содержащей МФ (0,5 мл суспензии на лунку), Аналогично призначительно снизить ее расход при культивировании гибридом - продуцентов моноканальных антител,
45
готавливают и распредел ют по лункам 24-луночно панели суспензию гибридом- ных клеток в Гс без добавлени к-среды с содержанием сыворотки 2 и 10%,
45
Claims (1)
- Формула изобретениШтамм культивируем1з1х клеток животных Mus musculus ВСКК (II) N 107 а также на панель с МФ в Гс без сы- 50 продуцент ростстимулируюпщх фак- воротки (контрольные услови ), Все торов гибридом.эмбриональную сыворотку крови илизначительно снизить ее расход при культивировании гибридом - продуцентов моноканальных антител,эмбриональную сыворотку крови или45Формула изобретениКоличество хромосом.. „ . „ 44 52 54 55 56 57 5822 2 4 58 12 12 6 2
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU874336184A SU1495374A1 (ru) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU874336184A SU1495374A1 (ru) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1495374A1 true SU1495374A1 (ru) | 1989-07-23 |
Family
ID=21339322
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU874336184A SU1495374A1 (ru) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1495374A1 (ru) |
-
1987
- 1987-11-30 SU SU874336184A patent/SU1495374A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Rathgen et al. Hybridoma, 1986, 5 (3),p. 255-263. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Park et al. | Mouse myeloma tumor stem cells: a primary cell culture assay | |
Dexter et al. | Proliferation of haemopoietic stem cells in vitro | |
KR860000897B1 (ko) | 인체 에리트로포이에틴의 제조방법 | |
US7070960B2 (en) | Method of increasing product expression through solute stress | |
Peck et al. | T lymphocyte responses to Mls locus antigens involve recognition of H-2 I region gene products | |
HU179655B (en) | Process for improving interferon-production | |
Paul | Quiescent SV40 virus transformed 3T3 cells in culture | |
JPS5863385A (ja) | 免疫系由来の細胞用培地 | |
KR860000900B1 (ko) | 인체 황체형성 호르몬의 제조방법 | |
Farach et al. | Developmental expression of a cell-surface protein involved in calcium uptake and skeleton formation in sea urchin embryos | |
Kuroki et al. | Malignant transformation of hamster embryonic cells by 4-hydroxyaminoquinoline N-oxide in tissue culture | |
CA1312030C (en) | Method to increase antibody titer | |
SU1495374A1 (ru) | Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом | |
Macieira-Coelho | The decreased growth potential in vitro of human fibroblasts of adult origin | |
Brunette | Cholera toxin and dibutyrl cyclic-AMP stimulate the growth of epithelial cells derived from epithelial rests from porcine periodontal ligament | |
Murakami et al. | Growth of mouse plasmacytoma cells in serum-free, hormone-supplemented medium: procedure for the determination of hormone and growth factor requirements for cell growth | |
Bradley et al. | Direct cloning of human parathyroid hyperplasia cells in soft-agar culture | |
DERWAHL et al. | Intercellular propagation of individually programmed growth bursts in FRTL-5 cells. Implications for interpreting growth factor actions | |
KR890002411B1 (ko) | 성인 t세포 백혈병 관련 세포주의 제조방법 | |
CN1656214A (zh) | 祖细胞在没有细胞因子存在条件下的生长和维持 | |
CA1163936A (en) | Mycoplasma-free hepatoma cell line | |
KR860000896B1 (ko) | 인체프롤랙틴(Human prolactin)의 제조방법 | |
RU2201958C2 (ru) | Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих | |
Watanabe et al. | THE RELATIONSHIP BETWEEN CELL‐SUBSTRATE ADHESIVENESS AND CELL GROWTH: A STUDY ON CHONDROCYTES CULTURED IN VITRO WITH CONDITIONED MEDIUM | |
Sommerville | Serotype transformation in Paramecium aurelia: antigen synthesis after a temperature change |