CN1656214A - 祖细胞在没有细胞因子存在条件下的生长和维持 - Google Patents

Abstract

本文涉及在缺乏外源性造血生长因子的条件下，造血祖细胞体外培养所用的方法和装置。造血祖细胞在缺乏外源性添加的造血生长因子的条件下进行培养，但祖细胞的数量和/或功能不会降低，同时保持了祖细胞的多能性。

Description

祖细胞在没有细胞因子存在条件下的生长和维持

发明领域

本发明通常涉及造血细胞，更具体地涉及到造血祖细胞的体外培养方法。

发明背景

循环的血液细胞，比如红血球、白血球、血小板以及淋巴细胞都是可辨别母体终末分化的产物。在正常的成人中，可辨别母体只在中轴骨骼的骨髓腔中发生末期分化，但有些分化延伸到了邻近的腿节、肱骨及椎骨中。这些母体细胞是从被称为祖细胞的细胞衍生出来的，祖细胞是一种发育极不完全的细胞，祖细胞在诸如甲基纤维素这样的半固体介质中培养1-3星期后可发育到相邻的成熟血液细胞集落中，通过这种方式可对祖细胞进行分析测定。

人体骨髓细胞培养物最初被发现具有有限的造血能力，但产生的造血祖细胞数量和成熟血液细胞数量会越来越少，并在6～8星期后停止了细胞生成。而且随后对原系统进行的改动也只取得了微小的改善。这在很大程度上是因为造血祖细胞对环境的依赖性较大，比如对体内存在的基本生成因子(造血生长因子和细胞因子)的依赖性较大(见5,999,703、5,728,851和6,372,210号美国专利)。

在以前为促进造血祖细胞体外增殖和分化所做的尝试中，人们对细胞因子在各种基质中的效果进行了考察，包括对细胞因子在预先放入造血祖细胞的基质和纤维结合蛋白中的效果进行了考察。在培养环境加入外源性生成因子，特别是白细胞介素-3(IL-3)和粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)可导致造血祖细胞有选择的向特定的分化方向扩增。这些发现表明，在造血祖细胞培养物中加入外源性生长因子可以导致原始造血祖细胞发生分化，并因此消除了未发育完全的造血祖细胞集落，从而对原始造血祖细胞造成了不利的影响。

其他的方法是使用经过放射性物质照射过的骨髓基质来培养和维持造血祖细胞，这些其他方法可使这些祖细胞成为长期培养的引发细胞(这些细胞是未发育完全的细胞)，并通过逆转录酶病毒载体来增加造血祖细胞和长期培养的引发细胞的转导作用。但是，在非自体骨髓移植的感染以及免疫反应方面又出现了问题。纤维结合蛋白是一种细胞基质成分，这种蛋白可以降低感染的风险以及免疫调节反应，同时还可增强逆转录酶病毒的转导作用。然而，单独靠纤维结合蛋白不足以在体外维持原始造血祖细胞。

骨髓移植后的造血祖细胞扩增是人体骨髓细胞长期培养的一项潜在应用。人类自体骨髓移植和异体骨髓移植目前被用来治疗白血病、淋巴瘤以及其他危及生命的疾病。然而，在这些疾病的治疗过程中，为了取得足够的植入细胞，必须要从捐献者体中移取大量的骨髓细胞，即便如此，经常也会得不到足够数量的细胞。

一种可使造血祖细胞扩增的方法降低了骨髓细胞捐献量，这种方法可使少量捐献的骨髓细胞在体外进行祖细胞扩增，然后再注入到骨髓接受者体中。人们还知道，少量的造血细胞会随血液进行循环。如果选取这些造血祖细胞并使其扩增，则有可能从周边血液中获取移植所需的造血祖细胞，并由此消除了骨髓捐献的必要性。

造血祖细胞的扩增有助于患者在经历化疗和放疗后的身体恢复，造血祖细胞扩增的另一项应用是用于人类骨髓细胞的长期培养。大多数化疗药剂和放疗手段是通过杀死正在经历细胞分裂的细胞而发挥疗效的。骨髓是人体是多产的组织之一；因此，化疗药物和放疗措施最先损害的器官通常是骨髓。化疗和放疗导致了人体生成的血液细胞在治疗过程中遭到了迅速的破坏。这样，在患者再次接受化疗之前必须要终断治疗，从而使造血系统补充血液供应。

一种使造血细胞成功扩增的方法可大大地促进非分化母体细胞大量生成，进而促进具有特定分化方向的分化母体细胞的大量生成，这种结果反过来又为包括输血在内的广泛应用提供了分化造血细胞。

目前存在一种需求，这种需求就是在体外培养条件下促进造血祖细胞的成活率和多能性。

同时还需要产生大量的分化造血细胞。

本发明的目标是提供造血干细胞扩增和增殖的方法，同时使造血祖细胞保持自我更新的能力及多能性。

本发明的另一目标是提供一种方法，该方法对具有特定分化能力的祖细胞以及大量生成更高分化程度的造血细胞过程进行控制。以下将对本发明的这些目标及其他目标进行更详细的说明。

发明概述

本发明很重要的一部分涉及到培养造血祖细胞的方法，该方法可使造血祖细胞保持自我更新能力以及多能性。因此，本发明的一个方面是改善造血祖细胞培养物的保存状况。本发明的另一方面是增加从造血祖细胞样本所获得的后代细胞数量。本发明的再一方面是增加从造血祖细胞样本所获得的分化后代细胞数量。

根据本发明，惊奇地发现的是，造血祖细胞可在不加入外源性生长因子的条件下进行培养，这样就避免了祖细胞在培养期间出现分化诱导和/或数量减少。因此，本发明可在不加入造血生长因子、接种的基质细胞或基质细胞调节介质的条件下，对造血祖细胞进行体外培养。通过将造血祖细胞植入到只含有血清的培养液中即可实现这一培养过程。使用本领域已知的技术(见5,677,139美国专利，该专利描述了灵长类动物胸腺基质单细胞层上的CD3⁺细胞的体外分化，见6,372,210号美国专利，该专利描述了支持CD34⁺细胞增殖和分化的无细胞因子培养液，但为了维持未成熟的显型细胞，需要加入外源性因子)从未取得过这样的结果。

根据本发明的一个方面，本发明提供一种对造血祖细胞进行体外培养的方法。一定数量的造血祖细胞被植入到培养室中。造血祖细胞的培养环境中不含有接种的基质细胞、基质细胞调节介质以及促进分化的外源性造血生长因子，但培养环境中含有血清。

造血祖细胞是由以下组织衍生出来的：骨髓(包括全骨髓)、周边血液(包括流动的周边血液)、脐带血、胎盘血、胎儿肝脏、胚胎细胞(包括胚胎干细胞)、大动脉—生殖腺—中肾衍生细胞以及淋巴软组织。淋巴软组织包括：胸腺、脾、肝、淋巴结、皮肤、扁桃腺以及派伊尔氏淋巴集结(Peyer’s Patches)。

在其他实施方案中，本发明的方法还包括收集造血细胞的步骤。在第一培养期后有第一次收集。至少在另一培养期后还至少有另一次收集过程，所收集到的细胞然后在至少含有一种外源性因子的环境下进行培养，外源性因子选自于由造血生长因子、接种的基质细胞以及基质细胞调节介质组成的一组物质；其中造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化，并影响细胞的定位。在某些实施方案中，促进造血细胞维持、扩增和/或分化，并影响细胞定位的造血生长因子可包括：白细胞间介素3、白细胞间介素6、白细胞间介素7、白细胞间介素11、白细胞间介素12、干细胞因子、FLK-2配位体/FLT-3配位体、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、制瘤素M和/或MCSF。

根据前面所述的本发明任何实施方案，本发明的方法在所述的第一培养步骤中包括：在不含有诸如白细胞间介素3、白细胞间介素6、白细胞间介素7、白细胞间介素11、白细胞间介素12、干细胞因子、FLK-2配位体/FLT-3配位体、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、制瘤素M和/或MCSF这些造血祖细胞生存和增殖因子的环境中对细胞进行培养。正如前面所述的，本发明人惊奇地发现造血祖细胞可在不添加任何这些介质的条件下生长。在以往的技术中，为了避免造血祖细胞死亡和/或在培养期间发生分化，通常要加入这些介质。对于引发细胞增殖从而提高干细胞的数量而言，这些介质被认为是必要的。在本发明的另一实施方案中，第一培养步骤是在不含任何外源性造血祖细胞生长因子(包括细胞因子)但含有血清的环境下进行的。

正如将要理解的，现在根据本发明可以在不添加外源性生长因子的条件下对造血祖细胞进行7、8、9、10或多达14天的培养。

根据本发明，现在还可以在培养期间不出现诱导分化和/或没有祖细胞损失的情况下对造血祖细胞进行培养，并在此期间收集细胞，然后在含有造血生长因子的条件下对收集到的细胞进行再培养，或者将收集到的细胞引入到患者体内；其中的造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化。在培养期内的培养过程及收集过程是本发明的单独一个方面。

根据本发明的另一方面，本发明提供一种对造血祖细胞进行体外培养，并由此生成分化的造血源细胞的方法。在第一培养步骤中，第一数量的造血祖细胞在不含接种的基质细胞、基质细胞调节介质以及外源性造血生长因子但含有血清的环境下进行培养，其中造血生成因子会促进造血细胞的维持、扩增和/或分化。在这些条件下经过一段时间后，培养的造血祖细胞数量得到了增加，培养过程生成了第二数量的造血祖细胞。此后，在第二培养步骤中，在培养出来的第二数量造血祖细胞中，至少有一部分在含有至少一种促生介质的环境中进行再培养，从而产生出分化的造血源细胞；其中促生介质选自于：能促进造血祖细胞维持、扩增和/或分化的造血生长因子、培养基质细胞以及基质细胞调节介质。在本发明的某一实施方案中，培养环境不含有诸如白细胞间介素的3、白细胞间介素6、白细胞间介素11、Tpo、干细胞因子以及FLK-2配位体/FLT-3配位体这些促进造血祖细胞生存和增殖的造血生长因子。在本发明的另一实施方案中，第一培养步骤所处的环境中不含除血清之外的任何造血生长因子。在本发明的这一方面，本发明的方法还包括多个第二培养步骤，每个第二培养步骤包括只对第二数量的造血祖细胞中的一部分进行培养。该方法还包括在第一培养步骤和第二培养步骤之间进行细胞的收集，其中收集步骤包括在对至少一部分第二数量的造血祖细胞进行第二步骤培养前，至少将第二数量的造血祖细胞的一部分收集起来。收集步骤可分成多个步骤进行，收集步骤之间有时间间隔。在这种情况下，第二培养步骤可分成多个培养步骤进行，一个培养步骤对应一个收集步骤。优选的造血祖细胞来源以及培养条件如前面所述。

在前面的任何涉及使用造血生长因子进行造血细胞维持、扩增和/或分化的实施方案中，所用的造血因子均选自于：白细胞间介素3、白细胞间介素12、干细胞因子、FLK-2配位体/FLT-3配位体、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、制瘤素M以及MCSF。

下面将对本发明的这些方面及其他方面进行更详细的说明。

图示简介

图1是在不含细胞因子的干细胞扩增培养基中培养7天时细胞平均总数的柱状图。

图2是在不含细胞因子的干细胞扩增培养基中培养7天时细胞的平均成活率。

图3是在不含细胞因子的干细胞扩增培养基中培养7天时CD34⁺细胞平均总数的柱状图。

图4是在不含细胞因子的干细胞扩增培养基中培养7天时CD34⁺细胞的平均百分率。

应该理解的是，实现本发明并不一定需要这些附图。

本发明的详细说明

本发明的某一方面涉及在不含接种的基质细胞、基质细胞调节介质以及外源性造血生长因子但含有血清的环境中进行造血祖细胞的培养，其中造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化。

本发明的方法所培养的细胞是造血祖细胞。本文中所用的“造血祖细胞”是指未发育完全的血液细胞，这种细胞具有自我更新能力，并可分化成更成熟的血液细胞(在本文中也被称为“后代细胞”)。这些血液细胞包括：粒性白细胞(例如成髓细胞，嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱性细胞)、红血球(例如网状细胞、红血球细胞)、凝血细胞(例如成巨核细胞、生成血小板的成巨核细胞、血小板)、淋巴细胞(例如B细胞、T细胞、NK细胞)、含抗原细胞(例如树状细胞、Kupfer细胞、Langerhans细胞)以及单核细胞(例如循环单核细胞、组织巨噬细胞、格子细胞)。本领域已知，这些细胞可包括CD34⁺细胞，也可不包括CD34⁺细胞。CD34⁺是本文以下所述“血液制品”中存在的未成熟细胞，CD34⁺表达CD34细胞的表面标志，CD34⁺被认为含有细胞子集落，子集落中的细胞具有前面所述的“祖细胞”特性。在本发明中，优选的细胞包括AC133抗原表达细胞(见5,843,633号美国专利)和/或CD34⁺细胞。造血祖细胞还包括以前被认为不具造血能力的细胞，但最近的研究表明这些以往被认为不具造血能力的细胞能够形成血液细胞。最近已从脑部、肝脏、肌肉以及其他组织中分离出了这些细胞(见Bjornson CR.等人在《科学》上发表的文章，1999，283(5401)：534-7，见Gritti A.等人在《生理学杂志》上发表的文章，2002，96(1-2)：81-90，见Muench MO.等人在《免疫学杂志》上发表的文章，2001，167(9)：4902-9，见Weissman IL.在《科学》上发表的文章，2000，287(5457)：1442-6)。

造血祖细胞可从血液制品中获取。本发明中所用的“血液制品”是指从含有造血源细胞的躯体器官或躯体中获得的产品。这些血液制品源包括全骨髓、脐带、周边血液、肝脏、胸腺、淋巴以及脾脏(所有这些源是可被调用的)。本领域的技术人员将清楚地认识到，通过多种方式可使前面提到的所有原生血液制品或未经处理的血液制品含有更多的具有“造血祖细胞”特性的细胞。举例而言，血液制品可与分化程度更高的后代细胞分离开来，通过所表达的细胞表面分子可有选择性地去除发育更完全、分化程度更高的细胞。另外，血液制品可进行分级处理，从而选择CD34⁺细胞和/或AC133⁺细胞。正如前面提到的，本技术领域认为CD34⁺细胞包括具有自我更新能力及多能性的细胞子集落。可使用抗CD34磁珠和/或抗AC133磁珠实现对CD34⁺和AC133⁺细胞的选择，这两种磁珠可通过商业渠道购买。未经分级处理的血液制品可直接从捐献者获得，或取自细胞存储库，或从商业供应商处购买。

采用本文下面将要详细说明的培养条件可保存造血祖细胞，并刺激造血祖细胞数量发生扩增和/或集落形成的能力。一旦造血祖细胞发生扩增后，造血祖细胞可输送回到人体中，从而补充患者的造血祖细胞数量。举例而言，这对于经历化疗的患者是十分适合的。在某些遗传条件下，造血祖细胞的数量会减小，本发明的方法也可用于这类情况。

还可以按照本发明的方法将增加的造血祖细胞取出，并使用造血生长因子对造血祖细胞进行刺激，其中造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化，从而在体外产生更成熟的血液细胞。这些扩增的血液细胞集落可按前面所述应用于人体内，或者按本领域技术人员所认为的进行试验性使用。这些分化的细胞包括前面所述的那些细胞以及T细胞、血浆细胞、红血球、成巨核细胞、嗜碱性细胞、分叶核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、血小板以及这些细胞各自的直接母体细胞。

在本发明的某些实施方案中，造血祖细胞可进行连续的培养，并可对培养得到的细胞进行收集。“收集造血细胞”被定义为从培养室中移出或分离出细胞。使用多种方法可完成细胞的分离过程，例如可采用酶促法、离心分离法、电子法进行细胞分离，或者根据细胞的大小进行细胞分离或者根据本发明的优选方法，即在细胞中加入细胞离散液(Bio Whittaker，Walkersville，MD)而对细胞进行分离。这些细胞可进行进一步的收集和分离。“分时收集步骤”或“间歇收集细胞”是指收集一部分细胞，留下另一部分细胞在已有的介质中继续培养，从而保障可连续的获得原始细胞并保持原始细胞的各种特性。收集“至少某一部分”意味着收集细胞子集落或收集全部细胞。因为，正如本领域技术人员将要理解的，本发明可被用来扩增造血祖细胞的数量，同时收集部分扩增的细胞进行处理，从而培育出更大集落的分化细胞。

本文中所述的“培养室”是指本领域所通用的塑料盘、转动容器以及塑料(如聚丙烯)袋。在本发明的某些实施方案中，三维基质特别地被排除在培养室范围之外。

在本发明中的所有培养方法中，所用的培养介质是常规的细胞培养介质，例如是RPMI、DMEM、ISCOVES等介质，在这些介质中添加了有效剂量的脂肪酸、有效剂量的胆固醇、有效剂量的铁传递蛋白(或有效剂量的离子盐)以及0.25～2.5U/ml的胰岛素(或起到生成因子作用的有效剂量胰岛素)。含有这些添加物的培养介质可通过商业渠道购得(比如从Quality Biological公司购买，这些培养介质在6,372,210B2号美国专利中有所说明)。本发明所用的优选培养介质是QBSF(Quality Biological公司生产)。重要的一点是，本发明所用的培养介质添加了人类血清或动物血清，如果造血祖细胞是人体原始细胞，则更适宜加入人体血清。虽然可以使用浓度更低(比如小于0.05％、小于0.1％、小于0.25％、小于0.5％、小于0.75％、小于1.0％、小于1.5％，以及位于本文明确指出的整数浓度范围之间的浓度)或浓度更高的培养介质，但适宜的血清浓度在2％-5％之间。当在这些浓度下使用血清时，血清可含有少量天然存在于血清中的造血生长因子。在优选情况下，血清是自体的，但也可以从血清库中取用。本文中所用的“自体的”是指从对象本身取得的物质，培养介质中的造血祖细胞源自于对象本身。培养介质中还可含有血清白蛋白(人类的或动物的)。根据本发明，在本发明中的细胞培养过程中，可在培养介质中添加(补充介质)或对部分培养介质进行替换(比如进行等量替换)，或保持培养介质不变。

与本发明相关的特别生长因子是造血生长因子。造血生长因子是指影响造血细胞生存、增殖或分化的因子。只影响造血细胞的生存及增殖，但对分化不具促进作用的生长因子包括白细胞间介素3、白细胞间介素6、白细胞间介质11、干细胞因子以及FLK-2配位体/FLT配位体。促进造血细胞分化的造血生长因子包括集落刺激因子，比如GMCSF、GCSF、MCSF、Tpo、Epo、制瘤素M以及除白细胞间介质3、6、11之外的其他白细胞间介素。前面这些生长因子是本领域技术人员所熟知的。这些生长因子中的大多数可通过商业渠道购得。这些生长因子可通过提纯、重组方法获得，或通过衍生或合成而得到。

在本发明的某一方面，本发明中的细胞在不含外源性细胞因子的环境下进行培养。“细胞因子”是可溶性蛋白的专业术语，其中的可溶性蛋白是由一个细胞子集落释放出来的，在免疫响应的生成和调节中，这种可溶性蛋白是细胞间的调节介质。见《基础及临床研究手册》中的人类细胞因子章节(Aggrawal等人编辑，麻省波士顿Blackwell科学出版社1991年出版)(该手册全文在此通过引证被并入本文)。细胞因子例如包括白细胞间介素IL-1至IL-5、肿瘤坏死因子α及β、干扰素α、β、γ、肿瘤生长因子β、集落刺激因子以及粒性白细胞单核细胞集落刺激因子。通过与细胞表面受体的结合可以调节每种细胞因子对其靶细胞的作用。细胞因子具有许多荷尔蒙的性质，但与经典的荷尔蒙不同之处在于细胞因子在体内一般只对组织内局部附近的细胞发挥作用。

在本发明的另一方面，本发明中的细胞在一种除血清外不含培养基质细胞、基质细胞调节介质以及外源性造血生长因子的环境中进行培养，其中造血生长因子促进造血细胞的分化。“不含有培养基质细胞”是指细胞培养室中没有作为促进造血祖细胞生存、增殖或分化的培养液而单独加入到培养室中的基质细胞，但这类基质细胞不包括经过分离后的血液制品中天然含有的基质细胞以及加入分离的血液制品后在培养室中生存和增殖的基质细胞。

本文中所用的“基质细胞”包括纤维原细胞和间叶细胞，基质细胞可带有其他细胞及元素，也可以不带有其他细胞和元素，其中这些细胞和元素被用来建立有利于造血祖细胞附着及生长的条件。纤维原细胞包括胎儿纤维原细胞，纤维原细胞通过组织或器官的活体解剖而获得。这些纤维原细胞和间叶细胞可使用外源性DNA进行转染，其中DNA编码上述造血生长因子中的某一因子。

“基质细胞调节介质”是指前面所述基质细胞接种到其中的介质。接种的时间足以使基质细胞在这种介质中分泌出因子。然后这些“基质细胞”调节介质被植入到造血祖细胞培养室中，从而促进造血祖细胞的增殖和/或分化。

因此，当细胞在不含前面所提到的因子的条件下培养时，意思是指细胞在不添加这些因子的环境中进行培养，但血清、普通营养介质或分离的血液制品、分级的或未分级的血液制品中所存在的因子除外；其中血液制品中含有造血祖细胞。

在优选情况下，造血细胞的培养条件可使造血细胞的数量得到增长，和/或使造血细胞的集落形成能力得到加强。这里所用的条件是指本领域已知条件的组合(比如温度、氧气、二氧化碳浓度、营养介质等)。本领域的技术人员可容易地确定足以使细胞数量得到增长所需要的时间，这一时间随植入的原始细胞数量不同而变化。例如，介质的变色可被用作融合的指标。此外，更准确的做法是在相同条件下对不同数量的血液制品进行培养，并以固定的时间间隔对细胞进行收集和计数，从而得到“控制曲线”。这些控制曲线被用来估算其后细胞培养过程中细胞的数量。根据本发明，造血细胞的优选培养时间是7天。虽然这一时间可延长几天，但本发明人发现，在培养到14天时，培养室的细胞总数及祖细胞的数量均少于在同等条件下培养期为7天时的数量。

决定集落形成能力的条件也用相似的方法进行确定。集落形成能力是细胞形成后代细胞的能力。本领域技术人员已熟知测定这一能力的方法，该方法包括在半固体培养介质中植入细胞，使用生长因子处理这些细胞，并对集落的数量进行计数。

如本文所使用的，“对象”可以是人类、非人类的灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物。人类造血细胞和人类对象是本发明实施方案中特别重要的内容。根据本发明，一定数量的造血祖细胞被植入到体外的细胞培养室中，并在含有血清但不含培养基质细胞、基质细胞调节介质以及外源性造血生长因子的环境中进行培养；其中造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化。

结合以下的实施例将会更充分地理解本发明。但这些实施例的目的只在于对本发明进行说明，这些实施例并不对本发明的范围构成任何限制。

实施例

细胞分离和培养

通过Ficoll分离和抗人体CD34⁺磁珠(Miltenyi Biotec.Auburn，CA)法从人体的流通周边血液中分离出单核细胞，CD34⁺造血祖细胞由这些单核细胞衍生而得。

CD34⁺细胞还可从人类的骨髓或脐带衍生出来。这些造血祖细胞源可从Poietics公司(Geithersburg，MD)购得。在某些情况下，磁珠分离步骤可在抗个体基因型抗体(Detachbead，Dynal)进行分离过程之后进行。

50万个CD34⁺细胞被植入到48孔标准培养盘(BectonDickinson/Falco，Bedford，MA)的每个孔中。培养使用0.35毫升的QBSF-60液相培养介质(Quality Biological，Gaithersburg，MD)，培养液中加入5％的人类AB型血清。培养在37℃、5％二氧化碳的条件下进行7-14天。

在培养期之后，从培养孔中收集所有非粘着细胞，对细胞进行计数，并用表面抗原对细胞进行沾染。使用锥虫蓝排除法和Nuebauer血球计测定细胞的数量和成活率。

结果

收集的细胞平均数量为136万个，这一数字是植入细胞量的2.6倍。收集细胞的成活率(89.1％)与植入细胞的成活率(92.3％)近似相同。这些结果在图1和图2中表明。

在测定CD34⁺集落时得到了相似的结果。收集的CD34⁺细胞平均数量为97.9万。这一数字是植入细胞量的2.1倍。植入细胞集落和收集细胞集落的CD34阳性标记百分率相近(92.0％对87.5％)。这些结果在图3和图4中表明。

表面显型测定所用的抗体包括抗CD34(Qbend10，Beckman/Coulter，Brea，CA)、抗CD38和抗CD45(均来自BDImmunocytometry，San Diego，CA)，使用这些抗体来评估祖细胞的分布情况。使用多参数FACScan流动细胞计数分析法进行细胞的流动计数分析，在分析中使用到了FACSCalibur仪器(BectonDickinson)。所包括的适应对照物与同型抗体相配，从而建立阳性和阴性象限，同时还与单色染色剂相配，从而建立补偿。对于每个样品而言，至少收集10,000个列表形式的事件。

从不含细胞因子的培养基中所收集的造血祖细胞的体外测定

使用常规的甲基纤维素测定法可测定造血祖细胞(经过上述的7-14天培养后)生成骨髓细胞集落和生成红血球细胞集落的能力。下面将说明一个甲基纤维素测定的实例，但在不出现不当实验方法的情况下，本领域的技术人员有能力按照需要对这一测定方法进行修改。

从前面所述的培养基中提取同样数量的细胞，并在细胞密度为1.33×10⁴个细胞/毫升的情况下向细胞中加入3.5ml甲基纤维素培养液中，培养液中含有细胞因子(浓度为20ng/ml的白细胞间介素3；30ng/ml的GM-CSF；3IU/ml的红细胞生成素；50ng/ml的干细胞因子；所有这些细胞因子都是由加拿大温哥华的干细胞技术公司生产)，以及加入0.5ml的DMEM(2％的FCS，10IU/ml的青霉素，10ug/ml的链霉素，1mM的L谷氨酸盐)。使用注射器和钝头针头将1.5ml混合液注入到有划痕的有盖培养皿中，使用钝针头是为了避免产生气泡。对每种条件进行重复测定。两个相同的有盖培养皿在5％二氧化碳及37℃下在培育箱中放置10～21天。在10～21天后，通过手工计数方法测定集落的数量。对累积20个或以上细胞的阳性集落进行计数。在培养14-21天后，根据黄褐色色素对属于红血球的集落进行计数，黄褐色色素表明的是血红蛋白，骨髓细胞集落是通过它们明显的透明外观进行辨识的。计数工作应进行二次。

从不含细胞因子的培养基中所收集的造血祖细胞的体内测定

使用本领域已知的动物模型可对培养出来的造血祖细胞(按前面所述的培养过程进行培养)在体内的分化及增殖能力进行测定。体内测定表明，造血祖细胞在宿主体内具有生成多种类型后代血液细胞的能力(多能性)，具有自我更新的能力，同时可以与宿主体内的细胞相融合。这种动物模型是经过亚致死剂量辐射的、缺乏免疫的、患有非肥胖性糖尿病的重度复合免疫不全症试验鼠。简单地讲，根据前面所述本发明方法培养出的造血祖细胞通过静脉注射而进入到试验鼠体中，在植入造血祖细胞6-8星期后检测受体体内的骨髓细胞(使用极限稀释分析法测定造血祖细胞生成CD34CD19⁺(B淋巴细胞)以及生成CD34⁺(骨髓细胞)后代集落细胞的频率)。

等同物

本领域中的技术人员将认识到或能够发现，使用常规的实验方法即可得到许多与本文所述的本发明具体实施方案等同的结果。这些等同情况在以下权利要求的范围之内。本文所提到的所有参考文献在此通过引证被并入本文。

Claims (20)

1.一种对造血祖细胞进行体外培育的方法，该方法包括：

将一定数量的造血祖细胞植入到培养室中；并在不含接种的基质细胞、基质细胞调节介质以及外源性造血生长因子但含有血清的环境中对所述的细胞进行培养；其中造血生长因子促进造血祖细胞的维持、扩增和/或分化。

2.如权利要求1中的方法，其中培养环境不含有以下物质：白细胞间介素3、白细胞间介素6、白细胞间介素11、Tpo、干细胞因子以及FLT/FLK配位体生长因子。

3.如权利要求1中的方法，其中培养环境不含有造血生长因子。

4.权利要求1中的方法还包括：在所述的植入步骤前，从血液制品中获得所述的造血祖细胞。

5.如权利要求4中的方法，其中所述的血液制品是流动的周边血液或流动的脐带血液。

6.如权利要求1中的方法，其中造血祖细胞在培养条件下的培养时间足以使造血祖细胞的数量超过植入到所述培养室中的造血祖细胞数量。

7.权利要求1中的方法还包括：

在所述的培养步骤后，对细胞进行收集。

8.权利要求7中的方法还包括：

在至少一种外源性添加物质中对所述的收集细胞进行培养；其中外源性添加物质选自：造血生长因子、接种的基质细胞以及基质细胞调节介质；造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化。

9.权利要求8中的方法还包括：

在有外源性添加物质存在的环境中对所述的第一次收集所取得的造血细胞进行培养；

在有外源性添加物质存在的环境中对所述的至少另一次收集所取得的造血细胞进行培养；

其中所述的外源性添加物质选自于：造血生长因子、培养基质细胞以及基质细胞调节介质；造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化。

10.一种对造血祖细胞进行体外培养，从而使造血原始细胞产生分化细胞的方法，该方法包括：

在第一培养步骤中，在含有血清但不含有接种的基质细胞、基质细胞调节介质以及外源性造血生长因子的环境中对第一数量的造血祖细胞进行培养；其中造血生长因子促进造血细胞的分化；在这种培养条件下，经过一段时间的培养，造血祖细胞的数量和集落形成能力都较第一数量的造血祖细胞有所增加；然后在第二培养步骤中，在至少含有一种以下物质的环境中对至少一部分第二数量的造血祖细胞进行培养：造血生长因子、接种的基质细胞以及基质细胞调节介质；其中造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化。这些培养步骤可产生造血原始细胞的分化细胞。

11.如权利要求10中的方法，其中所述第一培养步骤的环境中不含白细胞间介素3、白细胞间介素6、白细胞间介素11、Tpo、干细胞因子以及FLT/FLK配位体生长因子。

12.如权利要求10中的方法，其中培养环境中不含造血生长因子。

13.如权利要求10中的方法，其中第二培养步骤含有多个第二培养步骤，每个培养步骤对一部分所述第二数量的造血祖细胞进行培养。

14.权利要求10中的方法还包括在所述的第一和第二培养步骤间进行细胞收集，其中收集步骤包括在对至少一部分第二数量的造血祖细胞进行第二培养步骤之前，至少收集一部分第二数量的造血祖细胞。

15.如权利要求14中的方法，其中所述的收集步骤包括多个收集步骤，多个收集步骤之间有时间间隔，所述的第二培养步骤含有多个第二培养步骤，每个第二培养步骤都与一个所述的收集步骤相对应。

16.如权利要求10中的方法，其中所述的造血祖细胞从血液制品获得。

17.如权利要求16中的方法，其中所述的血液制品是流动的周边血液或流动的脐带血液。

18.一种对造血祖细胞进行体外培养，从面生成造血原始细胞的分化细胞的方法，该方法包括：

在第一培养步骤中，在含有血清但不含有接种的基质细胞、基质细胞调节介质以及外源性造血生长因子的环境中对第一数量的造血祖细胞进行培养，从而产生培养的造血祖细胞；其中造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化；

间歇性地收集所述培养造血祖细胞的一部分，从而生成多组间歇收集的造血培养细胞；

在多个第二培养步骤中，对多组间歇收集的造血细胞进行培养，第二培养步骤的培养环境中至少含有一种以下物质：造血生长因子、接种的基质细胞以及基质细胞调节介质；其中造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化；第二培养步骤可产生造血原始细胞的分化细胞。

19.如权利要求18中的方法，其中所述第一培养步骤的环境中不含白细胞间介素3、白细胞间介素6、白细胞间介素11、Tpo、干细胞因子以及FLT/FLK配位体生长因子。

20.如权利要求18中的方法，其中的环境不含造血生长因子。

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