CN1564864A - 造血干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供有效的造血干细胞的制备方法。本发明的造血干细胞的制备方法包括在gp130刺激因子、一种或一种以上细胞因子和基质细胞的存在下培养造血干细胞的步骤。

Description

造血干细胞的制备方法
                    发明背景
发明领域
本发明涉及造血干细胞的制备方法及用于培养造血干细胞的培养基。
技术背景
生物体中成熟血细胞的寿命短，常常通过造血前体细胞的分化而供给成熟血细胞，以此来保证血液的稳定性。造血前体细胞是通过未分化的造血干细胞进行分化而生成的。造血干细胞具有分化成各种分化系列的能力(分化多能性)，经过始终保持分化多能性进行自身复制的生涯，供给造血细胞。总之，在进行自身复制时产生具有分化多能性的干细胞，同时一部分经过造血前体细胞分化成各种成熟的血液细胞。
象这种血细胞的分化可受多种细胞因子的调节。已知，红细胞生成素(EPO)促进红细胞系的细胞的分化，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)促进嗜中性粒细胞系的分化，血小板生成素(TPO)促进巨核细胞和血小板产生细胞的分化。但是，造血干细胞在保持分化多能性进行自身复制时，不知道哪种因子是必要的。作为造血干细胞的增殖因子已有SCF/MGF(Williams，D.E.，Cell，63：167-174，1990；Zsebo，K.M.，Cell，63：213-224，1990)和SCGF(WO98/08869)等几个报道，但均无充分维持造血干细胞的分化多能性的作用。另外，试验了通过联合添加多种已知的细胞因子来培养造血干细胞(Miller CL，PNAS USA，94：13648-13653，1997；Yagi M.，PNAS USA，96：8126-8131，1999；ShihC.C.Blood，94：5 1623-1636，1999)。
另一方面，提供适于造血细胞维持和增殖的环境，尝试利用基质细胞来维持造血干细胞，并使之增殖，而不发生分化(Moore K.A.，Blood，89：12 4337-4347 1997；具有可移植的淋巴-骨髓重建能力的成年鼠造血干细胞的体外扩增，Cindy L.Miller和Connie J.Eaves，PNAS94：13648-13653)。WO99/03980中公开了一株基质细胞株，它是从小鼠胎儿的AGM(Aorta-Gonad-Mesonephros)区域建株的能支持造血干细胞和造血前体细胞增殖或生存。再者，Rappold I，Watt SM，KusadasiN，Rose-John S，Hatzfeld J，Ploemacher RE.Gp 130-信号协同FL和TPO进行长时程核心血液前体细胞扩增，Leukemia，1999 Dec；13(12)：2036-48)描述了用SCF、FL、TPO、sIL-6R-IL-6融合蛋白质和基质细胞来进行培养。
但，Rappold等的培养体系是培养造血前体细胞的培养体系，与培养造血干细胞的培养体系完全不同。另外有报道，Kusadasi N等，Leukemia.2000；11：1944-1953，在IL-6、Flt-3配体(FL)和TPO的培养体系中用FL+TPO代偿基质细胞的功能，基质细胞根本没有增强干细胞维持功能的作用。
                     发明概述
发明人发现在gp130刺激因子、细胞因子鸡尾酒(cocktail)和基质细胞的存在下培养造血干细胞，可使造血干细胞有效增殖，并支持其生存。
本发明的目的是提供造血干细胞的有效制备方法，造血干细胞的有效培养方法，以及在造血干细胞的培养中应用的培养基。
本发明的造血干细胞的制备方法包括在gp130刺激因子、一种或一种以上细胞因子和基质细胞的存在下培养造血干细胞的步骤。
本发明的造血干细胞的培养方法包括在gp130刺激因子、一种或一种以上细胞因子和基质细胞的存在下培养造血干细胞的步骤。
本发明的造血干细胞的培养中应用的培养基包含gp130刺激因子、一种或一种以上细胞因子和基质细胞。
末梢血干细胞移植和脐带血干细胞移植等造血干细胞移植疗法，若不能获取足量的造血干细胞数，就不能实施移植。通过本发明可在试管内有效扩增造血干细胞，或可以稳定维持。因此，即便在从患者得不到足量的造血干细胞时，也可培养必要量的造血干细胞，移植给患者。也就是说，本发明为血液细胞的移植疗法及移植疗法作为必要治疗的实用化开辟了一条道路。
用本发明的培养体系扩增的造血干细胞还可作为分化成血液以外的组织的细胞利用。因此，根据本发明所获得的造血干细胞可用于肝功能不全、肌营养不良、心肌梗塞等造成的心肌坏死、糖尿病引起的血管坏死、或肠道细胞坏死治疗中的正常细胞再生，和神经细胞的再生治疗。
                     附图简述
图1表示通过移植了小鼠造血干细胞的个体末梢血中供体来源的血细胞嵌合性随时间的变化显示细胞因子鸡尾酒对造血干细胞增殖的影响。“输入(input)”(□)表示采集小鼠造血干细胞后立即移植到放射线照射小鼠时的情况。“S+IL6+IL11+FL”(黑四角)表示采集小鼠造血干细胞后，在SCF+IL-6+IL-11+FL细胞因子存在下培养以后，移植到放射线照射小鼠时的情况。“SCF+FP6+FL”(○)表示采集小鼠造血干细胞后，在SCF+FP6+FL细胞因子存在下培养以后，移植到放射线照射小鼠时的情况。
图2表示通过移植了小鼠造血干细胞的个体末梢血中供体来源的血细胞嵌合性随时间的变化显示细胞因子鸡尾酒对造血干细胞增殖的影响。“输入(input)”(×)表示采集小鼠造血干细胞后立即移植到放射线照射小鼠时的情况。“液体STF”(□)表示采集小鼠造血干细胞后，在SCF+FP6+TPO细胞因子存在下培养以后，移植到放射线照射小鼠时的情况。“A9+STF”(黑四角和◆)表示采集小鼠造血干细胞后，在SCF+FP6+TPO细胞因子存在下与基质细胞AGM-S3-A9共培养以后，移植到放射线照射小鼠时的情况。“A9+STF(20)”(黑四角)表示FP6的浓度为20ng/ml时的结果。“A9+STF(50)”(◆)表示FP6的浓度为50ng/ml时的结果。
图3表示人间叶干细胞和细胞因子鸡尾酒对造血干细胞增殖的影响。具体而言，该图表示移植了小鼠造血干细胞的个体末梢血中供体来源的血细胞嵌合性随时间的变化。“输入”(×)表示采集小鼠造血干细胞后立即移植到放射线照射小鼠时的情况。“MSC”(○)表示采集小鼠造血干细胞后，与人间叶干细胞共培养以后移植到放射线照射小鼠时的情况。“MSC+STF”(△)表示采集小鼠造血干细胞后，在SCF+FP6+TPO细胞因子存在下与人间叶干细胞共培养以后移植到放射线照射小鼠时的情况。
图4表示基质细胞和细胞因子鸡尾酒对造血干细胞及造血干细胞前体细胞增殖的影响。“输入”表示采集人造血干细胞后立即进行集落分析。“A”表示采集人造血干细胞后，在SCF+FP6+TPO+FL细胞因子存在下与基质细胞AGM-S3-A9共培养以后进行集落分析。“B”表示采集人造血干细胞后，在SCF+FP6+TPO+FL细胞因子存在下培养以后进行集落分析。“BFU-E”：红细胞样爆发形成单位(erythroid burst-forming unit)、“CFU-GM”：粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(granulocyte-macrophage colony-forming unit)、“CFU-Emix”：红细胞混合集落形成单位(erythrocyte mixed colony-formingunit)。
图5表示基质细胞和细胞因子鸡尾酒对造血干细胞及造血干细胞前体细胞增殖的影响。“输入”表示采集人造血干细胞后立即进行集落分析。“A”表示表示采集人造血干细胞后，在SCF+FP6+TPO+FL细胞因子存在下与基质细胞AGM-S3-A9共培养以后进行集落分析。“B”表示表示采集人造血干细胞后，在SCF+TPO+FL细胞因子存在下与基质细胞AGM-S3-A9共培养以后进行集落分析。“C”表示采集人造血干细胞后，在SCF+FP6+TPO+FL细胞因子存在下培养以后进行集落分析。“D”表示采集人造血干细胞后，在SCF+TPO+FL细胞因子存在下培养以后进行集落分析。“BFU-E”：红细胞样爆发形成单位、“CFU-GM”：粒细胞-巨噬细胞集落形成单位、“CFU-Emix”：红细胞混合集落形成单位。
图6表示基质细胞和细胞因子鸡尾酒对造血干细胞及造血干细胞前体细胞增殖的影响。“输入”表示采集人造血干细胞后立即进行集落分析。“A”表示表示采集人造血干细胞后，在SCF+FP6+TPO+FL细胞因子存在下与基质细胞AGM-S3-A9共培养以后进行集落分析。“B”表示表示采集人造血干细胞后，在SCF+TPO+FL细胞因子存在下与基质细胞AGM-S3-A9共培养以后进行集落分析。“BFU-E”：红细胞样爆发形成单位、“CFU-GM”：粒细胞-巨噬细胞集落形成单位、“CFU-Emix”：红细胞混合集落形成单位。
                        发明详述
造血干细胞
本发明中的“造血干细胞”是指具有分化成血细胞中所有分化系列(lineages)的能力(多分化能力)，且能在维持其多能分化性的同时进行自身复制。
造血干细胞可从人和小鼠等哺乳动物的胎肝、骨髓、胎儿骨髓、末梢血、通过施用细胞因子和/或抗癌剂动员了干细胞的末梢血、以及脐带血中获得。
小鼠中通过移植实验可区分造血干细胞和造血前体细胞。即，将试验细胞移植到放射线照射小鼠后经过3个月以上，若能在移植个体(接受者)中见到供体来源的骨髓细胞、淋巴细胞双方分化系列的造血细胞，说明移植细胞团中存在具有多能分化性，在接受者个体中可自身复制的造血干细胞。
红细胞前体细胞在试管内的培养环境中难以维持扩增，迅速消失。确定维持、使红细胞前体细胞增殖时，因为可维持、使未分化的造血干细胞或造血前体细胞增殖，所以能继续产生红细胞前体细胞。因此，人造血干细胞的评价体系，可以是维持红细胞前体细胞(BFU-E)或可分化成粒细胞、巨噬细胞两个细胞系列的前体细胞(CFU-GM)，使之增殖为指标，确认造血干细胞或未分化的造血前体细胞的增殖。或者，给免疫功能不全的小鼠NOD/SCID小鼠移植人造血细胞，根据移植后人造血细胞的存在率来确认移植细胞团中是否存在造血干细胞或造血前体细胞。
gp130刺激因子
本发明中的“gp130刺激因子”是指借助gp130的信号传导分子，象IL-6和IL-6受体(以下叫做IL-6R)α链的复合体那样，通过与gp130结合而活化gp130，然后活化JAK激酶，使STAT3磷酸化，通过STAT3而促进JunB、JAB、SAA3、C-反应性蛋白等基因的转录，结果调节细胞增殖、细胞分化等。向原本不表达人gp130的小鼠IL-3依赖株Ba/F3细胞中转化表达编码人gp130基因，因为转化细胞可通过gp130信号进行增殖，所以可通过检测该转化细胞的增殖来评价gp130刺激因子的存在否。转化细胞增殖的测定可通过细胞摄取同位素标记的核酸，评价线粒体活性，直接计算细胞数等进行。例如，按照特开2001-8690号公报的实施例5中记载的方法进行。另外，由于如上所述gp130刺激可活化细胞内信号传导分子STAT3，所以可通过检测上述Ba/F3细胞的STAT3的活化来评价是不是gp130刺激因子。STAT3的活化可通过检测细胞内STAT3磷酸化进行，或者，针对STAT3促进转录的基因群，通过Northern分析、定量RT-PCR法检测其转录促进作用。
gp130刺激因子包括IL-6或其突变体与IL-6R或其突变体的融合蛋白，IL-6R(优选可溶性IL-6R(sIL-6R))或其突变体与IL-6或其突变体的联合(特表平10-509040号)、对gp130有拮抗作用的抗gp130抗体(Gu ZJ，Vos JD，Rebouissou C，Jourdan M，ZhangXG，Rossi JF，Wijdenes J，Klein B.，激动剂抗gp130传导物(transducer)单克隆抗体是人骨髓瘤细胞存活和生长因子，Leukemia，2000 Jan；14(1)：188-97)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞游走抑制因子(LIF)、制瘤素M和心营养蛋白(cardiotropin)。
本发明中的“IL-6”是指由4个螺旋构成的全长212个氨基酸残基的蛋白质(Hirano等，Nature，324，731(1986))。本发明中的“IL-6突变体”是指有一个或一个以上选自替换、缺失、插入及添加的改变，且具有gp130刺激活性的IL-6突变体。已知IL-6即便缺失N端信号肽第28位的丙氨酸残基也可维持gp130刺激活性(WO00/01731)。另外，已知即便IL-6第37位赖氨酸残基C端侧接受蛋白酶消化，以及从第28位的丙氨酸到第37位的赖氨酸残基为止的10个氨基酸残基缺失，对IL-6的活性也不造成障碍(WO00/01731)。因此，本发明中将N端缺失，且具有gp130刺激活性的改变了的IL-6作为IL-6突变体应用。所讲IL-6突变体包括到第28位为止的N末端序列缺失的IL-6，第37位为止的N末端序列缺失的IL-6。
本发明中的“IL-6R”是指由信号区域、细胞外区域、跨膜区域及细胞内区域构成的全长468个氨基酸残基的蛋白质(Yamasaki等，Science，241，p825(1988))。本发明中的“IL-6R突变体”是指具有一个或一个以上选自替换、缺失、插入及添加的改变，且具有gp130刺激活性的IL-6R突变体。已知IL-6R细胞外区域中存在的细胞因子受体区域(从第112位缬氨酸残基附近到第323位丙氨酸残基附近的区域)是与IL-6结合十分必要的区域(Yawata等，EMBO J.12，p1705(1993))。因此，本发明中应用包含IL-6R第112个缬氨酸残基附近到第333位丙氨酸残基附近区域的IL-6R作为IL-6R突变体。
融合蛋白质是IL-6或其突变体与IL-6R或其突变体直接或通过连接体连接成的蛋白质。例如，按照WO00/01731、WO99/02552、特表2000-506014号或Fisher等，Nature，Biotech.，15，p142(1997)中记载的方法制备融合蛋白。
融合蛋白质可以是IL-6R第112位缬氨酸残基到第333位丙氨酸残基片段的C末端与IL-6的第38位天冬氨酸到第212位甲硫氨酸为止的片段N末端直接连接而成的蛋白质(FP6)。该情况下，将连接了编码融合蛋白质DNA序列的在宿主中可表达载体导入适宜的宿主中，培养转化的宿主，从培养物中收集FP6，由此来制备FP6(参照WO00/01731)。
细胞因子
本发明中所使用的“细胞因子”可使造血干细胞增殖，维持造血干细胞。
所讲细胞因子包括血小板生成素(TPO)及其突变体和它们的衍生物、c-mp1配体(除外TPO)及其突变体、干细胞因子(SCF)、F1t-3配体(FL)、IL-3(白细胞介素3)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、转化生长因子-β(TGF-β)、MIP-1α(Davatelis，G.，J.Exp.Med.167：1939，1988)样增殖因子；红细胞生成素(EPO)之类的造血激素；趋化因子、Wnt基因产物、notch配体之类的分化增殖调节因子；发育调节因子；及这些因子的组合。
本发明中的“血小板生成素(TPO)”是具有特异性刺激或增强血小板产生活性的蛋白质，全长由332个氨基酸残基构成(WO95/21919)。另外，本发明中的“TPO突变体”是指具有一个或一个以上选自替换、缺失、插入及添加的改变，且能特异性刺激或增强血小板产生的TPO突变体。TPO突变体包括，例如WO95/18858、日本专利第2991640号、日本专利第2991630号、及日本专利第2996729号中记载的突变体，优选由1-163位氨基酸残基构成的TPO突变体。
本发明中的“TPO及其突变体的衍生物”是指连接了水溶性聚合物的TPO及其突变体。水溶性聚合物包括聚乙二醇，优选平均分子量约5kDa-50kDa的聚乙二醇。可按照众所周知的方法实施TPO及其突变体的聚乙二醇化(PEG化)(例如，参照Focus on Growth Factors3(2)：4-10(1992))。水溶性聚合物与c-mp1配体蛋白质的摩尔比可为1∶1-100∶1，多PEG化时摩尔比为1∶1-20∶1，单PEG化时摩尔比为1∶1-5∶1。
本发明中的“c-mp1配体”是指可与c-mp1受体结合的肽性配体，蛋白质性配体，及非肽性配体。蛋白质性c-mp1配体(TPO除外)包括作为巨核细胞刺激剂的激动性抗体(WO99/03495、WO99/10494)和造血受体激动剂等其他蛋白质(WO96/23888、WO97/12978、WO97/12985、WO98/17810、WO96/34016、WO00/24770)。肽性c-mp1配体包括WO96/40189、WO96/40750、WO98/25965、特开平10-72492、WO99/42127、WO00/24770中记载的配体。非肽性c-mp1配体包括苯二氮杂卓衍生物(特开平11-1477号，特开平11-152276号)和其它低分子配体(WO99/11262、WO99/22733、WO99/22734、WO00/35446、WO00/28987)。
本发明中优选的细胞因子包括干细胞因子(SCF)，血小板生成素(TPO)及其突变体以及它们的衍生物，Flt-3配体(FL)，或其组合。
本发明中优选的细胞因子至少包括血小板生成素(TPO)或其突变体或它们的衍生物。
基质细胞
本发明中的“基质细胞”是指可在体外提供与生物体内造血环境等同的或类似的造血环境的细胞，只要是能在试管内与造血细胞共培养的细胞即可，不管其来源。
基质细胞的例子有AGM(Aorta-Gonad-Mesonephros)区域来源的细胞、骨髓来源的基质细胞、间叶干细胞(mesenchymal stem cell)、成纤维细胞、血管内皮细胞、胎肝来源的细胞及前脂肪细胞。优选AGM区域来源的细胞、骨髓来源的基质细胞、间叶干细胞，特别优选AGM区域来源的细胞和间叶干细胞。
可人为地在调节表达的启动子下游插入自杀基因，将这样的重组载体导入基质细胞，与造血干细胞培养后，只使基质细胞死亡，从而可除去移植时的基质细胞。如下进行自杀基因的导入及表达。即，根据自杀基因表达的手段，更具体地讲，通过白喉毒素的利用(Lidor YJ，Lee WE，Nilson JH，Maxwell IH，Su LJ，Brand E，Globe LM，白喉毒素A链基因在人绒毛膜促性腺激素基因启动子控制下的体外表达，作为向卵巢癌细胞系导入毒性的手段，Am J Obstet Gynecol.1997Sep；177(3)：579-85)、疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(HStk)的利用(Link CJ，Seregina T，Traynor A，Burt RK.，恶性疾病的细胞自杀疗法，Oncologist.2000；5(1)：68-74.)、凋亡相关基因的表达，可使自杀基因表达。凋亡相关基因可利用具有死亡功能区的受体基因，如Fas(Ioth N，Cell，66：233-243，1991)、II型TNFR(Loetscher H.，Cell61(2))、死亡受体3(Kitoson J.，Nature，384：372-375，1996)、死亡受体4(Pan G.，Science，276：111-113，1997)，上述受体的信号传导分子Flice，属于信号传导系统的蛋白质分解酶ICE(IL-1 b convertingenzyme)(Cerretti D.P.，Science 256：97-100，1992)和Caspase家族(PatelT，FASEB.J.，10：587-597，1996)，如CPP32(Fernandes-Alnemri T，JBC，269：30761-30764，1994)等。可利用应用四环素的表达诱导系统(Manferd G.，PNAS USA，89：5547-5551，1992)来人为调控这些基因的表达。将这些基因导入基质细胞株时，除宿主中应用基质细胞株以外，通常应用将基因导入动物细胞的方法，例如应用莫洛尼鼠白血病病毒等逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒(AAV)的载体(Kotin，R.M.Hum Gene Ther 5，793(1994))、单纯疱疹病毒载体等病毒来源的动物细胞用载体的方法，磷酸钙共沉淀法，DEAE-葡聚糖法，电穿孔法，脂质体法，脂染(lipofection)法，显微注射法等。将自杀相关基因导入基质细胞时，加入该基因的耐药基因等标志基因和导入了目的基因的基质细胞株的选择很容易。
培养
本发明提供扩增造血干细胞的培养体系。通过利用该培养体系可有效维持造血干细胞的增殖、生存。
本发明的培养体系，包含造血干细胞，还可包含其它的造血细胞。还可以是包含造血干细胞的级分。即，用特异识别造血干细胞的抗体从脐带血、末梢血、骨髓等包含造血干细胞的组织中分离出造血干细胞进行培养。特异性除去红细胞等各种细胞的方法可通过目前的血细胞分级的方法进行。也可不分级进行培养。
培养造血干细胞，可应用培养用的平皿、培养瓶、培养袋进行培养，培养基组成、pH等可机械控制，通过高密度培养的生物反应物，可改善其培养体系(Schwartz，PNAS USA，88：6760，1991；Koller，M.R.，Bio/Technology，11：358，1993；Koller，M.R.，Blood，82：378，1993；Palsson，B.O.，Bio/Technology，11：368，1993)。
基质细胞与造血细胞的共培养，可在采集骨髓以后直接进行培养。另外，可在采集骨髓后分离基质细胞、造血细胞、其它细胞群等，与所采骨髓者之外的基质细胞、造血细胞组合进行共培养。另外，在只培养基质细胞使之增殖后，可添加细胞因子鸡尾酒和造血细胞进行共培养。培养基质细胞时，为了进行更有效地使之增殖、生存，可在培养体系中添加细胞刺激因子。所讲细胞刺激因子包括血小板生成素(TPO)及其突变体及其衍生物、c-mp1配体(TPO除外)及其衍生物、干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(FL)、白细胞介素3(IL-3)、粒细胞-巨噬细胞细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、转化生长因子-β(TGF-β)、MIP-1α(Davatelis，G.，J.Exp.Med.167：1939，1988)等细胞因子所代表的增殖因子；红细胞生成素(EPO)之类的造血激素；趋化因子、Wnt基因产物、notch配体之类的分化增殖调节因子；发育调节因子等。这些细胞因子也可由基质细胞产生。若是与细胞因子同样借助细胞因子受体而传递信号的物质，可与细胞因子同样使用。
对用于培养的培养基无特殊限制，只要对造血干细胞的增殖和生存无害即可，例如优选MEM-α培养基(GIBCO BRL)、SF-02培养基(三光纯药)、Opti-MEM培养基(GIBCO BRL)、IMDM培养基(GIBCO BRL)、PRMI1640培养基(GIBCO BRL)。通常培养温度为25-39℃，优选33-39℃。另外，培养基中添加的物质包括胎牛血清、人血清、马血清、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠、单硫甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸等。通常CO2为4-6％，优选5％。
由于造血干细胞能分化成造血系统的所有分化系列，所以可在试管内扩增造血干细胞后使之分化成各种细胞种类，进行移植。例如，如果红细胞必需的话，在扩增培养患者的干细胞后，利用EPO等促进红细胞分化诱导的因子，人为产生以红细胞为主要成分的造血细胞。
本发明的方法中包括培养造血干细胞后，从培养物中收集造血干细胞的步骤。
按本发明的方法培养的造血干细胞，利用单独的EDTA、包含EDTA的胰蛋白酶等作为细胞分离溶液使用的物质，从培养器皿中剥离，成为可用于人体的细胞悬液。
按本发明的方法培养的造血干细胞，可将造血干细胞与基质细胞分离移入患者。还可将基质细胞与造血干细胞同时移植。
按照本发明，制备方法中优选的制备方法包括在白细胞介素6(IL-6)和IL-6受体的α链(IL-6R)形成的融合蛋白、血小板生成素(TPO)、选自AGM区域来源的细胞、骨髓来源的基质细胞和间叶干细胞的基质细胞、根据情况选择的干细胞因子(SCF)和Flt-3配体(FL)存在下，培养造血干细胞的步骤。
按本发明，培养基中优选的培养基包括包含白细胞介素6(IL-6)和IL-6受体的α链(IL-6R)形成的融合蛋白、血小板生成素(TPO)、AGM区域来源的细胞、骨髓来源的基质细胞、从间叶干细胞筛选的基质细胞、根据情况包含干细胞因子(SCF)和Flt-3配体(FL)的培养基。
造血干细胞的用途
应用本发明的培养体系培养的造血干细胞，可取代以往的骨髓移植和脐带血移植，作为血细胞移植用的移植物应用。由于可半永久性移入移植物，所以造血干细胞的移植可改善以往的血细胞移植治疗。
造血干细胞的移植在对白血病进行全身性X线放射疗法和高剂量化学疗法时施用。例如，对实体癌患者实施化疗、放疗等有骨髓抑制副作用的治疗时，在术前采骨髓，在试管内扩增造血干细胞，术后返回到患者，可早日恢复因副作用而造成的造血系的障碍，如同进行更强力的化疗那样可改善化疗的治疗效果。另外，根据本发明所得造血干细胞能分化成各种血细胞，通过将之移入患者体内，少量形成各种血细胞，可试图改善呈现不全状况的患者。还可改善出现再生不良性贫血等贫血，因骨髓低形成而造成的造血不全症。此外，根据本发明的方法进行造血干细胞的移植所有效的疾患包括慢性肉芽肿、重复免疫功能不全综合征、无γ球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、获得性免疫功能不全综合征(AIDS)等免疫不全综合征、地中海贫血、酶缺损造成的溶血性贫血、镰刀状红细胞症等先天性贫血；Gaucher病、粘多糖症等溶酶体蓄积症、副肾白质变性症、各种癌或肿瘤等。
除所用细胞外，造血干细胞的移植与以往进行的骨髓移植和脐带血移植同样。有可能可以用于上述造血干细胞移植的造血干细胞的来源不限于骨髓，可应用前面所讲胎肝、胎儿骨髓、末梢血、应用细胞因子和/或抗癌剂动员了干细胞的末梢血和脐带血等。
除了按照本发明的方法产生的造血干细胞以外，移植物中可包含缓冲液等。
按照本发明的方法产生的造血干细胞可用于离体的基因治疗。针对造血干细胞进行的基因治疗很难，因为干细胞在静止期的染色体的重组率低，培养中干细胞发生分化等。通过利用本发明，可扩增干细胞而不分化，可大幅度改善基因导入率。所讲基因治疗是将外来基因(治疗用基因)导入造血干细胞，应用所得基因导入细胞进行。要导入的外来基因可根据病情适当选择。可作为以血细胞为靶细胞的基因治疗对象的疾病包括慢性肉芽肿、重复免疫功能不全综合征、无γ球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、获得性免疫功能不全综合征(AIDS)等免疫不全综合征、地中海贫血、酶缺损造成的溶血性贫血、镰刀状红细胞症等先天性贫血；Gaucher病、粘多糖症等溶酶体蓄积症、副肾白质变性症、各种癌或肿瘤等。
向造血干细胞中导入治疗用基因时，可应用通常所用的用于动物细胞基因导入的方法，如应用莫洛尼鼠白血病病毒等逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒(AAV)的载体、单纯疱疹病毒载体、HIV载体和内源性病毒载体RDI14(Kelly PF，Vandergriff J，Nathwani A，Nienhuis AW，Vanin EF，通过用猫内源性逆转录病毒(RDI14)包膜蛋白假型化的致癌逆转录病毒载体颗粒将基因高效地转移到脐血非肥胖糖尿病/严重复合免疫缺陷再增殖细胞中，Blood，2000Aug 15；96(4)：1206-14)等病毒来源的用于基因治疗的动物细胞用载体(所谓基因治疗用载体，参照Verma，I.M.，Nature，389：239，1997)的方法，磷酸钙共沉淀法，DEAE-葡聚糖法，电穿孔法，脂质体法，脂染法，显微注射法等。从靶细胞的染色体DNA能稳定持久表达整合的基因这一点考虑的话，优选逆转录病毒载体、腺病毒相关病毒载体或HIV载体。
例如，腺病毒相关病毒(AAV)载体可如下制备。首先，将野生型腺病毒相关病毒DNA两端的ITR(inverted terminal repeat)间插入了治疗用基因的载体质粒与表达病毒蛋白质的辅助质粒转染到293细胞中。接着感染辅助病毒的腺病毒，产生包含AAV载体的病毒颗粒。或者，转染表达担当辅助功能的腺病毒基因的载体而非腺病毒。然后，用所得病毒颗粒感染造血干细胞。载体DNA中，优选在目的基因的上游插入适当的启动子，下游插入适当的终止子，或在上游或下游适宜的位置插入增强子，由此，可调节基因的表达。为了防止沉默(サィレンシンゲ)，可在目的基因的上游或下游连接隔离子(ィンシュレ-タ-)。为了导入了治疗用基因的细胞的筛选更容易，可与治疗用基因连接耐药性基因等标志性基因。治疗用基因可以是正义基因也可以是反义基因。
基因治疗用组合物除包含按本发明的方法生产的造血干细胞以外，还可包含缓冲液和新型活性物质等。
再者，按本发明的培养体系扩增的造血干细胞可作为分化成血液之外组织的细胞使用。以往，人们认为生物体中存在的各种组织的干细胞只具有该组织的干细胞的作用，但近年来显示，也具有其它脏器干细胞的作用。造血干细胞或含有造血干细胞的细胞团具有分化成肝脏细胞(Lagases E，Connors H，AI-Dhalimy M，Reitsma M，Dohes M，Osborne L，Wang X，Finegold M，Weissman IL，Grompe M.，纯化的造血干细胞，体内分化成肝细胞，Nat Med.2000 Nov；6(11)：1229-34.；[2127]通过人LIN-，CD34+/-细胞体内产生人肝细胞，Esmail D.Zanjani，Christopher D.Porada，Kirsten B.Crapnell，Neil D.Theise，Dianne S.Kraus，F.R.MacKintosh，Joao L.Ascensao，Graca Almeida-Porada.Department of Veterans Affairs Medical Center，Reno，NV，USA；University of Nevada School of Medicine，Reno，NV，USA；New YorkUniversity School of Medicine，New York，NY，USA；Yale University，New Haven，CT，USA.Blood 2000 96(11)；494a)、骨骼肌细胞(GussoniE，Soneoka Y，Strickland CD，Buzney EA，Khan MK，Flint AF，KunkelLM，Mulligen RC.，通过干细胞移植在mdx小鼠中恢复肌营养不良蛋白的表达，Nature.1999 Sep 23；401(6751)：309-4)、心肌细胞(Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，Jakoniuk I，Anderson SM，Li B，Pickel J，McKayR，Nadal-Ginard B，Bodine DM，Leri A，Anversa P.，骨髓细胞再生受损的心肌，Nature.2001 Apr 5；410：701-5)、血管内皮细胞、肠粘膜细胞(Krause DS，Theise ND，Collector MI，Henegariu O，Hwang S，GardnerR，Neutzel S，Sharkis SJ，通过单一的骨髓来源的干细胞进行多器官多系统移植，Cell.2001 May 4；105(3)：369-77)等的能力。因此，按本发明的培养法制备的造血干细胞可用于治疗从肝功能不全、肌营养不良、心肌梗塞造成的心肌坏死、糖尿病引起的血管坏死、或肠道膜细胞坏死到正常细胞再生的治疗，按本发明的培养法制备的造血干细胞还可用于神经细胞的再生治疗。
                       实施例
实施例1：从小鼠骨髓制备造血干细胞
采集C57BL/6-Ly5.1pep(8-10周龄，雄性)(筑波大学中内启光教授提供)大腿骨内的骨髓，悬于PBS。按照常规方法(高津圣志，免疫研究的基本技术，羊土社，1995年)用比重离心法浓缩小鼠骨髓单核细胞，然后悬浮于染色缓冲液(含5％FCS、0.05％NaN3的PBS)中，按Osawa，M.等，Science 273：242-245，1996，用以下方法获得造血干细胞。
向骨髓单核细胞悬浮中添加FITC结合的CD34抗体、藻红蛋白结合的Sca-1抗体、别藻蓝素(allophycocyanin)c-Kit(均为Pharmingen公司产品)和以下6种生物素化的分化抗原特异的抗体CD45R、CD4、CD8、Gr-1、Ter119、CD11c(均为Pharmingen公司产品)，冰浴中放置20分钟进行反应。用染色缓冲液洗涤2次后，用细胞分选仪cellsorter(FACSVantage，Becton Dickinson)分选出CD34阴性、且Sca-1阳性、别藻蓝素c-Kit阳性且Lin阴性的细胞。
实施例2：细胞因子鸡尾酒与小鼠造血干细胞的液体培养
将实施例1中制备的小鼠造血干细胞50个/孔接种到U底的96孔板中，进行培养。向培养用的培养基S-clone SF03(三光纯药社)中添加0.1％BSA。分别添加50ng/ml的小鼠SCF(キリンビ-ル社)、人IL-6(キリンビ-ル社)、小鼠IL-11(R&D Systems)、Flt-3配体(R&D Systems)或小鼠SCF(キリン ビ-ル社)、FP6(东ソ-社)、Flt-3配体(R&D Systems)作为细胞因子鸡尾酒，37℃、5％CO2下培养7天。培养7天后，为了调整造血干细胞/前体细胞扩增比例，进行实施例3中所示竞争性长期造血再构建测定。
实施例3：给放射线照射小鼠移植造血细胞
将在实施例2及实施例3中培养的细胞与20万个全骨髓细胞(来源于C57BL/6-Ly5.2小鼠，Charles River)一起经尾静脉照射移植给经8.5Gy X射线照射的C57BL/6-Ly5.2小鼠(Charles River，8周龄，雄性)，各5只。移植后，按时间段从小鼠眼部回收末梢血，经FCAS计算C57BL/6-Ly5.1pep小鼠来源的细胞数的比例。按照常规方法(高津圣志免疫研究的基本技术，羊土社，1995年)进行末梢血分析。向50μl末梢血中加入350μl蒸馏水，放置30秒钟，使红细胞溶血后，加入2倍浓度的PBS离心，回收白细胞。用染色缓冲液(含5％FCS、0.05％NaN3的PBS)洗涤1次后，添加抗CD16抗体、FITC结合的抗Ly5.1(CD45.1)抗体、藻红蛋白结合的抗Gr-1和CD11c抗体，以及藻红蛋白结合的CD90(Thy1)和CD45R(B220)抗体(均购自Pharmingen公司)，冰浴中放置30分钟进行反应。接着，用染色缓冲液洗涤后，进行FACS分析。分别计算移植后随时间变化末梢血中Gr-1或CD11c阳性细胞中(髓系)Ly5.1阳性的比例，和CD90或CD45R阳性细胞中(淋巴系)Ly5.1阳性的比例，由此来推定造血干细胞培养期间可进行再构建细胞数的增减。
与图1所示，添加细胞因子进行培养时，移植后2周显示高嵌合性的具有短期骨髓再构建能力的造血前体细胞显著性增加。但是，细胞因子存在下培养的细胞的嵌合性1个月以后急速下降，比未培养移植的干细胞的嵌合性还低，这说明培养期间造血干细胞具有造血干细胞的分化性质，丢失了其长期再构建能力。另一方面，SCF+FP6+FL细胞因子联合与SCF+IL-6+IL-11+FL细胞因子联合相比，前者能长期保持稳定的嵌合性。该结果表明，应用FP6的培养体系中可同样进行与添加传递gp130受体信号的IL-6、IL-11时不同的造血细胞的扩增。前者中，即便在移植3个月后也可观察到高于后者的嵌合性，这提示加入FP6的细胞因子联合更能扩增未分化的造血细胞。
实施例4：小鼠基质细胞AGM-S3-A9与造血干细胞共培养
按WO99/03980或特开2001-37471制备基质细胞AGM-S3，对所得AGM-S3进行亚克隆，得到对人脐带血来源的造血干细胞支持活性高的亚克隆，即获得扩增或维持BFU-E活性高的亚克隆AGM-S3-A9。将AGM-S3-A9细胞(在含10％FCS的MEMα培养基中培养)接种到24孔培养皿中，1×105个/孔，培养1天，使细胞增殖到覆盖培养皿的底面。其后，换成含SCF(キリンビ-ル社)、TPO(キリンビ-ル社)(各20ng/ml)、FP6(东ソ-社)(各20ng/ml或50ng/ml)的1ml新鲜培养基(含10％FCS的MEMα培养基)，将100个实施例1中获得的小鼠造血干细胞(来源于小鼠C57BL/6-Ly5.1)铺到这些细胞上，开始培养。培养第7天用胰蛋白酶处理(含0.05％胰蛋白酶、0.5mM EDTA的PBS，37℃放置2-5分钟)细胞，回收包含培养皿中基质细胞在内的所有细胞，每2份培养体系作为1份移植给1只小鼠。回收按实施例2的方法同时制备的仅细胞因子鸡尾酒(各细胞因子的浓度为20ng/ml)的培养体系(含10％FCS的MEMα培养基)作为对照。应用回收的细胞，按实施例3所示的方法分析造血干细胞或造血前体细胞的增殖状况(图2)。
仅SCF+TPO+FP6的液体培养时，与实施例3同样，移植后2周可看到高嵌合性，但移植后2个月嵌合性减少。另一方面，基质细胞AGM-S3-A9与SCF+TPO+FP6共培养时，移植后2周可看到高与仅细胞因子的培养条件同样高的嵌合性，但即便移植后2个月还可维持超过输入的嵌合性。远远超过输入嵌合性的嵌合性上升提示，基质细胞AGM-S3-A9与SCF+TPO+FP6共培养结束时存在的造血干细胞比开始时的多，这提示造血干细胞在该培养体系下进行自身复制，发生了增殖。该结果提示，AGM-S3-A9基质细胞与SCF+TPO+FP6的存在下培养造血干细胞，不仅可扩增造血前体细胞而且可扩增造血干细胞。
实施例5：人间叶干细胞(hMSC)与造血干细胞其培养
将人间叶干细胞(hMSC)(CAMBREX，cat.#PT-2501：Lot#：0F0558专用培养基；hMSC BulletKit中培养)接种到24孔培养皿中，1×105个/孔，培养1天，使细胞增殖到覆盖培养皿的底面。其后，换成含SCF(キリンビ-ル社)、TPO(キリンビ-ル社)、FP6(东ソ-社)(各20ng/ml)的1ml新鲜培养基(含10％FCS的MEMα培养基)，将50个实施例1中获得的小鼠造血干细胞(来源于小鼠C57BL/6-Ly5.1)铺到这些细胞上，开始培养。培养第7天用胰蛋白酶处理(含0.05％胰蛋白酶、0.5mM EDTA的PBS，37℃放置2-5分钟)细胞，回收包含培养皿中基质细胞在内的所有细胞，每2份培养体系作为1份移植给1只小鼠。准备未添加细胞因子鸡尾酒的与hMSC共培养的培养体系，同时回收作为对照。应用回收的细胞，按实施例3所示的方法分析造血干细胞的增殖状况(图3)。
仅与hMSC共培养时未观察到嵌合性上升，培养过程中造血前体细胞、造血干细胞均丢失。另一方面，SCF+TPO+FP6细胞因子存在下与hMSC共培养造血干细胞时，移植后2周可看到高嵌合性，同时移植后经过2个月还可维持超过输入的嵌合性。远远超过输入嵌合性的嵌合性上升提示，hMSC细胞与SCF+TPO+FP6共培养结束时存在的造血干细胞比开始时的多，这提示造血干细胞在该培养体系下进行自身复制，发生了增殖。该结果提示，hMSC细胞与SCF+TPO+FP6的存在下培养造血干细胞，不仅可扩增造血前体细胞而且可扩增造血干细胞。
实施例6：人造血干细胞及造血前体细胞支持活性的评价
(1)人脐带血CD34阳性干细胞的分离
按照キリンビ-ル医药探索研究所研究伦理委员会的标准，正常分娩时收集人脐带血。用添加了肝素(Novo Nordisk公司)的注射器采集，以防止血液凝固。将肝素处理的脐带血重悬到Ficoll-paque(Pharmacia)上，通过比重离心(400G，室温，30分钟)分离单核细胞。用红细胞溶血剂(PharmLyseTM，Pharmacia)处理混入单核细胞中的红细胞，室温5分钟，使之溶血。用含1mM EDTA的PBS溶液洗涤单核细胞，然后添加结合CD34抗体的磁株(Direct CD34isolation kit，Miltenyi Biotec)，冰浴下放置30分钟。洗涤细胞后，用磁柱(MidiMACS，Miltenyi Biotec)分离表达CD34的细胞。该细胞团作为来源于人脐带血的造血干细胞。
(2)人造血干细胞与AGM-S3亚克隆(AGM-S3-A9)的共培养
将上述A9细胞以2×105个/孔接种到6孔培养皿(Faleon)中，用1ml含10％FCS的MEMα培养基培养，使细胞增殖到覆盖培养皿的底面。将来源于人脐带血的CD34阳性造血干细胞10000个/孔铺到基质细胞上，向4ml含10％FCS的MEMα培养基中添加含人FP620ng/ml、SCF 20ng/ml、人TPO(キリンビ-ル社)20ng/ml、和人FL100ng/ml(R&D Systems，目录号308-FK)的细胞因子鸡尾酒(SCF+FP6)，共培养。为了比较增殖活性，对照组不添加细胞因子只与A9共培养，或A9不存在下，向12孔中加入2ml含上述细胞因子鸡尾酒的培养基培养。共培养开始1周后除去半量培养基，添加1ml新培养基。共培养2周用胰蛋白酶处理(含0.05％胰蛋白酶、0.5mMEDTA的PBS(GIBCO BRL)，37℃放置5-10分钟)细胞，使基质细胞与人血液细胞同时从培养皿上脱落下来，通过进行集落测定来分析造血干细胞或造血前体细胞的增殖。
(3)通过集落测定评价造血干细胞和造血前体细胞的增殖状况
将上述共培养体系中增殖的细胞供给适当稀释的1ml甲基纤维素培养体系中，进行4连解析。为了比较扩增效果，以共培养前的CD34阳性细胞作为对照进行同样的集落测定。甲基纤维素培养体系是向含有0.89％甲基纤维素(信越化学)的IMDM培养基(GIBCO BRL)中加入10％胎牛血清(Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺(GIBCO BRL)、1mM丙酮酸钠(和光化学)、0.5uM 2-巯基乙醇和抗生素(终浓度100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、250ng/ml两性霉素B；Antibiotic-Antimycotic(X100)，liquid，GIBCO BRL)，向其中添加100ng/ml人SCF、人IL-6，10ng/ml人IL-3、人G-CSF、人TPO、41U/mlEPO(均为キリンビ-ル社)，在35mm培养皿(Nunc)中进行培养。上面所用各种造血因子均为重组体，为纯品。培养2周后，显微镜下观察出现的集落，计算CFU-GM(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)、BFU-E(红细胞样爆发形成单位)、CFU-Emix(红细胞混合集落形成单位)数。
图4表示CD34阳性造血干细胞与AGM-S3-A9基质细胞存在下，或基质细胞非存在下培养2周后检测的造血干细胞或造血前体细胞的扩增状况的结果。与共培养前相比，AGM-S3-A9基质细胞与细胞因子鸡尾酒培养基可支持CFU-GM、BFU-E、CFU-Emix所有的分化系列细胞的增殖。与单独应用细胞因子的培养体系相比，与只存在细胞因子鸡尾酒的条件下相比，可确认基质细胞存在下所有集落的扩增。特别是通常维持红细胞系前体细胞的BFU-E、CFU-Emix很困难，但在细胞因子鸡尾酒存在下，与基质细胞共培养的体系比单独应用细胞因子的体系更易看到增殖。因此，对于人造血细胞而言，基质细胞存在下添加包含sIL-6R-IL-6融合蛋白的细胞因子鸡尾酒可促进造血干细胞或造血前体细胞的扩增。
(4)A9和细胞因子鸡尾酒的造血干细胞支持活性中FP6的效果
对本造血干细胞增殖培养体系中FP6的活性进行评价。以CFU-GM、BFU-E、CFU-Emix为指标，应用上述(2)和(3)的评价体系对添加含FP6的细胞因子鸡尾酒(SCF+TPO+FL+FP6)或不含FP6的细胞因子鸡尾酒(SCF+TPO+FL)时的AGM-S3-A9共培养体系，或非共培养体系，进行对CD34阳性人脐带血来源的造血干细胞支持能力的比较。图5显示共培养2周的结果。无论应用何种细胞因子鸡尾酒的情况下，由于基质细胞的存在，可扩增所有的集落形成细胞。SCF+TPO+FL+FP6与SCF+TPO+FL的细胞因子组合应用时，FP6存在时可看到更多的集落形成细胞的增加。
到目前为止，有在基质细胞非存在下，向SCF+TPO+FL中添加sIL-6R-IL-6融合蛋白，或向SCF+TPO+FL中添加sIL-6R、IL-6进行培养时，可有效扩增SCID再构建细胞的报道(Koller O，Aviram R，Chebath J，beh-Hur H，Nagler A，Shultz L，Revel M，Lapidot T.，sIL-6R-IL-6：可溶性白细胞介素6(IL-6)受体/IL-6融合蛋白体外增强能够再增殖严重复合型免疫缺陷小鼠的人CD34(+)CD38(-/low)细胞的维持和增殖，Blood 1999 Aug 194：3923-31；Ueda T，Tsuji K，Yoshino H，Ebihara Y，Yagasaki H，Hisakawa H，Mitsui T，Manabe A，Tanaka R，Kobayashi K，Ito M，Yasukawa K，Nakahata T.，通过干细胞因子、Flk2/Flt3配体、血栓形成素、IL-6、可溶性IL-6受体扩增人NOD/SCID-再增殖细胞，J Clin Invest.2000 Apr；105(7)：1013-21.)。本实施例中，将基质细胞加入上述细胞因子的组合中，可看到超过细胞因子鸡尾酒单独时的集落形成细胞的扩增。本实施例的结果显示，与细胞因子鸡尾酒单独时相比，培养体系中存在基质细胞时，集落形成细胞增加，提示人造血干细胞进行了扩增。
对本造血干细胞增殖培养体系中TPO的活性进行检测。以CFU-GM、BFU-E、CFU-Emix为指标，应用上述(2)和(3)的评价体系，对添加含TPO的细胞因子鸡尾酒(SCF+TPO+FL+FP6)或不含TPO的细胞因子鸡尾酒(SCF+FP6+FL)时的AGM-S3-A9共培养体系，进行对CD34阳性人脐带血来源的造血干细胞支持能力的比较。结果示于图6。TPO存在时(SCF+TPO+FL+FP6)与TPO不存在时(SCF+FP6+FL)比较，可看到BFU-E 3.8倍、CFU-Emix 33倍扩增效果的差别。该结果表明可选择TPO作为所添加的细胞因子。另外，通过进行这样的检测，可选择适于本培养体系的细胞因子。

Claims (13)

1.一种制备造血干细胞的方法，它包括在gp130刺激因子、一种或一种以上细胞因子、以及基质细胞的存在下培养造血干细胞的步骤。
2.权利要求1的方法，其中gp130刺激因子为白细胞介素-6(IL-6)或其突变体与IL-6受体α链(IL-6R)或其突变体的融合蛋白、IL-6R或其突变体与IL-6或其突变体的联合、对gp130有激动作用的抗gp130抗体、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞游走抑制因子(LIF)、制瘤素M或心营养蛋白。
3.权利要求1的方法，其中gp130刺激因子为IL-6或其突变体与IL-6R或其突变体的融合蛋白。
4.权利要求3的方法，其中融合蛋白为IL-6R的112-333位片段C末端与IL-6的38-212位片段N末端直接连接而成的蛋白质(FP6)。
5.权利要求1的方法，其中细胞因子是使造血干细胞增殖和/或维持造血干细胞的因子。
6.权利要求1的方法，其中细胞因子为干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)或其突变体或它们的衍生物、Flt-3配体(FL)或这些因子的组合。
7.权利要求1的方法，其中细胞因子至少包含血小板生成素(TPO)或其突变体或它们的衍生物。
8.权利要求1的方法，其中基质细胞为AGM区域来源的细胞、骨髓来源的基质细胞、间叶干细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、胎肝来源的细胞或前体脂肪细胞。
9.权利要求1-8任一项中的方法，在进行造血干细胞的培养步骤之前，还包括培养基质细胞的步骤。
10.一种培养造血干细胞的方法，它包括在gp130刺激因子、一种或一种以上细胞因子、以及基质细胞的存在下培养造血干细胞的步骤。
11.一种制备造血干细胞的方法，它包括任选地在干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(FL)的存在下，与白细胞介素-6(IL-6)与IL-6受体α链(IL-6R)的融合蛋白、血小板生成素(TPO)、以及选自AGM区域来源的细胞、骨髓来源的基质细胞、间叶干细胞的基质细胞一起培养造血干细胞的步骤。
12.一种用于培养造血干细胞的培养基，它包含gp130刺激因子、一种或一种以上细胞因子、以及基质细胞。
13.一种用于培养造血干细胞的培养基，它包含白细胞介素-6(IL-6)与IL-6受体α链(IL-6R)的融合蛋白、血小板生成素(TPO)、以及选自AGM区域来源的细胞、骨髓来源的基质细胞、间叶干细胞的基质细胞，任选地包含干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(FL)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102337268A (zh) * 2010-07-16 2012-02-01 北京大学 人类ctrp4基因、其编码的蛋白质及它们的应用
CN104745668A (zh) * 2014-01-15 2015-07-01 上海吉泉生物技术有限公司 一种新型造血干细胞检测试剂制备方法和应用
CN105101979A (zh) * 2012-12-21 2015-11-25 奥卡塔治疗公司 由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050271639A1 (en) * 2002-08-22 2005-12-08 Penn Marc S Genetically engineered cells for therapeutic applications
KR100560340B1 (ko) * 2003-11-11 2006-03-14 한훈 제대혈로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법
KR100534215B1 (ko) * 2003-11-11 2005-12-08 (주)히스토스템 냉동 보관된 제대혈로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법
JP2007536936A (ja) 2004-05-14 2007-12-20 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 幹細胞集団および使用方法
WO2006030442A2 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Gamida-Cell Ltd. Methods of ex vivo progenitor and stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells
GB0503918D0 (en) * 2005-02-25 2005-04-06 Erasmus University Cell
EP1856245A2 (en) * 2005-03-01 2007-11-21 National Center for Cell Sciences A composition for creating an artificial bone-marrow like environment and uses thereof
JP2006345726A (ja) * 2005-06-14 2006-12-28 Hamamatsu Univ School Of Medicine 脳腫瘍治療用発現ベクター
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
US20080286249A1 (en) * 2006-01-12 2008-11-20 Varney Timothy R Use of mesenchymal stem cells for treating genetic diseases and disorders
CA2682469A1 (en) 2007-03-30 2008-10-09 The Cleveland Clinic Foundation Method of treating ischemic disorders
JP5573161B2 (ja) * 2007-12-05 2014-08-20 日産化学工業株式会社 ヘテロ環化合物による造血幹細胞の増幅方法
EP2228434A4 (en) * 2007-12-05 2013-01-23 Nissan Chemical Ind Ltd Amplification method for hematopoietic stem cells with heterocyclic compound
US20100310536A1 (en) * 2007-12-05 2010-12-09 Nissan Chemical Industries Limited Method for expanding hematopoietic stem cells using heterocyclic compound
CA2709398C (en) 2007-12-14 2017-11-07 The Cleveland Clinic Foundation Use of stromal cell-derived factor 1 for promoting wound healing
JP2011160661A (ja) * 2008-06-02 2011-08-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 血球細胞の初期化法
WO2010084970A1 (ja) * 2009-01-23 2010-07-29 国立大学法人大阪大学 標的細胞誘導用フィーダー細胞
AU2010286511B2 (en) 2009-08-28 2016-05-26 Juventas Therapeutics, Inc. SDF-1 delivery for treating ischemic tissue
SG10201800628QA (en) 2010-09-07 2018-02-27 Technion Res & Dev Foundation Novel Methods And Culture Media For Culturing Pluripotent Stem Cells
EP2625577B1 (en) 2010-10-08 2019-06-26 Terumo BCT, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
US20150064273A1 (en) 2012-02-13 2015-03-05 Gamida-Cell Ltd. Mesenchymal Stem Cells Conditioned Medium and Methods of Generating and Using the Same
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
JP6633522B2 (ja) 2013-11-16 2020-01-22 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド バイオリアクターにおける細胞増殖
WO2015148704A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Terumo Bct, Inc. Passive replacement of media
WO2015175472A1 (en) * 2014-05-12 2015-11-19 The General Hospital Corporation Compositions enriched for hox11+stem cells and methods of preparing the same
WO2016049421A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled feed
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
JP6660635B2 (ja) * 2015-08-21 2020-03-11 株式会社ＡｄｉｐｏＳｅｅｄｓ 細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法
EP3355914B1 (en) 2015-09-29 2024-03-06 The General Hospital Corporation A composition comprising bcg for reducing cholesterol.
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
EP3656841A1 (en) 2017-03-31 2020-05-27 Terumo BCT, Inc. Cell expansion
US20210046193A1 (en) * 2018-03-02 2021-02-18 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Drug stabilized therapeutic transgenes delivered by adeno-associated virus expression
KR20220113290A (ko) 2021-02-05 2022-08-12 의료법인 성광의료재단 다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계세포의 분화 방법
US12043823B2 (en) 2021-03-23 2024-07-23 Terumo Bct, Inc. Cell capture and expansion

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0668352A1 (en) * 1994-02-14 1995-08-23 Kirin Brewery Company, Ltd. Protein having TPO activity
US6103522A (en) * 1994-07-20 2000-08-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Human marrow stromal cell lines which sustain hematopoiesis
US5610056A (en) * 1994-11-16 1997-03-11 Amgen Inc. Use of stem cell factor interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor to induce the development of hematopoietic stem cells
PT793714E (pt) * 1994-11-16 2002-12-31 Amgen Inc Utilizacao do factor de celulas estaminais e do receptor de interleucina 6 soluvel para a expansao ex vivo de celulas hematopoieticas multipotentes
AU8243798A (en) * 1997-07-16 1999-02-10 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Agm-derived stroma cells
WO2000001731A1 (fr) * 1998-07-06 2000-01-13 Tosoh Corporation Proteine fusionnee avec liaison directe du recepteur il-6 a il-6
US20040170604A1 (en) * 1998-07-06 2004-09-02 Tosoh Corporation IL-6 receptor IL-6 direct fusion protein
KR20020013480A (ko) * 1998-12-04 2002-02-20 추후기재 사람 뇌의 내피세포 및 성장배지 및 원시 ｃｄ34+ｃｄ38-골수 간세포의 증가방법
EP1425388A2 (en) * 2001-09-12 2004-06-09 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung A method for isolating, culturing and differentiating intestinal stem cells for therapeutic use

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102337268A (zh) * 2010-07-16 2012-02-01 北京大学 人类ctrp4基因、其编码的蛋白质及它们的应用
CN102337268B (zh) * 2010-07-16 2013-04-24 北京大学 人类ctrp4基因、其编码的蛋白质及它们的应用
CN105101979A (zh) * 2012-12-21 2015-11-25 奥卡塔治疗公司 由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物
US11400118B2 (en) 2012-12-21 2022-08-02 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods for production of platelets from pluripotent stem cells and compositions thereof
US12076347B2 (en) 2012-12-21 2024-09-03 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods for production of platelets from pluripotent stem cells and compositions thereof
US12109239B2 (en) 2012-12-21 2024-10-08 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods for production of human hemogenic endothelial cells from pluripotent stem cells and compositions thereof
CN104745668A (zh) * 2014-01-15 2015-07-01 上海吉泉生物技术有限公司 一种新型造血干细胞检测试剂制备方法和应用

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