CN116855454A - 一种car-t细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体为一种CAR‑T细胞的培养方法。所述方法包括：1）从血样中通过离心收集T细胞；2）通过T细胞培养基培养活性T细胞并扩增；3）将癌细胞株在培养基中培养，使其成为CAR‑T细胞的杀伤靶细胞，利用基因工程为CAR‑T细胞株外接一种传递蛋白，并通过自增殖技术扩增得到CAR‑T细胞株；4）培养基中的细胞密度适宜时，向其中加入活化剂，对细胞刺激一段时间；5）将细胞进行取代培养，维持培养基的pH值和温度，并控制培养基中的细胞密度，获得CAR‑T细胞。本发明方法使得CAR‑T细胞可以表达CAR(嵌合抗原受体)，具有特异性识别肿瘤细胞，增强CAR‑T细胞的杀瘤活性并减少耗竭。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种CAR-T细胞的培养方法。
背景技术
CAR-T，全称是Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。
了解CAR-T细胞活性的关键特征非常重要。细胞表面上CAR的表达毫无疑问是重要的。其次，移植后在血液中必须能检测到足够的CAR-T细胞。可通过聚合酶链反应和流式细胞术检测CAR-T细胞。目前尚不清楚CAR-T细胞的给与剂量最少要多少才能起效。若CAR-T细胞在体内能有效扩增，那么少量的CAR-T细胞仍能够产生很好的疗效。鉴于生产CAR-T细胞的复杂性，能够在输入低剂量的细胞下就能达到疗效是非常吸引人的。毫无疑问输入的细胞必须存活足够的时间。
在实体瘤中，CAR-T细胞归巢至肿瘤部位不足以达到预期的临床疗效。肿瘤的免疫抑制性微环境和T细胞的内在因素导致CAR-T细胞的效应功能逐步丧失。功能障碍的CAR-T细胞无法杀伤肿瘤细胞。T细胞的功能受多种因素的调节,例如免疫检查点分子、抑制性细胞因子、转录因子、代谢分子和凋亡基因等。其中在肿瘤微环境还富含免疫抑制性细胞因子。其中TGF-β有抑制CAR-T细胞的功能，为肿瘤的生长和转移提供有利的微环境。
发明内容
为解决上述CAR-T细胞在肿瘤微环境受到TGF-β抑制的问题，本发明提供一种CAR-T细胞的培养方法，具体步骤如下：
1）从血样中通过离心收集T细胞；
2）通过T细胞培养基培养活性T细胞并扩增；
3）将癌细胞株在培养基中培养，使其成为CAR-T细胞的杀伤靶细胞，利用基因工程为CAR-T细胞株外接一种传递蛋白，并通过自增殖技术扩增得到CAR-T细胞株；
4）培养基中的细胞密度适宜时，向其中加入活化剂，对细胞刺激一段时间；
5）将细胞进行取代培养，维持培养基的pH值和温度，并控制培养基中的细胞密度，获得CAR-T细胞。
作为优选，
步骤1）所述离心，在进行离心前向血液样品中添加抗凝剂。
作为优选，
步骤2）所述培养基的pH值为6.5～7.5。
作为优选，
步骤2）所述培养基包括L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸，其中L-半胱氨酸浓度为1.6～2.4 g/L、L-组氨酸浓度为1.5～2.2 g/L、L-异亮氨酸浓度为3.8～4.2 g/L、L-丙氨酸浓度为1.8～2.3 g/L、L-丝氨酸浓度为3.6～4.4 g/L、L-精氨酸浓度为3.5～4.5 g/L，培养基环境是36.5～37.2 ℃。
作为优选，
步骤3）所述CAR-T细胞株的外接传递蛋白为切除TGF-β受体胞内信号刺激域并且其胞内部分与细胞因子受体胞内刺激域进行融合的结构蛋白。进一步，结构为按照信号蛋白sp、TGF-β受体胞外域、TGF-β受体跨膜域、细胞因子受体胞内刺激域顺序依次串联表达的。
作为优选。
步骤3）所述基因工程技术包括克隆CAR-T细胞株外接的传递蛋白的遗传因子1524bp，用 Nde I和HindIII在温度为36.5～37.2 ℃条件下双酶切接入CAR-T细胞，使CAR-T细胞形成包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的核酸序列。
作为优选，
步骤4）所述活化剂包括IL-12R、IL-15R、IL-18R的一种或多种。
作为优选，
步骤4）所述细胞密度为1×107个细胞/mL。
作为优选，
步骤4）所述对细胞刺激12～48 h，最优选为24～30 h。
作为优选，
步骤5）所述温度为36.0～37.5 ℃，最优选为36.5～37.2 ℃。
作为优选，
步骤5）所述pH为6.5～7.5。
作为优选，
步骤5）所述细胞密度为8×106个细胞/mL。
作为优选，
步骤1～5）中任一步骤的二氧化碳含量≥5 ％。
对于本发明技术方案而言，核心之处在于为CAR-T细胞株外接一种特殊的传递蛋白，通过识别靶抗原的受体共表达在免疫效应细胞上可以抑制肿瘤微环境中的TGF-β并提高CAR-T细胞的增殖和存活水平，达到优化CAR-T细胞的杀伤功能，减少肿瘤微环境对自身CAR-T细胞的抑制作用。
同时，本发明中所述活化剂IL-12是一种促炎症细胞因子，可诱导Th1进行CD4+T细胞反应，促进CD8+克隆扩增和持续存在，它还负责调节CTL和自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性活性，重新激活无能的肿瘤浸润淋巴细胞，对结构性表达IL-12的CD19-CAR-T细胞的临床前研究表明，它增强了肿瘤杀伤效果和针对癌症抗原的免疫记忆；IL-15是一种刺激CD8+T细胞和NK细胞活化、增殖和细胞毒性活性的细胞因子，IL-18增加Th1细胞细胞因子的产生，同时抑制IL-10的合成，IL-15和IL-18都是免疫反应的增强剂，已经在CAR-T细胞上进行了测试，与传统的CAR-T细胞相比，分泌IL-18和IL-15的CAR-T细胞在小鼠中显示出增强的扩张性和持久性，并且在体外和体内显示出增强的肿瘤细胞毒性。
与现有技术相比，本发明具备的有益效果：
1）CAR-T细胞可以表达CAR(嵌合抗原受体)，具有特异性识别肿瘤细胞；
2）CAR-T细胞可以表达IL-15R胞内刺激域融合蛋白及嵌合抗原受体，减少肿瘤微环境，增强CAR-T细胞的杀瘤活性并减少耗竭；
3）CAR-T细胞可降低TGF-β通路对T细胞抑制作用，以增强其免疫疗法的疗效；
4）CAR-T细胞可激活IL-15信号通路，IL-15是T细胞的生长因子，可以促进抗原刺激的T细胞增殖，同时还能在一定条件下，非特异性地诱导记忆性T细胞的增殖，诱导这些细胞分泌IFN-γ、TNF-α等多种活性物质，进而抑制肿瘤细胞的生长，增强抗肿瘤能力及其免疫疗法的疗效。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料；
如无特殊说明，本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。
实施例1：本发明提供一种CAR-T细胞的培养方法，
具体步骤如下：
1）收集血液血样品，向血液样品中添加抗凝剂，然后对血液进行离心，收集分离出的T细胞；
2）在由浓度为1.6 g/L的L-半胱氨酸、浓度为1.5 g/L的L-组氨酸、浓度为3.8 g/L的L-异亮氨酸、浓度为1.8 g/L的L-丙氨酸、浓度为3.6 g/L的L-丝氨酸、浓度为3.5 g/L的L-精氨酸组成的培养基，在温度为36.5 ℃，pH为6.5的条件下培养活性T细胞并扩增；
3）使用基因工程技术为细胞外接一种特殊的传递蛋白，传递蛋白中按照信号蛋白sp、TGF-β受体胞外域、TGF-β受体跨膜域、细胞因子受体胞内刺激域顺序依次串联表达，将癌细胞株培养在培养基中，使活性T细胞成为CAR-T细胞的杀伤靶细胞，并通过自增殖技术扩增得到CAR-T细胞株；
4）培养基中的细胞密度为1×107 个细胞/mL时，向其中加入活化剂IL-18R，对细胞刺激5 h；
5）将细胞进行取代培养，维持培养基在pH值为6.5，温度为36.5 ℃，并控制培养基中的细胞密度不超过8×106 个细胞/mL，获得CAR-T细胞。
上述步骤中的二氧化碳含量均≥5 ％。
对培养得到的细胞进行如下检测，检测结果如下表表1。
细胞数量检测：
1）用96 %酒精冲洗计数板后，用干净鹿皮擦净，另擦净盖片一张；把盖片覆在计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；
2）取吸管1 支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液9 滴，再滴入台盼蓝染液1 滴，混匀，置2～3min；
3）把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1~2 滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；
4）镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者；计算四角大方格内的细胞数；压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内（即仅计算压两个边的细胞）。
计算公式：细胞数/毫升原液=（4大格细胞总数/4）×10000×稀释倍数。
细胞存活率检测：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录720 h后血液中CAR-T细胞数量，并计算细胞存活率。
计算公式：细胞存活率=12 h时血液中细胞数量/720 h时血液中细胞数量×100%。
细胞增殖速度：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录血液中CAR-T细胞数量，观察CAR-T细胞在实体肿瘤环境中什么时间会出现增值高峰。
持久性：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录血液中CAR-T细胞数量，观察CAR-T细胞在体内存活时间。
本检测中细胞存活率检测、细胞增殖速度检测和持久性检测需同时在同一个体中进行。
表1 细胞检测
实施例2：本发明提供一种CAR-T细胞的培养方法，
具体步骤如下：
1）收集血液血样品，向血液样品中添加抗凝剂，然后对血液进行离心，收集分离出的T细胞；
2）在由浓度为2 g/L的L-半胱氨酸、浓度为2 g/L的L-组氨酸、浓度为4 g/L的L-异亮氨酸、浓度为2 g/L的L-丙氨酸、浓度为4 g/L的L-丝氨酸、浓度为4 g/L的L-精氨酸组成的培养基，在温度为37 ℃，pH为7.0的条件下培养活性T细胞并扩增；
3）使用基因工程技术为细胞外接一种特殊的传递蛋白，传递蛋白中按照信号蛋白sp、TGF-β受体胞外域、TGF-β受体跨膜域、细胞因子受体胞内刺激域顺序依次串联表达，将癌细胞株培养在培养基中，使活性T细胞成为CAR-T细胞的杀伤靶细胞，并通过自增殖技术扩增得到CAR-T细胞株；
4）培养基中的细胞密度为1×107 个细胞/mL时，向其中加入活化剂IL-15R，对细胞刺激7h；
5）将细胞进行取代培养，维持培养基在pH值为7，温度为37 ℃，并控制培养基中的细胞密度不超过8×106 个细胞/mL，获得CAR-T细胞。
上述步骤中的二氧化碳含量均≥5 ％。
对培养得到的细胞进行如下检测，检测结果如下表表2。
细胞数量检测：
1）用96 %酒精冲洗计数板后，用干净鹿皮擦净，另擦净盖片一张；把盖片覆在计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；
2）取吸管1 支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液9 滴，再滴入台盼蓝染液1 滴，混匀，置2～3min；
3）把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1~2 滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；
4）镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者；计算四角大方格内的细胞数；压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内（即仅计算压两个边的细胞）。
计算公式：细胞数/毫升原液=（4大格细胞总数/4）×10000×稀释倍数。
细胞存活率检测：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录720 h后血液中CAR-T细胞数量，并计算细胞存活率。
计算公式：细胞存活率=12 h时血液中细胞数量/720 h时血液中细胞数量×100%。
细胞增殖速度：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录血液中CAR-T细胞数量，观察CAR-T细胞在实体肿瘤环境中什么时间会出现增值高峰。
持久性：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录血液中CAR-T细胞数量，观察CAR-T细胞在体内存活时间。
本检测中细胞存活率检测、细胞增殖速度检测和持久性检测需同时在同一个体中进行。
表2 细胞检测
实施例3：本发明提供一种CAR-T细胞的培养方法，
具体步骤如下：
1）收集血液血样品，向血液样品中添加抗凝剂，然后对血液进行离心，收集分离出的T细胞；
2）在由浓度为2.4 g/L的L-半胱氨酸、浓度为2.2 g/L的L-组氨酸、浓度为4.2 g/L的L-异亮氨酸、浓度为2.3 g/L的L-丙氨酸、浓度为4.4 g/L的L-丝氨酸、浓度为4.5 g/L的L-精氨酸组成的培养基，在温度为37.2 ℃，pH为7.5的条件下培养活性T细胞并扩增；
3）使用基因工程技术为细胞外接一种特殊的传递蛋白，传递蛋白中按照信号蛋白sp、TGF-β受体胞外域、TGF-β受体跨膜域、细胞因子受体胞内刺激域顺序依次串联表达，将癌细胞株培养在培养基中，使活性T细胞成为CAR-T细胞的杀伤靶细胞，并通过自增殖技术扩增得到CAR-T细胞株；
4）培养基中的细胞密度为1×107个细胞/mL时，向其中加入活化剂IL-12R，对细胞刺激10 h；
5）将细胞进行取代培养，维持培养基在pH值为7.5，温度为37.2 ℃，并控制培养基中的细胞密度不超过8×106个细胞/mL，获得CAR-T细胞。
上述步骤中的二氧化碳含量均≥5 ％。
对培养得到的细胞进行如下检测，检测结果如下表表3。
细胞数量检测：
1）用96 %酒精冲洗计数板后，用干净鹿皮擦净，另擦净盖片一张；把盖片覆在计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；
2）取吸管1 支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液9 滴，再滴入台盼蓝染液1 滴，混匀，置2～3min；
3）把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1~2 滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；
4）镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者；计算四角大方格内的细胞数；压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内（即仅计算压两个边的细胞）。
计算公式：细胞数/毫升原液=（4大格细胞总数/4）×10000×稀释倍数。
细胞存活率检测：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录720 h后血液中CAR-T细胞数量，并计算细胞存活率。
计算公式：细胞存活率=12 h时血液中细胞数量/720 h时血液中细胞数量×100%。
细胞增殖速度：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录血液中CAR-T细胞数量，观察CAR-T细胞在实体肿瘤环境中什么时间会出现增值高峰。
持久性：向健康的小白鼠注射300 mg/kg的肾上腺酮促使实验小白鼠体内癌细胞迅速增长，148 h后小白鼠体内出现肿瘤或结块，将已经活化处理过的CAR-T细胞植入小白鼠体内，每12 h对小白鼠进行抽血，记录血液中CAR-T细胞数量，观察CAR-T细胞在体内存活时间。
本检测中细胞存活率检测、细胞增殖速度检测和持久性检测需同时在同一个体中进行。
表3 细胞检测
对比例1：一种CAR-T细胞的培养方法，
与实施例2相比，对比例1仅不对本发明独有的氨基酸培养基进行使用，使用市售细胞培养基，替代氨基酸培养基进行CAR-T细胞的培养。
对所培养的CAR-T细胞在于实施例2在相同的条件进行相同的检测并与实施例2做对比，具体数据如下表表4所示。
表4 对比例1性能测试
从上述性能测试结果可以看出，本发明提供的氨基酸培养基可以在CAR-T细胞株为外接一种特殊的传递蛋白，该蛋白可以阻碍细胞上TGF-β受体向细胞内部信号传递，并且其胞内部分与细胞因子受体胞内刺激域进行融合的结构蛋白还可以修饰细胞外环境中TGF-β活性分子，减少肿瘤微环境中有效TGF-β的数量，识别靶抗原的受体共表达在免疫效应细胞上可以抑制肿瘤微环境中的TGF-β并提高CAR-T细胞的增殖和存活水平，达到优化CAR-T细胞的杀伤功能，减少肿瘤微环境对自身CAR-T细胞的抑制作用。
对比例2：一种CAR-T细胞的培养方法，
与实施例2相比，对比例2仅改变本发明中活化剂进行使用，使用市售功能性抗人CD28 单克隆抗体，替代活化剂进行CAR-T细胞的培养。
对所培养的CAR-T细胞在于实施例2在相同的条件进行相同的检测并与实施例2做对比，具体数据如下表表5所示。
表5 对比例2性能测试
从上述性能测试结果可以看出，功能性抗人 CD28 单克隆抗体可以高能效的催动CAR-T细胞，但是实验小白鼠出现了严重的细胞因子释放综合症，并于72 h后死亡，通过对小白鼠血样的研究，发现大量的IL-6，导致巨噬细胞活化综合征，并且小白鼠体内肿瘤和结块的体积仅有部分减小，根据对比例2的结果讨论，对比例2没有达到本发明的预期。
对比例3：一种CAR-T细胞的培养方法，
与实施例2相比，对比例3仅不对本发明中活化剂进行使用对CAR-T细胞的培养。
对所培养的CAR-T细胞在于实施例2在相同的条件进行相同的检测并与实施例2做对比，具体数据如下表表6所示。
表6 对比例3性能测试
从上述性能测试结果可以看出，没有活化剂的参与所培养出的细胞数量明显下降，而且通过对实验小白鼠25天的观察以及解剖发现，肿瘤和结块体积没有明显缩小，甚至有恶化趋势，本发明的活化剂可激活CAR-T细胞的IL-15信号通路，IL-15是T细胞的生长因子，可以促进抗原刺激的T细胞增殖，同时还能在一定条件下，非特异性地诱导记忆性T细胞的增殖，诱导这些细胞分泌IFN-γ、TNF-α等多种活性物质，进而抑制肿瘤细胞的生长，增强抗肿瘤能力及其免疫疗法的疗效。
对比例4：一种CAR-T细胞的培养方法，
基于实施例2，对比例4仅对本发明中特有的氨基酸培养基组分比例进行调整。
由浓度为2 g/L的L-半胱氨酸、浓度为2 g/L的L-组氨酸、浓度为4 g/L的L-异亮氨酸、浓度为2 g/L的L-丙氨酸、浓度为4 g/L的L-丝氨酸、浓度为4 g/L的L-精氨酸组成的培养基对CAR-T细胞进行培养，记作对比例4-1。
由浓度为2 g/L的L-半胱氨酸、浓度为2 g/L的L-组氨酸、浓度为4 g/L的L-异亮氨酸、浓度为2 g/L的L-丙氨酸、浓度为4 g/L的L-丝氨酸、浓度为4 g/L的L-精氨酸组成的培养基对CAR-T细胞进行培养，记作对比例4-2。
对所培养的CAR-T细胞在于实施例2在相同的条件进行相同的检测并与实施例2做对比，具体数据如下表表7所示。
表7 对比例4性能测试
从上述性能测试结果可以看出，改变培养基中L-组氨酸或L-丝氨酸用量，最终会使CAR-T细胞在肿瘤微环境中存活率降低，可以推断出CAR-T细胞未形成本发明预期的蛋白质结构，通过解剖两只小白鼠还可以观察到肿瘤和结块依旧存在，另外由于没有蛋白结构细胞在肿瘤微环境中的增殖高峰延后出现，培养基中的细胞数量也有小幅度下降。
Claims (8)
1.一种CAR-T细胞培育方法，其特征在于，
所述方法包括：
1）从血样中通过离心收集T细胞；
2）通过T细胞培养基培养活性T细胞并扩增；
3）将癌细胞株在培养基中培养，使其成为CAR-T细胞的杀伤靶细胞，利用基因工程为CAR-T细胞株外接一种传递蛋白，并通过自增殖技术扩增得到CAR-T细胞株；
4）培养基中的细胞密度适宜时，向其中加入活化剂，对细胞刺激一段时间；
5）将细胞进行取代培养，维持培养基的pH值和温度，并控制培养基中的细胞密度，获得CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培育方法，其特征在于，
步骤1）所述离心前向血液样品中添加抗凝剂。
3.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养方法，其特征在于，
步骤2）所述培养基包括L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸。
4.根据权利要求3所述的一种CAR-T细胞培养方法，其特征在于，
所述L-半胱氨酸浓度为1.6～2.4 g/L、L-组氨酸浓度为1.5～2.2 g/L、L-异亮氨酸浓度为3.8～4.2 g/L、L-丙氨酸浓度为1.8～2.3 g/L、L-丝氨酸浓度为3.6～4.4 g/L、L-精氨酸浓度为3.5～4.5 g/L。
5.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培育方法，其特征在于，
步骤3）所述CAR-T细胞株的外接传递蛋白为切除TGF-β受体胞内信号刺激域并且其胞内部分与细胞因子受体胞内刺激域进行融合的结构蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培育方法，其特征在于，
步骤4）所述活化剂包括IL-12R、IL-15R、IL-18R的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培育方法，其特征在于，
步骤4）所述细胞密度为1×107个细胞/mL。
8.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞培育方法，其特征在于，
步骤5）所述细胞密度为8×106个细胞/mL。
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