JPS5813396A - インタ−ロイキン１存在下にインタ−ロイキン２非産生悪性化細胞株よりネズミインタ−ロイキン２を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は従来文献上“ＴＸ！胞成長因子パ又はＴＣＧ
Ｆ”として知られてい、るネズミインターロ１占。

イキン２（以下Ｉ　Ｉ、−２と略す。）を製造する方法
；より詳細には、従来“リンパ球活性化因子″′又は”
　ＬＡＦ”として知られているインターロイ（３） キン１（以下Ｉ　Ｌ−１と略す）の存在下にマイトジェ
ン（有糸分裂誘発剤）刺激だけではＩＬ−２を生成でき
ないネズミ悪性化細胞からＩＬ−２を製造する方法に関
する。

１９７７球が、例えば抗原、リンパ球の表層成分に対す
る抗体、捷たｄある種の植物マイトジェンによって刺激
を受け、幼若化する時、様々な種類のたんばく性伝達物
質（リンホカイン）が産生される。２種類のこのような
リンホカイン、ＩＬ−１とＩＬ−２は哺乳動物のＴ及び
Ｂ細胞の免疫応答を調節しそｉｌ、ＶＣは次の様なもの
が含捷れる：（１）胸腺細胞の有糸分裂の促進；（２）
アロ抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞反応の誘導；及び（３
）異種赤面球による刺激に引き続いて起きろ抗体応答に
おけろヘル、＋　　Ｔ細胞産生の補助。更に、ＩＬ−２
はエフェクターＴ細胞株の試験管内での対数的増殖を１
： 維持すると共に、ｌ、ｌ’、　ヌードマウスの貯臓細胞
から試１．：白、。

験管内（ｉｎ　ｖ　ｌ　１ｒｏ）及びインビボ（ｉｎ　
ｖｉＶｏ）　において細胞障害性Ｔ細胞を誘導する。

従来、ネズミのＩＬ−２は正常ラットおよびマ（４） ウスの胸腺細胞を組織培養培地中で培養し、フィトヘマ
グルチニン（以下ＰＨＡと略す。）又はコンカナバリン
Ａ（以下Ｃｏｎ　Ａと略す。）のようなマイトジェンで
細胞を刺激することによって生成されていた。しかしな
がら、正常な胸腺細胞をマイトジェンで刺激してネズミ
のＩＬ−２をｌｕ生させる方法では少量の濃度の工り、
２しか産生されなかった。従って、ＩＬ−２を含む制限
培地（ｃｏｎｄｉ　ｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉａｍ）を非
常に木葉Ｑ−吻しても少量の純化されたネズミＩＬ−２
Ｌか製造できなかった。その結果、この免疫調節分子の
インビボ実験或いは分子的特性の研究に必要な十分量の
濃縮されたネズミのＩＬ−２は入手できなかった。

ギリス（Ｃｉｌｌｉｓ）等は、最近Ｔ細胞マイトジェン
を用いて細胞を刺激することにより悪性腫瘍細胞からネ
ズミＩＬ−２を生成する方法を報告した。

「リンパ球調節分子の生化学的、生物学的特性」、イン
ターロイキン２生産Ｔ細胞リンパ腫の単離及び表現型特
性Ｊ　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ、Ｉｒｎｎｕｎｏ
ｌｏｇｙ１２５．２５７０（１９８０）、Ｂ１０’、Ｂ
Ｒマウス由（５） 来の特定の牌臓リンパ腫細胞株でＬＢＲＭ−６６と命名
されたものは正常のラット又はマウスの同数胸腺細胞を
マイトジェン刺激して従来生成された場合よりｍｅ当た
り数百倍のＩＬ−２を産生ずることが判明した。ギリス
（Ｇｉｌｌｉｓ）等は上記報告の中でクローン化（分枝
化）されたＬＢＲＭ−ろろ細胞を組織培養培地中で培養
した細胞を植物マイトジェンで刺激することによってク
ローン化ＬＢＲＭ−６３細胞からＩＬ−２を生成するこ
とを報告している。クローン化細胞株のいくつかはマイ
トジェン刺激で高濃度のＩＬ−２を生成することが判明
したが、一方、他のクローン化細胞株は、マイトジェン
刺激によってもＩＬ−２を生成できないことが判明した
。よって本発明の主たる目的はマイトジェン刺命だけで
はＩＬ−２を生成できない悪性化細胞株からネズミＩＬ
−２を生成することにある。

この発明はクローン化されたネズミ悪性化細胞から工Ｌ
−２を製造する方法に関する。この方法は種々の添加物
を含有するたんば〈含イｊ培地中で（６） ネズミ白血病およびリンパ腫細胞のような悪性化腫瘍細
胞を試験管（ｉｎ　ｙｉｔｒｏ　）で培養することを含
む。培地［ＩＬ−１とＴ細胞マイトジェンを添加するこ
とにより培養物を刺激することにより、ＩＬ−２を含有
する上清を生成する。一定時間抜上清を集めＩＬ−２の
含有量を測定する。

上記方法は、Ｂ１０・ＢＲマウス由来のマウス゛　の放
射線ｔＺＶ誘発牌臓リンすく腫細胞法ＬＢＲＭ−６ろを
、ザブクローン化することにより生成されたＬＢＲＭ−
ろろ−ＩＡ５なる特定のクローン化細胞と組合せて実施
された。ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５細胞は、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに受は入れ番号ＡＴ
ＣＣ−ＣＲＬ−８０７９として寄託されている。ＬＢＲ
Ｍ−６３−ＩＡ５細胞はマイトジェン単独刺激ではＩＬ
−２を生成しない。

しかしながら発明者は、この１．Ｌ−２非生成年離クロ
ーンヲ＋−ｔｉ物マイトジェン件（（モノ力インである
ＩＬ−’ｌの共存下におくことにより従来同一濃度で培
養したレクチン刺敵ラット又はマウス牌臓細胞で得られ
るものより数百倍多くＩＬ−２が生（７） 成されることを見出した。発明者は捷だ使用するＩＬ−
ｊの濃度がＩＬ−２の生成＃に影響することも確認した
。

発明者は更にマイトジェン単独の刺激で高活性のＩＬ−
２を生成することができる種々のネズミ悪性化細胞から
生成されろＩＬ−２のレベルにＩＬ−１が影響を与え得
ることを確認した。例えば、ＬＢＲＭ−３３親細胞から
クローン化されたＬＢＲＭ−３３−５Ａ４リンパ腫細胞
（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−８０８０）を至適濃度の１０分の
１の適当なマイトジェンの添加のもとに培養ｔ７、更に
ＩＬ−ｊを加えると、最適濃度のマイトジェンが単独で
使用パ　　・ された場合と同じ生成計１でＩＬ−２生成ＩＮ？増強さ
れることが判明した。

親株であろＬＢＲＭ−３ろ細胞株は、スローアンパ　　
９ ケツテｌング癌セ、ンター、ニューヨーク市ヨーク・、
′。

アベニュ、　１２７５１．１ｉ７４びローズウェル・パ
ーク・メモリアル研究所・ニューヨーク州ノ・ソファロ
ー。

より容易に得られる。

沁 本発明に明達している、ＬＢＲＭ−３３−４Ａ２は、（
８） ソーク研究所、カリフォルニア州うヨラより容易倚 にｌられる。

本発明に従いクローン化した白血病及びリンパ腫である
ネズミ悪性化腫瘍細胞を種々の添加物を加えたタンパク
質含有培地中、試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で培養す
る。Ｔ細胞マイトジェンを、大食細胞の生成物であるＩ
Ｌ−１と共に培養液中に加えてクローン化した悪性化細
胞が工Ｌ−２を含む上清を生成すべく刺激する。一定時
間後、上清を集め、工Ｌ−２の存在量を分析する。

本発明のもう１つの態様として、Ｔ細胞マイトジェン単
独の刺激でＩＬ−２を生成できるネズミ悪性化細胞から
ＩＬ−２を生成するために必要なマイトジェンの量を減
じるために、準最適な濃度のＴ細胞マイトジェンと共に
ＩＬ−ｉが共同刺激原（Ｇｏ　−ｓｔ　１ｍｎ１ａｎｔ
　）として用いられる。

この発明の方法はギリス等によりＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　
ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１９８１）における［イン
ターロイキン１を介したＴ細胞活性化の解析のためのＴ
細１１ａ　ＩＪンノ々腫モデル］にお（９） いて記述されている。

との方法がＢｌＱ、ＢＴ（マウス由来の放射線誘発牌臓
リンパ腫ＬＢＲＭ−３６の種々のクローンに適用された
。マイトジェン刺激単独ではＩＬ−２を生成できない４
１つの特定のクローン化細胞ＬＢＨ＆−３３−ＩＡ５で
はこの方法を適用することにより従来同一濃度で培養し
たマイトジェン刺激ラット又はマウス牌臓細胞で得られ
ろものより数百倍の濃度のＩＬ−２を生成することがで
きろことが判明した。

発明者は、すで［４？定のガン細胞株のＩＬ−２生成に
用いた初期濃度が、親細胞株かそのクローンであるかに
かかわらず初期細胞数あたりの生産されろＩＬ−２の量
に影響を及ぼすことを確認している。発明者はＬＢＲＭ
−３３細胞或いはそのクローンの場合、そのネズミ細胞
の初期濃度は１ｍｌ当り約６×１０　細胞数から１ｍｅ
当り３Ｘ１０６細胞数までの間にあることが好捷しく、
１ｍｂ当りｌＸ１０６細胞数が理想的な濃度であること
を発見した。

（１０） ネズミガン細胞株、特ＫＬＢＲＭ−３３１Ｊンパ腫細胞
及びその副分枝（サブクローン）は、以前にＴ細胞を増
殖する事がわかっている細胞培養培地中で増殖させる事
が出来る。これらの培地は、ロスウェル、パーク、メモ
リアル、インステイテユート（以下「ＲＰＭＩＪと略す
）培地、クリック（Ｃ１ｉｃｋ’ｓ）培地、ダルベツコ
−モディファイド・イーグル培地（以下１”ＤＭＥＭＪ
と略す）を包含する。これらの培地は種々の添加物を個
々に、あるいは併用して加える事が出来る。これは例え
ば５６Ｃで３０分間加熱して不活化した胎児牛血清（以
下［Ｆ　ＣＳｊと略す）を包含する。加えるＦｅ２の量
は全培養液量の２〜１０パーセントである。他の添加物
としては１ｒｎｌあたり約２０〜２５０単位の濃度のペ
ニシリン（約５０単位が良好）、１ｍ７！あたり約２０
〜２５０μｍのストレプトマイシン（約５０μｍが理、
肋、：的）である。これ生 らの抗性物質は、培養の外からの好ましくない細菌汚染
の可能性を最小限に押えるために用いられる。さらに他
の添加物として（ｉ）　１　ｍｌあたり約１００〜１０
００μｍの新鮮なＬ−グルタミン（理想的濃度け３０　
ｏμｙ　）　；（ｆ！１１０〜６０ｍＭ）Ｎ−２ヒドロ
キシ−ピペラジン−ｘｒｌ、−２−エクンスルホン酸（
以下ＨＥＰＥＳと略す）緩衝液（約２５　ｍＭが良好）
；（１１１）１×１０−５〜５Ｘ１０−５Ｍの２メルカ
プトエタノール、（約２．５Ｘ１０”’Ｍが理想的）；
　５〜２５１ＴＩ　Ｍ　Ｎａ　ＨＣＯ−、（約１６＋Ｔ
ＩＭが理想的）を培地中に用いる事が出来る。

本発明のＩＬ−２生産法において数種の異った有糸分裂
誘発刺激剤を用いる事が出来る。これらけＣｏｎＡ、　
Ｐ　ＨＡ、ポークライードマイトジェン（以下［ＰＫＭ
Ｊという）の如き植物糖タンパク質を包含する。マイト
ジェン刺激単独でＩＬ−２を生成し得る悪性化マウス細
胞株及びその副分枝に関して、発明者は、培養に加えろ
わ、たマイトジェンの特定の濃度が生成されるＩＬ−２
の濃度に□−ｆお。おｉｌｌ・、え。

′１ を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて培養した場合、も
し刺激源として、容積比で０．１％のＰＨＡが用′いら
れたならば、ｍｇあたり約６５，０単位（ｕｎｉｔ）の
濃度のＩＬ−２が生成される。もしＰＨＡの濃度を容績
比約１卜１で増加させた場合ｒｎｌｔｙ＞たり約５６５
単位という最大量のＩＬ−２が生成される。

表ｉ　：　ＬＢＦｔＭ−３３−５Ａ４及びＩＡ５細胞に
よるＩＬ−２産生に及ぼすＩＬ−１及びＴ細胞マイトジ
ェン濃度の影響 ＊ 培　養　　　　　　　ＵＡｎｌＣ２４時間培養上清中の
ＩＬ−２量）５Ａ４　＋１％ＰＨＡ　　　　　　　　　
　　　　５６５．０５Ａ４＋０．１％ＰＨＡ　　　　　
　　　　　　　　　３５．０５Ａ４　＋　ＩＬ−１”　
　　　　　　　　　　　　　　　０．０５Ａ４　＋ＩＬ
−１＋ｔｏ％ＰＦ（Ａ　　　　　　　６０４．０５Ａ４
　＋　ＩＬ−１＋　０．１チＰＨＡ　　　　　　　５２
５・０１Ａ５＋１％ＰＨＡ　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｏ，０１Ａ５＋０．１チＰ日Ａ　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｏ，０１Ａ５　＋　ＩＬ−１０，０ １Ａ５　＋　ＩＬ−１＋１％ＰＨＡ　　　　　　４７６
、ＯＩ　Ａ５　＋　ＩＬ−１＋　０．１％ＰＨＡ　　　
　　　　５１３，０中ｌ　Ｑ　Ｕ／ｍＡ。

（１３） 発明者は更にクローン化細胞がマイトジェン刺激単独に
よってもＩＬ−２を生成し得るクローン化細胞の場合で
もＩＬ−１がクローン化悪性化細胞からのＩＬ−２生成
に影響することを見出した。

特にＩＬ−１は準至適濃度のマイトジェン刺激が用いら
れた場合、ＩＬ−２生成を最高水準まで、回復させろ能
力があることが見出された。例えば表１に見られるよう
に、ＬＢＲＭ−３３親細胞からクローン化されたＬＢＲ
Ｍ−３３−５Ａ４細胞を容積比１チのＰＨＡで刺激した
場合のＩＬ−２生成にはＩＬ−１（１０単位／　ｍｅ　
）の添加は有意の効果を示さなかった。しかしながら、
容積比０．１％のＰ）ＩＡで刺激したＬＢＲＭ−３３−
５Ａ４細胞に同量のＩＬ−１を加えた場合には、ＩＬ−
２生成量を低水準（６５単位／　ｍｌ、　）から至適量
のマイトジェン（容積比１％ＰＨＡ）が用いられた場合
の水準（５２５単位／ｍＯにまで増強した。同様の結果
はやはりｒ、ＢＲＭ−３３親細胞のサブクローンである
ＬＢＲＭ−３３−４Ａ２のような、マイトジェン刺激単
独でＩＬ−２を生成する他の細胞株を用いた場（１４） 合にも得られた。

更に重要な事には、発明者は、どの様な濃度のマイトジ
ェンに対してもＩＬ−２を生成しないクローン化悪性化
ネズミ細胞株に対して、ＩＬ−１とマイトジェンの共同
刺激によりこの様な細胞がらＩＬ−２を生成させること
のできることを見出した。実際、ＩＬ−１が共同刺激源
として用いられた場合には、通常非応答性の悪性化Ｔ細
胞が適当な植物マイトジェンで刺激された時でも最高濃
度のＩＬ−２が産生されろ。例えば表１に示されるよう
にＬＢＲＭ−ろろ−ＩＡ５クローン化細胞が２％ＦＯ８
を含ｔｒＲＰＭ１−１６４Ｏｆ培養された場合、容積比
１チ又け０．１％（それぞれ至適、準至適濃度）の濃度
のＰＨＡを用いても、約２４時間後に回収された培養上
清中にはＩＬ−２の生成は検知されない。ＩＬ−１（１
０単位／’ｍ！、）を同様の１４ＰＦ（Ａで刺激した培
養液中に加えた場合１ｃは１１１１１ ｍｌ、あたり４７６単位のＩＬ−２が生成された。

Ｐｉ（Ａ濃度が１０分の１減少して容積比０．１％とな
ってももし刺激培養液中に１ｏ単位／　ｍｅのＩＬ−１
が含まれていれば最適水準のＩＬ−２（約５１３単位／
ｒｎｅ）がなお生成される。

発明者は更に、この発明の工程で用いられるＩＬ−１の
濃度がクローン化悪性化ネズミ細胞株からのＩＬ−２生
成の水準に影響することを確認したがしかしその影響は
ネズミ胸腺細胞の増殖を惹起するに必要な水準よりもか
なり低い水準まで１Ｌ−１の濃度を下げないと発現しな
い。第１図に図示されるように、ＩＬ−１が、胸腺細胞
の増殖を発現させる能力はＩＬ−１ｐ度がｔｎ、ｌあた
り約２５単位以下に減少するまで減弱し始めない。そし
て５０チの減少はＩ　Ｌ−１の濃度がｔｎｌあたり約８
単位で生じる。しかしながら、この特定の濃度のＩ　Ｌ
−１をＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５細１１包（ＩＸＩＯ６細
胞数を体積比１チのＰ）ＩＡで例敷）加えた場合、なお
最高水準のＩＬ−２生成がみられる。

実際ＩＬ−２生、碑、、はＩＬ−１９度がｍｅあたり０
．５単位以下に下が“る捷で低下しない。ｍｌあたり（
１，２単位のＩＬ−１濃度でもｍｔ当り約１６５単位ｂ
ゝ のＩＬ−２が生成され、そ′ｆ１．はな夛、同様のマイ
トジェンで刺激された正常マウス胸腺細胞から生成され
るＩＬ−２の水準の少なくとも１００倍である。

更に発明者はクローン化悪性化ネズミ細胞株からのＩＬ
−２の生成を刺激するためのＩＬ−１の能力は培養培地
中にＩＬ−ｉが継続的に存在する必要のないことを確認
した。下の表２に示したように１０単位／　ａ７！（Ｄ
濃度のＩＬ−ＩＫＬＢＲＭ−３３−１Ａ５細胞を４時間
共存させ、更に引き続いて細胞を容積比１％のＰＨＡと
１０単位／ｍ７！のＩＬ−’ｌの存在下容積比１０％の
Ｆｅ２を含むＲＰＭ１＝１６４０で培養すると、２４時
間後に、４２６単位／　ｒｎｌのＩＬ−２が生成する。

しかしながら、たとえ引き続いて行なう培養に、ＩＬ−
１が加えられなくても、実質的に同水準のＩＬ−２が生
成された。同様に表２に示されたように、特にもし、Ｌ
ＢＲＭ−３３−ＩＡ５クローン細胞が１０単位／　ｍｌ
の濃度のＩＬ−１で４時間前処理され、更に引き続いて
、細胞株が完全に洗浄され、そして次にＰ）ＩＡ　（容
積比１％）のみ、で刺激された場（１７） 合でも４１０単位／　ｍｌｌのＩＬ−２が生成される。

この生成の特性は、ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５株をＩＬ−
２産生状態に転換させるためのＩＬ−１とＬＢＲＭ−３
３−ＩＡ５の相互作用が比較的速やかに行なわれること
を示している。

（１８） クローン化悪性化ネズミ細胞を刺激することによって生
成されるＩＬ−２の量は時間によって変化する。例えば
１０６個のＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５細胞がＦｅ２を含有
するＲＰＭｌ−１６４０培地で培養され、容積比１係の
ＰＨＡとＩＬ−ｉで刺激された場合、ＩＬ−２活性はＰ
ｉ−ＩＡとＩＬ−１の共［晰１激後約５〜７時間後に検
出され始めた。この５〜７時間の間の最初のＩＬ−２活
性は、たとえＦｅ２が培地中に加えられなくても生成し
た。

ＦＣ８使用の有無にかかわらず、ＩＬ−２はＰＨＡの刺
激後約１６〜２４時間後に最高水準に達した。

更に次の２４時間の間に、存在するＩＬ−２の量は僅か
に減少した。このように、ＬＢＲＭ−３６−１Ａ５細胞
を用いてＲＰＭｌ−１６４０培地中で１壇 ％Ｐ）ＩＡとＩＬ−１で納性化することによりＩＬ−２
を産生ずるための至適培養持続時間は約１６〜４８時間
である。ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５リンパ腫細胞のような
ネズミ悪性化細胞株を用いてＩＬ−２を生成する上述の
工程は、種々の環境条件下で行なうことができる。しか
しながら好ましくは（２０） （１ｑ） ＬＢＲＭ−３６−１Ａ５の培養は約３５〜３８Ｃで空石
− 気中５〜１０％の炭酸ガスを含む温度調節下で行うのが
良好である。又、培地のｐ　Ｉ−１はわずかにアルカリ
性東件下で行うのが理想的でふつうｐＨ約１１〜Ｚ４で
ある。

ガン細胞株は平底ミクロプレー１・容器を包含する種々
の容器中、１００／Ｉｔの如き種々の量で、接種する。

フラスコ番号ろ０１ろ寸たは３０２４（Ｆａｌｃｏｎ　
Ｌａｂｗａｒｅ＋　Ｄｉｖ、Ｂｅｃｌｏｎ＋　Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎｔ社製）の如き組織培養フラスコもｍ１ＶＷ
＋る。

ＩＬ−２の微量定量法 ＩＬ−１がＩＬ−２産生に及ぼす影響を調べるために、
種々のクローン化されたネズミ悪性化細胞株の肩先分裂
誘発剤及びＩＬ−１刺激により生成−ｔ−る■Ｌ−２活
性についてギリス等の　ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
１ｍｎｕｎｏｌｏｇｙ　１２０　＋　２０２７　（１９
７８）における［Ｔ細胞増殖因子：生産のパラメーター
及び活性の微量定量法」で記述された方法を用いて検定
する。マウス細胞障害性Ｔ細胞株（以下１−ＣＴＬＬＪ
と略す）の工Ｌ−２依存性細胞増殖を（２１） 調べて検定する。非生産細胞株が、Ｉ　Ｌ−ｊの添加に
よってＩＬ−２を産生するようになり得るというととが
決定したら、ＩＬ−２産生の至適培養東件、たとえば上
述のとと＜　ＬＢＲＭ−３３−１Ａ５の至適初期細胞濃
度、有糸分裂誘発剤濃度、工り一１濃度及び培養時間を
決定するために微量定量法を用いる。

簡単に記述すれば、微量定量法は、２００　／Ｊｔ中Ｉ
Ｌ−２含有試料のｌｏｇ２希釈を行ない約３．０００の
ＣＴＬＬ細胞（ＩＬ−２依存性の正常エフェクターＴ細
胞）を接種することを包含する。

これを空気中５％炭酸ガス含有の湿度調節環境中３７Ｃ
で２４時間培養する。この後培養液に４時間パルスで０
．５マイクロキユーリーのトリチウムラベル化チミジン
（［’Ｈ）Ｔｄｒ；比活性２０ｍＣ１／ｍハ）を加え、
ガラス繊維フイゝルター片上に、例えば自動複数試料採
取器等にキ・、や細胞を採取する。

次に液体シンチレーションカラレターで（３Ｈ）Ｔｄｒ
の取り込みを測定する。この方法によりＩＬ　−２存在
下で培養したＣＴＬＬ細胞のみで、濃度に依存ＬＪＣ（
３Ｈ）　’Ｉ’ｄｒ　（７）取り込みが見られた。ｘｒ
、−２の存在しない培地で培養されたＣＴＬＬ、ｖ＋１
ＩＩＩＩ８は、〔３Ｈ″ＪＴｄｒのシンチラント対照計
のみ則り込み、工Ｌ−２除去後２４時間後においても、
９５％以上がトリパンブルー陽性であった。ＩＬ−２活
性の単位は、（３）］　）　Ｔｄｒの取り込みのプロビ
ット分Ｃｏｎ　Ａ　（５Ｐ’ｉ−／ｌｕｇ　）刺錠した
絹織培養培地中４８時間後に存在するＩＬ−２活１１１
−量として表わす。

１単位／ｍｌＥ基準では、１：２希釈でＣＴＬＬ（）１
）Ｔｄｒをり込みが約１０，０００　ｃｐｍでル）ろ。

ＩＬ−１の調整 上に述べたような方法で使用されろＩＬ−１は、中でも
とくに、ＬＢＲＭ−３３ネズミ悪性化細胞株の親株のク
ローンあ・らＩＬ−２産牛を促すもの（ｄ、たとえば、
Ｐ　３８４−Ｄ　　と呼ばれている／ｌｔｊ←定のマク
１１１ ０フア一ジ悪性化細胞株を、ホルボールミリステートア
セテート（以下１−ＰＭＡＪと略す）で刺激することに
よって調整されろ。（ｉＪＪ用前に、得られた上清を適
宜濃縮し、硫安塩析、ジエチルアミンエチル（以下、「
ＤＥＡＥ」と略す。）セルロースのイオン交換クロマト
グラフィー、その後セファクリルＳ−２００でのゲルろ
過というような様々な操作を糾み合わせて部分的に精製
する。

上清中のＩＬ−’ｌ活性のレベルは、胸腺細胞の有糸分
裂をどれだけ増強するかを調べて決定する。

胸腺細胞の増殖は、ＩＬ−１のｌｏｇ　２希釈列の存在
下で、マイクロプレート培養において、検定する。約１
５×１０　胸腺細胞（４−６週令のＣ３Ｉ−１／ＨｅＪ
またはＣＢＡ／Ｊ　マウスから得る）をそれぞれ含む複
数のサンプルを、１．０μｙ−／ｍｌのＰＨＡまたけ１
容量係のＰＨＡを含み、ＩＬ−１がＩｏｇ２希釈列にな
っている２００μｔの１０容量チのＦｅ２を含むＲＰＭ
Ｉ培養液に接種する。７２時間培養後マイクロプレート
のくぼみに４時間、０．５マイクロキユーリーの（Ｈ）
Ｔｄｒを添加し、その後培養物を、上述の、ＩＬ−２の
微量定量法を実施するためのＧ　ｉｉ　ｌ　ｉｓ　らの
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｐ−ｎｕ　−ｎｏ
ｌｏｇｙ１２０．２０２２（１９７８）と同じ方法でガ
ラ（２４） ス繊維フィルター片の上［採取−Ｊ−ル。Ｃ’Ｈ）　Ｔ
ｄｒの取り込みを液体シンチレーションカウンターによ
って測定する。外からＩＬ−１を添加しないときは、Ｐ
ＨＡによろ胸腺細胞増殖がわずかだけ観察された（５０
０ＣＩ）ｎｌ以下）が、１０単位／蛯のＩＬ−１存在下
では、ＩＬ−１含南培養液中での１０、［１００ｃｐｍ
以上の（’Ｈ］Ｔｔｉｒ　ノ取り込−１ｃ、）：つて例
証されるような著しい胸腺細胞増殖が観察された。この
結果は、Ｍ　ｉ　ｙ、ｃ　ｌ　ｒ−）によって記載され
た結果、［マクロファージ細胞株Ｐ３８８Ｄ１によって
産生されたリンパ球活性化因子（’ＬＡＦ）の特性Ｊ　
　Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｒ　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌＯｇｙ　＋　１２０１１４９２（１９７８）　と一致
する。

実施例　１ 特定のクローン化されたマウス白血病Ｔ細胞。

ＬＢＲＭ−ろ３−１Ａ５の１×１０　細胞／ｍｅの濃度
の細胞株サンプルを２００μｔの平底マイクロプレート
のクホみ（３５９６：マサチューセッツ州ケンブリッジ
のコスタ−社テータパツケイジング（ＣＯｓｔａｒ　Ｉ
ｎｃ、Ｄａｔａ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　））中（７）Ｒ
ＰＭＩ−（２５） １６４０培地中で培養した。この培地には、５容喰チの
加熱失活させた（５６Ｃ・６０分）Ｆｅ２゜５０単位／
　ｔｎｌ、のペニシリン、２．５Ｘ１０　　Ｍの２−メ
ルカプトエタノール、５０μｆｆ／ｍｉ　のスト−レフ ブトマイシン及び３００μｆｌ　／　ｒｎｌの新鮮Ｌ−
グルタミンを添加した。細胞株試料、培地及び添加物を
含むそれぞれの培養液は、合計して約１００μｔとなっ
た。微小なくぼみ中での培養物に２容量チのＰＨＡ（Ｐ
ＨＡ−Ｍ、ニューヨーク州グランドアイランドバイオロ
ジカル社（Ｇｒａｎｄ　ＩｓｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｇｏ、）を１００μを添加することによって、ま
た０、１から１００単位／　ｒｎｌの濃度のＩＬ−１を
添加することによって刺激した。これらの培養物をすべ
て、５％００２を含む湿った空気巾約３７Ｃ［維持した
。

２４時間後、これらの培養物から得られた上清試料をあ
つめ、上述の微量検１定法により工Ｌ−２川Ｖ 活性を検定した。この検定の結果を第１図に示す。

実施例　２ 特定のクローン化されたマウス白面病Ｔ細胞、ＬＢＲＭ
−３３−ＩＡ５及びＬＢＥ（Ｍ−３３−５Ａ４の１Ｑ６
７ｍｌｌの濃度の＃１ｌＪ２１株試料を、２００　ｐｔ
　（Ｄ平底マイクロプレートのくぼみ（３５９６，マサ
チューセッツ州、ケンブリッジのコスタ−社、データバ
ツケイジング（Ｃｏ５ｔａｒ、Ｉｎｃ、　５Ｄａｔａ　
Ｐａｃｋａｇ−ｉｎｇ））中のＲＰＭＩ−１６４０培地
中で培養した。

この培地には、５容量チの加熱失活させた（５６ｒ、３
０分）Ｆｅ２，５［１単位／ｍｅのペニシリン。

２．５Ｘ１０　　Ｍの２−メルカプトエタノール。

５０μＰ／ｌｎＡのストレプトマイシン及び３００μｍ
／ｒｎｌの新鮮Ｌ−グルタミンを添加した。細胞、培地
及び添加物を含むそれぞれの培養液は合計して約１００
μｔとなった。微小なくぼみ中での培養物に２または０
．２容計チのＰＨＡにューヨーク州グランドアイランド
のグランドアイランドバイオロジカル社（Ｇｒａｎｄ　
ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｇｏ、））を１
００７αを添加することまたはＩＬ−１を添加すること
によって刺激した。

共同刺激（Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｌ　ｉｏｎ　）のために
使われたＩＬ−１ｉ、ホールボールエステルで刺ｆｋさ
れたＰ３８８Ｄ、マクロファージ腫瘍細胞株から採取さ
れた上清から調製し、Ｍｉｚｅｌらが記述したようにそ
の後硫酸アンモニウム塩析、ＤＥＡＥセルロースイオン
交換クロマトグラフィー、及びセファクリルＳ−２００
にュージャージー州、ビス力夕ウエイ、ファルマシアフ
ァイン・ケミカル製）Ｋよるゲルろ過によってさらに濃
縮した。

複数の培養液に、ＰＨＡ有糸分裂誘発剤及び上述された
ように処理されたＩＬ−１（１０単位／１ｎｌ）ｉたけ
、非可逆的にＩＬ−１生物学的活性をセファデックスＧ
−２５にュージャージー州、ピスカタウエイ、ファルマ
シア・ファイン中ケミカル製）を充填した１０ｃｒｎの
ゲルラ過カラムにて溶出して、ＩＬ−１から分離除去し
た。下の表３に示されたように、有糸分裂誘発剤で刺激
されたＬＢＲＭ−３３−５Ａ４及びＬＢＲＭ−３３−Ｉ
Ａ５培養液にＩＬ−１を添加すると、ＩＬ−２産生に十
（２８） 分な効果がみられた。至適濃度のＰＨＡで刺激された（
１容量％）ＬＢＦ（Ｍ−３３−５Ａ４培養液への外から
のＩＬ−１添加は、結果として生じた上清のＩＬ−２力
価にほとんど影響を与えながったが、準至適濃度（０，
１容量％）のＰ）ＩＡで刺激されたＬＢＲＭ−３３−５
Ａ４細胞にＩＬ−１を添加すると、ＩＬ−２産生け３９
９単位／αまで増加した。対照実験においてはＩＬ−１
の非存在下で０．１チＰＨＡと２４時間培養したＬＢＲ
Ｍ−３３−５Ａ４細胞は、８５単位／　ｍｌ、だけのＩ
Ｌ−２を含−５Ａ４細胞の肩章のＩＬ−２産生誘導（０
，１％Ｐｔ（Ａ共存下の）を阻害した。

表６に示されたように、クローン化されたＬＢＲＭ−３
３−ＩＡ５細胞の場合には、２４時間ＰＨＡで刺激して
も（１または０．１容量チのいずれでも）、有意のＩＬ
−２産生は全く見られなかった。！シかしながら、Ｐ）
ＩＡで刺激されたＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５細胞培養液に
１０単位／　ｔｕｇ（２９） のＩＬ、−４を添加すると約４００単位／　ｒｕｂ　ノ
Ｉ　Ｌサールで前処理すると、有意のＬＢＲＭ−３３−
ＩＡ５細胞のＩＬ−２産生（ＰＨＡと共同しての）を阻
害した。

１、　Ｌ　−１の変性（胸腺細胞に対するＩＬ−ｉの生
物活性の損失につながる）は、ＬＢＲＭ＝３３−ＩＡ５
／ＬＢＲＭ−３３−５Ａ４細胞のＩＬ−２産生を増強す
るモノカインの作用も捷だ消失させるという点でこれら
の結果は悪性細胞株のＩＬ−２産生に及ぼすＩＬ−ｉの
作用を明確に立証する。

すでに当業者には明らかな如く、本発明になるネズミの
ＩＬ−２産生Ｃ１＼上述以例の親細胞株、そとからクロ
ーン化された細胞株、培地、培地添加物及び上述のもめ
以外の不糸分裂誘発剤を用い、本発明の精神、又は本質
的な特性から離れずに行う事が出来る。それ故に上述の
特定の方法は全て例示であり限定的なものでは−ない。

すなわら本発明の範囲は前述した実施例に限定されるも
のではなく、むしろ特許請求の範囲に示したものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図は胸腺細胞の肩先分裂のＪ・フ発（・−・）及び
ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５細胞よりのＩＬ−２産生（ムー
ム）で検定したＩＬ−１活性の濃度依存性を示す。 特許出願人　　ステイーブンーギリス （外２名） （３２） 毛／Ｚ し 培養ｊ夜中のＩＬ−１（Ｕ廊り １１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）Ｔ細胞有糸分裂誘発剤及びインターロイキン１を
   含有する培地中で、ネズミ悪性化細胞を培養し、該培地
   からネズミインターロイキン２を回収することを特徴と
   するネズミ細胞株からインターロイキン２を製造する方
   法。 （２）ネズミ悪性化細胞がＴ白血病細胞またはＴリンパ
   腫細胞である特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）ネズミ悪性化細胞が、Ｔ白血病細胞またはＴ　Ｉ
   Ｊタンパ細胞のクローンである特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 （４）ＴＩＪンパ腫細胞のクローンが、Ｔ細胞有糸分裂
   刺激だけではインターロイキン２を産生できないＬＢＲ
   Ｍ−３３ネズミリンパ腫Ｔ細胞のクロー（１） ンである特許請求の範囲第６項記載の方法。 ｆ； （５）　　クローン化され夙ＬＢＲＭ−ろろ細胞がＬＢ
   ＲＭ−３３−ＩＡ５細胞である特許請求の範囲第４項記
   載の方法。 （６）Ｔ白血病クローン細胞またはＴリンパ腫クローン
   細胞の初濃度が約６Ｘ１０”から３　Ｘ　１０６細胞／
   　ｍｌの範囲内である特許請求の範囲第１．２゜３．４
   または５項記載の方法。 （７）Ｔリンパ腫細胞のクローンがＬＢＲＭ−３３ネズ
   ミリンパ腫Ｔ細胞のクローンである特許請求の範囲第６
   項記載の方法。 （３）　　ＬＢＲＭ−３３細胞のクローンがＬＢＲＭ−
   ３３−５Ａ４またはＬＢＲＭ−ろろ−４Ａ２細胞のいず
   れかである特許請求の範囲第７項記載の方法。 （９）Ｔ白血病クローン細胞またはＴリンパ腫クローン
   細胞の初濃度が約６×１０　から３　Ｘ　１０６細胞／
   　ｒｎｌの範囲である特許請求の範囲第７または８項記
   載の方法。 （１１Ｔ細胞肩先分裂誘発剤およびインターロイキン１
   を含む培地中で、ネズミ悪性化細胞を培養（２） する工程により製せられるインターロイキン２を含む培
   養上清。 ｆｉｌｌ　　ネズミ悪性化細胞がＴ白血病細胞またはＴ
   リンパ腫細胞である特許請求の範囲第１０項の培養上清
   。 （１２）　　Ｔリンパ腫細胞がＬＢＲＭ−３３ネズミリ
   ンパ腫Ｔ細胞である特許請求の範囲第１１項の培養上清
   。 ０タ　ネズミ悪性化細胞が、ＬＢＲＭ−３３細胞のクロ
   ーンである特許請求の範囲第１２項の培養上清。 （１４）クローン化されたＬＢＲＭ−３３細胞がＬＢＲ
   Ｍ−３３−ＩＡ５細胞である特許請求の範囲第１６項の
   培養上清。