JPS60155127A - 生物学的活性物質の製法 - Google Patents
生物学的活性物質の製法Info
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- JPS60155127A JPS60155127A JP59259103A JP25910384A JPS60155127A JP S60155127 A JPS60155127 A JP S60155127A JP 59259103 A JP59259103 A JP 59259103A JP 25910384 A JP25910384 A JP 25910384A JP S60155127 A JPS60155127 A JP S60155127A
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、病Ｎ蝉−として知られているボルデテラ（Ｂ
ｏｒｄ＠ｔｅｌ１ｍ ） １７４ Ｋ属する微生物を特
定の培地を用いて培養し、培養物から生−学的活ａ、
！質を製造する方法に関する。
ｏｒｄ＠ｔｅｌ１ｍ ） １７４ Ｋ属する微生物を特
定の培地を用いて培養し、培養物から生−学的活ａ、
！質を製造する方法に関する。
：ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳菌、パ
ラ百日咳菌、気管支敗血症菌等カーあり、特に百日咳菌
は、１００日、つづくとソわれる特有の咳を伴う、気管
、気管支、および小気管、支がおかされる急性の感染症
である。６８咳の王たる、病、Ｉ！、、ｆ／Ｍとして知
られている。従って、臨、床上−１かかる百−咳薗等の
迅速・確実な一出が値ま、れ、ており、そのためには臨
床分離薗の生育を促進するような培養方法あるいは培地
が必要である。、また、竺−咳の予防、のりめには百日
咳ワクチン（死−〇全画体ワクチン又はコンポーネント
ワクチン）、が用いられるが、ワクチ、ンを効率曳＜；
竺する。ためにも・百日咳１）生育を、促進する本うな
培養方法するいは培地が望ましく、・。
ラ百日咳菌、気管支敗血症菌等カーあり、特に百日咳菌
は、１００日、つづくとソわれる特有の咳を伴う、気管
、気管支、および小気管、支がおかされる急性の感染症
である。６８咳の王たる、病、Ｉ！、、ｆ／Ｍとして知
られている。従って、臨、床上−１かかる百−咳薗等の
迅速・確実な一出が値ま、れ、ており、そのためには臨
床分離薗の生育を促進するような培養方法あるいは培地
が必要である。、また、竺−咳の予防、のりめには百日
咳ワクチン（死−〇全画体ワクチン又はコンポーネント
ワクチン）、が用いられるが、ワクチ、ンを効率曳＜；
竺する。ためにも・百日咳１）生育を、促進する本うな
培養方法するいは培地が望ましく、・。
また、竺えば、百日−■叩菌の培養物（培養ｉ地と一体
）ｔパらシ棚尿病治療乃−予防薬へ１ての展−カリ１．
待１５るところの、インシュリで分ｔＩＩＰ声強活性物
質（ｌａｌ＊ｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ。
）ｔパらシ棚尿病治療乃−予防薬へ１ての展−カリ１．
待１５るところの、インシュリで分ｔＩＩＰ声強活性物
質（ｌａｌ＊ｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ。
以下ＩＡＰと略記する）や、Ｃ日＠−のワクチンコンポ
ーネントとして注目されている１ｅｕｋｏｃｙｔｏｓｉ
ｓ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−ｈｓｍａｇｇ
ｌｕｔｉｎｉｎ（以下ＬＰＦ−ＨＡと略記する）やｆｉ
ｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ （
以下Ｆ−）ＩＡと略記する）等、医療上有効な生物学的
活性物質が得られるが、かかる生物学的活性物質を効率
良く製造するためにも、百日咳菌の効率的培養方法が必
要である。
ーネントとして注目されている１ｅｕｋｏｃｙｔｏｓｉ
ｓ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−ｈｓｍａｇｇ
ｌｕｔｉｎｉｎ（以下ＬＰＦ−ＨＡと略記する）やｆｉ
ｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ （
以下Ｆ−）ＩＡと略記する）等、医療上有効な生物学的
活性物質が得られるが、かかる生物学的活性物質を効率
良く製造するためにも、百日咳菌の効率的培養方法が必
要である。
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ 属に属する脳、とりわけ百日咳
Ｉ相開の生育用の培地としては、コーエンら（７メリカ
ン・ジャーナル・オプ・パブリック・ヘルス； Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ ）
ｌｅａｌｔｈ３６ ３７１〜３７６（１９４６）ンやサ
ザーランドら（ジャーナル・オプ・パンａジー・アンド
・バクテリオロジー； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔ
ｈｏｌｏｇｙａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８２
４３１〜４３ Ｂ（１９６１））の考案した、活性炭
やスターチ或いはイオン交換樹脂を含む培地が知られて
いる。しかし、活性炭やイオン交換樹脂は不均一系を形
成し、菌増殖の経時変化を追跡するのに適さないし、又
、非特異的吸着性の為、脂肪酸等の菌の生育に抑制を及
ぼす因子の除去効果は必ずしも選択的とは云えない。菌
の生育に及ぼすスターチの効果も充分とは云えず、上記
の欠陥を補う新しい培地の開発が望まれていた。又、臨
床的に百日咳菌す単一コミニーとして分離するに際して
は、百日咳患者の日収噴霧液を直接ポルデー・ヂャング
培地（以下ＳＳ培地と略す）の如き血液を含む置屋寒天
培地に接触させることが必要とされるが、これらの培地
は、新鮮血液を必須成分とするため保存性に乏しく、ひ
つきようコロニー形成能の再現性が悪いという欠点を有
していた。従ってかかる点からも一定の化学組成を有し
、且つ、保存性に富む臨床用分離培地の開発が望まれて
いた。
Ｉ相開の生育用の培地としては、コーエンら（７メリカ
ン・ジャーナル・オプ・パブリック・ヘルス； Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ ）
ｌｅａｌｔｈ３６ ３７１〜３７６（１９４６）ンやサ
ザーランドら（ジャーナル・オプ・パンａジー・アンド
・バクテリオロジー； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔ
ｈｏｌｏｇｙａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８２
４３１〜４３ Ｂ（１９６１））の考案した、活性炭
やスターチ或いはイオン交換樹脂を含む培地が知られて
いる。しかし、活性炭やイオン交換樹脂は不均一系を形
成し、菌増殖の経時変化を追跡するのに適さないし、又
、非特異的吸着性の為、脂肪酸等の菌の生育に抑制を及
ぼす因子の除去効果は必ずしも選択的とは云えない。菌
の生育に及ぼすスターチの効果も充分とは云えず、上記
の欠陥を補う新しい培地の開発が望まれていた。又、臨
床的に百日咳菌す単一コミニーとして分離するに際して
は、百日咳患者の日収噴霧液を直接ポルデー・ヂャング
培地（以下ＳＳ培地と略す）の如き血液を含む置屋寒天
培地に接触させることが必要とされるが、これらの培地
は、新鮮血液を必須成分とするため保存性に乏しく、ひ
つきようコロニー形成能の再現性が悪いという欠点を有
していた。従ってかかる点からも一定の化学組成を有し
、且つ、保存性に富む臨床用分離培地の開発が望まれて
いた。
近年、ステデー（５ｔａｉｎｅｒ ）及びシＥｌ ７Ｌ
、チー（５ｃｈｏｌｔｅ ） Ｋよってこの百日咳−の
大量培養のだめの合成培地が開発された（ジャーナルオ
グ ジェネラル マイク−バイオロジー（Ｊ、ｇｅｎ、
Ｍｉａｒｏｂｌｏｌ ） ６３巻、２１１−２２０頁。
、チー（５ｃｈｏｌｔｅ ） Ｋよってこの百日咳−の
大量培養のだめの合成培地が開発された（ジャーナルオ
グ ジェネラル マイク−バイオロジー（Ｊ、ｇｅｎ、
Ｍｉａｒｏｂｌｏｌ ） ６３巻、２１１−２２０頁。
１９７１年）。このステデー・ショルテー培地（以下Ｓ
Ｓ培地と略記する）は天然物由来の血液及びポリペプト
ン等、ａット差に変動の考えられる添加智を含まないた
め、菌の培地組成を厳密にコントａ−ルし得るので、菌
性状に変化をもたらすことな（、培養を行い得ること、
及びＦｌ１１述したＩＡＰもしくはＬＰＦ−ＨＡの如き
生物学的活性物質の分離・精製に際し、不要な他種蛋白
質の爽雑な防ぎ得る等の特徴を有すので近年百日咳ワク
チン及び百日咳菌よりの生物学的活性物質を工業的規模
で製造するのに広く用いられているが、攪拌下もしくは
静置下の液体培養条件でＬＰＦ−）ＬＡの産生等が十分
でな（、また接種サイズが１０’ ｃｅｌｌｇ ／１以
下の場合、安定な生育特性が得られないという欠点を有
する。またＳＳ培地に寒天を１〜２％となるように加え
て固化して得た寒天培地（以下ＳＳＡ培地と略記するン
では、１０’ ｃａｌｌｓ以下の播種（ジートンでのコ
ミニー形成は認められないと〜１う大きな欠陥を有する
。
Ｓ培地と略記する）は天然物由来の血液及びポリペプト
ン等、ａット差に変動の考えられる添加智を含まないた
め、菌の培地組成を厳密にコントａ−ルし得るので、菌
性状に変化をもたらすことな（、培養を行い得ること、
及びＦｌ１１述したＩＡＰもしくはＬＰＦ−ＨＡの如き
生物学的活性物質の分離・精製に際し、不要な他種蛋白
質の爽雑な防ぎ得る等の特徴を有すので近年百日咳ワク
チン及び百日咳菌よりの生物学的活性物質を工業的規模
で製造するのに広く用いられているが、攪拌下もしくは
静置下の液体培養条件でＬＰＦ−）ＬＡの産生等が十分
でな（、また接種サイズが１０’ ｃｅｌｌｇ ／１以
下の場合、安定な生育特性が得られないという欠点を有
する。またＳＳ培地に寒天を１〜２％となるように加え
て固化して得た寒天培地（以下ＳＳＡ培地と略記するン
では、１０’ ｃａｌｌｓ以下の播種（ジートンでのコ
ミニー形成は認められないと〜１う大きな欠陥を有する
。
本発明の目的は、ボルデテラ属に属する微生物を安定で
かつ効率的に培養することのできる培地を用いて、ボル
デテラ属に栖する微生物を培養することによって、生物
学的活性＠買を製造する方法を提供することにある。
かつ効率的に培養することのできる培地を用いて、ボル
デテラ属に栖する微生物を培養することによって、生物
学的活性＠買を製造する方法を提供することにある。
そして、かかる本発明の目的は、ボルデテラ属に属する
微生物なカザミノばを０．１〜２０１１／］、７スコル
ビン酸を０．０１〜Ｉ Ｊｌ／７！及びグルタチオンを
０．１〜５ Ｎ／ｌ含有する培地な用いて培養し、培養
物（培養培地と函体）から生物学的活性物質を採取する
ことを特徴とする、生物学的活性物質の製法によって達
成される。
微生物なカザミノばを０．１〜２０１１／］、７スコル
ビン酸を０．０１〜Ｉ Ｊｌ／７！及びグルタチオンを
０．１〜５ Ｎ／ｌ含有する培地な用いて培養し、培養
物（培養培地と函体）から生物学的活性物質を採取する
ことを特徴とする、生物学的活性物質の製法によって達
成される。
本発明におけるボルデテラ属に属する微生物とは、百日
咳菌、バラ百日１×菌、気管支敗皿症菌をいう。本発明
において好ましく用いられるのは百日咳菌であり、なか
でも百日咳Ｉ相醒が好ましい。ボルデテラ属に属する微
生物の歯学的性質及び増養条件等に関しては、Ｂ＠ｒｇ
）”Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔ＠ｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ＋第８版、１９７４年、
Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ ＷｉｌｌｋｉｎｓＣ
ｏ０発行やＪ、Ｅｘｐ Ｍｅｄ、 １２９巻、第５２３
−５５０頁、１９６９年あるいは＃１蹟学実習提要、第
３版、第８０頁以下、昭和４７年、丸善発行等がありす
でに公知である。
咳菌、バラ百日１×菌、気管支敗皿症菌をいう。本発明
において好ましく用いられるのは百日咳菌であり、なか
でも百日咳Ｉ相醒が好ましい。ボルデテラ属に属する微
生物の歯学的性質及び増養条件等に関しては、Ｂ＠ｒｇ
）”Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔ＠ｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ＋第８版、１９７４年、
Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ ＷｉｌｌｋｉｎｓＣ
ｏ０発行やＪ、Ｅｘｐ Ｍｅｄ、 １２９巻、第５２３
−５５０頁、１９６９年あるいは＃１蹟学実習提要、第
３版、第８０頁以下、昭和４７年、丸善発行等がありす
でに公知である。
本発明の培地の成分として用いられるカザミノ酸は、カ
ゼインの酸による加水分解物であり、乾燥した粉末とし
て人手できる。また、アスコルビン酸はビタミンＣとし
て知られており、グルタチオンは、酵母および動物の肝
臓、筋肉などに広く分布しているペプチドの一種である
。
ゼインの酸による加水分解物であり、乾燥した粉末とし
て人手できる。また、アスコルビン酸はビタミンＣとし
て知られており、グルタチオンは、酵母および動物の肝
臓、筋肉などに広く分布しているペプチドの一種である
。
グルタチオンは酸化型のものでも還元屋のものでも、又
それらの混合物であってもよい。本発明の培地には、カ
ザミノ酸が０．１〜２０ ｙ／Ｉｍ好ましくは（）、５
〜１０ Ｊｌ／ｌ 、アスコルビン酸が０．０１〜１
ｊｌ／１１ 、好ましくは０．１〜（）、４１／ＩＩ
、グルタチオンが０．１〜５１１／１１ 、好ましくは
０．１〜１１１／ｌ言まれていることが必要である。上
記範囲外の場合には、本発明の目的が十分には達成され
ない。
それらの混合物であってもよい。本発明の培地には、カ
ザミノ酸が０．１〜２０ ｙ／Ｉｍ好ましくは（）、５
〜１０ Ｊｌ／ｌ 、アスコルビン酸が０．０１〜１
ｊｌ／１１ 、好ましくは０．１〜（）、４１／ＩＩ
、グルタチオンが０．１〜５１１／１１ 、好ましくは
０．１〜１１１／ｌ言まれていることが必要である。上
記範囲外の場合には、本発明の目的が十分には達成され
ない。
本発明の培地に、前記成分に加えて、シクロテキストリ
ンスはその誘導体を０．００１〜５＆／ＩＩ 、好まし
くは０．０５〜５＆／ノ含有せしめると、本発明の目的
はより有利に達成される。
ンスはその誘導体を０．００１〜５＆／ＩＩ 、好まし
くは０．０５〜５＆／ノ含有せしめると、本発明の目的
はより有利に達成される。
シクロデキストリン又はその誘導体は、そのまま、前記
成分を含有する培地に添加混合しても良いが、あらかじ
めグルタチオンと包接化合物をつくらせこの包接化合物
を培地に添加してもよい。本発明におけるシクロテキス
トリンとはα、β、ｒシクａデキストリンな意味し、シ
クロデキストリン誘導体とは、クリえば、７ミノシクａ
デキストリンや７ミノデオキシシクロテキストリンの如
きアミノ化誘導体、７セチルシクａデキストリンや二ｌ
−ｏンクロデキスＩ・リンの如キエステル化−４体、メ
チルシクロテキストリン、エチルシクｏｆヤストリン、
プロピルシクｑデキストリン、カルボキシメチルシクａ
デキストリンの如きエーテル化肪導−（エーテル化シク
ロテキストリンンをいう。本発明において好ましいのは
エーテル化シクａデキストリンであり、中でも、ヘキサ
キス（２，６−ｏ−ジメチル）α−シクａテキストリン
（Ｍｅｄ−ＣＤ）やヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル
）β−シクロデキストリン（Ｍｅβ−ＣＤ）等の、メチ
ノげキストリンが特に好ましい。
成分を含有する培地に添加混合しても良いが、あらかじ
めグルタチオンと包接化合物をつくらせこの包接化合物
を培地に添加してもよい。本発明におけるシクロテキス
トリンとはα、β、ｒシクａデキストリンな意味し、シ
クロデキストリン誘導体とは、クリえば、７ミノシクａ
デキストリンや７ミノデオキシシクロテキストリンの如
きアミノ化誘導体、７セチルシクａデキストリンや二ｌ
−ｏンクロデキスＩ・リンの如キエステル化−４体、メ
チルシクロテキストリン、エチルシクｏｆヤストリン、
プロピルシクｑデキストリン、カルボキシメチルシクａ
デキストリンの如きエーテル化肪導−（エーテル化シク
ロテキストリンンをいう。本発明において好ましいのは
エーテル化シクａデキストリンであり、中でも、ヘキサ
キス（２，６−ｏ−ジメチル）α−シクａテキストリン
（Ｍｅｄ−ＣＤ）やヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル
）β−シクロデキストリン（Ｍｅβ−ＣＤ）等の、メチ
ノげキストリンが特に好ましい。
本、発明、において培地とは、レイヨンやペプトン水な
どの従来公知の液状培地、あるいは液状培地に寒天、ゼ
ラチン、卵白、１血清などを加えて固％Ｋした従来公知
の固形培地を意味するが、好ましいのは８８培地（又は
８８Ｂ培地）、及びこれに寒天を１〜２％（Ｗ／Ｖ）程
度添加し固化したＳＳＡ培地である。例えば、５ＳＪａ
地は、通常、１１あたり、グルタミン酸ナトリウム。
どの従来公知の液状培地、あるいは液状培地に寒天、ゼ
ラチン、卵白、１血清などを加えて固％Ｋした従来公知
の固形培地を意味するが、好ましいのは８８培地（又は
８８Ｂ培地）、及びこれに寒天を１〜２％（Ｗ／Ｖ）程
度添加し固化したＳＳＡ培地である。例えば、５ＳＪａ
地は、通常、１１あたり、グルタミン酸ナトリウム。
！−プロリン、塩化ナトリウム、リン＃２水素カリウム
、塩化カリウム、塩化マグネジ′つλ。
、塩化カリウム、塩化マグネジ′つλ。
塩化カルシウム、トリスヒトミキンメチルアミノメタン
を、それぞれ１θ、７． ０，２４． ２，５゜０．５
． ０．２． ０．１． ０．０２． １．５２５ Ｉ
Ｉを含む水溶液を濃塩酸でｐＨ７，６に！４整した後、
１２４℃で１５分間オートクレーブで滅菌し【得られ、
る、基礎培、地に、ｌ−ンスチン、ｍ酸第１鉄、アスコ
ルビン酸、ニアシン２．グルタミン酸１．Ｊあたり、そ
れぞれ４，１．．２．（１，４，Ｉ Ｏ＆含む懸、液を
ミ、リポ７フイルター（０，４５μ）で除、１して得ら
れる補液な、基４ｄｌ培地に対して１，０ｑｂ（ｖ／ｖ
）、、の割合で加え℃得られ、る。本発明においては、
かかる培地にカサミノ酸、７スコルビンー及びグルタチ
オンの必狭量が添加され、更に場合によっては、シクロ
テキストリンスはその誘導体の必９！菫が冷加される。
を、それぞれ１θ、７． ０，２４． ２，５゜０．５
． ０．２． ０．１． ０．０２． １．５２５ Ｉ
Ｉを含む水溶液を濃塩酸でｐＨ７，６に！４整した後、
１２４℃で１５分間オートクレーブで滅菌し【得られ、
る、基礎培、地に、ｌ−ンスチン、ｍ酸第１鉄、アスコ
ルビン酸、ニアシン２．グルタミン酸１．Ｊあたり、そ
れぞれ４，１．．２．（１，４，Ｉ Ｏ＆含む懸、液を
ミ、リポ７フイルター（０，４５μ）で除、１して得ら
れる補液な、基４ｄｌ培地に対して１，０ｑｂ（ｖ／ｖ
）、、の割合で加え℃得られ、る。本発明においては、
かかる培地にカサミノ酸、７スコルビンー及びグルタチ
オンの必狭量が添加され、更に場合によっては、シクロ
テキストリンスはその誘導体の必９！菫が冷加される。
本発明の培地は、―が安定に且つ５４Ｊ本曳く生育する
りで、百日咳の臨床分離−り生育及び検出のために好ま
しく使用することができる。また、糖尿病治療桑とし℃
の医桑幼来が期待されるＩＡＰ、 白日咳ワクチンコン
ポーネントとして期待されるＬ Ｐ Ｆ−１−１Ａ Ｊ
ＰＦ −）Ｉ Ａ及び一体ワクチン等の活性物質の製造
上も極めて有利な培地でもある。
りで、百日咳の臨床分離−り生育及び検出のために好ま
しく使用することができる。また、糖尿病治療桑とし℃
の医桑幼来が期待されるＩＡＰ、 白日咳ワクチンコン
ポーネントとして期待されるＬ Ｐ Ｆ−１−１Ａ Ｊ
ＰＦ −）Ｉ Ａ及び一体ワクチン等の活性物質の製造
上も極めて有利な培地でもある。
かかる培地な用いたボルデテラ属に属する微生物の培養
方法及び条件は特に限定されるものではな（、従来公知
の方法及び条件を採用できるが、静置培養よりは振と５
培養の方が好ましく、培養温度は３０〜３８℃、培養時
間は１０〜１００時間が適当である。
方法及び条件は特に限定されるものではな（、従来公知
の方法及び条件を採用できるが、静置培養よりは振と５
培養の方が好ましく、培養温度は３０〜３８℃、培養時
間は１０〜１００時間が適当である。
培養物（培養培地と菌体）から、生成された生物学的活
性物員を採取する方法１手段も特に限定されるものでは
なく、公知の方法２手段を利用できる。例えば、ＬＰＦ
−ＨＡを得るには、６日咳ｌ相鉋（ボルデテラ・バタシ
ス東浜株ンを本発明の培地にて３５′Ｇで４８時間培養
し、得られる培養液の遠心上清（ｐＨ８，３）を、ｐＨ
８，０のｏ、０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で平衡化したハ
イドロキシアパタイトカラムに通過せしめる。そして、
得られる通過液Ｉｔ ｐＨ６，０に＃４整した後、今度
は、ｐＨ６，０のＯ，ＬＩＩＭＩＪン酸緩衝液で平衡化
したハイドロキシ７バタイトカラムに吸着させ、これを
Ｕ’、５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分画を得る。この蛋白分
画をハプトグロビン−セファロース４Ｂを支持体とする
アフィニティー′クロマトクラフィーに吸着させ、０．
５Ｍ ＮａＣ１及ヒ３Ｍのチオシアン化カリウムを含む
０．１Ｍｌ１１＊酸緩衝液（ｐＨ７，０）で脱着してＬ
Ｐ ＃’ −）Ｉ Ａを得ることができる。
性物員を採取する方法１手段も特に限定されるものでは
なく、公知の方法２手段を利用できる。例えば、ＬＰＦ
−ＨＡを得るには、６日咳ｌ相鉋（ボルデテラ・バタシ
ス東浜株ンを本発明の培地にて３５′Ｇで４８時間培養
し、得られる培養液の遠心上清（ｐＨ８，３）を、ｐＨ
８，０のｏ、０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で平衡化したハ
イドロキシアパタイトカラムに通過せしめる。そして、
得られる通過液Ｉｔ ｐＨ６，０に＃４整した後、今度
は、ｐＨ６，０のＯ，ＬＩＩＭＩＪン酸緩衝液で平衡化
したハイドロキシ７バタイトカラムに吸着させ、これを
Ｕ’、５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分画を得る。この蛋白分
画をハプトグロビン−セファロース４Ｂを支持体とする
アフィニティー′クロマトクラフィーに吸着させ、０．
５Ｍ ＮａＣ１及ヒ３Ｍのチオシアン化カリウムを含む
０．１Ｍｌ１１＊酸緩衝液（ｐＨ７，０）で脱着してＬ
Ｐ ＃’ −）Ｉ Ａを得ることができる。
またｐＨ８，０のハイドロキシ７バタイトカラムに吸着
されたものを、０．５ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．Ｉ
Ｍ燐酸緩＠ ｔｉ （ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分
画を得る。この蛋白分画をハプトグロビンセファａ−ス
４Ｂを支持体とするアフィニテイークａマドグラフィー
に通過せしめ、通過液よりＦ −ｋｌＡを得ることがで
きる。
されたものを、０．５ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．Ｉ
Ｍ燐酸緩＠ ｔｉ （ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分
画を得る。この蛋白分画をハプトグロビンセファａ−ス
４Ｂを支持体とするアフィニテイークａマドグラフィー
に通過せしめ、通過液よりＦ −ｋｌＡを得ることがで
きる。
以下、実施例により本％明を詳述する。
実施例１
通常のＳＳＡ培地（アスコルビン酸を０．０２１−／
ｌ含むン中のグルタチオンの濃度を１．５倍、即ち０．
１５１／ｌ Ｋ変更し、更にカザミノ改の濃度が各々０
． ０．５． １．０． ２，５． ５．（１゜１０．
０１１／ｌとなるように、又Ｍｅβ−ＣＤの濃度が谷々
１３． ０，０５． ０，１ （１，ｔ）、２５． ０
．５０゜１．０１／ＩＩとなるように１４整した改良８
８Ａ培地に１約１００個の百日＠ｌ相相開浜株をスプレ
ッドして、３５℃で３日間培養した。そして、形成され
たコロニーの数を、同秦件下のｆｌＧ培地で形成された
コｏニー数と比較した。その結果を第１表に示した。Ｍ
ｅβ−ＣＩ）の０．５０〜１．Ｏｇｉｇａ）ｆＡ加によ
って、コロニーはＢＧ培地ｄＪ場合とほぼ等しい数だけ
形成されていることがわかる。カザミノ酸の０８５〜５
．（＃／ｌの存在は出現コｅ＋ニーの形感をより明白に
していた。
ｌ含むン中のグルタチオンの濃度を１．５倍、即ち０．
１５１／ｌ Ｋ変更し、更にカザミノ改の濃度が各々０
． ０．５． １．０． ２，５． ５．（１゜１０．
０１１／ｌとなるように、又Ｍｅβ−ＣＤの濃度が谷々
１３． ０，０５． ０，１ （１，ｔ）、２５． ０
．５０゜１．０１／ＩＩとなるように１４整した改良８
８Ａ培地に１約１００個の百日＠ｌ相相開浜株をスプレ
ッドして、３５℃で３日間培養した。そして、形成され
たコロニーの数を、同秦件下のｆｌＧ培地で形成された
コｏニー数と比較した。その結果を第１表に示した。Ｍ
ｅβ−ＣＩ）の０．５０〜１．Ｏｇｉｇａ）ｆＡ加によ
って、コロニーはＢＧ培地ｄＪ場合とほぼ等しい数だけ
形成されていることがわかる。カザミノ酸の０８５〜５
．（＃／ｌの存在は出現コｅ＋ニーの形感をより明白に
していた。
第１表
比較用のＢＧ培地＝１０４±１６コロニー数／プレート
※：コロニーは小さい。
※：コロニーは小さい。
実施例２
通常のＳＳＢ培地の＆ｔ！培地に、カザミノ酸をＩｏ１
／ｌとなるように添加し、更にグルタチオンが１．５倍
、７スフルビン葭が２０＠Ｉ／Ｃなるように調製した補
液なＩ、Ｕう（Ｖ／Ｖ ）の割合で加えた。かくして得
られた改良ｓｓＢ培地（カザ４ ／ １ｉ＃！ ’に：
１０ ！’ ／ ｊ ｅ ７ ス＝ ルビ７ｍ＝に０
．４１１／ｌ 、グルタチオンを０．１５．９／ノ含む
）に、Ｍｅβ−ＣＤを谷々０． ０，０５． ０．５．
２，０゜ｓ、ｏＭ／ｌとなるように加え、それぞれの
２００−を坂ロフラスコに分注した後、Ｇ日咳ｌ相−東
浜株を１．５Ｘ１０°１１１１１ ／ ｍとなるように
接種し、３５℃で培養した。その結果を第１図と第２図
に示した。
／ｌとなるように添加し、更にグルタチオンが１．５倍
、７スフルビン葭が２０＠Ｉ／Ｃなるように調製した補
液なＩ、Ｕう（Ｖ／Ｖ ）の割合で加えた。かくして得
られた改良ｓｓＢ培地（カザ４ ／ １ｉ＃！ ’に：
１０ ！’ ／ ｊ ｅ ７ ス＝ ルビ７ｍ＝に０
．４１１／ｌ 、グルタチオンを０．１５．９／ノ含む
）に、Ｍｅβ−ＣＤを谷々０． ０，０５． ０．５．
２，０゜ｓ、ｏＭ／ｌとなるように加え、それぞれの
２００−を坂ロフラスコに分注した後、Ｇ日咳ｌ相−東
浜株を１．５Ｘ１０°１１１１１ ／ ｍとなるように
接種し、３５℃で培養した。その結果を第１図と第２図
に示した。
第１図は１ｌｌｌ貞度（ＩＯＵ／１ｌｊ）と項番時間の
関ｉ１に、第２図は、ＬＰＦ−）ＩＡ活性の経時変化な
示している。本発明の培地な用いると１日咳閑の増殖及
びＬＰＦ−）ＩＡ産生が着しいことがわかる。そして、
か〜る効果はＭｅβ−ＣＤの離船によって促進されてい
ることもわかる。
関ｉ１に、第２図は、ＬＰＦ−）ＩＡ活性の経時変化な
示している。本発明の培地な用いると１日咳閑の増殖及
びＬＰＦ−）ＩＡ産生が着しいことがわかる。そして、
か〜る効果はＭｅβ−ＣＤの離船によって促進されてい
ることもわかる。
なお、＃ｉ濃度と１．ＰＦ−）ＩＡ活性は以下の如き方
法でめたものである。−濃度は培−ｊＩＩ液の濁度（０
Ｄｓｓｅ ）な測定してめた。１０υとＩｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ ０ｐａｃｉｔｙ Ｕｎｉｔ の略であり
、１１０Ｕ＝１０°侭／１に相当する。Ｌｐｙ−ＫＡ活
性は、以下の如き方法で産生されたＬＰＦ’−）ＩＡを
採取しその活性を１１足した。培養液の遠心上清（ｐ）
１８．６ ）を、ｐ）１８．０の（１，０１Ｍリン酸緩
衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに通過
せしめ、得られる通過液をｐＨ６，ＯＫ調整した後、今
腋はｐａ ６，０００．（１１Ｍリン酸緩衝液で平衡化
し謔ハイドク″キシアパタイトカラムに吸着させ、これ
ｋ Ｌｌ、５ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１ Ｍリン
酸緩１Ｍ液（ｐ）１７．０ ）で溶出して蛋白分画な得
た。この蛋白分画をハプトグロビン−セファＩＪ−スを
支持体と一４／、１°ｌノ・に１イークロマトグラフィ
ーに吸着させ、０．５ＭＮａＣＡ！ 及び３Ｍのチオシ
アン化カリウムを含む０．１ Ｍ トリス緩衝液で脱着
してＬＰＦ−）ＩＡを得た。Ｌ Ｐ Ｆ −）１ Ａ
ｔ８性は、佐原らの＃素抗体法（ＥＬＩＳＡ法、第２８
回毒素シンポジウム（１９８１年７月２３日〜２４日、
岩手県へ幡平）講演要旨集、第１４１〜１４４貞参照）
によって測定し、ＬＰＦ−）１Ａの活性単位（ｕ）は、
ＯＤ４０（Ｉｍμ が、単位容ｔｋ（ＷＬｔ）当り１１
．１を与える各サンプルの希釈倍数であられした。
法でめたものである。−濃度は培−ｊＩＩ液の濁度（０
Ｄｓｓｅ ）な測定してめた。１０υとＩｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ ０ｐａｃｉｔｙ Ｕｎｉｔ の略であり
、１１０Ｕ＝１０°侭／１に相当する。Ｌｐｙ−ＫＡ活
性は、以下の如き方法で産生されたＬＰＦ’−）ＩＡを
採取しその活性を１１足した。培養液の遠心上清（ｐ）
１８．６ ）を、ｐ）１８．０の（１，０１Ｍリン酸緩
衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに通過
せしめ、得られる通過液をｐＨ６，ＯＫ調整した後、今
腋はｐａ ６，０００．（１１Ｍリン酸緩衝液で平衡化
し謔ハイドク″キシアパタイトカラムに吸着させ、これ
ｋ Ｌｌ、５ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１ Ｍリン
酸緩１Ｍ液（ｐ）１７．０ ）で溶出して蛋白分画な得
た。この蛋白分画をハプトグロビン−セファＩＪ−スを
支持体と一４／、１°ｌノ・に１イークロマトグラフィ
ーに吸着させ、０．５ＭＮａＣＡ！ 及び３Ｍのチオシ
アン化カリウムを含む０．１ Ｍ トリス緩衝液で脱着
してＬＰＦ−）ＩＡを得た。Ｌ Ｐ Ｆ −）１ Ａ
ｔ８性は、佐原らの＃素抗体法（ＥＬＩＳＡ法、第２８
回毒素シンポジウム（１９８１年７月２３日〜２４日、
岩手県へ幡平）講演要旨集、第１４１〜１４４貞参照）
によって測定し、ＬＰＦ−）１Ａの活性単位（ｕ）は、
ＯＤ４０（Ｉｍμ が、単位容ｔｋ（ＷＬｔ）当り１１
．１を与える各サンプルの希釈倍数であられした。
実施例３
実施例２と同様な方法で（但し、Ｍ・β−ＣＩ）は添加
せずに）、７スコルビン酸、グルタチオン。
せずに）、７スコルビン酸、グルタチオン。
カザミノ酸を檜々の一度で含む培地を準備し、実施１１
２と同じ方法で百日咳菌をＩＪｋＩｍ、培養し、４８時
間後のＬＰＦ−）ＩＡ活性を測定した。
２と同じ方法で百日咳菌をＩＪｋＩｍ、培養し、４８時
間後のＬＰＦ−）ＩＡ活性を測定した。
結果は第２．３．４表に示した通りであった・第２表
還元層グルタチオン： ｕ、ｌｓ ＆／１カザミノ酸
”、１０Ｊｌ／１ 第３表 ■ ７♂コルビンＩｌｌ： ０．４１／１ カザミノ酸： １０１／１ ９４表 アスコルビン酸： ０，４１／１ 遺元履グルタチオｖ：ｕ、１ｓｌ／１ 夾施例４ （１） 培 養 通常のＳＳＢ培地の基礎培地１ｔｃｘｏｌｌ／１のカサ
ミノ酸及び２１／ｌのＭｅβ−ＣＤを加え、これにグル
タチオンな標準組成の１．５倍、アスコルビン酸が２０
倍となるようにａｍした補液を１．０％（Ｖ／Ｖ ）の
割合で加えた。かくして得られた改良ＳＳＢ倍地培地！
に、１．０×１０°個／ｄとなるように百日咳■相開を
接種し、５．Ｏｌの層書器を用いて培養を行った。
”、１０Ｊｌ／１ 第３表 ■ ７♂コルビンＩｌｌ： ０．４１／１ カザミノ酸： １０１／１ ９４表 アスコルビン酸： ０，４１／１ 遺元履グルタチオｖ：ｕ、１ｓｌ／１ 夾施例４ （１） 培 養 通常のＳＳＢ培地の基礎培地１ｔｃｘｏｌｌ／１のカサ
ミノ酸及び２１／ｌのＭｅβ−ＣＤを加え、これにグル
タチオンな標準組成の１．５倍、アスコルビン酸が２０
倍となるようにａｍした補液を１．０％（Ｖ／Ｖ ）の
割合で加えた。かくして得られた改良ＳＳＢ倍地培地！
に、１．０×１０°個／ｄとなるように百日咳■相開を
接種し、５．Ｏｌの層書器を用いて培養を行った。
４８時間後、ｖＭｄ度ハ約１０’Ｊ１６１／ＴＬｌ、Ｌ
Ｐ Ｆ−）ｉ ＡはＥＬＩＳＡＩ直で１２５００／Ｗ
Ｌｔとなった。培養終了液を６０００ｒｖａＸＢＵ分遠
心分離して得られた上清（３，６１）を、以降のＬ Ｐ
Ｆ −ＨＡ精製に供した。
Ｐ Ｆ−）ｉ ＡはＥＬＩＳＡＩ直で１２５００／Ｗ
Ｌｔとなった。培養終了液を６０００ｒｖａＸＢＵ分遠
心分離して得られた上清（３，６１）を、以降のＬ Ｐ
Ｆ −ＨＡ精製に供した。
（２） 培養漱からのＬＰＦ−ＨＡの分離精製培養上清
３．６１ （ｐＨ８，３ンを、４℃前後で（１，（１１
モルリン酸バッファー（ｐ）ｉ ８ ）で平衡化したへ
イドａキシルアパタイト（ＢＤＨケミカルズ社製社製シ
カラム００１１１３）に、流速２００Ｍ１／時間で流し
た。υ、（ＩＩＭＩＪン咳緩衝液（ｐＨ８）０．４１で
カラムを洗い、得られた通過液４６０１を譲塩酸でｐＨ
６，０に調整した。この溶液を、ｏ、ｏ Ｉ Ｍリン＃
ｉ、緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したハイドロキシル
アパタイトカラム（１４０＃＋７りに、流込ＩＵｃ１ｍ
（７時間で流した。０．ＯＩＭリン酸緩衝ｇ、（ｐＨ６
，０）０．５１でカラムを洗い、次いで０．１モルリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２５０ｍｌで洗い、更に０．
５モル食塩な含む０．１モルリン酸緩衝液（ｐ）１７．
０ ）で溶出２分画した。祷られた蛋白画分を集め（１
００１１１） ０．５モル笈塩を含む０．１モルリン酸
緩衝液で平歯化したノ〜ブトグロビンーセファａ−ス４
Ｂカラム（３０ａＪ ）に通した。吸着したものを、３
モル千オシアン酸カリと０．５モル食塩な含む０．１モ
ルリン酸緩衝液で溶出１分画した。得られた蛋白画分を
集め、０．５モル食塩な′よむ０．１モルリン酸緩＃液
（ｐＨ７，０）に対し透析してＬＰＦ−ｊ（Ａを２０．
７ダ得た。
３．６１ （ｐＨ８，３ンを、４℃前後で（１，（１１
モルリン酸バッファー（ｐ）ｉ ８ ）で平衡化したへ
イドａキシルアパタイト（ＢＤＨケミカルズ社製社製シ
カラム００１１１３）に、流速２００Ｍ１／時間で流し
た。υ、（ＩＩＭＩＪン咳緩衝液（ｐＨ８）０．４１で
カラムを洗い、得られた通過液４６０１を譲塩酸でｐＨ
６，０に調整した。この溶液を、ｏ、ｏ Ｉ Ｍリン＃
ｉ、緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したハイドロキシル
アパタイトカラム（１４０＃＋７りに、流込ＩＵｃ１ｍ
（７時間で流した。０．ＯＩＭリン酸緩衝ｇ、（ｐＨ６
，０）０．５１でカラムを洗い、次いで０．１モルリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２５０ｍｌで洗い、更に０．
５モル食塩な含む０．１モルリン酸緩衝液（ｐ）１７．
０ ）で溶出２分画した。祷られた蛋白画分を集め（１
００１１１） ０．５モル笈塩を含む０．１モルリン酸
緩衝液で平歯化したノ〜ブトグロビンーセファａ−ス４
Ｂカラム（３０ａＪ ）に通した。吸着したものを、３
モル千オシアン酸カリと０．５モル食塩な含む０．１モ
ルリン酸緩衝液で溶出１分画した。得られた蛋白画分を
集め、０．５モル食塩な′よむ０．１モルリン酸緩＃液
（ｐＨ７，０）に対し透析してＬＰＦ−ｊ（Ａを２０．
７ダ得た。
このものは、ポリアクリルアミドゲル（ポリアクリルア
ミ ド濃度７．５％、ＩＮＫＯＩ（−米酢Ｉ襄緩衛’ａ
（ｐＨ４，３７）ディスク電気泳動で単一バンドな示し
、泳動位置は既存のしＰＦ−ＨＡと一致した。またこの
もののｋＬｌｓＡ値は１１１．Ｉ Ｕ／μＪであった。
ミ ド濃度７．５％、ＩＮＫＯＩ（−米酢Ｉ襄緩衛’ａ
（ｐＨ４，３７）ディスク電気泳動で単一バンドな示し
、泳動位置は既存のしＰＦ−ＨＡと一致した。またこの
もののｋＬｌｓＡ値は１１１．Ｉ Ｕ／μＪであった。
第１図は、本発明の培地？用いた場合Ｑ）鴎痰度と培女
時間の関係を示す図であり１，１１４２図は同じ＜ＬＰ
Ｆ−）ｆＡ活性と培養時間の関係を示す図である。 第１図 ０ １２ ２４ Ｊ６ ４δ 藉着時間（）ＩＩ−） 第１頁の続き ０発 明 者 小 野 章 二 日野市旭が丘４丁目所
内 ［相］発 明 者 山 口 久 夫 日野市旭が丘４丁
目所内 ３番２号 帝人株式会社生物医学研究 ３番２号 帝人株式会社生物医学研究
時間の関係を示す図であり１，１１４２図は同じ＜ＬＰ
Ｆ−）ｆＡ活性と培養時間の関係を示す図である。 第１図 ０ １２ ２４ Ｊ６ ４δ 藉着時間（）ＩＩ−） 第１頁の続き ０発 明 者 小 野 章 二 日野市旭が丘４丁目所
内 ［相］発 明 者 山 口 久 夫 日野市旭が丘４丁
目所内 ３番２号 帝人株式会社生物医学研究 ３番２号 帝人株式会社生物医学研究
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 ボルデテラ属に属する微生物な、カザミノ−を０
．１〜２０１１／１，７スコルビン酸な０．０１．〜１
１／／１．及びグルタチオンを０．１〜５＆／ｌ、含有
する培地で培養し、培養物から生物学的活性物質を採取
することを特徴とする生物学的活性物質の製法。 ２、 培−に、カザミノ酸、７スコルビン鍼、グルタチ
オン以外に、シクロデキストリン又は雪″−導体”０・
００１〜５９／ｌ含有さ門ていること、を特徴とする特
許請警の範囲嬉１項記載の生物学的活性物質の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59259103A JPS60155127A (ja) | 1984-12-10 | 1984-12-10 | 生物学的活性物質の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59259103A JPS60155127A (ja) | 1984-12-10 | 1984-12-10 | 生物学的活性物質の製法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17326282A Division JPS6028277B2 (ja) | 1982-10-04 | 1982-10-04 | ボルデテラ属に属する微生物の培養方法及び培地 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60155127A true JPS60155127A (ja) | 1985-08-15 |
Family
ID=17329362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59259103A Pending JPS60155127A (ja) | 1984-12-10 | 1984-12-10 | 生物学的活性物質の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60155127A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6463342A (en) * | 1987-09-03 | 1989-03-09 | Kohjin Co | Stabilization of glutathione-containing composition |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5750925A (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of pertussis toxoid |
-
1984
- 1984-12-10 JP JP59259103A patent/JPS60155127A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5750925A (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of pertussis toxoid |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6463342A (en) * | 1987-09-03 | 1989-03-09 | Kohjin Co | Stabilization of glutathione-containing composition |
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