JPS6144470B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、微生物、特にボルデテラ
（Bordetella）属に属する微生物を培養するため
の培地に関する。 ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌，パラ百日咳菌，気管支敗血症菌等があり、特
に百日咳菌は、100日つづくといわれる特有の咳
を伴う、気管，気管支，および小気管支がおかさ
れる急性の感染症である百日咳の主たる病原菌と
して知られている。従つて、臨床上は、かかる百
日咳菌等の迅速・確実な検出が望まれており、そ
のめには臨床分離菌の生育を促進するような培地
が必要である。 また、ボルデテラ属に属する微生物は種々の生
物学的活性物質を産生する。例えば、百日咳Ｉ相
金の培養物（培養培地と菌体）からは、各種糖尿
病治療乃至予防薬としての展開が期待しうるとこ
ろの、インシユリン分泌増強活性物質（ISlet
activating protein，以下IAPと略記する）や、
百日咳菌のワクチンコンポーネントとして注目さ
れている白血球増加因子（Lencocytosis
Promoting Factor，以下LPFと略記する）等、
医療上有効な生物学的活性物質が得られる。 ところが、百日咳Ｉ相菌は相変化をおこし易く
安定した培養が難しく、その結果、菌の抗原性，
病原性，LPF産生能あるいはLAP産性能が培養
条件によつて著しく異なるという問題点があつ
た。かかる問題点を解消する試みが従来行なわれ
てきた。 例えば、ロワツトら（Rowatt Ｅ…ジヤーナル
オブ ジエネラル マイクロバイオロジー（J.
gen.Micrbiogy）17巻，279―296頁及び297―326
頁，1957年）によればボルデテラ属の微生物、と
りわけ百日咳Ｉ相菌の培養を抑制する因子として
は、以下のものが挙げられている。(1)システイン
の加熱（オートクレーブ）処理によつて得られる
コロイド状サルフアイド又はサルフアー。(2)カゼ
イン加水分解物のオートクレーブ処理により得ら
れる過酸化水素又ま有機過酸化物。(3)菌が二次的
に産生する不飽和脂肪酸、とりわけオレイン酸。
そしてこれらの抑制効果を打消す培地への添加物
として、(1)に関してはアルブミン，赤血球又はそ
の破砕物，活性炭，イオン交換樹脂、(2)に関して
はカタラーゼ，ヘミン，FeSO₄、(3)に関してはス
ターチ，アミロース，デキスリトリン等が挙げら
れているが、これ添加物の効果は菌の接種数が１
×10⁶個以下では不安定である。また活性炭，イ
オン交交換樹脂，アミロースなどの吸着剤の添加
も効果があるとされるが、培地中に不均一な部分
を形成しやすく必ずしも十分なものであるとは言
えない。赤血球，アルブミンなどの添加物は、こ
れらがロツト的に組成変化しやすくまた、変性し
易いので、保存に適し且つ安定した培地を調製す
るには適切ではない。 近年ステナー（Stainer）及びシヨルテー
（Scholte）によつてこの百日咳Ｉ相菌の大量培養
のための合成培地が開発された（ジヤーナル オ
ブ ジエネラル マイクロバイオロジー J.gen.
Microbiol）63巻，211―220頁，1971年）このス
テナー・シヨルテー培地（以下SS培地と略記す
る）は天然物由来の血液及びポリペプトン等、ロ
ツト差に変動の考えられる添加物を含まないた
め、菌の培地組成を厳密にコントロールし得るの
で、菌性状に変化をもたらすことなく、培養を行
い得ること、及び前述したIAPもしくはLPFの如
き生物学的活性物質の分離・精製に際し、不要な
他種蛋白質の爽雑を防ぎ得る等の特徴を有するの
で近年百日咳ワクチン及び百日咳菌よりの生物学
的活性物質を工業的規模で製造するのに広く用い
られているが、攪拌下もしくは静置下の液体培養
条件で、特に接種サイズが10⁷コロニー／ml以下
の場合、LPFの産生能力等の点で安定な生育特性
が得られないという欠点を有する。またSS培地
に寒天を1.2％となるように加えて固化して得た
寒天培地（以下SSA培地と略記する）では、10³
コロニー数以下の播種（シート）でのコロニー形
成は認められないという大きな欠陥を有する。 本発明者らは従来技術の欠点を改良し、微生
物、特にボルデテラ属に属する微生物を安定にか
つ効率良く培養するための培地を得るべく鋭意研
究の結果、本発明に到達した。 即ち、本発明はシクロデキストリン又はその誘
導体を含有する、ボルデテラ属に属する微生物を
培養するための培地である。 本発明の培地は、種々の微生物の培養のために
使用できるが、特にボルデテラ属に属する微生物
を培養するために適している。 ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌，パラ百日咳菌，気管支敗血症菌等がある。本
発明において好ましく用いられるのは百日咳菌で
あり、なかでも百日咳Ｉ相菌が好ましい。 ボルデテラ属に属する微生物の菌学的性質及び
培養条件等に関しては、Bergys Manusl of
Determinative Bacteriology，第８版，1974年，
The Williams＆ Willkins Co，発行やJ.Exp
Med.129巻，第523―550頁，1969年あるいは細菌
学実習提要，第３版，第80頁以下，昭和47年，丸
善発行等がありすでに公知である。 シクロデキストリンは、澱粉あるいは澱粉の加
水分解物にBacillus ｍ acerans amylase
（transglycosylase）等を作用させて得られる。
Ｄ―グリコピラノース基が６〜10個α―１，４グ
リコシド結合によつて環状に結合した王冠状の分
子である。そのうち主なものは６，７または８個
のＤ―グリコピラノース基からなり、それぞれα
―，β―，γ―シクロデキストリンと呼ばれてい
る。本発明におけるシクロデキストリンとは、前
記α，β，γ等のシクロデキストリン又はそれら
の混合物をいう。 シクロデキストリン分子は多数の１級及び２級
水酸基を有するので、単糖類に広く用いられてい
る反応を適用して種々の誘導体が得られる。本発
明におけるシクロデキストリン誘導体とはかかる
方法で得られる誘導体を意味し、例えばアミノシ
クロデキストリンやアミノデオキシシクロデキス
トリンの如きアミノ化誘導体、アセチルシクロデ
キストリンやイトロデキストリンの如きエステル
化誘導体、メチルシクロデキストリン，エチルシ
クロデキストリン，プロピルシクロデキストリ
ン，カルボキシルメチルシクロデキストリンの如
きエーテル化誘導体（エーテル化シクロデキスト
リン）がある。本発明において好ましいのはエー
テル化シクロデキストリンであり、中でもヘキサ
キス（２，６―０―ジメチル）α―シクロデキス
トリン（neα―CD）やヘプタキス（２，６―０
―ジメチル）β―シクロデキストリン（neβ―
CD）等のメチルシクロデキストリンが特に好ま
しい。 本発明において培地とは、ブイヨンやペプトン
水などの従来公知の液状培地、あるいは液状培地
に寒天，ゼラチン，卵白，血清などを加えて固形
にした従来公知の固形培地を意味するのが好まし
いのはSS培地、及びこれに寒天を１〜２％
（Ｗ／Ｖ）程度添加し固化したSS培地である。SS
培地、１あたり、グルタミン酸ナトリウム，ｌ
―プロリン，塩化ナトリウム，リン酸２水素カリ
ウム，塩化カリウム，塩化マグネシウム，塩化カ
ルシウム，トリスヒドロキシメチルアミノメタン
を、それぞれ10.7，0.24，2.5，0.5，0.2，0.02，
1.525ｇを含む水溶液を濃塩酸でPH7.6に調整した
後121℃で15分間オートクレープで滅菌して得ら
れる基礎培地に、ｌ―シスチン，硫酸第１鉄，ア
スコルビン酸，ニアシン，還元型グルタチオンを
１あたり、それぞれ４，１，２，0.4，10ｇ含
む溶液をミリポアフイルター（0.45μ）で除菌し
て得られる補液を、基礎培地に対して10％（Ｖ／
Ｖ）の割合で加えて得られる 本発明において前記培地に添加混合されるシク
ロデキストリン又はその誘導体の量は、接種され
る菌の量に依存するが、例えば、接種される菌が
10⁶〜10⁸コロニー／mlの場合には、前記培地に10
〜5000μｇ／ml、好ましくは100〜1000μｇ／ml
の割合でシクロデキストリン又はその誘導体を添
加混合し、本発明において用いられる培地を得
る。かかるシクロデキストリン又はその誘導体の
添加培地、とりわけ添加SS培地は菌が安定に且
つ効率良く生育するので糖尿病治療薬としての医
薬効果が期待されるIAP，百日咳ワクチンコンポ
ーネントとして期待されるLPF及び菌体ワクチン
等の活性物質の製造上極めて有利な培地である。 かかる培地を用いたボルデテラ属に属する微生
物の培養方法及び条件は特に限定されるものでは
なく、従来公知の方法及び条件を採用できるが、
静置培養よりは振とう培養の方が好ましく、培養
温度は35℃前後、培養時間は10〜100時間が適当
である。 培養物（培養培地と菌体）から、生成された生
物学的活性物質を採取する方法，手段も特に限定
されるものではなく、公知の方法，手段を利用で
きる。例えば、LPFを得るには、百日咳Ｉ相菌を
（ボルデテラ・パタシス東浜株）を300μｇ／mlの
メチルβ―シクロデキストリンを含むSS培地に
て35℃で18時間培養し、得られる培養液の遠心上
清（PH8.6）を、PH8.0の0.01Mリン酸緩衝液で平
衡化したハイドロキシアパタイトカラムに通過せ
しめる。そして、得られる通過液をPH6.0に調整
した後、今度は、PH6.0の0.01Mリン酸緩衝液で
平衡化したハイドキシアパタイトカラムに吸着さ
せ、これを、0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）で溶出して蛋白文画を得
る。この蛋白文画をハプトグロビン―セフアロー
スを支持体とするアフイニテイークロマトグラフ
イーに吸着させ、0.5MNaCl及び3Mのチオシアン
化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液で脱着して
LPMを得ることができる。 以下、実施例により本発明を詳述する。 実施例 １ ボルデテラパタシス（Bordetella pertussis）
（百日咳菌）東浜株Ｉ相菌の凍結乾燥菌体を１％
カザミノ酸溶液に懸濁させ、脱繊維馬血液を20％
含むボルデ・ジヤングー（Bordet―Dengou）培
地（以下BG培地という）で35℃、３日間培養し
た。この菌を１白金耳かき取り、更にBG培地で
24時間リフレツシユしたSS培地に懸濁し、５×
10³コロニー／mlの接種菌懸濁液を得た。 予め所定の終濃度（μｇ／ml）となるように、
シクロデキストリン又はその誘導体を含む1.2％
寒天濃度の固定SS培地を調整しておき、１プレ
ート当りの菌数が10³コロニーとなるようにスプ
レツドした。 35℃で４日間培養後の菌生育状態（コロニー
数）を第１表に示した。

【表】 なお、用いたエーテル化シクロデキストリン
は、H.Schlenkらの方法（Abstr.Pap。Amer。
Chem.Soc.，149，11C，1965参照）に準拠した
合成された。 以下、α―シクロテキストリンをα―CD，そ
のメチル化物（ヘキサキス（２，６―０―ジメチ
ル）α―シクロデキストリン）をMeα―CD，エ
チル化物をEtα―CD，β―シクロデキストリン
をβ―CD，そのメチル化物をMeβ―シクロテキ
ストリン），エチル化物をEtβ―CDと略記す
る。 第１表から明らかな如く、シクロデキストリン
又はその誘導体を培地に添加することにより、百
日咳菌の生育が促進されている。また、その効果
はα―CD又はβ―CDよりもそれらのメチル化物
又はエチル化物の方が優れており、α体よりもβ
体の方がよりすぐ優れていることがわかる。 実施例 ２ 実施例１と同様の方法で得られた接種菌懸濁液
を、所定濃度のMeβ―CDを含むSS液体培地10
mlに接種サイズが10⁶コロニーとなるように接種
し、Ｌ字型試験管で往復振とうしながら35℃で接
種した。得られた培地の濁度（OD650mμ）の経
時変化は第２表の通りであつた。

【表】 第２表より、Meβ―CDを培地に１〜500μ
ｇ／mlの範囲で添加すると、添加量の増大と共に
培地の濁度が増大、即ち菌の生育が促進されてい
ることがわかる。 実施例 ３ 実施例１と同様の方法で得られた接種懸液を、
所定の濃度のMeβ―CDを含むSS培地に10⁷コロ
ニー／mlとなる様に懸濁させ、静置又は振とう条
件下、35℃で18時間培養を行つた。 培養後、培養液の濁度（OD₆₅₀）を測定し、次
に以下の如き方法で産生されたLPFを採取しその
活性を測定した。培養液の遠心上清（PH8.6）
を、PH8.0の0.1Mリン酸緩衝液で平衡化したハイ
ドロキシアパタイトカラムに通過せしめ、得られ
る通過液をPH6.0に調整した後、今後はPH6.0の
0.01Mリン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラムに吸着させ、これを0.5M塩化ナ
トリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で溶
出して蛋白文画を得た。この蛋白文画をハプトグ
ロビン―セフアロースを支持体とするアフイニテ
イークロマトグラフイーに吸着させ、0.5M NaCl
及び3Mのチオシアン化カリウムを含む0.1Mトリ
ス緩衝液で脱着してLPFを得た。 LPF活性は、佐藤らの酵素抗体法（ELISA
法、第28回毒素シンポジウム（1981年７月23日〜
24日、岩手県八幡平）講演要旨集、第141〜144頁
参照）によつて測定し、LPFの活性単位（ｕ）は
OD400mμが、単位容量（ml）当り0.1を与える
各サンプルの希釈倍数であらわした。 結果を第１図に示した。第１図から、Meβ―
CDは、特に振とう条件下で、菌体当りのLPF産
生能を著しく増大させていることがわかる。 なお、Meα―CDを用いた場合も、ほぼ同様な
結果が得られた。 実施例 ４ 実施例１と同様の方法で得られた接種菌懸濁液
を、Meβ―CDを500μｇ／ml含むSS培地150ml
に3.3×10⁸コロニー／mlとなる様に懸濁させ、振
とう条件下、35℃で所定時間培養を行つた。培養
時間と培養液の濁度及び産生されたLPFの量
（LPF活性）との関係を第２図に示した。 なお、LPF活性の測定は実施例３の場合と同様
にして行つた。 第２図から、少なくとも培養時間が20時間を越
えるとMeβ―CDの有無によつて、培養液の濁
度、即ち生育した菌の絶対量は大差がないが、産
生されるLSFの量は著しく異なり、Meβ―CDの
存在によつて百日咳菌のLPF産性能が著しく増大
していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、培地へのMeβ―CDの添加量と培養
液の濁度及び産生されたLPFの量（LPF活性）と
の関係を示す図である。第２図は、培地へのMe
β―CDの添加の有無の場合における、培養時間
と培養液の濁度及びLPFの量との関係を示す図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シクロデキストリン又はその誘導体を含有す
   る、ボルデテラ属に属する微生物を培養するため
   の培地。 ２ シクロデキストリン又はその誘動体を10〜
   5000μｇ／mlの割合で含有する、特許請求の範囲
   第１項記載の培地。