JPS64929B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、百日咳菌（Bordetella pertussis）
の培養物から、繊維状赤血球凝集素
（filamentoushemagglutinin，以下Ｆ―HAと略
記する）を製造する方法に関するものである。 百日咳菌は、100日つづくといわれる特有の咳
を伴う、気管，気管支，および小気管支がおかさ
れる急性の感染症である百日咳の主たる病原菌と
して知られている。かかる百日咳の予防のため、
従来、百日咳菌の全菌体ワクチンが使用されてい
たが、その副作用が強いという欠点があり、最近
は副作用の少ない百日咳防御抗原分画ワクチン
（コンポーネントワクチン）が使用されている。
百日咳防御抗原としては、白血球増多因子―赤血
球凝集素（leukocytosis promoting factor―
hemagglutinin，以下LPF―HAと略記する）と
Ｆ―HAが知られており、特にＦ―HAは、百日
咳菌の感染に対する初期の防御に関与していると
いわれている。従つて、百日咳のコンポーネント
ワクチンを工業的に製造するためには、百日咳菌
からLPE―HAとＦ―HAを効率良く製造する必
要があるのであるが、百日咳菌の工業的な培養は
容易でなく、また、菌の培養は十分でもＦ―HA
の産生がそれに必ずしも伴わないという問題点が
あつた。 近年、ステナー（Stainer）及びシヨルテー
（Scholte）によつてこの百日咳菌の大量培養のた
めの合成培地が開発された（ジヤーナル オブ
ジエネラル マイクロバイオロジー（J.gen.
Microbiol）63巻，211―220頁，1971年）。この
ステナー・シヨルテー培地（以下SS培地と略記
する）は天然物由来の血液及びポリペプトン等、
ロツト差に変動の考えられる添加物を含まないた
め、菌の培地組成を厳密にコントロールし得るの
で、菌性状に変化をもたらすことなく、培養を行
い得ること、及びLPF―HAやＦ―HAの如き生
物学的活性物質の分離・精製に際し、不要な他種
蛋白質の爽雑を防ぎ得る等の特徴を有するので近
年百日咳ワクチン及び百日咳菌よりの生物学的活
性物質を工業的規模で製造するのに広く用いられ
ているが、記拌下もしくは静置下の液体培養条件
でＦ―HAの産生が十分でなく、また接種サイズ
が10⁷cells／ml以下の場合、安定な生育特性が得
られないという欠点を有する。またSS培地に寒
天を１〜２％となるように加えて固化して得た寒
天培地（以下SSA培地と略記する）では、
10⁷cells以下の播種（シード）でのコロニー形成
は認められないという大きな欠陥をする。 本発明の目的は、上記培地の欠点を改良し、改
良された培地を用いてＦ―HAを効率良く製造す
ることにある。 即ち、本発明は、百日咳菌を、カザミノ酸を
0.1〜20ｇ／，アスコルビン酸を0.01〜１ｇ／
及びグルタチオンを0.1〜５ｇ／含有する培
地で培養し、培養物から繊維状赤血球凝集素を採
取することを特徴とする繊維状赤血球凝集素の製
法である。 本発明において用いられる百日咳菌としては、
百日咳Ｉ相菌が好ましい。百日咳菌の菌学的性質
及び培養条件等に関しては、Bergy's Manual
of Determinative Bacteriology，第８版，1974
年，The Williams＆Willkins Co.発行やJ.
ExpMed.129巻，第523―550頁，1969年あるいは
細菌学実習提要，第３版，第80頁以下、昭和47
年，丸善発行等がありすでに公知である。 本発明の培地の成分として用いられるカザミノ
酸は、カゼインの酸による加水分解物であり、乾
燥した粉末として入手できる。また、アスコルビ
ン酸はビタミンＣとして知られており、グルタチ
オンは、酵母および動物の肝臓、筋肉などに広く
分布しているペプチドの一種である。グルタチオ
ンは酸化型のものでも還元型のものでも、又それ
らの混合物であつてもよい。本発明の培地には、
カザミノ酸が0.1〜20ｇ／，好ましくは0.5〜10
ｇ／，アスコルビン酸が0.01〜１ｇ／，好ま
しくは0.1〜0.4ｇ／，グルタチオンが0.1〜５
ｇ／，好ましくは0.1〜１ｇ／含まれている
ことが必要である。上記範囲外の場合には、本発
明の目的が十分には達成されない。 本発明の培地に、前記成分に加えて、シクロデ
キストリン又はその誘導体を0.001〜５ｇ／，
好ましくは0.05〜５ｇ／含有せしめると、本発
明の目的はより有利に達成される。シクロデキス
トリン又はその誘導体は、そのまゝ、前記成分を
含有する培地に添加混合しても良いが、あらかじ
めグルタチオンと包接化合物をつくらせこの包接
化合物を培地に添加してもよい。本発明における
シクロデキストリンとはα，β，γシクロデキス
トリンを意味し、シクロデキストリン誘導体と
は、例えば、アミノシクロデキストリンやアミノ
デオキシシクロデキストリンの如きアミノ化誘導
体、アセチルシクロデキストリンやニトロシクロ
デキストリンの如きエステル化誘導体、メチルシ
クロデキストリン，エチルシクロデキストリン，
プロピルシクロデキストリン，カルボキシメチル
シクロデキストリンの如きエーテル化誘導体（エ
ーテル化シクロデキストリン）をいう。本発明に
おいて好ましいのはエーテル化シクロデキストリ
ンであり、中でも、ヘキサキス（2.6―Ｏ―ジメ
チル）α―シクロデキストリン（Meα―CD）や
ヘプタキス（２，６―Ｏ―ジメチル）β―シクロ
デキストリン（Meβ―CD）等のメチルデキスト
リンが特に好ましい。 本発明において培地とは、ブイヨンやペプトン
水などの従来公知の液状培地、あるいは液状培地
に寒天，ゼラチン，卵白，血清などを加えて固形
にした従来公知の固形培地を意味するが、好まし
いのはSS培地（又はSSB培地）、及びこれに寒天
を１〜２％（Ｗ／Ｖ）程度添加し固化したSSA
培地である。例えば、SS培地は、通常、１あ
たり、グルタミン酸ナトリウム，―プロリン，
塩化ナトリウム，リン酸２水素カリウム，塩化カ
リウム，塩化マグネシウム，塩化カルシウム，ト
リスヒドロキシメチルアミノメタンを、それぞれ
10.7，0.24，2.5，0.5，0.2，0.1，0.02，6.1ｇを含
む水溶液を濃塩酸でPH7.6に調整した後、121℃で
15分間オートクレープで滅菌して得られる基礎培
地に、―シスチン，硫酸第１鉄，アスコルビン
酸，ニアシン，グルタチオンを１あたり、それ
ぞれ４，１，２，0.4，10ｇ含む溶液をミリポア
フイルター（0.45μ）で除菌して得られる補液を、
基礎培地に対して1.0％（Ｖ／Ｖ）の割合で加え
て得られる。本発明においては、かかる培地にカ
ザミノ酸，アスコルビン酸及びグルタチオンの必
要量が添加され、更に場合によつてはシクロデキ
ストリン又はその誘導体の必要量が添加される。 かかる培地を用いた百日咳菌の培養方法及び条
件は特に限定されるものではなく、従来公知の方
法及び条件を採用できるが、静置培養よりは振と
う培養の方が好ましく、培養温度は30〜38℃、培
養時間は10〜100時間が適当である。 培養物（培養培地と菌体）から、生成されたＦ
―HAを採取する方法，手段も特に限定されるも
のではなく、公知の方法，手段を利用できる。例
えば、百日咳Ｉ相菌（ボルデテラ・パタシス東浜
株）を本発明の培地にて35℃で48時間培養し、得
られる培養液の遠心上清（PH8.3）を、PH8.0の
0.01Mリン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラムにかける。そして、ハイドロキシ
アパタイトカラムに吸着された蛋白を、0.5M塩
化ナトリウムを含む0.1M燐酸緩衝液（PH7.0）で
溶出して蛋白分画を得る。この蛋白分画をハプト
グロビンセフアロース4Bを支持体とするアフイ
ニテイークロマトグラフイーに通過せしめ、通過
液よりＦ―HAを得ることができる。 以下、実施例により本発明を詳述する。 実施例 １ 通常のSSB培地の基礎培地に、カザミノ酸を10
ｇ／となるように添加し、更にグルタチオンが
1.5倍，アスコルビン酸が20倍になるように調製
した補液を1.0％（Ｖ／Ｖ）の割合で加えた。か
くして得られた改良SSB培地（カザミノ酸を10
ｇ／，アスコルビン酸を0.4ｇ／，グルタチ
オンを0.15ｇ／含む）と、これに更に１ｇ／
のMeβ―CDを添加した培地を用いて、それぞれ
に百日咳Ｉ相菌東浜株を1.5×10⁹個／mlとなるよ
うに接種し、35℃で振とう培養を行なつた。培養
時間と培養物中に生成した赤血球凝集素の量（凝
集価）との関係は、第１図に示した通りであつ
た。 なお、Ｆ―HAの赤血球凝集価の測定は、以下
の如きMasry（J.Gen.Microbiol.7，p201−210，
1952年）の改良法によつて行なつた。即ち、マイ
クロタイター用Ｖプレートを用い、２倍ずつ希釈
したサンプル液0.05mlに、等量の固定ニワトリ血
球（0.6％）を混合し、良く撹拌し室温にて１時
間放置後、完全に赤血球が凝集したものの最大希
釈倍数を、赤血球凝集価とした。 第１図から、従来Ｆ―HAの産生には不適とさ
れていた振とう培養においても、本発明の培地を
用いれば、48時間後の赤血球凝集価が、Meβ―
CDが無添加の場合は2⁵になり、Meβ―CDを添加
した場合には2⁹にもなつていることがわかる。な
お、静地培養の場合には、約120時間後に2⁹程度
になり、本発明の方法が工業的実施に優れてい
る。 実施例 ２ 実施例１と同じ改良SSB培地に、各種シクロデ
キストリン又はその誘導体を１ｇ／添加した培
地を用いて、それぞれに百日ぜきＩ相菌東浜株を
1.0×10⁹個／mlとなるように接種し、35℃で振と
う培養を行なつた。培養48時間目と72時間目に、
培養物中に生成したＦ―HAの量（凝集価）は、
第１表に示した通りであつた。

【表】 第１表より、シクロデキストリンよりもメチル
化誘導体の方が優れており、その中でも特に
Meβ―CDが有効なことがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において、百日ぜき菌の培養
物中に生成するＦ―HAの量（赤血球凝集価）と
培養時間の関係を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 百日咳菌を、カザミノ酸を0.1〜20ｇ／、
   アスコルビン酸を0.01〜１ｇ／及びグルタチオ
   ンを0.1〜５ｇ／含有する培地で培養し、培養
   物から繊維状赤血球凝集素を採取することを特徴
   とする繊維状赤血球凝集素の製法。 ２ 培地に、カザミノ酸、アスコルビン酸，グル
   タチオン以外に、シクロデキストリン又はその誘
   導体が0.001〜５ｇ／含有されていることを特
   徴とする、特許請求の範囲第１項記載の繊維状赤
   血球凝集素の製法。