JPS59181222A - 百日ぜき菌の感染防御抗原ｈａ画分の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

不発明は、百日ぜき菌（ＺＪ感染防御抗原Ｉ（Ａ画分（
Ｆ　−Ｉ−Ｉ　Ａ　：　Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　Ｈｅ
ｍａｇｇｌｕｔ　１ｎｉｎおよびＬ　Ｐ　Ｆ　−ＨＡ　
：　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｓ　ｉｓ−ｐｒｏｍｏｔ　ｉｎ
ｇＦａｃｒｏｒ　Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎを含んた
画分〕の製造方法、さらに詳しく　ｈｘ、百日ぜき画を
シクロデキヌトリンまたはその誘導体を添カロし１こ液
状培地にて通気攪拌培養するに際し、培養帰席および溶
存酸素量を特定範囲に制御しかつ消泡条件下で行なうこ
とにより百日ぜき菌０Ｊ感染防御抗原ＨＡ画分を大量に
製造する方法に関する。 産業上の利用分野 百日ぜきは我が国でＣＳ届出伝染病に指定されており、
乳児〜幼児に多発する公衆衛生上重要な感染症である。 とくに乳児では重症経過をたどることが多く１時には死
亡例もみられゐ。この疾病は古くからワクチンによゐ予
防が効果的であることが知られτおり、原因菌である百
日ぜき菌工相菌の全菌体の不活性ワクチンが広く用いら
れていた。 しかし−このような菌体不活化ワクチンは副作用力弓ｎ
・く、そのため−開期にはワクチンの接種か中止、され
てい１こ。その−万、百日ぜきシこよる乳幼児の疾病は
大きな問題となっており、副作用のないワクチンの製造
が熱望されていた。 従来技術 先に、佐原らは感染防御抗原に関する基礎的研究をもと
にして画期的なコンポーネントワクチンである沈降百日
ぜき精製ワクチン０：）製造に成功した（持分１１イｉ
ｉ　５７−５２０３号を参照）。このワクチンはｘ；−
ｏＡおよびＬ　ｌ）Ｆ　−１−Ｉ　Ａを含んだＨＡｌｌ
ｊｊｉ分を主な感染防御抗原とし、制作）ｂをほとんど
示すことなく優れた予防効毀をイ１すゐものであってす
でに実用化されている。 この実用化されているワクチン（／Ｊ製造Ｆこは、百日
ぜき■相菌を適当な培地に接種し、３５℃前後で５日間
静置培養し、培養液を遠心し、その上清に硫酸アンモニ
ウムを約５０％飽オ旧こな’ｂｅＫう↓こ加えるかアル
コール添扉し、生じた沈殿を１０．ＯＱＱｒｐｍ、３０
分間遠心して分離し、この沈殿を塩化す）　ＩＪウム添
加緩価液にて抽出し、その抽出画分を常法によりシヨ糖
密度勾耐遠心にかけて百日ぜきＨＡＡ画分回収し、ホル
マリンで無毒化処理してワクチンとしており、所望によ
りこれにシフテリアトギンイド、破傷風トキイソドを加
え、さらに必要番こよりアルミニウムアジュバント処理
し、ゼラチン、グルコーヌなどの安定剤を添力［化で沈
降精製百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンとし
ている。 しかしながら、この方法ではとくに培養に難点があり、
大規模な培養が不可能でワクチンの弗産が困難である。 すなわち、この公知の沈降百日せき精製ワクチンの製造
法では、ルー瓶などの小容器に液状培地を１００〜ａ　
ＯＯＩＩｔ程度入れて横臥位置で３５℃前後にて５日間
静置培養するもので、きわめて小規模でかつ長期間を要
する。一般に微生物の犬昂培養番こは液状培地による攪
拌培養方式が採用されることが多い。百日ぜき菌は液状
培地による振壷培養を行なうと菌自身の増殖はある程度
までは達成されるが、たとえばＨＡ画分の産生はきわめ
て低いといわれている（　Ａｒａ　ｉ、　ＩＩ−Ｌ　＆
Ｍｕｎｏｚ、　Ｊ、　Ｊ、　、　１ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ
ｍｕｎ、　２５＋　７６４−７６７゜、１９７９を参ｇ
）。このことは狛＝ｌ製ワクチンの構成成分の少なくと
も一方は資産し煎いことを示唆するものである。したか
つ了、この佐原らの百日せきワクチンは画期的なワクチ
ンであ６がその製造１こは小規模で長時間を要する静１
簡培＠に頼らさるを得す、その製法の改良が熱望されて
いる。 最近、銘木らは百日ぜきＩ相菌の増殖を促進しかつＬ　
Ｐ　Ｆ　−ＨＡの産生を促進しうる添加物の検索をＫみ
−　ンクロデキヌトリンおよびその誘導体、とく番こメ
チル化β−シクロデギヌトリン（２，６−ジ（０−メチ
ル）−β−シクロテキストリン、以下メヂル化β−ＣＤ
と略称する）の添刀口が百日ぜき■相菌のヌテイナーシ
ョルテ液体培地＋５ｔａｉｎｅｒ。 Ｄ、　Ｗ、　＆５ｃｈｏｌｔｅ、　Ｍ、　Ｊ、　；、Ｊ
、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。 邦、２１．１−２２０．１９７１を参照）を用いた攪拌
培養における菌増殖およびＬＰＦ−ＨＡ産生を促進する
こと、さらに培養液中でのＬＰＦ−ＨＡの安定性にも富
力することを報告している（銘木ら、第２９回毒素シン
ポジウム予稿集、１〜５．１９８２を参照）。 し刀）しながら、かかる方法を］（ｌあるいはそれ以上
のスケールの発酵槽を用いる工業的規模の百日ぜき菌の
感染防御抗原の製造に適用した場合シこは、従来の攪拌
培養にもとつく知見からは全く類推できない結果が得ら
れた。すなわち、攪拌条件を一定とする振盪培養や攪拌
培養系では菌数の増加は見られる場合もあるが、Ｌ　Ｐ
　Ｆ　−１−Ｉ　Ａの産生邦は充分でないことを知った
のである。 またーＷＨＯ）１９７７年刊行の資料（Ｍａｎｕａｌｆ
ｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎ
ｔｒｏｌ　ｏｆ　ｖａｃｃｉ−ｎｃ−Ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ　ｖａｃｃｉｎｅ−Ｗｌ−１０を参照）によれば、白
日せきワクチンの製法に関して発酵槽を用いた百日せき
菌の大量培養について記載されており、空気を上方から
の表面油気≦こよりあるいはグリッドを曲して培地中に
入れ、特殊な羽根で攪拌して培養液内ｌこ巻込む方式で
、一定の通気攪拌によって６日せき菌菌体を得ることが
できるとしている。し刀）しながら、不発明者らは、ス
テイナー・ショルテ培地あるいは後述のその改良培地１
゜ｌの培養規模においてＷｌｌ、０の記述に準し、把１
底からの血気団を０２ｖＶＭ（空気流計Ｉｌ）／培地容
量（１）／時間ｃ分））、羽根の回転数を５００あるい
は５ＱＱｒｐｍＯＪ一定とじ−いわゆる槽底７１）らの
一定ｊ■１気攪拌培養系につぃて検削を力１］えｆこと
ころ、［Ａ１数の増加は期待できるが一百日せき保１０
Ａ　ｉｉ＋＋、ｉりｊの産生は不充分てあり、到底、精
製白Ｆ）せきワクチンの工業的生産Ｉこは適さないこと
を知つ１こ。 そこで、不発明者らは、大規模な培養装置、とくに１口
」常の醗酵槽を用いた通気攪拌培養においても菌の増殖
とともに所望のＩ−Ｉ　Ａ画分の犬励生産

【こ適した培
養条件を見い出すべく種々研究を重ねた結果、ある範囲
の培養温度において溶存酸素伶（以下、ＤＯと略記する
ことがあゐ）を特定の範囲に制御しかつ消泡処理をしな
がら、さらに望ましくは、ｐ　Ｉ−１の制御条件下にこ
培養−１＝ことにより、大規模な培養、とくに通常の醗
酵槽を用いた通気攪拌培養においても、百日ぜき菌の著
しい増殖とともに、百日ぜき菌ＨＡ画分子？著しく増大
しうろことを見い出し、不発明を完成すねに至った。 不発明によれば、百日ぜき菌をシクロテキストリンまた
はその誘導体を添加した液状培地に接種し、消泡処′ｆ
ｉＪｊＬながニ、Ｊ＠養温尺２０〜３７℃において溶存
酸夛指を０７〜５．　Ｑ　１）ｐＨｌの範囲に保ち、さ
らに望ましくはｐ　ｉｌをたとえは６０〜９０にて通気
攪拌培養し、対数増殖期ないし定常期の菌発育段階で感
染防御抗原ＨＡ画分を採取することにより、所望の百日
せき菌の感染防御抗原１−Ｉ　Ａ画分を工業的規模にて
用度される。 不発明で小いられる百日ぜき菌株としては、通常ワクチ
ン株として知られているものであればいスｔ＋、　テモ
よく、一般４こそのＩ相菌のボルデ・ジャング槁地、賂
代菌あるいは振保培養菌が用いられ、これを種菌として
液状培地に接種する。なお、百日ぜき菌ｉｔ相菌も適用
することができる。接種係はとくｌこ限定されないが、
通常、最終濃度が０．２〜Ｉ　Ｑ　ｌ０ＬＪ／ｇ！’　
＋　ＩＯＵ：　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｏｐａｃ
ｉｔｙｕｎｉｔ、生物学的製剤基準−２３８，１９７９
，厚生省を参照）、好ましくは約１．０　Ｉ　ＯＴＪ　
／　ｍｒｔとなる程度であめ。 ｌｆ＆私培地としては公知σノいずれの培地も用いられ
るが、好ましくはステイナー・ショルテ培地、とくに好
ましくは、該ステイナー・ショルテ培地を基本とし、こ
れにカザミノ酸を０１〜２０９／Ｅ添加し、アヌコルビ
ンａ’ｃ　０．０１〜１９／ｌ、クルタチオンを０１〜
５９／ｌの範囲に調整したステイナー・ショルテ改良培
地（以下、岸に改良培地という）が用いられる。 培地シこ添加されるシクロテキストリンまたはその誘導
体と主では、前記メチル［ヒβ−ＣＤのほか、上を併用
して用いられる。これらのうち、メチル化β−ＣＤがも
つとも良好な添加効果を示す。その添加励はとくに限定
されないが、通常、０，００１〜５ｇ／ｉ−好ま′シ＜
は約０．５〜２．５ｆｌ／ｌである。 不発明者らは百日ぜき菌の大規模培養における菌増殖、
Ｆ−ＨＡおよびＬ　Ｐ　］”　−１−Ｉ　Ａ産生勘の増
大には培養温度ならびにＤＯの制御が大きな要因となる
ことを初めて認め、かつ消泡操作の有無さらには培地の
ｐＨの制御も大きく影響することを明らかシこした。こ
れらの成績について以下説明する。 培養温度については、百日せき菌■相菌東兵株をボルデ
・ジャング培地で親・伏したものを種菌とし、メチル化
β−ＣＤ１、Ｏｆｔ／ｌを雄刃ｕした改良培Ｊ：Ｉｋ　
１０　ｍｌ−こ０．２１０１Ｊ／ｍ１Ｋｆ（ルヨウ４Ｃ
接種し、温度勾配培養装置ＴＮ１　］　２Ｄ　Ｃ東洋科
学産業製）を用い、培養温度を１７℃から４２℃の範囲
で振盪速度６０回／分にて４８時曲振帰培養して至適範
ＵＢｌを調べた。増殖した菌数は光電比色計コールマン
ジュニア６Ｄ型（コールマン社製）を用い、０Ｄ６５０
１こお４ｊる測定値から換算して求めた。 なお、この実験は実験室的小蜆模にて振盪培養で行なっ
たが、培養温度に関しては大規模な通ヌ攪拌培養でも同
傾向を示す。 その結果を第１図に示したが、菌の増殖は２０〜３７℃
の範囲が望ましく、より好ましくは２３〜３７℃であっ
た。 培地の溶存酸素ｆｉ　（ＤＯ）　１１０．７〜６．０　
ＰＩ）Ｉ＆好ましくは１０〜５．５ｐｐｍの範囲に保持
される。 この範囲内に制御することにより、百日ぜき菌の増殖が
増大するとともに、所望のＬ　ｌ）　Ｆ　−１４Ａおよ
びＦ　−Ｔ−Ｉ　Ａの産学も著しく増大する。 なお、ＤＯ動制御は通気量と攪拌速度の制御を糾合ぜて
イ１なうのがもっともよく、通気ｍと攪拌速度Ｃゴとく
に限定されないが、通常の通気攪拌槽を用いた場合には
、空気の通気量は３ＶＶＭ以下、通常０．１〜２ｖｖｍ
、好ましくはＱ、１〜ｌ、５ＶＶＭの範囲であり、攪拌
速度は６ＱＱｒｐｍ以下、通常５０〜３５　Ｑ　ｒ　ｐ
　ｔｎ、好ましくは１００〜２５Ｑｒｐｍの範囲である
。ただし、純酸素を併片する場合は通気量あるいは攪拌
速度は減することができる。 また、消泡操作の有無によっても培養液中の菌数増ｍお
よびＦ−８１，Ｌ　Ｐ　Ｆ−１１Ａｉノ収率が大きく影
響され、後述の実施例１と同様の実験条件で培養した場
合、消泡を行わないときには泡にイ」着した菌体がその
まま槽壁番こ累積されたり、排気ノズルから流出された
りして培養液中の両舷、Ｆ　−ＩＩ　ＡおよびＬ　Ｐ　
Ｆ　−Ｉ−Ｉ　Ａ　＠ともｌＣ数〜８０％程度の減弱が
認められた。なお、消泡は機械的消泡と化学的消泡剤の
いずれも適用され−例えば［［（１消泡用装置を用いる
か−あるいは通常のエステル△ 一゛−゛゛ 系、シリコン系、アルコール糸などの化学的消泡剤を用
いることができる。なお、培養液力）らのＨＡ画分の採
取、精製等の点からは機械的消泡手段を用いるのがより
好ましい。 培地１）　）ｉの至適範囲を知るため、ｐ　Ｉ−１を種
々に変えて歯の増殖を調べた。Ｉ）０を２．５ｐｐｍと
一定りこした以外は後述の実施例１と同様の実験条件で
培養した。ｐＨ６，０〜９．０の範囲ではいずれも菌増
殖は達せられ、ＰＨ６，５〜８．５、とくにｐＨ６，８
〜７．５の範囲では菌増殖速度が若干増大することが認
められた。 不発明番こよる培養温度、溶存酸素量さらには消泡−’
ｐＩ−１などの制御は自動制御おまひ手動制御のいずれ
も採用される。 また、目的とするＨＡ画分を高収率で得るには閑の培養
状態のチェックが重要であり、対数増殖期から転換期を
経て定常期番こ至るまでの菌発育段階において採取する
のがもっとも望ましく、それは接種角によって変るが一
通常、７〜４０時間番こ相当し−例えば−１，０１ｏｕ
／　ｍｔの接種菌量の埴１合には通常２４〜３５時間で
ある。 大施忽 つきに実施例を挙げて不発明をさら番こ具体的に説明す
るが不発明はこれらに限定されない。 実施例１ ５０１の醗酵槽（丸菱理化Ｃ株）製）に、下記第１表に
示す組成を有する改良培地にメチル化β−ＣＤを最終濃
度１．Ｏｆ／／ｌになるよう番こ添加した培地３５１を
加え、百日ぜき菌Ｔ相菌を１．０ＩＯＵ／ｍｌ！の量で
接種し、ヌパージャーによる槽底力）らの通気攪拌培養
系でＤＯの制御範囲を種々変え、温度３５℃、ＰＩ−Ｉ
７，２に制御し、消泡手段として機械的消泡を用い−そ
ねそれ２４時間培養を行なった。 第】表 ※）基礎培地は１２１℃、３０分間高圧滅菌し、補液は
濾過滅菌し、使用前に両者を混合しで用いる。 得られた培養液について、先と同様にして菌数を測定し
、葦たＦ−ＨＡを血球凝集試験（Ｓａｔｏ。 Ｙ、ｅ

【、ａｌ、　　Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉ＋ｎｍｕｎ
、ヱ、　　９２９〜９９９．１９７３を参照］により測
定、Ｌ　Ｐ　Ｆ　−ＨＡ７２１ｎＶｉｔｒＯテハｔ−ｉ
ｐ　−Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ法（佐原ら、第２８回毒素シ
ンポジウム予稿集、１４１〜］４４．１９８１を参照）
による単位（Ｌ　Ｐ’Ｅ　ｕ　／　ｙ（ｌと略記すル）
全測定し、ｉｎ　ｖｉｖｏ　　でＨ；Ｈｄｄ／Ｙマウス
（４週令、雌）を用いＬ　Ｐ　Ｆ　−Ｉ−Ｉ　Ａ静注３
日後の白血球数をカウントする方法（銘木ら、第２９回
毒素シンポジウム予稿集、１〜５−１９８２７？参照〕
によって測定した。その結果を第２図に示す。 第２図力）ら明らかなように、菌増殖ならび【こ■」Ａ
画分の高単位の産生が見らねるのＣ：１ＬＤＯが０７〜
６０ＰＰｍであり、Ｄ　０１．０−５．５　ｐ　ｌ）　
ｍではとくに良好な結果が伜られた。 比較例１〜１０および実施例２〜５ 培養条件を種々力・えて面目せきｉＨＡ画分の産生用を
比較検討し１こ。すなわち−従来の通気攪拌、　を一定
とすめ方法と不発明に基づく通気攪拌を連結ｌ的に変化
させる方法について比較し１こ。 １４１０Ｌ曲気攪拌培養装置（ＮＢＳ社辺）ｌこ、実施
例】で用いたものと同じメチル化β−ＣＤを最終濃度１
．０９／ｌ添加した改良培地１（ｌを力１え、百日ぜき
菌■相Ｍをｌ、Ｑ　ｌ０ＬＪ／渭ｌＯＪ量で接柚し、ヌ
バージＡ１−６ζよゐ檜底力）らの通免輩拌培養糸で、
ガ・、２表番こ示す県外下に、すべで３５℃で３６時間
培養した・ 通気攪拌を一定とじ消泡処理を行なわない培養は第２表
中の比較例１〜５，７および８である。 そＱ」中では比較例５σ、ｌＱＱｒｌ）ｍてＱ、５ｒｒ
ｍという条件がＩ−Ｉ　Ａ画分の産生用は良好であつ１
こ。 しカ・しなか函、その場合においても培養１０時曲まで
はある程度の対数増殖（約Ｉ　Ｑ　ｌ０ＬＪ／ｓ＋／　
）を示しｆコが、その後急激に増殖速度が減じ３６時間
後においても約１５１０Ｕ、’＋ｔにとどまり、ｌ−Ｉ
　Ａ画分産生量Ｃまｌ”　−ＨＡが１６．Ｉ−ＩＡ／河
１．Ｉ−Ｐ　Ｆ　−１−ＩＡが１．０　Ｑ　ＩＯＵ／ｍ
ｔできわめて低く、４８時間後まで培養を続け１こ場合
においでもほとんど増却しな力）つた。 マタ、Ｑ２ｖｖｍで通気し、攪拌ｆ　５００　ｒＰｍあ
るいは６００ｒＰｍの一定とし一消泡処理をしない培養
系は一比較例７，８であるが、いずれの場合も培養後５
〜１０時間で、激しい発泡のため番こ菌体が槽壁上部に
付着するか培養Ｋｌが槽外へ流失し、それを３６時間後
にすべて回収混合した場合においてもＨＡ画分餉はきわ
めて低かった。 Ｄｏを制御するが消泡処理を行なわない培養系の比較例
１０においても、同様の培養液の流失や菌体の槽壁への
伺着がおこり、Ｉ−Ｉ　Ａ画分］は低７１１）つた。 通気攪拌を一定とし、かつ消泡処理を行なう培養系は比
較例６および９であゐ。いずれの場合も、培養初期（７
Ｊ　Ｄ　ＯがＨＡ画分産生にとって不適当な６、ＯＰＰ
ｍ以上にあり、培養の進行に伴ないＤＯは連続的に下降
しつづけ３６時間以前シこ菌増殖およびＨＡ産生に不適
当な０、’７ｐｐｍ以下の杖態に達してい１こ。不発明
の方法を一部加味して化学的消泡処理を行なった比較例
９ては、３６時間培養後において３　Ｑ　１．ＯｔＪ／
河ｔｌこ達しｆこが、Ｆ　−ＨＡは１２８１−ＩＡ／耐
、Ｌ　Ｐ　Ｆ、−Ｉ−Ｉ　Ａは５ＱＱＬＰＥＵ／　ｍｅ
程度であった。 １５、培養液中のＤＯをＤＯコンＹローラー（ＮＢＳ社
製）を用いて自動的に連続的に通気量あるいは攪拌速度
を変化させて、１．６〜８．５ｐｐｍとなるように制御
し７：ｌ）つ消泡処理をしながら培養を行なったものが
実施例２〜５であるが、それらは培養１０時間後におい
ても対数増殖を維持し、最終的には３６時間できわめて
高い菌数、Ｆ〒ＨＡｌおよびＬＰＦ−ＨＡｉを得ること
ができた。 なお、上方力）らの表面通気による方法では、ＨＡ画分
の産生は全く認められなかった。 こわらの成績から明らかなように一発酵槽を片いた通気
攪拌培養では＋　Ｄｏ非制御下においでは消泡処理をし
た場合に菌増、殖は認められるが、それらの例ではＦ　
−ＨＡおよびＩ−Ｐ　Ｆ　−１４Ａはいずれも産４１＝
　ｆｆｉが低いことがわかった。一方、ＤＯ制御下で行
った場合には菌増殖のみならずＦ　−ＨＡ量およびＬＰ
Ｆ−ＨＡｉともに著しく増大した。 このように発酵槽を用いた通気攪拌培養では、ＤＯ制御
によって菌増殖は勿論、目的とする百日ぜき菌ＩＩＡ産
生廻の著しい増大が図れることが判明し１こ。 比較例１１ｆｉらびに実施例６および７上述のように、
本発明による特定の条件制御下に培養することにより目
的とする百日ぜき菌ＨＡ画分の大量産生が達成されるが
、これを従来公知の静置培養における場合と比較すると
第３表に示すとおりである。なお、表番こ示す各培養の
条件は下記のとおりである。たたし、菌接種量と培養温
度はそれぞれ１．Ｑ　ＩＯＵ／、４、および３５℃で共
通とした。 （Ｎ静置培養（比較例１１） 培養容器ニル−瓶、１．５１！容 培地：実施例工で用いたものと同じ改良培地０゜１ 培養時間：１２０時１１’ｔｌ （至）制御培養（不発明の方法）〔実施例６および７） 培養容器：　ａｏｏｌ容醗醇槽（丸菱理化製）培地：実
施例１で用いたものと同じ改良培地、２００１；メチル
化β−ＣＤ（実施例６）葦たはメチル化α−ＣＤ（実施
例７）１−．０９／ｌを添加 Ｄｏ制御：２．２−２．４ｐｐｍ 消泡：機械的消泡手段（回転ディヌク方式番こよる） ｐ　Ｉ−１制御：ＰＩ（７，３ 培養時間：３５時間 上記結果を第３表に示す。 第３表 第３表の結果からも明らかなように、不発明方法によれ
ば従来静置法に比べて菌増殖およびＬＰＦ−ＨＡ量とも
に著しく増大しており、Ｆ　−ＨＡ量は同等力）それ以
上で、例えば菌数は２〜３倍、ＬＰＦ−ＨＡ量は１０倍
以上増大し一培養時間は１２０時間から３５時間へと大
幅に短縮されている。 なお、実施例６および７におけるＤｏ制御下での培養の
場合Ｑノ菌数、Ｆ　−ＨＡ量およびＬＰＦ−Ｉ−Ｉ　Ａ
量の経時的な推移を第３図（Ｉ）および（９）、第４図
（Ｉ）および＠）にそわ、ぞれ示した。これらの図力）
らも明ら力１なように、本発明によるＤＯ制御下に培養
した場合には菌数の増大とともにＦ−ＨＡ量およびＬＰ
Ｆ−ＨＡｉも著しく増大される。

【図面の簡単な説明】

第１図は百日ぜき菌の増殖と培養温度の関係を示すグラ
フ、第２図は培養液中のＤＯ制御範囲と２４時間培養後
の菌数、Ｆ　−１−Ｉ　Ａ量およびＬ　Ｐ　Ｉ”−ＨＡ
量を示すグラフ、第３（２）（Ｉ）および（ＩＩ）なら
びに第４図（■）オよび（ＴＪ）ｉｊＤＯ２，２〜２゜
４ｐｐｍの制御下に培養した場合の菌数、Ｆ−ＨＡ量お
よびＬｐ　ｒ；　−ＨＡ量の経時的な推移を示すグラフ
である。 代　理　人　弁理士　青　山　　葆　　ほか１名手続補
正書（，６゜ 昭和５８年６月１３日 特許庁長官　殿 １事件の表示 昭和５８年特許願第　０５４６８０　　　号２発明の名
称 百日ぜき菌の感染防御抗原ＨＡ画分の製造方法３補正を
する者 事件との関係　特許出願人 住所　熊本県熊本市清水町太窪６６８番地名称　財団法
人化学及血清療法研究所 （ほか１名） ４代理人 ５補正命令の日付　　自発 ６補正の対象 ７補正の内容 （Ｉ＋明細書第１〜２頁の特許請求の範囲を別紙のとお
り補正する。 （社）明細書の「発明の詳細な説明」の下記箇所を補正
する。 （１）３頁７行：　「工相菌ｊｆｆｉｒ■相菌」と補正
。 （２ｊ５頁８行：　ＦＨＡＨＡ画分「Ｆ−ＨＡ画分」と
補正。 （３ｊ１２頁３行：　［ｖ　ｖｒｔＪ　ｆ　［ＶＶＭＪ
　色補正。 （４＋１３頁６および９行：「爾」を「菌」と補正。 （５）１５頁第１表中１０行：トリスヒドロギシメチル
アミノメタンの含量「１．５２５ｊ　ｔ　ｒ６．１００
」と補正。 （６１１５頁第１表中の末イ１：　「グルタチオン」を
「グルタチオン」と補正。 （７）１６頁下炉ら３イ１：　「６０１）■朋」を「６
．０ｐｐｍＪと補正。 （８１１８頁７行：「培養後５〜１０時間」を「培養５
〜１０時間」と補正。 （９）２１頁下から５行二「歯」全１菌」と補正。 叫２４頁１１行：「冊」を「叩」と補正。 以上 補正した特許請求の範囲 ｔｌＪ百日ぜき菌をシクロデキストリンまたはその誘導
体を添加した液状培地に接種し、培養温度２０〜３７℃
で培地の溶存酸素量を０７〜６．　Ｑ　ｐｐｍの範囲に
保ちかつ消泡処理をしながら通気攪拌培養し、対数増殖
期ないし定常期の菌発育段階で感染防御抗原ＨＡ画分を
採取することを特徴とする百日ぜき菌の感染防御抗原Ｈ
Ａ画分の製造方法。 （２〕液状培地がカザミノ酸を０１〜２０９／ｌ、アス
コルビン酸’ｋｏ、０１〜ｌｆｊ／ｌ、グルタチオンを
０１〜５０Ｆ／／およびシクロデキストリンまたはその
誘導体を０．００１〜５７／ｌ含有している前記第（１
）項の方法。 ｔ３１シクロデキストリンまたはその誘導体がメチル化
α−シクロデキストリン、メチル化β−シクロデキスト
リン、メチル化γ−シクロテキストリン、α−シクロデ
キストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロ
デキストリンから選ばれ乙り種または２種以上である前
記第（１ｊ項の方法。 （４２培養時間ｆニア〜４０時間とする前記第（１３項
の方法。 （５ン消泡処理が、機械的消泡手段、化学的消泡剤の添
７ＪＦＪまたはそれらの組合わせによる前記第（１〕項
の方法。 （６）ｐｌ’ｌが６０〜９０の範囲である前記第（１１
項の方法。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）百日ぜき菌をシクロデキヌトリンまたはその誘導
   体を添ｍ［−だ液状培地番こ接種し、培養温度２０〜３
   ７℃で培地の溶存酸素量を０７〜６．０ｐｐｍの範囲に
   保ちかつ消泡処理をしながら通気攪拌培養し一対数増殖
   期ないし定常期の菌発育段階で感染防制抗原ＨＡ画分を
   採取することを特徴とする白日ぜき菌の感染防御抗原Ｉ
   −Ｉ　Ａ画分の製造方法。
2. （２）液状培地がカザミノ酸ｒａ−（１，１〜２０ｇ／
   ｌ、アヌコルビン酸を０．０ｊ〜３９／ｌ、グルタチオ
   ンを０１〜５０ｇ／ｌおよびシクロテキヌトリンまたは
   その誘導体−￥−０，００１〜５Ｆ！／ｌ含有している
   前記第（１）項の方法。
3. （３）ンクロデキヌトリンまｆこはその誘”Ｊ　体力Ｊ
   　４−ル化α−シクロテキストリンーメチル化α−シク
   ロテキヌトリン、メチル化ｒ−シクロテキヌトリン、α
   −シクロテセストリン、β−シクロテキヌトリンおよび
   γ−シクロデキヌＩ−リンから選ハれる１種または２種
   以上である前訃硼１第（］）項の方法。
4. （４）培養時間を７〜４０時ｍｌとすめ前記第（１）項
   の方法。
5. （５）消泡処理が、機わＩり的消泡手段、化学的消泡剤
   の添加またはそれらの組合わせにまる前記第（］）項の
   方法。
6. （６）ｐＨが６．０〜９０の範囲である前記第（１）項
   の方法。