SU1447266A3 - Способ получени фракции НА, содержащей защитный антиген ВоRDетеLLа реRтUSSIS - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицинской промьйшенности и может быть использовано при получении коклюшной вакцины. Цель изобретени  - интенсификаци  способа. Дл  получени  -- фракции НА Bordetella pertu ssis культуру в одной фазе выращивают в .жидкой питательной среде известного состава , в которую дополнительно ввод т метилированный или /з-циклодекстрин в концентрации 1-10 г/л. При необходимости дл  стимул ции роста в среду ввод т 0,1-20 г/л казаминокислот, 0,01-1 г/л аскорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л глютатиона. Процесс культивировани  ведут при 20-31°С в услови х аэрации и перемешивани , обеспечивающих концентрацию кислорода 1,0-5,5 ррт и пеногашение. Отбор культуральной жидкости дл  выделени  целевого продукта осуществл ют на стадии от -логарифмической фазы роста до статической, 4 табл. О)

Description

:&

Ч ГО

О) Од

ы

Изобретение относитс  к медицинсой промьппленности и может быть исользовано при получении коклюшной вакцины.g

Цель изобретени  - интенсификаци  способа.

Пример 1. В ферментер объемом 50 л загружают 35 л модифицированной питательной среды, to содержащей глутамат натри 

10,72 г/л, 1-пролин 0,240 г/л, фосфат кали  0,5 г/л, хлорид кали  0,2 г/л, хлорид магни  0,1 г/л, хлорид кальци  0,02 г/л, трисгидро- IS ксиметиламинометан 6,1 г/л, казами- нокислоты 10,0 г/л, рН 7,3 (основна  среда). Стерилизуют при 121®С в течение 30 мин.

Отдельно готов т дополнительную идкость, содержащую 1-цистеин гидрохлорид 0,04 г/л, сульфат железа 0,01 г/л, аскорбиновую кислоту , / 0,4 г/л, ниацин 0,004 г/л, глюта- jc тион (восстановленный тип) 0,15 г/л. Эту среду стерилизуют с помощью мембранной фильтрации. Основную и дополнительную среды смешивают перед использованием. Стерильньй метили- рованньш /i-циклодекстрин добавл ют в конечной концентрации 1,0 г/л.

После инокулировани  В.pertussis 1 фазы в количестве 1-10 микр.тел среду культивируют при аэрации через дно реактора с помощью барботера с 35 механическим обеспечиванием при 35°С, рН 7,2, в течение 24 ч при различном количестве растворенного кислорода (до).

Повышенный рост микроорганизмов и интенсивное продуцирование фракции НА наблюдаетс  в диапазоне до 0,7-6,0 ррт, особенно при 1,0-5,5ррт.

К культуральной жидкости или к жидкой фазе культуральной жидкости добавл ют сульфат аммони  до степени 1/3 насьпцени . Осадок отдел ют центрифугированием или фильтрованием. Осадок раствор ют в фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 1 моль NaCl. К раствору добавл ют сульфат аммони  до степени 1/2 насыщени , осадок отдел ют центрифугированием или фильтрованием , диализуют против фосфатного буфера. Полученньй раствор ультра- центрифугируют, верхний слой жидкости центрифугируют в градиенте плотности сахарозы и отдел ют верх30

40

45

50

c

5

0

0

5

0

НИИ слой жидкости (фракции НА В.pertussis ). Вьц еление осуществл ют предпочтительно при и ниже. Полученна  фракци  НА содержит большое количество LPF-HA и F-HA.

Фракцию НА разбавл ют солевым раствором до 2-3-кратного разбавлени  и добавл ют формалин в концентрации от 0,1 до 1,2 об.%. Смесь обрабатывают при 20-43 С в течение 3-60 дней., LPF активность и активность HSF (гис- тамин-чувствительный фактор) уменьшаютс  и получают нетоксичную фрак- .

В сравнительньк примерах 1-10 и примерах 2-5 провод т сравнение по- .лучени  фракции НА В.pertussis; в различных услови х культивировани  (при посто нной аэрации и скорости перемешивани  и при переменной аэрации и перемешивании).

В ферментер емкостью 14 л загружс- ют 10 л среды (по примеру 1) и иноку лируют культуру в количестве 1 «10® микр.тел/мл. Культивируют при аэрации и перемешивании при в течение 36 ч.

Вли ние условий аэрации и перемешивани  на интенсивность роста куль- туры В.pertussis 1 фазы и выход целевого продукта представлены в табл.1,

В сравнительных примерах 1-5,7 и 8 культивирование осуществл ют при посто нных аэрации и перемешивании без пеногашени  и в этом р ду примеров услови  культивировани  в сравнительном примере 5 (скорость перемешивани  100 об/мин, аэраци  - 0,5 УУМ) привод т к хорошему продуцированию фракции НА. Однако скорость роста быстро уменьшаетс  и после 36 ч культивировани  концентраци  клеток не превышает 15-109 микр.тел/мл.

В сравнительных примерах 7 и 8 культивирование, осуществл ют при посто нной скорости перемешивани  500 или 600 об/мин при скорости аэра- ции 0,2 WM без пеногашени . После 5-10 ч выращивани  клетки либо прилипают к верхней стенке реактора, либо культура выбрасываетс  из реактора за счет сильного пенообразова- ни , продуцирование НА-фракции низкое .

В сравнительном примере 10 культивирование осуществл ют при контро

лировании ДО, но без пеногашени . В этом случае также продуцирование НА-фракции очень низкое из-за адгезии клеток и их выброса с пеной.

В сравнительных примерах 6-9 культивирование осуществл ют при посто нной скорости аэрации и перемешивании с пеногашением. Во всех случа х, в которых количество ДО на начальной стадии культивировани  больше 6,0 рр услови , пригодные дл  продуцировани  фракции НА, не обеспечивались. С интенсификацией роста культура ДО уменьшаетс  и через 36 ч его уровень снижаетс  до 0,7 ррт, что неблагопри тно вли ет на размножение клеток и продуцирование фракции НА.

Б сравнительном примере 9, где осуществл ют пеногашение с помощью химических веществ, через 36 ч концентраци  клеток достигает О 80 -10 микр.тел/мл, но количества F-Ha и LPF-HA составл ет 128 НА/мл и 500 LPE ед./мл соответственно,

В примерах 2-5 культивирование осуществл ют при контролировании ДО в диапазоне 1,6-3,5 ррт с помощью автоматического и непрерывного контрол  аэрации и скорости перемешивани  до-контролером. После Ю ч микроорганизмы росли в логарифмической фазе и после 36 ч получены высокие урожаи клеток F-HA и LPF-HA.

Осуществление азрации с поверхности преп тствует продуцированию фракции НА,

В сравнительном примере 11 и примерах 6 и 7 провод т сравнительное культивирование по предлагаемому способу и в стандартных статических услови х. Количество инокул та 1 10 микр.тел/мл, температура 35 С,

Статическое культивирование (сравнительный пример 11). Реактор дл  культивировани  1,5 л; колба КОИХ; среда - модифицированна  (пример 1) в количестве 0,2 л, врем  инкубировани  120 ч.

Культивирование под контролем (примеры 6 и 7 по изобретению). Реактор дл  культивировани : ферментер емкостью 300 л, среда - модифицированна  (пример 1) 200 л, дополнительно содержаща  1 г/л метилированного |1-циклодекстрина (пример 6) и 1,0 г/ метилированного р-циклодекстрина (пример 7). до-контроль 2,2-2,4 ррт. Пеногашение механическое с помощью

15

ю

7266

вращающегос  диска. рН-контроль: рН 7,3 врем  инкубировани  35 ч.

Сравнительные данные по культивированию в различных услови х приведены в табл.2

Из табл.2 следует, что способ по.изобретению в 2-3 раза эффективнее статического культивировани  по концентрации клеток, в 10 и более раз - по уровню с/ PF-HA, врем  инкубации сокращаетс  до 35 ч.

Пример 8. Фракцию НА, полученную в примере 1, разбавл ют физиологическим раствором до уровн  концентрации протеина 30 мкг TCAPN/мл. К раствору добавл ют формалин в концентрации 0,6 или 1,0 об.% и смесь обрабатывают при 37

или 39 С в течение 5-21 дн , на стадии обработки формалином добавл ют аминокислоты (глицин, лизин, серин, метионин, цистеин, глютамат натри  или аспарагинова  кислота в концентрации 0,25 М или смесь глицири- на и серина в концентрации 0,15 М).

В течение обработки формалином аггрегируетс  осадок, а раствор ди- ализуют дл  удалени  формалина. Целевой- продукт контролируют на остаточную токсичность на мышах, а.после трехнедельного хранени  при 37°С - на обратимую токсичность.

Пример 9. Штамм Tohama фазы 1 В.pertussis культивируют в среде Bordet-gen-gengon, получают посевную культуру и используют ее дл  инокулировани  0,4л модифицированной среды (пример 1), котора  дополнительно содержит 10 мг/мл метилированного |Э-циклодекстрина, в двухлитровой колбе при конечной концентрации 10 микр.тел/мл.

Инкубацию осуществл ют при вращательном встр хивании при 200 об/мин и при в течение 18 ч дл  получени  посевной культуры.

Полученные культуры объедин ют и инокулируют в такую же среду, как

было описано, Б ферментер емкостью 300 л в количестве 1-10 микр.тел/млj культивируют в услови х аэрации и перемешивани .

Культивирование осуществл ют ри автоматическом контроле аэрации

и скорости перемешивани , поддержива  ДО в диапазоне 1,8-2,7 ррт. Температуру поддерживают на уровне 35°С, рН 7,2. Пепогашение осуществл«ют механически с помощью ротационного диска.

Через 35 ч культивировани  отбирают пробу культуральной жидкости и измер ют концентрацию клеток (210-Ю ьшкр.тел/ип), F-HA (1024 НЛ/мл) и LPr-HA (2400 LPE ед/мл Культуральную жидкость центрифугируют и отдел ют супернатант, К нему добавл ют сульфат аммони  до степени насыщени  1/3, образующийс  осадок отдел ют центрифугированием при 10000 об/ми1 в течгние 30 мин. Осадок раствор ют в буферном растворе (рИ 7,2), содержащем дополнительно 1 моль NaCl, и отдел ют нерастворек- ные вещества центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин, К полученному верхнему слою жидкости добавл ют сульфат аммони  до степени насыщени  1/2, Получающиес  осадки отдел ют центрифугированием по описанной методике и повторно раствор ют в буферном растворе, диализуют при 4°С и нерастворенные вещества отдел ют центрифугированием и отбрасывают . Раствор усиленно центрифугируют , супернатант центрифугируют в градиенте плотности, сахарозы 10-30% (39000 об/мин в течение 20 мин) и затем отдел ют фракции НА. Полученные фракции НА объедин ют и стерилизуют фильтрованием через мем- бранньт фильтр. Раствор, содержащий ИА-фракцию, разбавл ют буферным раствором до концентрации протеина 300 мкг ТСАР/мл. Все стадии обработ- . ки культуральной ЖРЩКОСТИ и очистки целевого продукта осуществл ют при

2-4°С. t

К полученной НА фракции добавл ют 0,6 об,% формалина, 0,05 об.% твина-80, 0,02 вес./об,% желатины и 0,25 М глицина и хран т смесь в течение 7 дней при 39°Ct Смесь после хранени  диализуют против фосфатного буфера рН 7,2, дополнительно содержащего 0,7 вес,/об.% NaClj и полу- (шнный раствор разбавл ют тем же буферным раствором до концентрации протеина 8 мкг ТСАР/мл. К разбавленной нетоксичной НА-фракции добавл ют гел гидроокиси алюмини  в количестве

5

0

5

0

5

0

5

0

fe

0,2 мг/мл (в расчете на алюминий), при этом НА-фракци  адсорбируетс  на геле, к которому добавл ют 0,01 вес./об.% тимерсола. Получают очищенную убитую адсорбированную коклюшную вакцину.

Результаты проверки вакцины представлены в табл.3.

Пример 10. К разбавленному раствору нетоксичной фракции НА (пример 9) добавл ют дифтерийньш ток- соид (33 Lf/кл) и CTojiон чный ток- соид (5 Lf/мл), к смесз- добавл  от гель гидроокиси алюмини  (0,2мг/мл в расчете на алюминий) дл  получени  адсорбированной тривакцины К смеси добавл ют 0,02 вес./об,% желатины и 0,1 вес./об.% глюкозы дл  стабилизации препарата, а также 0,01 вес./об., тимерсала в качестве фиксатора.

Свойства полученной тривакцины представлены в табл.4,

Таким образом, использование предлагаемого способа позвол ет интенсифицировать процесс получени  коклюшного антигена, используемого дл  приготовлени  моно- и тривакцины (АКДС-вакцины).

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  фракции НА,, содержащей защитный антиген Bordetella pertussis, включающий культивирование штамма Bordetella pertussis; в 1 фазе в жидкой среде в присутствии 1-10 г/л метилированного. о(-цикло- декстрина или метилированного /1 -цик- лодекстрина и при необходимости 0,1- 20 г/л казаминокислот, г/л аскорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л глютатиона в услови х перемешивани  при 20-37 С и отбор полученной НА фракции из культуральной среды на стадии от логарифмической фазы роста до статической фазы роста, отличающийс  тем, что, с целью интенсификации способа, культивирование провод т в присутствии растворенного кислорода в количестве 1,0- 5,5 ррга в услови х, обеспечивающих исключение пенообразование.

   При контролировании (+), без контролировани  (-).

   С химическим обеспенивающим агентом (+), механическое сбеспенивание (-) Авт означает, что аэра1даю и перемешивание измен ют автоматически дл  контрол  DO.

   Таблица 1

   НетДаДа

   ) 85 210 210

   1024 1024 1024

   1ЬО 2350 1600

   120 35 35

   Таблица 3

   Содержание азота протеи мкг/мл

   Тест на стерильность

   Тест на устойчивость

   Концентраци  ионов водорода

   Тест на независимость

   от термолабильного

   токсина

   Тест на токсичность

   (по уменьшению живоговеса мьши), BWD ед/мл

   Таблица 2

   Тест на токсичность (по возрастанию лейкоцитов мьшш) , LP ед/мл Тест на токсичность (по чувствительности к гистамину мыши), HS ед/мл

   Пирогенный тест (обща  температура )

   Содержание алюмини ,

   мкг/мл

   Содержание тимерсала,

   вес,/об,%

   Содержание формаЛь- дегида, вес./об,%

   Тест на независимость от аномальной токсичности: .

   на мыши

   на гвинейской свинье

   Тест на эффективность IP ед/мл

   Содержание азота протеина , мкг/мл

   Тест на стерильность Тест на устойчивость

   Концентраци  ионов водорода

   Тест на независимость от термолабильного токсина

   Тест на токсичность (по уменьшению

   Прошел

   0,82

   (0,42-1,25) Прошел

   0,06 (0,01-0,16)

   Прошел, 0,4

   0,168 0,009

   0,002

   Прошел

   Прошел, 13,5

   Таблица 4

   28,0

   Стерильно Прошел

   6,72

   Прошел

   Прошел 9.3

   живого веса мьшш), BWD ед/мл

   Тест на токсичность (по увеличению лейкоцитов мьппи) , LP ед/мл

   Тест на токсичность (по чувствительност к гистамину мьшш) HS ед/мл

   Пирогенный тест (обща  температура )

   Содержание алюмини , мкг/мл

   Содержание тимар- сала, вес./об.%

   Содержание формальдегида , .вес,/об.%

   Тест на независимость от аномальной токсичности:

   на мьшш

   на гвинейской свинье

   Тест на стерильност на кролике

   на гвинейской свинье

   (4,2-17,0)

   Прошел 0,66 (0,33-1,02)

   Прошел 0,04 (0,01-0,12)

   Прошел, 0,5

   0,174 . 0,0094 0,002

   Прошел