ES2341645T3 - Medios para cultivo celular. - Google Patents
Medios para cultivo celular. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2341645T3 ES2341645T3 ES02791342T ES02791342T ES2341645T3 ES 2341645 T3 ES2341645 T3 ES 2341645T3 ES 02791342 T ES02791342 T ES 02791342T ES 02791342 T ES02791342 T ES 02791342T ES 2341645 T3 ES2341645 T3 ES 2341645T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- media
- powder
- cell
- medium
- solvent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/36—Lipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Procedimiento de producción de un polvo de medio nutritivo aglomerado, un polvo de complemento de medio aglomerado, un polvo de subgrupo de medio nutritivo aglomerado o un polvo de tampón aglomerado, comprendiendo el procedimiento: aglomerar un polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón, con un disolvente que comprende al menos un lípido disuelto en el mismo, suministrar el disolvente al menos un lípido para su incorporación en el polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón, y en el que el al menos un lípido se compleja con una ciclodextrina.
Description
Medios para cultivo celular.
La presente invención se refiere de forma
general a células, medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios y formulaciones tampón. Específicamente, la
presente invención proporciona formulaciones de medio nutritivo en
polvo seco, particularmente formulaciones de medio de cultivo
celular, que comprenden todos los factores nutritivos necesarios
que facilitan el cultivo in vitro de las células, y a
procedimientos de producción de estas formulaciones de medios. La
presente invención se refiere específicamente a procedimientos que
incorporan lípidos y/u otros componentes escasamente solubles en
disolventes inorgánicos o polares tales como agua. La invención
también se refiere a procedimientos de producción de complementos de
medios en polvo seco, tales como sueros en polvo seco (por ejemplo,
suero bovino fetal) con ingredientes complementarios tales como
lípidos u otros ingredientes útiles para soportar el cultivo
celular. La invención también se refiere a formulaciones tampón en
polvo seco que producen condiciones iónicas y de pH particulares
tras la rehidratación. La invención también se refiere a
procedimientos de preparación de medios nutritivos, complementos de
medios (particularmente sueros en polvo seco), subgrupos de medios
y formulaciones tampón en polvo seco estériles preparados con
aditivos solubles en disolventes orgánicos o apolares. La invención
también se refiere a medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios, formulaciones tampón en polvo seco y células
preparadas mediante los procedimientos de la invención. La presente
invención también se refiere a kits y procedimientos para el
cultivo de células procariotas y eucariotas que usan estos medios
nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y
formulaciones tampón en polvo seco.
Los medios de cultivo celular proporcionan
nutrientes para mantener y/o hacer crecer células en un entorno
controlado, artificial e in vitro. Las características y
composiciones de los medios de cultivo celular varían dependiendo
de los requisitos celulares particulares y cualquier función para la
que se cultivan las células. Los parámetros importantes incluyen
osmolalidad, pH y formulaciones de nutrientes. El entorno normal de
una célula en cultivo es un medio acuoso en el que se disuelven o
suspenden los nutrientes y otros componentes del cultivo. Es
especialmente ventajosa la incorporación de cantidades útiles de
lípidos u otros componentes que son sólo escasamente solubles en
agua.
Se han utilizado formulaciones de medios para
cultivar una serie de tipos de células incluyendo células animales,
vegetales y bacterianas. Las células cultivadas en medios de cultivo
catabolizan los nutrientes disponibles y producen sustancias
biológicas útiles tales como anticuerpos monoclonales, hormonas,
factores de crecimiento, virus, factores antigénicos, enzimas,
citocinas y similares. Tales productos tienen aplicaciones
industriales y/o terapéuticas y, con la llegada de la tecnología
del ADN recombinante, pueden modificarse células mediante
ingeniería para que produzcan grandes cantidades de estos productos.
Por tanto, la capacidad para cultivar células in vitro no
sólo es importante para el estudio de la fisiología celular, sino
que también es necesaria para la producción de sustancias útiles que
no pueden obtenerse de otra manera por medios rentables.
Las formulaciones de medios de cultivo celular
se han documentado bien en la bibliografía y una serie de medios
están disponibles comercialmente. En los primeros trabajos de
cultivo celular, las formulaciones de los medios se basaron en la
composición química y las propiedades fisicoquímicas (por ejemplo,
osmolalidad, pH, etc.) de la sangre y se denominaron "soluciones
fisiológicas" (Ringer, S., J. Physiol. 3:380-393
(1880); Waymouth, C., En: Cells and Tissues in Culture, Vol. 1,
Academic Press, Londres, págs. 99-142 (1965);
Waymouth, C., In Vitro 6:109-127 (1970)).
Sin embargo, las células en diferentes tejidos de organismos
multicelulares, por ejemplo, plantas, invertebrados incluyendo
insectos, vertebrados incluyendo peces y mamíferos están expuestos
a diferentes microentornos con respecto a la presión parcial de
oxígeno/dióxido de carbono y las concentraciones de nutrientes,
vitaminas y oligoelementos; por consiguiente, el cultivo in
vitro satisfactorio de diferentes tipos celulares con
frecuencia requerirá el uso de diferentes formulaciones de medios.
Los componentes típicos de los medios de cultivo celular incluyen
aminoácidos, sales orgánicas e inorgánicas, vitaminas, metales
traza, azúcares, lípidos y ácidos nucleicos, cuyos tipos y
cantidades pueden variar dependiendo de los requisitos particulares
de un tipo de célula o tejido dado y el fin al que se aplica la
célula. Con frecuencia, particularmente en composiciones de medios
complejos, los problemas de estabilidad dan como resultado productos
tóxicos y/o menores concentraciones eficaces de los nutrientes
requeridos, limitando de ese modo la vida funcional de los medios
de cultivo. Por ejemplo, la glutamina es un constituyente de casi
todos los medios que se usan en el cultivo de células de mamíferos
in vitro. La glutamina se descompone espontáneamente en ácido
pirrolidona-carboxílico y amoniaco. La velocidad de
degradación puede estar influenciada por las condiciones iónicas y
de pH pero en los medios de cultivo celular, con frecuencia no
puede evitarse la formación de estos productos de degradación.
(Tritsch et al., Exp. Cell Res. 28:360-364
(1962)).
Wang et al. (In Vitro
14(8):715-722 (1978)) han demostrado que se
producen fotoproductos tales como peróxido de hidrógeno, que son
letales para las células, en el medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM). La riboflavina y el triptófano o la tirosina son
componentes necesarios para la formación de peróxido de hidrógeno
durante la exposición a la luz. Dado que la mayoría de los medios
de cultivo para mamíferos contienen riboflavina, tirosina y
triptófano, es probable que se produzcan fotoproductos tóxicos en la
mayoría de los medios de cultivo celular.
Para evitar estos problemas, los investigadores
preparan los medios "cuando es necesario", y evitan el
almacenamiento a largo plazo de los medios de cultivo. Los medios
disponibles comercialmente, normalmente en forma de polvo seco, son
una alternativa conveniente a preparar los medios desde cero, es
decir, añadiendo cada nutriente individualmente, y también evitan
algunos de los problemas de estabilidad asociados con los medios
líquidos. Sin embargo, sólo está disponible un número limitado de
medios de cultivo comerciales, a excepción de aquellas formulaciones
a medida suministradas por el fabricante.
Los líquidos (medios acuosos) con frecuencia se
complementan con concentrado lipídico, por ejemplo, el lípido Lipid
Concentrate (100X), disponible de GIBCO de Invitrogen Corporation,
Carlsbad, California. Convencionalmente los medios en polvo no
podían contener eficazmente componentes que no fueran fácilmente
solubles en agua, el disolvente más común utilizado para la
reconstitución. Por tanto, después de que se reconstituya un polvo
para formar un medio, frecuentemente se añaden componentes
adicionales con una pequeña cantidad de disolvente orgánico tal
como alcoholes (por ejemplo, metanol, etanol, glicoles, etc.),
éteres (por ejemplo, MEK), cetonas (por ejemplo, acetona), DMSO,
etc. Estos disolventes deben usarse con moderación ya que
generalmente provocan efectos tóxicos o indeseados en las células
que están cultivándose. La toxicidad y la solubilidad interaccionan
limitando la cantidad del componente deseado que puede añadirse al
cultivo.
Aunque las formulaciones de medios en polvo seco
pueden aumentar la vida útil de almacenamiento de algunos medios,
existen varios problemas asociados con los medios en polvo seco,
especialmente en la aplicación a gran escala. La producción de
grandes volúmenes de medios requiere instalaciones de almacenamiento
para los medios de polvo seco, por no mencionar las cocinas
especializadas para los medios necesarias para mezclar y pesar los
componentes de nutrientes. Debido a la naturaleza corrosiva de los
medios de polvo seco, los tanques de mezclado deben sustituirse
periódicamente.
Normalmente, las formulaciones de medios de
cultivo celular se complementan con una gama de aditivos, incluyendo
componentes indefinidos tales como suero bovino fetal (FBS) (por
ejemplo, al 10-20%, 5-10%,
1-5%, 0,1-1% v/v) o extractos o
hidrolizados de plantas, embriones, órganos o glándulas de animales
(por ejemplo, al 0,5-10%, 0,1-1%).
Aunque el FBS es el complemento aplicado más comúnmente en los
medios de cultivo de células animales, también se utilizan de
manera rutinaria otras fuentes de suero, incluyendo de ternero
recién nacido, caballo y ser humano. Los órganos o las glándulas
que se han usado para preparar extractos para la complementación de
medios de cultivo incluyen la glándula submaxilar (Cohen, S., J.
Biol Chem. 237:1555-1565 (1961)), hipófisis (Peehl,
D.M., y Ham, R.G., In Vitro 16:516-525
(1980); patente estadounidense n.º 4.673.649), hipotálamo (Maciag,
T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
76:5674-5678 (1979); Gilchrest, B.A., et al.,
J. Cell. Physiol. 120:377-383 (1984)), retina
ocular (Barretault, D., et al., Differentiation
18:29-42 (1981)) y cerebro (Maciag T., et
al., Science 211:1452-1454 (1981)). Estos tipos
de complementos químicamente indefinidos sirven para varias
funciones útiles en los medios de cultivo celular (Lambert, K.J.
et al., En: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R.E.
et al., Eds., Academic Press Nueva York, págs.
85-122 (1985)). Por ejemplo, estos complementos
proporcionan vehículos o quelantes para nutrientes lábiles o
insolubles en agua; se unen y neutralizan restos tóxicos;
proporcionan hormonas y factores de crecimiento, inhibidores de
proteasas y nutrientes de bajo peso molecular esenciales, a menudo
no identificados o indefinidos; y protegen a las células frente al
daño y el estrés físico. Por tanto, el suero o los extractos de
órganos/glándulas se usan comúnmente como complementos de coste
relativamente bajo para proporcionar un medio de cultivo mejorado
para el cultivo de células animales.
Particularmente para usos alimentarios o
terapéuticos, hay una tendencia a reducir e incluso eliminar
componentes indefinidos, particularmente de origen animal, debido a
preocupaciones de seguridad y costes. Los medios de cultivo
mejorados también pueden producirse usando cantidades pequeñas de
componentes que tienen baja solubilidad en agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Los medios de cultivo normalmente se producen en
forma líquida o en forma de polvo (véase por ejemplo el Catálogo de
productos de 2000-2001 de GIBCO BRL). Cada una de
estas formas tiene ventajas y desventajas particulares.
Por ejemplo, el medio de cultivo líquido tiene
la ventaja de que se proporciona listo para su uso (a menos que sea
necesario o se desee la complementación con nutrientes u otros
componentes), y de que las formulaciones se han optimizado para
tipos celulares particulares. Sin embargo, los medios líquidos
tienen las desventajas de que con frecuencia requieren la adición
de complementos (por ejemplo, L-glutamina, suero,
extractos, citocinas, lípidos, etc.) para un óptimo rendimiento en
el cultivo celular. Además, el medio líquido con frecuencia es
difícil de esterilizar de manera económica, dado que muchos de los
componentes son termolábiles (obviándose así el uso de tratamiento
en autoclave, por ejemplo) y los líquidos a granel no son
particularmente susceptibles a procedimientos de esterilización
penetrantes tales como la irradiación con rayos gamma o
ultravioleta; por tanto, los medios de cultivo líquidos de la
manera más frecuente se esterilizan mediante filtración, lo que
puede convertirse en un proceso que requiere mucho tiempo y es
costoso. La filtración tiene una desventaja porque se eliminan del
medio componentes sin disolver, por ejemplo, liposomas, micelas,
partículas insolubles, etc., algunos de los que son deseados.
Además, la producción y el almacenamiento de grandes tamaños de lote
(por ejemplo, 1000 litros o más) de medios de cultivo líquidos son
poco prácticos, y los componentes de los medios de cultivo líquidos
con frecuencia tienen vidas útiles de almacenamiento relativamente
cortas.
Para superar algunas de estas desventajas, un
medio de cultivo líquido puede formularse en forma concentrada;
estos componentes de los medios pueden diluirse entonces hasta
concentraciones de trabajo antes de su uso. Este enfoque
proporciona la capacidad de preparar tamaños de lotes más grandes y
más variables que con los medios de cultivo convencionales, y las
formulaciones de medios concentrados o los componentes de los mismos
con frecuencia tienen vidas útiles de almacenamiento más largas
(véase la patente estadounidense n.º 5.474.931, que se refiere a
tecnología de concentrados de medios de cultivo). Sin embargo, a
pesar de estas ventajas, los medios líquidos concentrados todavía
tienen las desventajas de la necesidad de adición de complementos
(por ejemplo, FBS, L-glutamina o extractos de
órganos/glándulas), y pueden ser difíciles de esterilizar de manera
económica.
Alternativamente a los medios líquidos, con
frecuencia se utilizan medios de cultivo en polvo. Los medios en
polvo normalmente se producen mezclando los componentes secados del
medio de cultivo por medio de un procedimiento de mezclado, por
ejemplo, molienda con molino de bolas, o liofilizando un medio de
cultivo líquido preparado previamente. Este enfoque tiene las
ventajas de que pueden producirse tamaños de lotes incluso más
grandes, los medios en polvo normalmente tienen vidas útiles de
almacenamiento más largas que los medios líquidos, y los medios
pueden esterilizarse mediante irradiación (por ejemplo, irradiación
con rayos gamma o ultravioleta) o la penetración con óxido de
etileno tras la formulación. Sin embargo, los medios en polvo
convencionales tienen varias desventajas diferenciadas. Por
ejemplo, algunos de los componentes de los medios en polvo se
vuelven insolubles o se agregan tras la liofilización de tal manera
que la resolubilización es difícil o imposible. Además, los medios
en polvo normalmente comprenden partículas de polvo fino que pueden
hacerlos particularmente difíciles de reconstituir sin cierta
pérdida de material, y que además pueden hacerlos poco prácticos
para su uso en muchas instalaciones de producción de biotecnología
que operan en el marco de las normas BPF/BPL, USP o ISO 9000.
Además, muchos de los complementos utilizados en los medios de
cultivo, por ejemplo, L-glutamina y FBS, no pueden
añadirse al medio de cultivo antes de la liofilización o la molienda
con molino de bolas debido a su inestabilidad o propensión a
conglomerarse tras la concentración o debido a su sensibilidad al
cizallamiento mediante procesos tales como la molienda con molino de
bolas. Finalmente, muchos de estos complementos, particularmente
los complementos de suero tales como FBS, muestran una pérdida
sustancial de la actividad o se vuelven completamente inactivos si
se hacen intentos para producir complementos en polvo mediante
procesos tales como la liofilización.
Por tanto, existe una necesidad actual de medios
nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones
de polvo seco estables, nutricionalmente complejos, que se disuelvan
rápidamente, que puedan prepararse en cantidades volumétricas
variables y que sean susceptibles de esterilización, particularmente
mediante ionización o irradiación con rayos ultravioleta. En
particular, existe una necesidad de proporcionar medios nutritivos
de polvo seco que sean completos, es decir, que no requieran o
reduzcan sustancialmente la necesidad de complementación por
ejemplo, con un complemento lipídico, tras la reconstitución.
La presente invención proporciona procedimientos
para la producción de polvos de medios nutritivos, complementos de
medios, subgrupos de medios y tampones que comprenden aglomerar un
medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón
de polvo seco con un disolvente o disolventes. El disolvente
comprende al menos un lípido disuelto en el mismo, y libera el al
menos un lípido para su incorporación en el polvo. El al menos un
lípido se compleja con una ciclodextrina, por ejemplo,
\beta-metilciclodextrina. La invención también se
refiere en algunas realizaciones a un procedimiento de este tipo que
comprende secar por pulverización un medio nutritivo, complemento
de medio, subgrupo de medio o tampón líquido en condiciones
suficientes para producir sus equivalentes de polvo seco. Tales
condiciones pueden comprender, por ejemplo, controlar el calor y
la(s) presión/presiones parcial(es) del/de los
disolvente(s) hasta que se forme el medio, complemento de
medios, subgrupo de medios o tampón en polvo. El polvo puede
formarse en una etapa o en múltiples etapas. Cuando se utiliza más
de un disolvente, los disolventes pueden introducirse a través del
mismo orificio o boquilla o pueden introducirse a través de
boquillas separadas. Los disolventes compatibles, por ejemplo, los
solubles entre sí o miscibles de manera suficiente pueden compartir
un orificio o boquilla mientras que puede utilizarse una boquilla
separada para uno o más disolventes incompatibles con el primer
disolvente.
Según la invención, el procedimiento puede
comprender además esterilizar el polvo de medio nutritivo,
complemento de medios, subgrupo de medios o tampón, lo que puede
llevarse a cabo antes de o después de envasar el polvo. En
procedimientos preferidos particularmente, la esterilización se
lleva a cabo después del envasado del polvo mediante irradiación del
polvo envasado con rayos gamma.
Los polvos de medio nutritivo particularmente
preferidos que pueden producirse según la invención incluyen polvos
de medio de cultivo seleccionados del grupo constituido por un polvo
de medio de cultivo bacteriano, un polvo de medio de cultivo de
levaduras, un polvo de medio de cultivo vegetal, un polvo de medio
de cultivo animal.
Los complementos de medios particularmente
preferidos que pueden producirse mediante los procedimientos de la
invención incluyen: sueros animales en polvo, tales como sueros
bovinos (por ejemplo, sueros bovino fetal, de ternero recién nacido
o normal de ternero), sueros humanos, sueros equinos, sueros
porcinos, sueros de mono, sueros de simio, sueros de rata, sueros
murinos, sueros de conejo, sueros ovinos y similares; citocinas
(incluyendo factores de crecimiento (tales como EGF, aFGF, bFGF,
HGF, IGF-1, IGF-2, NGF y similares),
interleucinas, factores estimulantes de colonias e interferones);
factores de adhesión o componentes de la matriz extracelular (tales
como colágenos, lamininas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos,
fibronectina, vitronectina y similares); lípidos (tales como
fosfolípidos, colesterol, concentrado de colesterol bovino, ácidos
grasos, esfingolípidos y similares); glicanos y extractos de
tejidos, órganos o glándulas de animales (tales como extracto de
hipófisis bovina, extracto de cerebro bovino, extracto de embrión
de pollo, extracto de embrión bovino, extracto de carne de pollo,
tendón de Aquiles y extractos del mismo) y similares). Otros
complementos de medios que pueden producirse mediante los presentes
procedimientos incluyen una variedad de proteínas (tales como
albúminas séricas, particularmente albúminas séricas bovina o
humana; inmunoglobulinas y fragmentos o complejos de las mismas;
aprotinina; hemoglobina; hemina o hematina; enzimas (tales como
tripsina, colagenasas, pancreatinina o dispasa; lipoproteínas;
ferritina; etc.) que pueden ser naturales o recombinantes;
vitaminas; aminoácidos y variantes de los mismos (incluyendo, pero
sin limitarse a, L-glutamina y cistina), cofactores
enzimáticos y otros componentes útiles en el cultivo de células
in vitro con los que estará familiarizado un experto.
Los medios nutritivos y los complementos de
medios preparados mediante la invención también pueden comprender
subgrupos tales como suero (preferiblemente aquellos descritos
anteriormente), L-glutamina, insulina, transferrina,
uno o más lípidos (preferiblemente uno o más fosfolípidos,
esfingolípidos, ácidos grasos o colesterol), una o más citocinas
(preferiblemente aquellas descritas anteriormente), uno o más
neurotransmisores, uno o más extractos de tejidos, órganos o
glándulas de animales (preferiblemente aquellos descritos
anteriormente), una o más proteínas (preferiblemente aquellas
descritas anteriormente) o uno o más tampones (preferiblemente
bicarbonato o fosfato), o cualquier combinación de los mismos.
Los polvos de tampón particularmente adecuados
para su preparación según los procedimientos de la invención
incluyen polvos de solución salina tamponada, lo más particularmente
polvos de solución salina tamponada con fosfato o polvos de solución
salina tamponada con Tris.
La invención también proporciona polvos de medio
nutritivo, polvos de complemento de medios (incluyendo los polvos de
los complementos descritos anteriormente) y polvos de tampón
preparados según estos procedimientos.
Otras realizaciones preferidas de la presente
invención resultarán evidentes para un experto a la luz de los
siguientes dibujos y la descripción de la invención, y de las
reivindicaciones.
La figura 1 es un histograma de un barrido
densitométrico de SDS-PAGE de muestras de suero
bovino fetal (FBS) preparadas en forma de polvo (figura 1A) y FBS
líquido convencional (figura 1B).
La figura 2 es una combinación de gráficos de
líneas de crecimiento (figura 2A) y éxito de pase (figura 2B) de
células SP2/0 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)
complementado con FBS al 2% (p/v) preparado en forma de polvo
mediante aglomeración.
La figura 3 es una combinación de histogramas de
barridos espectrofotométricos (8 = 200-350 nm) de
suero bovino fetal (FBS) en polvo preparado mediante secado por
pulverización (figura 3A) o de FBS líquido convencional (figura
3B).
La figura 4 es una combinación de gráficos de
líneas que muestra la valoración del pH (capacidad tamponante), en
dos fechas diferentes (figuras 4A y 4B), de diversos medios en polvo
seco (DPM, dry powdered media) preparados mediante
aglomeración o mediante molienda con molino de bolas, con o sin la
adición de bicarbonato de sodio.
La figura 5 es una combinación de gráficos de
barras que muestra el efecto de la aglomeración sobre las
velocidades de disolución (en agua) de Opti-MEM
I^{TM} (figura 5A) o DMEM (figura 5B). Los medios se aglomeraron
con agua o FBS según se indica.
La figura 6 es una combinación de gráficos de
líneas que muestra el crecimiento durante siete días de células
SP2/0 en Opti-MEM I^{TM} (figura 6A) o DMEM
(figura 6B) aglomerado, ambos conteniendo FBS al 2%.
La figura 7 es una combinación de gráficos de
líneas que muestra el crecimiento durante siete días de células
SP2/0 (figura 7A), células AE-1 (figura 7B) y
células L5.1 (figura 7C) en DMEM aglomerado que contenía FBS al
10%.
La figura 8 es una combinación de gráficos de
líneas que muestra el éxito de pase de las células SP2/0 en
Opti-MEM I^{TM} (figura 8A) o DMEM (figura 8B)
aglomerados con o bien agua o bien FBS, complementado con FBS al
2%.
La figura 9 es una combinación de gráficos de
líneas que muestra el éxito de pase de células SP2/0 (figura 9A),
células AE-1 (figura 9B) y células L5.1 (figura 9C)
en DMEM aglomerado con FBS y bicarbonato de sodio y complementado
con FBS al 10%.
La figura 10 es un gráfico de líneas que muestra
el crecimiento de células SP2/0 durante cuatro pases en medios de
cultivo en polvo reconstituidos con agua convencionales (medios de
control), o en medios de cultivo en polvo aglomerados preparados en
cantidades a gran escala. Los resultados se muestran para medios de
control (\Box), medios de cultivo en polvo aglomerados con agua de
la invención (\blacklozenge) y medios de cultivo en polvo con pH
automático aglomerados con agua (que contenían bicarbonato de sodio)
de la invención (\blacksquare).
La figura 11 es un gráfico de líneas de células
AE-1 cultivadas durante seis o siete días en un
medio que contenía suero bovino fetal líquido (FBS) al 2%
(\ding{115}) o al 10% (\blacklozenge), o FBS en polvo al 2%(x) o
al 10% (\blacksquare) preparado mediante secado por pulverización.
Se muestran los experimentos por duplicado en las figuras 11A y
11B.
La figura 12 es un gráfico de líneas de células
SP2/0 cultivadas durante siete días en un medio que contenía FBS
líquido al 2% (\ding{115}) o al 10% (\blacklozenge), o FBS en
polvo al 2%(x) o al 10% (\blacksquare) preparado mediante secado
por pulverización. Se muestran los experimentos por duplicado en las
figuras 12A y 12B.
La figura 13 es un gráfico de líneas del
crecimiento de células AE-1 durante cuatro pases en
un medio que contenía FBS líquido al 5% (\blacklozenge) o FBS en
polvo al 5% preparado mediante secado por pulverización
(\blacksquare).
La figura 14 es un gráfico de líneas que indica
el efecto de la irradiación con rayos \gamma y la aglomeración
sobre el crecimiento de células SP2/0 durante cinco días.
La figura 15 es un gráfico de barras que indica
el efecto de la radiación \gamma sobre el crecimiento de células
VERO en medios de cultivo aglomerados.
La figura 16 es una serie de gráficos de líneas
que indican el efecto de la radiación \gamma sobre la capacidad de
la transferrina de soportar el crecimiento de células 293 durante
cuatro pases. En cada gráfico, se cultivaron las células en medio
293 libre de suero convencional (\blacklozenge), en medio sin
transferrina (\blacksquare), en medio que contenía transferrina en
polvo que se había irradiado con rayos \gamma a -70ºC
(\ding{115}) o a temperatura ambiente (\ding{91}), o en medio
que contenía transferrina en polvo que no se había irradiado con
rayos \gamma pero que se había almacenado a -70ºC (x) o a
temperatura ambiente (\medbullet). Los resultados de cada punto de
datos son los promedios de matraces por duplicado.
Figura 16A: células del pase 1;
Figura 16B: células del pase 2;
Figura 16C: células del pase 3;
Figura 16D: células del pase 4.
La figura 17 es una serie de gráficos de barras
que indican el efecto de la irradiación, en diferentes condiciones
de irradiación, sobre la capacidad del FBS para soportar el
crecimiento de células independientes del anclaje (figuras 17A y
17B) y células dependientes del anclaje (figuras 17C y 17D) en los
pases primero (Px1), segundo (Px2) y tercero (Px3).
Figura 17A: células SP2/0;
Figura 17B: células AE-1;
Figura 17C: células VERO;
Figura 17D: células BHK.
\vskip1.000000\baselineskip
En la descripción que sigue, se utilizan
extensamente varios términos usados convencionalmente en el campo
de los medios de cultivo celular. Con el fin de proporcionar una
comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y las
reivindicaciones, y el alcance que ha de darse a tales términos, se
proporcionan las siguientes definiciones.
El término "polvo" tal como se usa en el
presente documento hace referencia a una composición que está
presente en forma granular, que puede o puede no complejarse o
aglomerarse con un disolvente tal como agua o suero. El término
"polvo seco" puede usarse de manera intercambiable con el
término "polvo"; sin embargo, "polvo seco" tal como se
usa en el presente documento simplemente hace referencia al aspecto
macroscópico del material granulado y no se pretende que signifique
que el material está completamente libre de disolvente complejado o
aglomerado a menos que se indique lo contrario.
El término "ingrediente" hace referencia a
cualquier compuesto, ya sea de origen químico o biológico, que
puede utilizarse en medios de cultivo celular para mantener o
promover el crecimiento de la proliferación de las células. Los
términos "componente", "nutriente" e "ingrediente"
pueden utilizarse de manera intercambiable y todos hacen referencia
a tales compuestos. Los ingredientes típicos que se utilizan en los
medios de cultivo celular incluyen aminoácidos, sales, metales,
azúcares, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, vitaminas, ácidos
grasos, proteínas y similares. Otros ingredientes que promueven o
mantienen el cultivo de células ex vivo pueden seleccionarse
por los expertos en la técnica, según la necesidad particular.
El término "citocina" hace referencia a un
compuesto que induce una respuesta fisiológica en una célula, tal
como crecimiento, diferenciación, senescencia, apoptosis,
citotoxicidad, síntesis o transporte, respuesta inmunitaria o
secreción de anticuerpos. En esta definición de "citocina"
están incluidos los factores de crecimiento, interleucinas,
factores estimulantes de colonias, interferones, tromboxanos,
prostaglandinas, hormonas y linfocinas.
Por "cultivo celular" o "cultivo" se
entiende el mantenimiento de las células en un entorno artificial,
por ejemplo, un entorno in vitro. Debe entenderse, sin
embargo, que el término "cultivo celular" es un término
genérico y puede usarse para abarcar el cultivo no sólo de células
procariotas (por ejemplo, bacterianas) o eucariotas (por ejemplo,
de animales, vegetales y fúngicas) individuales, sino también de
tejidos, órganos, sistemas de órganos u organismos completos, para
los que los términos "cultivo tisular", "cultivo de
órganos", "cultivo de sistema de órganos" o "cultivo
organotípico" pueden utilizarse ocasionalmente de manera
intercambiable con el término "cultivo celular".
Por "cultivo" se entiende el mantenimiento
de células en un entorno artificial en condiciones que favorecen el
crecimiento, diferenciación, producción biológica o viabilidad
continuada, en un estado activo o quiescente, de las células. Por
tanto, "cultivo" puede utilizarse de manera intercambiable con
"cultivo celular" o cualquiera de sus sinónimos descritos
anteriormente.
Por "recipiente de cultivo" se entiende un
recipiente de vidrio, plástico o metal que puede proporcionar un
entorno aséptico para cultivar células.
Las frases "medio de cultivo celular",
"medio de cultivo" (en plural "medios" en cada caso) y
"formulación de medio" hacer referencia a una disolución
nutritiva que soporta el cultivo y/o crecimiento de las células;
estas frases pueden utilizarse de manera intercambiable.
Por "extracto" se entiende una composición
que comprende una preparación purificada, parcialmente purificada o
concentrada de los subgrupos de una sustancia, normalmente formada
mediante el tratamiento de la sustancia o bien mecánicamente (por
ejemplo, mediante tratamiento con presión) o bien químicamente (por
ejemplo, mediante destilación, solubilización, precipitación,
acción enzimática o tratamiento con elevadas concentraciones de
sales).
Por "digesto enzimático" se entiende una
composición que comprende un tipo especializado de extracto,
concretamente uno preparado tratando la sustancia que va a
extraerse (por ejemplo, componentes vegetales o células de
levaduras) con al menos una enzima que puede degradar los
componentes de la sustancia en formas más sencillas (por ejemplo,
en una preparación que comprende mono o disacáridos y/o mono, di o
tripéptidos). En este contexto, y para los fines de la presente
invención, el término "hidrolizado" puede utilizarse algunas
veces de manera intercambiable con el término "digesto
enzimático".
"Lípido" tendrá su significado como
generalmente se entiende en bioquímica. "Lípido" también
significa una parte de la célula o un ingrediente de un medio que
es soluble en un disolvente apolar o no acuoso. El lípido puede ser
escasamente soluble o insoluble en agua en presencia o ausencia de
otros ingredientes del medio. El lípido puede ser soluble en una
mezcla de disolventes que incluye agua y uno o más disolventes
orgánicos. Los lípidos pueden comprender ácidos grasos, hormonas,
metabolitos, citocinas, vitaminas, indicadores, estimuladores o
inhibidores. "Lípido" en algunos contextos puede hacer
referencia a ingredientes que normalmente son insolubles o
escasamente solubles en agua, pero que se han convertido, por
ejemplo, mediante saponificación, hidroxilación, etc., en una forma
de compuesto o ión que es soluble en agua. Por tanto, por ejemplo,
un ácido graso es un lípido, pero también ha de incluirse en la
definición una sal de un ácido graso. Además, "lípido" se
utiliza genéricamente para que signifique generalmente cualquier
componente que se introduce favorablemente utilizando disolventes
orgánicos o apolares o que normalmente no es soluble en agua o
medios acuosos. Los lípidos pueden estar presentes como moléculas
disueltas, o en otras formas tales como micelas u otras asociaciones
sueltas de moléculas. Un lípido puede utilizarse como una molécula
libre o puede unirse a una o más de otras moléculas. Por ejemplo,
las proteínas o péptidos pueden asociarse con uno o más de otros
lípidos para proporcionar estabilidad y/o para ayudar en la
liberación del polvo aglomerado. El lípido también puede hacer
referencia a un ingrediente que podría actuar como un fármaco para
inhibir o activar una o más funciones de una célula o componente
celular.
El término "poner en contacto" hace
referencia a la colocación de las células que van a cultivarse en un
recipiente de cultivo con el medio en el que van a cultivarse las
células. El término "poner en contacto" abarca, entre otros,
mezclar las células con el medio, perfundir las células con el
medio, pipetear el medio sobre células en un recipiente de cultivo y
sumergir las células en el medio de cultivo.
El término "combinar" hace referencia a
mezclar o incorporar los ingredientes en una formulación de medio de
cultivo celular. La combinación puede producirse en forma de líquido
o polvo o con uno más polvos y uno o más líquidos.
Un medio de cultivo celular está compuesto por
varios ingredientes y estos ingredientes varían de un medio de
cultivo a otro. Una "formulación 1X" se entiende que hace
referencia a cualquier disolución acuosa que contiene algunos o
todos los ingredientes que se encuentran en un medio de cultivo
celular a concentraciones de trabajo. La "formulación 1X"
puede hacer referencia, por ejemplo, al medio de cultivo celular o a
cualquier subgrupo de ingredientes para ese medio. La concentración
de un ingrediente en una disolución 1X es aproximadamente la misma
que la concentración de ese ingrediente que se encuentra en una
formulación de medio de cultivo celular utilizada para mantener o
cultivar células in vitro. Un medio de cultivo celular
utilizado para el cultivo in vitro de células es por
definición una formulación 1X. Cuando están presentes varios
ingredientes, cada ingrediente en una formulación 1X tiene una
concentración aproximadamente igual a la concentración de aquellos
ingredientes en un medio de cultivo celular. Por ejemplo, el medio
de cultivo RPMI-1640 contiene, entre otros
ingredientes, L-arginina 0,2 g/l,
L-asparagina 0,05 g/l y ácido
L-aspártico 0,02 g/l. Una "formulación 1X" de
estos aminoácidos contiene aproximadamente las mismas
concentraciones de estos ingredientes en disolución. Por tanto,
cuando se hace referencia a una "formulación 1X", se pretende
que cada ingrediente en la disolución tenga la misma o
aproximadamente la misma concentración que la que se encuentra en el
medio de cultivo celular que esta describiéndose. Las
concentraciones de los ingredientes en una formulación 1X del medio
de cultivo celular las conocen bien los expertos en la técnica.
Véase Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate
For Serum-Free Animal Cell Culture Allen R. Liss,
N.Y. (1984), que se incorpora como referencia al presente documento
en su totalidad. Sin embargo, pueden diferir la osmolalidad y/o el
pH en una formulación 1X en comparación con el medio de cultivo,
particularmente cuando están contenidos menos ingredientes en la
formulación 1X. La concentración 1X de cualquier componente no es
necesariamente constante a través de diversas formulaciones de
medios. Por tanto 1X podría indicar concentraciones diferentes de un
único componente cuando se hace referencia a medios diferentes. Sin
embargo, cuando se usa generalmente, 1X indicará una concentración
que se encuentra comúnmente en los tipos de medios a los que se hace
referencia. Una cantidad 1X es la cantidad de un ingrediente que
dará como resultado una concentración 1X para el volumen apropiado
del medio.
Una "formulación 10X" se entiende que hace
referencia a una disolución en la que cada ingrediente en esa
disolución está aproximadamente 10 veces más concentrado que el
mismo ingrediente en el medio de cultivo celular. Por ejemplo, una
formulación 10X del medio de cultivo RPMI-1640 puede
contener, entre otros ingredientes, L-arginina 2,0
g/l, L-asparagina 0,5 g/l y ácido
L-aspártico 0,2 g/l (compárese con la formulación
1X, anteriormente). Una "formulación 10X" puede contener
varios ingredientes adicionales a una concentración aproximadamente
10 veces la que se encuentra en el medio de cultivo 1X. Tal como
resultará fácilmente evidente, la "formulación 20X",
"formulación 25X", "formulación 50X" y "formulación
100X" designan disoluciones que contienen ingredientes a
concentraciones de aproximadamente 20, 25, 50 ó 100 veces,
respectivamente, en comparación con un medio de cultivo celular 1X.
De nuevo, pueden variar la osmolalidad y el pH de la formulación de
los medios y la disolución concentrada. Véase la patente
estadounidense n.º 5.474.931, que se refiere a la tecnología de
concentrados de medios de cultivo.
Por "sin pérdida significativa de la actividad
biológica y bioquímica" se entiende una disminución inferior a
aproximadamente el 30%, preferiblemente inferior a aproximadamente
el 25%, más preferiblemente inferior a aproximadamente el 20%,
todavía más preferiblemente inferior a aproximadamente el 15% y lo
más preferiblemente inferior a aproximadamente el 10%, de la
actividad biológica o bioquímica de los medios nutritivos,
complemento de medios, subgrupo de medios o tampón en comparación
con medios nutritivos, complemento de medios, subgrupo de medios o
tampón recién preparados de la misma formulación.
Un "disolvente" es un líquido que disuelve
o que ha disuelto otro ingrediente del medio. Los disolventes pueden
utilizarse en la preparación de los medios, en la preparación de
polvos de medios, en la preparación de subgrupos o complementos u
otras formulaciones, particularmente polvos de la presente invención
y en la reconstitución de un polvo o la dilución de un concentrado
en la preparación para cultivar células. Los disolventes pueden ser
polares, por ejemplo, un disolvente acuoso, o apolares, por ejemplo,
un disolvente orgánico. Los disolventes pueden ser complejos, es
decir, que requieren más de un ingrediente para solubilizar un
ingrediente. Los disolventes complejos pueden ser mezclas sencillas
de dos líquidos tales como alcohol y agua o pueden ser mezclas de
sales u otros sólidos en un líquido. Pueden ser necesarios en
algunos casos dos, tres, cuatro, cinco o seis o más componentes
para formar una mezcla soluble. Se prefieren los disolventes
sencillos tales como mezclas de etanol o metanol y agua debido a su
facilidad de preparación y manipulación. Debido a preocupaciones
ambientales, de toxicidad y/o incendios, se prefiere usar mezclas
acuosas en las que la cantidad del disolvente orgánico es la
cantidad mínima en la mezcla para disolver suficientemente el
ingrediente o ingredientes relevantes.
Por un "periodo de tiempo prolongado" se
entiende un periodo de tiempo más largo que aquél durante el que se
almacena un medio nutritivo, complemento, subgrupo o tampón cuando
se prepara mediante procedimientos tradicionales tales como
molienda con molino de bolas. Tal como se usa en el presente
documento, un "periodo de tiempo prolongado" por tanto
significa aproximadamente 1-36 meses,
aproximadamente 2-30 meses, aproximadamente
3-24 meses, aproximadamente 6-24
meses, aproximadamente 9-18 meses o aproximadamente
4-12 meses, en condiciones de almacenamiento dadas,
que puede incluir el almacenamiento a temperaturas de
aproximadamente -70ºC a aproximadamente 25ºC, de aproximadamente
-20ºC a aproximadamente 25ºC, de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 25ºC, de aproximadamente 4ºC a aproximadamente
25ºC, de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 25ºC o de
aproximadamente 20ºC a aproximadamente 25ºC. Los ensayos para la
determinación de la actividad biológica o bioquímica de un medio
nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón se
conocen bien en la técnica y un experto está familiarizado con los
mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere generalmente a
procedimientos de producción de medios nutritivos, complementos de
medios, subgrupos de medios o tampones y los medios producidos de
ese modo. Los medios nutritivos, complementos de medios y subgrupos
de medios producidos mediante los presentes procedimientos son
cualquier medio, complemento de medios o subgrupo de medios (libres
de suero o que contienen suero) que pueden usarse para soportar el
crecimiento de una célula, que puede ser una célula bacteriana, una
célula fúngica (particularmente una célula de levaduras), una
célula vegetal o una célula animal (particularmente una célula de
insectos, una célula de nematodos o una célula de mamíferos, más
preferiblemente una célula humana), cualquiera de las cuales puede
ser una célula somática, una célula germinal, una célula normal, una
célula enferma, una célula transformada, una célula mutante, una
célula madre, una célula precursora o una célula embrionaria. Tales
medios nutritivos preferidos incluyen, pero no se limitan a, medios
de cultivo celular, lo más preferiblemente un medio de cultivo de
células bacterianas, medio de cultivo de células vegetales o un
medio de cultivo de células animales. Los complementos de medios
preferidos incluyen, pero no se limitan a, complementos indefinidos
tales como extractos de células, glándulas, tejidos u órganos de
bacterias, animales o plantas (particularmente extracto de hipófisis
bovina, extracto de cerebro bovino y extracto de embrión de pollo);
y fluidos biológicos (particularmente sueros de animales, y lo más
preferiblemente suero bovino (particularmente suero bovino fetal, de
ternero recién nacido o normal de ternero), suero de caballo, suero
porcino, suero de rata, suero murino, suero de conejo, suero de
mono, suero de simio o suero humano, cualquiera de los cuales pueden
ser suero fetal) y extractos de los mismos (más preferiblemente
albúmina sérica y lo más preferiblemente albúmina sérica bovina o
albúmina sérica humana). Los complementos de medios también pueden
incluir sustitutos definidos tales como LipoMAX8®, OptiMAb®,
Knock-Out^{TM} SR (cada uno disponible de
Invitrogen Corporation, Carlsbad, California), y similares, que
pueden usarse como sustitutos para los complementos de medios
indefinidos descritos anteriormente. Tales complementos también
pueden comprender componentes definidos, incluyendo pero sin
limitarse a, hormonas, citocinas, neurotransmisores, lípidos,
factores de adhesión, proteínas y similares.
Los medios nutritivos también pueden dividirse
en diversos subgrupos (véase la patente estadounidense
n.º 5.474.931) que pueden prepararse mediante, y usarse según, los procedimientos de la invención. Tales subgrupos pueden combinarse para producir los medios nutritivos de la presente invención.
n.º 5.474.931) que pueden prepararse mediante, y usarse según, los procedimientos de la invención. Tales subgrupos pueden combinarse para producir los medios nutritivos de la presente invención.
Mediante los procedimientos de la presente
invención, puede producirse cualquier medio nutritivo, complemento
de medios, subgrupo de medios o tampón y almacenarse durante un
periodo de tiempo prolongado sin una pérdida significativa de
actividad biológica y bioquímica. Mediante los procedimientos de la
presente invención se consigue una mejora significativa en la
incorporación de lípidos y/o ingredientes escasamente solubles en
agua. El componente lipídico puede incorporarse en un subgrupo,
complemento, etc., pero preferiblemente el componente lipídico así
como todos los demás ingredientes que van a reconstituirse están
contenidos en una única mezcla/composición. Cuando se usan varias
composiciones para reconstituir un medio, preferiblemente se
necesita un número pequeño de diferentes polvos, por ejemplo, 2, 3,
4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede preparar cualquier medio nutritivo,
complemento de medio, subgrupo de medio o tampón mediante los
procedimientos de la presente invención. Los medios nutritivos,
complementos nutritivos y subgrupos de medios particularmente
preferidos que pueden prepararse según la invención incluyen medios
de cultivo celular, complementos de medios y subgrupos de medios
que soportan el crecimiento de células animales, células vegetales,
células bacterianas o células de levaduras. Tampones
particularmente preferidos que pueden prepararse según la invención
incluyen soluciones salinas equilibradas que son isotónicas para
células animales, células vegetales, células bacterianas o células
de levaduras.
Los ejemplos de medios de cultivo de células
animales que pueden prepararse según la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, DMEM, RPMI-1640, MCDB 131,
MCDB 153, MDEM, IMDM, MEM, M199, medio McCoy 5A, medios E de
Williams, medio L-15 de Leibovitz, medio para
insectos de Grace, medio para insectos IPL-41, medio
para insectos TC-100, medio para Drosophila de
Schneider, medio de cultivo para células de anfibios de Wolf &
Quimby, medios libres de suero específicos de células (SFM) tales
como aquellos diseñados para soportar el cultivo de queratinocitos,
células endoteliales, hepatocitos, melanocitos, etc., mezcla de
nutrientes F10 y mezcla de nutrientes F12. Otros medios,
complementos de medios y subgrupos de medios adecuados para la
preparación mediante la invención están disponibles comercialmente
(por ejemplo, de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, y
Sigma; St. Louis, Missouri). Las formulaciones para estos medios,
complementos de medios y subgrupos de medios, así como muchos otros
medios, complementos de medios y subgrupos de medios de cultivo de
células animales utilizados comúnmente se conocen bien en la
técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el Catálogo y Guía de
Referencia de GIBCO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) y
en el Catálogo de Células Animales de Sigma (Sigma; St. Louis,
Missouri).
Los ejemplos de medios de cultivo de células
vegetales que pueden prepararse según la presente invención
incluyen, pero no se limitan a, medios de cultivo de plantas de
Anderson, medios basales CLC, medios de Gamborg, medios de cultivo
de plantas marinas de Guillard, medios marinos de Provasoli, medios
de Kao y Michayluk, medios de Murashige y Skoog, medios para
plantas leñosas de McCown, medios para orquídeas de Knudson, medios
para orquídeas de Lindermann, y medios de Went y Vacin. Las
formulaciones para estos medios, que están disponibles
comercialmente, así como para muchos otros medios de cultivo de
células vegetales utilizados comúnmente, se conocen bien en la
técnica y pueden encontrarse por ejemplo en el Catálogo de Cultivo
de Células Vegetales de Sigma (Sigma; St. Louis, Missouri).
Los ejemplos de los medios de cultivo de células
bacterianas que pueden prepararse según la presente invención
incluyen, pero no se limitan a, medios de
tripticasa-soja, medios de infusión de
cerebro-corazón, medios de extractos de levaduras,
medios de extractos de levaduras-peptona, medios de
infusión de carne de vacuno, medios de tioglicolato, medios de
indol-nitrato, medios MR-VP, medios
de citrato de Simmons, medios CTA, medios de
bilis-esculina, medios de
Bordet-Gengou, medios de
carbón-extracto de levaduras (CYE), medios de
manitol-sales, medios de MacConkey, medios de
eosina-azul de metileno (EMB), medios de
Thayer-Martin, medios de
Salmonella-Shigella, y medios de ureasa. Las
formulaciones para estos medios, que están disponibles
comercialmente, así como para muchos otros medios de cultivo de
células bacterianas utilizados comúnmente, se conocen bien en la
técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el Manual de DIFCO
(DIFCO; Norwood, Massachusetts) y en el Manual de Microbiología
Clínica (Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC).
Los ejemplos de medios de cultivo de células
fúngicas, particularmente medios de cultivo de células de levaduras,
que pueden prepararse según la presente invención incluyen, pero no
se limitan a, medios de Sabouraud y medios de morfología de
levaduras (YMA). Las formulaciones para estos medios, que están
disponibles comercialmente, así como para muchos otros medios de
cultivo de células de levaduras utilizados comúnmente, se conocen
bien en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el Manual
de DIFCO (DIFCO; Norwood, Massachusetts) y en el Manual de
Microbiología Clínica (Sociedad Americana de Microbiología,
Washington, DC).
Tal como apreciará el experto, cualquiera de los
medios anteriores u otros medios que pueden prepararse según la
presente invención también pueden incluir uno o más componentes
adicionales, tales como agentes indicadores o de selección (por
ejemplo, colorantes, antibióticos, aminoácidos, enzimas, sustratos y
similares), filtros (por ejemplo, carbón vegetal), sales,
polisacáridos, iones, detergentes, estabilizadores y similares. La
invención no se limita en su aplicación a medios formulados
actualmente, sino que es aplicable ampliamente a cualquier
formulación para cultivar células.
En una realización particularmente preferida de
la invención, los medios de cultivo descritos anteriormente pueden
comprender una o más sales tampón, preferiblemente bicarbonato de
sodio, a concentraciones suficientes para proporcionar una
capacidad de tamponamiento óptima para el medio de cultivo. Puede
añadirse una sal tampón, tal como bicarbonato de sodio, en forma de
polvo al medio en polvo antes de, durante o tras la aglomeración
del medio. En un ejemplo, puede añadirse el bicarbonato de sodio al
medio de cultivo antes de, durante o tras la aglomeración con un
disolvente apropiado (tal como agua, suero o un agente de ajuste de
pH tal como un ácido (por ejemplo, HCl a una concentración de 0,1 M
a 5 M, preferiblemente a 1 M) o una base (por ejemplo, NaOH a una
concentración de 0,1 M a 5 M, preferiblemente a 1 M) de tal manera
que, tras la reconstitución del medio aglomerado, el medio de
cultivo está a un pH óptimo o sustancialmente óptimo para el cultivo
de una variedad de tipos celulares. Por ejemplo, los medios de
cultivo de células bacterianas preparados mediante los presentes
procedimientos, tras la reconstitución, preferiblemente tendrán un
pH de aproximadamente 4-10, más preferiblemente de
aproximadamente 5-9 o de aproximadamente
6-8,5. Los medios de cultivo de células fúngicas
(por ejemplo, levaduras) preparados mediante los presentes
procedimientos, tras la reconstitución, preferiblemente tendrán un
pH de aproximadamente 3-8, más preferiblemente de
aproximadamente 4-8 o de aproximadamente
4-7,5; los medios de cultivo de células animales
preparados mediante los presentes procedimientos, tras la
reconstitución, preferiblemente tendrán un pH de aproximadamente
6-8 o de aproximadamente 7-8, más
preferiblemente de aproximadamente 7-7,5 o de
aproximadamente 7,2-7,4; y los medios de cultivo de
células vegetales preparados mediante los presentes procedimientos,
tras la reconstitución, preferiblemente tendrán un pH de
aproximadamente 4-8, preferiblemente de
aproximadamente 4,5-7, 5-6 ó
5,5-6. Por supuesto, el pH óptimo para un medio de
cultivo dado que va a utilizarse en un tipo celular particular
también puede determinarlo empíricamente un experto usando
procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden
cultivarse células gástricas a pH muy inferiores a los de otras
células, por ejemplo, de 1-3. Un experto aprecia
que otras células adaptadas a entornos agresivos pueden tener
tolerancias o necesidades especiales que podrían estar fuera de los
intervalos normales que satisfacen las condiciones de cultivo para
las células cultivadas comúnmente.
En otro ejemplo, pueden añadirse una o más sales
tampón, por ejemplo, bicarbonato de sodio, directamente a un medio
nutritivo en polvo mediante la aglomeración del/de los
tampón/tampones en el medio usando un aparato de lecho fluidizado,
o secando por pulverización el/los tampón/tampones sobre un medio en
polvo aglomerado o seco (usando un aparato de secado por
pulverización tal como se describe a continuación). En una
realización relacionada, puede añadirse un agente de ajuste del pH
tal como un ácido (por ejemplo, HCl) o una base (por ejemplo, NaOH)
a un medio nutritivo en polvo, que puede contener una o más sales
tampón (tales como bicarbonato de sodio), mediante la aglomeración
del agente de ajuste del pH en el medio nutritivo en polvo en un
aparato de lecho fluidizado, mediante el secado por pulverización
del agente de ajuste del pH sobre el medio nutritivo aglomerado o
en polvo, o mediante una combinación de los mismos; este enfoque
obvia la adición subsiguiente de un agente de ajuste del pH tras la
reconstitución del medio en polvo. Por tanto, el procedimiento
descrito en la frase anterior proporciona un medio de cultivo
nutritivo en polvo útil en el cultivo o crecimiento de células
in vitro que, tras la reconstitución con un disolvente (por
ejemplo, agua o suero), tiene un pH que es óptimo para el soporte
del cultivo o crecimiento celular sin necesidad de ajuste del pH del
medio líquido. Este tipo de medio, definido en el presente
documento como "medio con ajuste de pH de manera automática",
por tanto obvia las etapas que requieren mucho tiempo y propensas a
errores de adición de tampón/tampones al medio tras la
reconstitución y ajuste del pH del medio tras la disolución del/de
los tampón/tampones. Por ejemplo, un medio de cultivo de células de
mamíferos preparado según estos procedimientos puede, tras la
reconstitución, tener un pH de entre aproximadamente 7,1 y
aproximadamente 7,5, más preferiblemente entre aproximadamente 7,1
y aproximadamente 7,4 y lo más preferiblemente de aproximadamente
7,2 a aproximadamente 7,4 o de aproximadamente 7,2 a
aproximadamente 7,3. La preparación de un ejemplo de medio de
cultivo con ajuste de pH de manera automática de este tipo se
muestra con mayor detalle a continuación en los ejemplos 3 y 6.
Los ejemplos de los complementos de medios que
pueden prepararse como polvos mediante los presentes procedimientos
incluyen, sin limitación, sueros animales (tal como sueros bovinos
(por ejemplo, suero bovino fetal, de ternero recién nacido y de
ternero), sueros humanos, sueros equinos, sueros porcinos, sueros de
mono, sueros de simio, sueros de rata, sueros murinos, sueros de
conejo, sueros ovinos y similares), sustitutos definidos tales como
LipoMAX®, OptiMAb®, Knock-Out^{TM} SR (cada uno
disponible de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California),
hormonas (incluyendo hormonas esteroideas tales como
corticosteroides, estrógenos, andrógenos (por ejemplo,
testosterona) y hormonas peptídicas tales como insulina, citocinas
(incluyendo factores de crecimiento (por ejemplo, EGF, aFGF, bFGF,
HGF, IGF-1, IGF-2, NGF y similares),
interleucinas, factores estimulantes de colonias, interferones y
similares), neurotransmisores, lípidos (incluyendo fosfolípidos,
esfingolípidos, ácidos grasos, colesterol y similares), factores de
adhesión (incluyendo componentes de la matriz extracelular tales
como fibronectina, vitronectina, lamininas, colágenos,
proteoglicanos, glicosaminoglicanos y similares), y extractos de
tejidos, órganos o glándulas de animales (tales como extracto de
hipófisis bovina, extracto de cerebro bovino, extracto de embrión
de pollo, extracto de embrión bovino, extracto de carne o tejido de
pollo, tendón de Aquiles y extractos de los mismos) y similares).
Otros complementos de medios que pueden producirse mediante los
presentes procedimientos incluyen una variedad de proteínas (tales
como albúminas séricas, particularmente albúminas séricas humana o
bovina; inmunoglobulinas y fragmentos o complejos de las mismas;
aprotinina; hemoglobina; hemina o hematina; enzimas (tales como
tripsina, colagenasas, pancreatinina o dispasa); lipoproteínas;
fetuina; ferritina; etc.), que pueden ser naturales o
recombinantes; vitaminas; aminoácidos y variantes de los mismos
(incluyendo, pero sin limitarse a, L-glutamina y
cistina), cofactores enzimáticos; polisacáridos; sales o iones
(incluyendo oligoelementos tales como sales o iones de molibdeno,
vanadio, cobalto, manganeso, selenio, y similares); y otros
complementos y composiciones que son útiles en el cultivo de células
in vitro con los que estará familiarizado el experto. Estos
sueros y otros complementos de medios están disponibles
comercialmente (por ejemplo, de Invitrogen Corporation, Carlsbad,
California, y Sigma Cell Culture, St. Louis, Missouri);
alternativamente, los sueros y otros complementos de medios
descritos anteriormente pueden aislarse de sus fuentes naturales o
producirse de manera recombinante mediante procedimientos conocidos
en la técnica que serán rutinarios para el experto (véase Freshney,
R.I., Culture of Animal Cells, Nueva York: Alan R. Liss, Inc.,
págs. 74-78 (1983), y las referencias citadas en ese
documento; también véase Harlow, E., y Lane, D., Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring
Harbor Laboratory, págs. 116-120 (1988)).
Los ejemplos de los tampones que pueden
prepararse según la presente invención incluyen, pero no se limitan
a, formulaciones de solución salina tamponada con fosfato (PBS),
formulaciones de solución salina tamponada con Tris (TBS),
formulaciones de solución salina tamponada con HEPES (HBS),
soluciones salinas equilibradas de Hank (HBSS), PBS de Dulbecco
(DPBS), soluciones salinas equilibradas de Earle, soluciones salinas
de Puck, soluciones salinas basales para plantas de Murashige y
Skoog, soluciones salinas basales para plantas marinas de Keller,
soluciones salinas basales para plantas marinas de Provasoli y
soluciones salinas basales de Kao y Michayluk. Las formulaciones
para estos tampones, que están disponibles comercialmente, así como
para muchos otros tampones utilizados comúnmente, se conocen bien
en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el Catálogo y
Guía de Referencia de GIBCO (Invitrogen Corporation, Carlsbad,
California), en el Manual de DIFCO (DIFCO; Norwood, Massachusetts)
y en
los Catálogos de Cultivo Celular de Sigma para el cultivo de células animales y vegetales (Sigma; St. Louis, Missouri).
los Catálogos de Cultivo Celular de Sigma para el cultivo de células animales y vegetales (Sigma; St. Louis, Missouri).
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de la presente invención
prevén la preparación de los medios nutritivos, complementos de
medios, subgrupos de medios y tampones en polvo descritos
anteriormente. Estos medios, complementos, subgrupos y tampones en
polvo se preparan usando aglomeración (por ejemplo, tecnología de
lecho fluidizado) y opcionalmente por medio de secado por
pulverización.
En una realización, los medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo se
preparan usando la tecnología de lecho fluidizado para aglomerar las
disoluciones de los medios, complementos de medios, subgrupos de
medios o tampones, produciendo de ese modo sus formas en polvo seco.
La tecnología de lecho fluidizado es un proceso de producción de
polvos aglomerados que tienen características alteradas
(particularmente, por ejemplo, la solubilidad) a partir de los
materiales de partida. En las aplicaciones generales de la
tecnología, los polvos se suspenden en una columna de aire con
movimiento ascendente mientras que al mismo tiempo una cantidad
controlada y definida de líquido se inyecta en el flujo de polvo
para producir un estado humedecido del polvo; luego se usa calor
suave para proporcionar la energía para el secado del material,
produciéndose de ese modo un polvo aglomerado.
Están disponibles comercialmente aparatos para
producir y/o procesar materiales particulados mediante la tecnología
de lecho fluidizado (por ejemplo, de Niro,
Inc./Aeromatic-Fielder; Columbia, Maryland), y se
describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.^{os}
3.771.237; 4.885.848; 5.133.137; 5.357.688 y 5.392.351; y en el
documento WO 95/13867. La aglomeración también incluye variaciones
en la tecnología de lecho fluidizado tradicional o adiciones a la
tecnología de lecho fluidizado convencional tales como mezcladoras
Processall Mixmill, mezcladora/extrusora
Extrud-O-Mix, mezcladora/recubridora
Turbulizer y extrusora/granuladora Bextruder. Véanse, por ejemplo,
los productos de Hosokawa Bepex Corporation, 333 NE Taft St.,
Minneapolis, MN 55413-2810 y sus competidores.
Tales aparatos se han usado para preparar los polvos aglomerados de
diversos materiales, incluyendo suero de leche (patente
estadounidense n.º 5.006.204), emulsiones de carne aciduladas
(patente estadounidense n.º 4.511.592), proteasas (patente
estadounidense n.º 4.689.297) y otras proteínas (documento DK 167090
B1) y bicarbonato de sodio (patente estadounidense n.º
5.325.606).
Según esta realización, puede usarse la
tecnología de lecho fluidizado para preparar medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios y tampones aglomerados
en volumen. En la práctica de esta realización, se coloca un medio
nutritivo, complemento de medio o tampón en polvo seco en una
máquina de aglomeración, por ejemplo, un aparato de lecho
fluidizado y se somete a la aglomeración en su interior. Los medios
nutritivos en polvo (particularmente medios de cultivo celular en
polvo), complementos de medios en polvo (particularmente sueros
animales en polvo) y tampones en polvo (particularmente soluciones
salinas tamponadas en polvo), pueden obtenerse preparadas
previamente de fuentes comerciales (por ejemplo, Invitrogen
Corporation, Carlsbad California). Alternativamente, los medios
nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones
en polvo pueden prepararse mezclando componentes individuales o
conjuntos de componentes según las formulaciones descritas
anteriormente. Tales formulaciones pueden incluir componentes que
normalmente no están presentes en las formulaciones de medios
nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones
en polvo debido a su inestabilidad, tales como suero,
L-glutamina, cistina, insulina, transferrina,
lípidos (particularmente fosfolípidos, esfingolípidos, ácidos
grasos y colesterol), citocinas (particularmente factores de
crecimiento, interleucinas, factores estimulantes de colonias e
interferones), neurotransmisores y tampones (particularmente
bicarbonato de sodio). Si se añade L-glutamina a la
formulación, puede ser en forma de un complejo con cationes
divalentes tales como calcio o magnesio (véase la patente
estadounidense n.º 5.474.931). En otro ejemplo, pueden mezclarse dos
o más componentes en polvo y entonces aglomerarse para producir
medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones
complejos. Por ejemplo, puede mezclarse un medio nutritivo en polvo
con un suero en polvo (producido, por ejemplo, mediante secado por
pulverización tal como se describe a continuación) tal como FBS a
una concentración de suero de aproximadamente el 0,1%, 0,2%, 0,5%,
1%, 2%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% o superior (p/p
como un porcentaje del medio en polvo); la mezcla de
suero-medio en polvo resultante puede entonces
aglomerarse para producir un complejo de
suero-medio aglomerado que se disolverá fácilmente
en un disolvente de reconstitución y por tanto estará listo para su
uso sin complementación adicional.
Una vez que se coloca el medio nutritivo,
complemento de medios, subgrupo de medios o tampón en polvo (o
mezcla de los mismos) en el aparato de lecho fluidizado, se somete
a suspensión en una columna con movimiento ascendente de un gas,
preferiblemente aire atmosférico o un gas inerte tal como nitrógeno,
y se hace pasar a través de uno o más filtros de partículas. Dado
que la mayoría de los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios y tampones no aglomerados, de polvo seco son de
un tamaño de partícula relativamente pequeño, los filtros que han
de usarse en la invención deben ser tamices de mallas que permitan
que el aire fluya a su través pero que retengan los polvos, por
ejemplo filtros de aproximadamente 1-100 de malla,
preferiblemente de aproximadamente 2-50 de malla,
más preferiblemente de aproximadamente 2,5-35 de
malla, todavía más preferiblemente de aproximadamente
3-20 de malla o de aproximadamente
3,5-15 de malla y lo más preferiblemente de
aproximadamente 4-6 de malla.
Tras la colocación dentro de la cámara de lecho
fluidizado, el medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de
medios o tampón de polvo seco (o mezcla de los mismos) se somete
entonces a aglomeración inyectando, preferiblemente usando una
boquilla de pulverización en el aparato de lecho fluidizado, una
cantidad definida y controlada de disolvente en el polvo, para
producir un polvo humedecido. Los disolventes preferidos para su uso
en la presente invención incluyen cualquier disolvente que sea
compatible con la formulación del medio nutritivo, complemento de
medios, subgrupo de medios o tampón. Por "compatible" se
entiende que el disolvente no induce cambios perjudiciales
irreversibles en las características físicas o de rendimiento del
medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o
tampón, tales como degradación de los componentes de nutrientes del
medio nutritivo o cambios en las características iónicas del
tampón. Disolventes particularmente preferidos para su uso en la
invención son el agua (lo más particularmente agua destilada y/o
desionizada), suero (particularmente suero bovino o humano y lo más
particularmente suero de ternero o suero bovino fetal), disolventes
orgánicos (particularmente dimetilsulfóxido, alcoholes (por
ejemplo, metanol, etanol, glicoles, etc.), éteres (por ejemplo,
MEK), cetonas (por ejemplo, acetona), y similares), y cualquier
combinación o secuencia de los mismos, pudiendo contener cualquiera
de los mismos uno o más componentes adicionales (por ejemplo, sales,
polisacáridos, iones, detergentes, estabilizadores, etc.).
Puede ser deseable o ventajoso incluir en el
disolvente uno o más componentes que, debido a las concentraciones
de los componentes requeridos en el producto final, no pueden
incorporarse de manera óptima en el producto mediante otros
procedimientos tales como la molienda con molino de bolas. El/los
componente(s) puede(n) disolverse, suspenderse,
formarse como coloides o introducirse de otra manera en el
disolvente a la concentración deseada, antes del uso del disolvente
en la aglomeración del medio, complemento de medios, subgrupo de
medios o tampón en polvo de la invención. Los componentes pueden
incorporarse ventajosamente en el disolvente de tal manera
incluyen, pero no se limitan a, uno más de los sueros, hormonas,
citocinas, neurotransmisores, lípidos, factores de adhesión,
proteínas, aminoácidos, vitaminas, cofactores enzimáticos,
polisacáridos, sales, iones, tampones y similares descritos
anteriormente.
El/los disolvente(s) debe(n)
introducirse en el polvo seco en un volumen que depende de la masa
del medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón en
polvo que va a aglomerarse. Los volúmenes preferidos de disolvente
por 500 gramos de medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo
de medios o tampón son de aproximadamente 5-100 ml,
más preferiblemente de aproximadamente 10-50 ml,
todavía más preferiblemente de aproximadamente
25-50 ml, y lo más preferiblemente de
aproximadamente 35 ml. Por supuesto, un experto se da cuenta de que
las consideraciones de escala influirán en el volumen y la velocidad
o el suministro del disolvente. Velocidades de introducción de
disolvente preferidas por 500 gramos de medio nutritivo, complemento
de medios, subgrupo de medios o tampón son una velocidad de
aproximadamente 1-10 ml/min., preferiblemente de
aproximadamente 2-8 ml/min., más preferiblemente de
aproximadamente 4-8 ml/min. y lo más preferiblemente
de aproximadamente 6 ml/min. En algunas situaciones, puede ser
deseable realizar ciclos entre añadir disolvente durante
aproximadamente un minuto y luego no añadir disolvente durante
aproximadamente un minuto (permitiendo el secado del polvo dentro
de la cámara del aparato), de manera que se impida la aglutinación
del polvo durante la aglomeración. En algunas situaciones puede ser
deseable realizar ciclos entre añadir un primer disolvente y un
segundo o tercer disolvente, con o sin un periodo en el que no se
añade disolvente. En algunas situaciones puede ser deseable añadir
varios disolventes de manera coincidente desde orificios separados
dentro del aparato.
Una vez que la aglomeración del polvo es
completa, como se evidencia por un mayor tamaño de partícula que el
del polvo no aglomerado, original y por la ausencia de partículas de
polvo fino en el polvo aglomerado, se seca completamente el polvo
en el aparato. En algunas situaciones puede ser deseable secar
parcial o completamente un polvo antes de añadir ingredientes
adicionales con un segundo o tercer disolvente. En algunas
situaciones puede ser deseable usar un disolvente anterior, por
ejemplo, un primer disolvente como un disolvente posterior, por
ejemplo, un tercer disolvente. En algunas situaciones puede ser
deseable usar un disolvente sencillo como, por ejemplo, primer
disolvente y un disolvente complejo, por ejemplo, como segundo
disolvente. Un experto apreciará que son posibles muchos órdenes y
secuencias y que pueden determinarse las condiciones óptimas
mediante procedimientos simples conocidos en la técnica.
Temperaturas preferidas de los aparatos para el secado del polvo
aglomerado son de aproximadamente 50-80ºC, más
preferiblemente de aproximadamente 55-75ºC, y lo más
preferiblemente de aproximadamente 60-65ºC; el
polvo se seca preferiblemente en el aparato durante aproximadamente
3-10 minutos y lo más preferiblemente durante
aproximadamente 5-7 minutos, por 500 gramos de
polvo. Se elige la temperatura de tal manera que se eviten efectos
perjudiciales tales como la desnaturalización irreversible de los
ingredientes. Temperaturas superiores, por ejemplo, de
80-150ºC, o temperaturas superiores o inferiores,
por ejemplo, de 20-40ºC pueden ser especialmente
ventajosas cuando se usan disolventes menos volátiles o más
volátiles, respectivamente.
Se elige el flujo de aire para mantener las
condiciones de fluido en el lecho. La temperatura se puede ajustar
para retener el líquido introducido en el aparato durante un periodo
de tiempo que permita una aglomeración suficiente. La aglomeración
es generalmente suficiente cuando las partículas son de mayor tamaño
que los polvos que van a aglomerarse y cuando los ingredientes
introducidos con el disolvente se asimilan en partículas de mayor
tamaño. Por ejemplo, cuando se usan disolventes más volátiles, puede
usarse una temperatura inferior, por ejemplo, de -10ºC, 0ºC, 5ºC,
10ºC, 20ºC, 25ºC, 35ºC o 40ºC. Un experto apreciará que según se
volatilice(n) el/los disolvente(s), se requiere
energía que tenderá a enfriar la mezcla de aglomeración. Por tanto,
la temperatura puede controlarse mediante el control del tipo y la
velocidad de suministro de disolvente y la velocidad de
calentamiento de la mezcla. La aglomeración de los ingredientes
disueltos se logra preferiblemente cuando el líquido puede actuar
como un agente para unir, por ejemplo, mediante fuerzas
superficiales, polvos más pequeños, ingredientes disueltos o
ingredientes suspendidos o formados como coloides a la mezcla de
aglomeración en el lecho. Por tanto, la temperatura de aglomeración
variará con el disolvente en uso, con la velocidad de flujo que
mantiene el lecho fluidizado, la velocidad de suministro del/de los
disolvente(s), la velocidad de volatilización del/de los
disolvente(s) y la velocidad de calentamiento. La temperatura
puede oscilar, por ejemplo, desde un límite inferior, por ejemplo,
-20ºC, -10ºC, 0ºC, 5ºC, 10ºC, 20ºC, 25ºC, 35ºC, 40ºC o 50ºC cuando
se usan disolventes volátiles o durante un tiempo de residencia más
largo del líquido para efectuar la aglomeración, hasta un límite
superior, por ejemplo, 40ºC, 50ºC, 60ºC, 65ºC, 75ºC, 85ºC, 90ºC,
95ºC, 100ºC, 110ºC, 120ºC, 125ºC, 140ºC, 150ºC, 175ºC, 200ºC,
220ºC, 240ºC, 250ºC, 275ºC, 300ºC o más para disolventes menos
volátiles, para una volatilización más rápida y cuando es necesario
menos tiempo de aglomeración. Por ejemplo, cuando se están usando
múltiples disolventes o bien de manera coincidente o bien de manera
secuencial, el disolvente menos volátil puede ser suficiente para
la aglomeración permitiendo una volatilización más rápida de un
disolvente más volátil.
Puede usarse una mezcla de disolventes para
controlar el tiempo de volatilización de modo que el líquido resida
en el aparato durante un tiempo suficiente para efectuar la
aglomeración. Por ejemplo, puede usarse una mezcla de un disolvente
más volátil, por ejemplo, un disolvente orgánico tal como alcohol,
especialmente etanol, y un disolvente menos volátil, por ejemplo,
un disolvente polar tal como el agua. Por ejemplo, un ingrediente
insoluble o escasamente soluble en un disolvente polar puede ser
soluble en un disolvente orgánico. El ingrediente puede ser soluble
en una mezcla de disolvente polar y orgánico. Por tanto, algunas
realizaciones usan una mezcla de disolvente orgánico y polar para
suministrar uno o más ingredientes. La mezcla de disolventes, es
decir, la razón del disolvente polar con respecto al orgánico
variará con el/los ingrediente(s) que vayan a asimilarse en
el lecho. Los parámetros que van a usarse en la elección de la
mezcla incluirán la solubilidad, por ejemplo, la razón podría
ajustarse para contener la mínima cantidad de disolvente orgánico
que suministrará la cantidad deseada del/de los
ingrediente(s) para la aglomeración; la volatilidad, por
ejemplo, la razón puede ajustarse para contener un disolvente menos
volátil que dé como resultado una aglomeración suficiente;
preocupaciones sobre seguridad o normativas, por ejemplo, la razón
podría ajustarse para contener una mínima cantidad de disolvente
orgánico que sea suficiente para la solvatación y aglomeración en el
lecho pero que no presente riesgos indebidos para el lugar de
trabajo o el entorno o pueden elegirse o evitarse disolventes
específicos para cumplir con las normativas; las condiciones del
lecho, por ejemplo, la mezcla puede elegirse de modo que se logre
una temperatura y/o flujo deseados suficientes para la aglomeración;
usos específicos del polvo de los medios, por ejemplo, para algunos
usos, los protocolos de fabricación incluirán preferiblemente uno o
más disolventes, mientras que excluirán o prohibirán preferiblemente
otros disolventes; y la compatibilidad con el aparato, por ejemplo,
disolventes o mezclas de disolvente que permitan la fácil
introducción a través de un orificio o boquilla y que no daña de
manera inaceptable los componentes de los aparatos. La mezcla puede
introducirse de varias maneras. Por ejemplo, puede prepararse una
mezcla de disolventes, opcionalmente con uno o más ingredientes
solubles, formados como coloides o suspendidos, y suministrarse como
una mezcla a través de un orificio o boquilla. Otra manera en que
puede obtenerse una mezcla es introduciendo disolventes separados o
mezclas de disolventes a través de rutas separadas. Por ejemplo, la
separación puede ser espacial, podrían usarse múltiples orificios o
boquillas; la separación podría ser temporal, los disolventes o
mezclas podrían introducirse secuencialmente a través de un único
orificio o boquilla o a través de orificios o boquillas separados;
la separación puede implicar diferentes fases, puede introducirse un
disolvente como un vapor antes, durante y/o después de la
introducción de un disolvente en una fase líquida, o puede
suministrarse un disolvente como un componente sólido al lecho y
volatilizarse durante el funcionamiento del lecho; etc. Cualquier
medio para la introducción se aplicará igualmente para suministrar
los disolventes o las mezclas de disolventes.
En otra realización de la invención, pueden
prepararse los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos
de medios y tampones en polvo mediante secado por pulverización. En
este aspecto de la invención, los medios nutritivos, complementos
de medios, subgrupos de medios y tampones en sus formas líquidas se
colocan en un aparato de secado por pulverización; estos líquidos
se convierten entonces en sus polvos correspondientes mediante la
pulverización de la disolución dentro de una cámara en el aparato en
condiciones apropiadas para producir los polvos, tales como a
temperatura y humedad controladas, hasta que se formen los polvos.
En algunas situaciones, puede ser deseable o ventajoso secar por
pulverización mezclas complejas de dos o más de los medios,
complementos de medios, subgrupos de medios y/o tampones descritos
anteriormente. Por ejemplo, pueden mezclarse medios nutritivos
líquidos que contienen sueros animales a una concentración deseada,
o sueros animales líquidos que contienen componentes de medios
nutritivos a concentraciones deseadas, y entonces prepararse como
polvos secados por pulverización según los procedimientos de la
invención. El secado por pulverización y otros procedimientos para
obtener polvos pueden proporcionar ingredientes de polvo para la
aglomeración.
En un enfoque típico de secado por
pulverización, los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios y tampones líquidos se aspiran en el aparato y
se atomizan en una pulverización con un atomizador de tipo
giratorio o de boquilla. La pulverización líquida atomizada
resultante se mezcla entonces con un gas (por ejemplo, nitrógeno o
más preferiblemente aire) y se pulveriza en una cámara de secado en
condiciones suficientes para promover la producción de un producto
en polvo. Estas condiciones pueden comprender el control
electrónico de la temperatura y la humedad dentro de la cámara de
tal manera que se promueve el secado final del producto. En estas
condiciones, el disolvente en el líquido se evapora de manera
controlada, formándose de ese modo partículas de flujo libre (es
decir, polvo) de los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios o tampones de la invención. Entonces se descarga
el polvo de la cámara de secado, y se hace pasar a través de uno o
más filtros (tales como la tamices de malla descritos anteriormente
para la preparación de lecho fluidizado) y se recoge para su
procesamiento adicional (por ejemplo, envasado, esterilización,
etc.). En algunas aplicaciones, particularmente cuando se producen
polvos a partir de formulaciones sensibles al calor de medios
nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones,
el aparato de secado por pulverización puede combinarse con un
aparato de lecho fluidizado integrado dentro de la cámara de secado,
lo que permite la introducción de disolventes de aglomeración tales
como los descritos anteriormente en el polvo secado por
pulverización para producir medios nutritivos, complementos de
medios, subgrupos de medios y tampones en polvo secados por
pulverización aglomerados.
Los aparatos para producir materiales
particulados a partir de materiales líquidos mediante secado por
pulverización (con o sin la tecnología de lecho fluidizado
integrado) están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Niro,
Inc./Aeromatic-Fielder; Columbia, Maryland), y se
describen, por ejemplo, en los folletos técnicos "Spray
Drying" ("Secado por pulverización"), "Powdered
Pharmaceuticals by Spray Drying" ("Productos farmacéuticos en
polvo mediante secado por pulverización") y "Fresh Options in
Drying" ("Nuevas opciones de secado") de Niro,
Inc./Aeromatic-Fielder, cuyas descripciones se
incorporan como referencia al presente documento en su totalidad.
Según este fabricante, tales aparatos se han utilizado para preparar
polvos de diversos materiales, incluyendo productos lácteos,
analgésicos, antibióticos, vacunas, vitaminas, levaduras, proteínas
vegetales, huevos, productos químicos, aromatizantes alimentarios y
similares. En la presente invención, se ha descubierto que el
secado por pulverización es particularmente útil para la preparación
de complementos de medios en polvo, tales como sueros y en
particular aquellos sueros descritos anteriormente, lo más
particularmente sueros bovinos y humanos (tales como suero de
ternero y suero bovino fetal).
En la práctica de esta realización de la
invención, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos
de medios, tampones o agentes de ajuste del pH líquidos pueden
pulverizarse en la cámara a través del atomizador a una velocidad
de pulverización de aproximadamente 25 a 100 g/min., preferiblemente
a una velocidad de pulverización de aproximadamente
30-90 g/min., 35-85 g/min.,
40-80 g/min., 45-75 g/min.,
50-75 g/min., 55-70 g/min. o
60-65 g/min., y más preferiblemente a
aproximadamente 65 g/min.. La temperatura del aire de entrada en el
atomizador se ajusta preferiblemente a aproximadamente
100-300ºC, más preferiblemente a aproximadamente
150- 250ºC, y lo más preferiblemente a aproximadamente 200ºC, con
una temperatura de salida de aproximadamente
50-100ºC, más preferiblemente de aproximadamente
60-80ºC, y lo más preferiblemente aproximadamente
70ºC. El flujo de aire en el atomizador se ajusta preferiblemente a
aproximadamente 50-100 kg/h, más preferiblemente de
aproximadamente 75-90 kg/h, y lo más
preferiblemente de aproximadamente 80,0 kg/h, a una presión en la
boquilla de aproximadamente 100-500 kPa, más
preferiblemente de aproximadamente 200-300 kPa, y lo
más preferiblemente de aproximadamente 200 kPa. Se ha encontrado en
la presente invención que estas condiciones y ajustes son
preferibles para la producción de una variedad de polvos de medios
nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones
mediante secado por pulverización, particularmente para la
producción de los sueros en polvo descritos anteriormente. Tras el
secado, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de
medios o tampones en polvo secados por pulverización pueden
recogerse en la cámara de secado a través de uno o más filtros,
preferiblemente tales como aquellos descritos anteriormente para la
tecnología de lecho fluidizado.
\global\parskip0.800000\baselineskip
Tras esta preparación, los polvos de la
invención preparados mediante los procedimientos de lecho fluidizado
o de secado por pulverización descritos anteriormente tienen
características físicas alteradas con respecto a las de los polvos
de partida o a las de los medios, complementos, subgrupos y tampones
en polvo preparados liofilizando los correspondientes líquidos. Por
ejemplo, los polvos no procesados o liofilizados con frecuencia
producen un significativo polvo fino cuando se usan, y se disuelven
escasa o lentamente en diversos disolventes, mientras que los
aglomerados están sustancialmente libres de polvo fino y/o se
disuelven rápidamente. Normalmente, los medios, complementos de
medios, subgrupos de medios y tampones en polvo de la invención
presentarán tanto una formación de polvo fino reducida como una
disolución más rápida que sus equivalentes en polvo preparados
mediante técnicas convencionales tales como la molienda con molino
de bolas. En algunos polvos que están sustancialmente libres de
polvo fino pero que no pueden demostrar una disolución mejorada, los
polvos pueden disolverse rápidamente mediante solvatación mecánica
rápida del polvo, tal como usando una rueda de paletas mecánica, o
en primer lugar proporcionando una niebla de disolvente sobre el
polvo tal como mediante solvatación por pulverización.
Por tanto, en una realización de la invención,
los enfoques de secado por pulverización y aglomeración descritos
anteriormente se combinan para producir polvos de medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios y tampones secados por
pulverización aglomerados. En esta realización, un medio,
complemento, subgrupo o tampón en polvo que se ha preparado
mediante secado por pulverización puede, tras haberse secado por
pulverización, aglomerarse entonces con un disolvente (tales como
aquellos descritos anteriormente) para mejorar adicionalmente las
características físicas y de rendimiento del medio, complemento,
subgrupo o tampón resultante. Por ejemplo, puede prepararse un
polvo de suero de animal secando por pulverización suero animal
líquido tal como se describió anteriormente, y este polvo de suero
secado por pulverización puede mezclarse entonces en los medios
nutritivos de polvo seco (preparados mediante secado por
pulverización o mediante técnicas convencionales tales como la
molienda con molino de bolas); este polvo mezclado puede aglomerarse
entonces tal como se describió anteriormente. Alternativamente, un
polvo de medio nutritivo, complemento de medio, subgrupo de medio o
tampón secado por pulverización puede aglomerarse como
anteriormente, para mejorar las propiedades de disolución del polvo.
Este enfoque puede ser particularmente ventajoso cuando se secan
por pulverización líquidos con bajo contenido en sólidos
(aproximadamente del 1-10%), tal como sueros
animales líquidos. Como apreciará un experto, estos enfoques
facilitarán la preparación de un lote grande de uno o más
componentes (por ejemplo, sueros u otros complementos de medios)
que se usan como una reserva para la adición a un medio,
complemento, subgrupo o tampón en polvo a una concentración
deseada, mientras que también se obtienen los beneficios de la
aglomeración descritos anteriormente. Además, este enfoque puede
reducir la variabilidad entre lotes, lo que puede ser un problema
con ciertos complementos de medios (particularmente sueros
animales).
Los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios o tampones en polvo aglomerados o secados por
pulverización preparados tal como se describió anteriormente pueden
envasarse entonces, por ejemplo en recipientes tales como viales,
tubos, botellas, bolsas, sobres, cajas, cajas de cartón, bidones y
similares, antes de o tras la esterilización tal como se describe a
continuación. Los medios, complementos de medios, subgrupos de
medios o tampones en polvo pueden envasarse en una forma envasada al
vacío, compacta, tal como la conocida en la técnica como "envase
tipo brick" en el que se envasa el polvo en un recipiente
flexible (tal como una bolsa o un sobre) que se sella mientras se
practica el vacío. Tales envases pueden comprender ventajosamente
una o más orificios de entrada (tales como válvulas, orificios de
cierre tipo luer, etc.) que permiten la introducción de un
disolvente (por ejemplo, agua, sueros, medios u otros disolventes o
disoluciones acuosos u orgánicos) directamente en el envase para
facilitar la rápida disolución del polvo. El envase puede
comprender dos o más compartimentos adyacentes, uno o más de los
cuales pueden contener uno o más de los medios, complementos de
medios, subgrupos de medios o tampones de polvo seco de la invención
y uno u otros más de los cuales pueden contener uno o más
disolventes acuosos u orgánicos que pueden ser estériles. Entonces,
el polvo seco puede disolverse simplemente eliminando o rompiendo
la barrera entre los compartimentos, de manera ideal sin pérdida de
esterilidad, para permitir la mezcla del polvo y el disolvente de
tal manera que el polvo se disuelve y produce un medio nutritivo,
complemento de medio, subgrupo de medio o tampón estéril a una
concentración deseada.
Los medios, complementos de medios, subgrupos de
medios y tampones envasados de la invención se almacenan
preferiblemente durante tiempos prolongados, y a las temperaturas,
indicadas anteriormente, normalmente durante aproximadamente
1-24 meses a temperaturas inferiores a
aproximadamente 30ºC, más preferiblemente a temperaturas inferiores
a aproximadamente 20-25ºC, hasta su uso. A
diferencia de los medios, complementos de medios, subgrupos de
medios o tampones en polvo tradicionales, el almacenamiento a
temperaturas reducidas (por ejemplo, 0-4ºC) no es
necesario para el mantenimiento de las características de
rendimiento de los medios, complementos de medios, subgrupos de
medios y tampones preparados mediante los presentes procedimientos.
Por supuesto, pueden requerirse otras temperaturas de
almacenamiento para aquellos aspectos de la invención en los que los
envases también comprenden compartimentos separados que contienen
uno o más disolventes; en estos casos, las condiciones de
almacenamiento óptimas estarán impuestas por los requisitos de
almacenamiento del/de los disolvente(s) que conocerá el
experto.
\vskip1.000000\baselineskip
Una ventaja particular de la presente invención
son los procedimientos que logran la aglomeración de lípidos e
ingredientes no suficientemente solubles en preparaciones de
disolventes acuosos comunes en los medios de polvo seco.
Convencionalmente, tales ingredientes se han añadido en
procedimientos por debajo del nivel óptimo, por ejemplo, como
concentrados disueltos en disolvente orgánico. Mediante los
procedimientos de la presente invención, pueden conseguirse medios
de polvo seco que contienen solutos no acuosos deseados.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Son ejemplos de tales solutos no acuosos: ácidos
grasos, grasas neutras, ceras, esteroides y compuestos esteroideos,
fosfátidos, glicolípidos (por ejemplo, esfingosinas, cerebrósidos,
ceramidas, gangliósidos), lipoproteínas, fosfolípidos,
fosfoglicéridos (por ejemplo, etanolaminas tales como
fosfatidiletanolamina o fosfoglicérido de etanolamina, colinas
tales como fosfatidilcolina o fosfoglicérido de colina),
lipoaminoácidos, cardiolipina y compuestos relacionados,
plasmalógenos, esteroles (por ejemplo, colesterol, lanosterol),
terpenos, vitaminas liposolubles (por ejemplo, vitamina A y sus
vitámeros, vitamina E y sus vitámeros, vitamina K y sus vitámeros,
vitamina D y sus vitámeros). Las proteínas liposolubles también son
ejemplos de lípidos tal como se usan en los medios en aspectos de la
presente invención.
Un aspecto de la presente invención comprende
procedimientos para incorporar de uno o más lípidos en un polvo
seco. Los lípidos pueden introducirse suministrando un disolvente
que contiene el/los lípido(s) a un lecho de aglomeración.
Por ejemplo, un disolvente orgánico que contiene el/los
lípido(s) puede introducirse en el aparato de aglomeración.
Preferiblemente, se usa un disolvente de baja toxicidad. Dependiendo
del tipo celular para el que está preparándose el medio, pueden
preferirse disolventes tales como alcoholes, por ejemplo, metanol o
etanol. Los disolventes pueden disolver perfectamente el/los
componente(s) lipídico (s) o pueden disolver el/los
componente(s) en presencia de otro(s)
disolvente(s) o soluto(s). Tras la disolución, puede
añadirse otro componente, por ejemplo, otro lípido o disolvente.
La mezcla de disolventes que va a introducirse
en el aparato puede introducirse antes de, después y/o durante el
suministro de otro disolvente o mezcla. El otro disolvente o mezcla
puede contener alguno del/de los mismo(s)
disolvente(s) o componente(s) como la mezcla de
disolventes. Por tanto, una mezcla de disolventes puede contener
cualquier razón de disolventes. Por ejemplo, mezclas preferidas de
disolventes que van a usarse en la mezcla de disolventes pueden
contener agua y alcohol, más preferiblemente, por ejemplo, para la
mayoría de células de mamíferos, agua y etanol. La razón se
seleccionará según los parámetros descritos anteriormente y por
ejemplo puede ser de tan sólo aproximadamente, por ejemplo, el 1,
5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 33, 40, 50, 60, 67, 70, 75 o de hasta el
80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de etanol (v/v), siendo el resto
predominantemente agua. Ocasionalmente, los lípidos por sí mismos
pueden actuar parcialmente como disolventes. Otros disolventes
orgánicos tales como aquellos ejemplificados anteriormente pueden
usarse en razones similares. Un experto apreciará que lípidos
diferentes pueden requerir disolventes, mezclas de disolventes y
razones de mezclas de disolventes diferentes para el proceso de
aglomeración. Cuando se usan varios disolventes orgánicos, pueden
usarse secuencialmente o pueden mezclarse juntos en forma líquida.
La concentración de cada uno puede ser similar a los porcentajes
ejemplificados anteriormente.
Inesperadamente, los presentes inventores han
encontrado que una mezcla de agua y etanol funciona mejor que
cualquiera de los dos por separado para suministrar lípidos a la
aglomeración de polvo seco. Se cree que los parámetros tratados
anteriormente, por ejemplo, relativos a la temperatura de
solubilidad y tiempo de secado están detrás de este hallazgo
inesperado. Siguiendo el ejemplo del etanol y agua, los inventores
creen que un experto apreciará los beneficios y compromisos
impuestos por otras mezclas de disolventes y solutos.
La invención también incluye realizaciones en
las que los lípidos se aglomeran en el polvo seco tras su
modificación para aumentar la solubilidad en agua. Por ejemplo, el
lípido puede hacerse iónico mediante su conversión en una sal, por
ejemplo, puede saponificarse un ácido graso. Un experto apreciará
otros medios tales como la hidroxilación o esterificación que
mejorarán la solubilidad en agua. El lípido cuya solubilidad se ha
mejorado puede añadirse en un disolvente acuoso o puede añadirse en
una mezcla de disolventes. Por ejemplo, la mejora de la solubilidad
puede permitir que se use una menor cantidad de disolvente
orgánico.
Otro aspecto de la presente descripción implica
el uso de productos químicos que pueden asociarse o complejarse con
estructuras lipídicas para dar como resultado la solubilidad de
lípidos en entornos acuosos. Tales interacciones pueden deberse a
la formación de micelas en las que la parte hidrófoba de la molécula
que provoca la formación de la micela contendrá el resto lipídico y
la parte hidrófila de la molécula que provoca la formación de la
micela se disolverá en un entorno acuoso dando como resultado la
solubilización de lípidos en un entorno acuoso. (Ejemplo: Pluronic
F-68 u otros agentes tensioactivos). Otras
interacciones similares, a las que se refiere la invención, pueden
resultar de compuestos tales como ciclodextrinas que pueden
solubilizar (reparto, complejación física) lípidos dentro de la
estructura de la ciclodextrina y mantener esa complejación física
tras la adición a entornos acuosos, efectuando así la solubilidad
de dicho lípido en dicho entorno acuoso. (Ejemplo:
\beta-metilciclodextrina).
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en el presente documento
procedimientos para esterilizar medios nutritivos, complementos de
medios, subgrupos de medios y tampones de la invención, así como
para esterilizar medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios y tampones en polvo preparados mediante
procedimientos convencionales tales como molienda con molino de
bolas o liofilización. Puesto que los medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios y tampones se preparan
normalmente en disoluciones de gran volumen y con frecuencia
contienen componentes termolábiles, no son susceptibles de
esterilización mediante irradiación o mediante calentamiento. Por
tanto, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de
medios y tampones se esterilizan comúnmente mediante procedimientos
de eliminación de contaminantes tales como la filtración, lo que
aumenta significativamente el gasto y tiempo requeridos para
fabricar tales medios, complementos de medios, subgrupos de medios
y
tampones.
tampones.
Los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios y tampones en polvo preparados según los
procedimientos de la invención (por ejemplo, mediante secado por
pulverización de los medios, complementos de medios, subgrupos de
medios o tampones líquidos, o mediante la aglomeración de los
medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en
polvo), sin embargo, pueden esterilizarse mediante procedimientos
menos costosos y más eficaces. Por ejemplo, medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo
(preparados tal como se describió anteriormente) pueden irradiarse
en condiciones que favorecen la esterilización de estos polvos.
Preferiblemente, esta irradiación se lleva a cabo en volumen (es
decir, después del envasado del medio nutritivo, complemento de
medios, subgrupo de medios o tampón), y lo más preferiblemente esta
irradiación se lleva a cabo mediante la exposición del medio,
complemento de medios, subgrupo de medios o tampón envasado en
volumen de la invención a una fuente de rayos gamma en condiciones
tales que las bacterias, hongos, esporas o virus que puedan residir
en los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o
tampones en polvo se inactiven (es decir, impedir que se repliquen).
Alternativamente, la irradiación puede llevarse a cabo mediante la
exposición de los medios, complementos de medios, subgrupos de
medios o tampones en polvo, antes del envasado, a una fuente de
rayos gamma o una fuente de luz ultravioleta. Los medios,
complementos de medios, subgrupos de medios y tampones de la
invención pueden esterilizarse alternativamente mediante
tratamiento térmico (si los subgrupos de los medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios o tampón son
termoestables), por ejemplo por pasteurización instantánea o
tratamiento en autoclave. Como comprenderá un experto en la
técnica, la dosis de irradiación o calor, y el tiempo de exposición,
requeridos para la esterilización dependen del volumen de los
materiales que vayan a esterilizarse.
Los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios o tampones en polvo a granel pueden exponerse a
una fuente de irradiación a una dosificación total de
aproximadamente 10-100 kilograys (kGy),
preferiblemente a una dosificación total de aproximadamente
15-75 kGy, 15-50 kGy,
15-kGy o 20-40 kGy, más
preferiblemente a una dosificación total de aproximadamente
20-30 kGy, y lo más preferiblemente a una
dosificación total de aproximadamente 25 kGy, durante de
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 7 días, más preferiblemente
de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 días, de 1 hora a
aproximadamente 3 días, durante aproximadamente
1-24 horas o durante aproximadamente
1-5 horas, y lo más preferiblemente durante
aproximadamente 1-3 horas ("tasa de dosis
normal"). Alternativamente, los polvos en volumen de la invención
pueden esterilizarse a una "tasa de dosis lenta" de una
dosificación total de aproximadamente 25-100 kGy
durante un periodo de aproximadamente 1-5 días.
Durante la irradiación, los medios nutritivos, complementos de
medios, subgrupos de medios o tampones en polvo se almacenan
preferiblemente a una temperatura de aproximadamente -70ºC a
aproximadamente temperatura ambiente (aproximadamente
20-25ºC), lo más preferiblemente a -70ºC. Un experto
apreciará, por supuesto, que la dosis de radiación y los tiempos de
exposición pueden ajustarse dependiendo del volumen y/o la masa del
material que vaya a irradiarse; las dosificaciones de irradiación,
tiempos de exposición y temperaturas de almacenamiento óptimos
típicos requeridos para la esterilización de materiales en polvo en
volumen mediante irradiación o tratamiento térmico se conocen bien
en la técnica.
Tras la esterilización, los medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios y tampones sin envasar
pueden envasarse en condiciones asépticas, por ejemplo envasando los
medios, complementos de medios, subgrupos de medios u tampones en
recipientes tales como tubos, viales, botellas, bolsas, sobres,
cajas, cajas de cartón, bidones estériles y similares, o en el
envasado a vacío o el envasado de polvo/disolvente integrado
descritos anteriormente. Los medios, complementos de medios,
subgrupos de medios y tampones envasados estériles pueden
almacenarse entonces durante periodos de tiempo prolongados tal como
se describió anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, la presente invención proporciona
medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y
tampones en polvo que son fácilmente solubles en un disolvente de
rehidratación y que están sustancialmente libres de polvo fino.
Para su uso, el medio, complemento de medios, subgrupo de medios o
tampón aglomerado o secado por pulverización pueden hidratarse (o
"reconstituirse") en un volumen de un disolvente suficiente
para producir las condiciones de nutrientes, electrolitos, iónicas y
de pH deseadas requeridas para el uso particular del medio,
complemento de medios, subgrupo de medios o tampón solvatado. Esta
reconstitución se facilita particularmente en la presente
invención, dado que los presentes medios, complementos de medios,
subgrupos de medios y tampones se disolverán rápidamente y
producirán poca cantidad, si alguna, de polvo o material insoluble,
a diferencia de los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios o tampones liofilizados o molidos con
molino
de bolas.
de bolas.
Los disolventes preferidos para su uso en la
reconstitución de los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios y tampones en polvo de la invención incluyen,
pero no se limitan a, agua (lo más particularmente agua destilada
y/o desionizada), suero (particularmente suero bovino o humano y lo
más particularmente suero de ternero o suero bovino fetal),
disolventes orgánicos (particularmente dimetilsulfóxido, acetona,
etanol y similares), o cualquier combinación de los mismos,
pudiendo contener cualquiera de ellos uno o más componentes
adicionales (por ejemplo, sales, polisacáridos, iones, detergentes,
estabilizadores, etc.). Por ejemplo, se reconstituyen
preferiblemente complementos de medios (tales como sueros animales)
y tampones en polvo en agua hasta una concentración final 1X, u
opcionalmente hasta una concentración superior (por ejemplo, 2X,
2,5X, 5X, 10X, 20X, 25X, 50X, 100X, 500X, 1000X, etc.) para la
preparación de disoluciones madre o para almacenamiento.
Alternativamente, los medios de cultivo en polvo pueden
reconstituirse en una disolución de complementos de medios (por
ejemplo, sueros tales como FBS) en agua, tales como aquellas
disoluciones en las que el complemento de medios está presente a
una concentración, por ejemplo, del 0,5%, 1%, 2%, 2,5%, 5%, 7,5%,
10%, 15%, 20%, 25%, 50%, o superior, vol/vol en el agua.
La reconstitución de los medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo se
lleva a cabo preferiblemente en condiciones asépticas para mantener
la esterilidad del medio, complemento de medios, subgrupo de medios
o tampón reconstituido, aunque alternativamente puede esterilizarse
el medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón
reconstituido, preferiblemente mediante filtración u otros
procedimientos de esterilización que se conocen bien en la técnica,
tras la rehidratación. Tras su reconstitución, los medios
complementos de medios, subgrupos de medios y tampones deben
almacenarse a temperaturas inferiores a aproximadamente 10ºC,
preferiblemente a temperaturas de aproximadamente
0-4ºC, hasta su uso.
Los medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios y tampones reconstituidos pueden usarse para
cultivar células según las técnicas de cultivo celular
convencionales que conoce bien un experto en la técnica. En tales
técnicas, las células que van a cultivarse se ponen en contacto con
el medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón
reconstituido de la invención en condiciones que favorecen el
cultivo de las células (tales como temperatura, humedad,
iluminación y condiciones atmosféricas controladas). Las células
que son particularmente susceptibles de cultivo mediante tales
procedimientos incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas,
células de levaduras, células vegetales y células animales. Tales
células bacterianas, células de levaduras, células vegetales y
células animales están disponibles comercialmente de depositarios
de cultivos conocidos, por ejemplo, la Colección Americana de
Cultivos Tipo (Manassas, Virginia), Invitrogen (Carslbad,
California) y otros con los que estará familiarizado un experto en
la técnica. Las células animales preferidas para el cultivo
mediante estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a,
células de insectos (lo más preferiblemente células de Drosophila,
células de Spodoptera y células de Trichoplusa), células de
nematodos (lo más preferiblemente, células de C. elegans) y
células de mamíferos (incluyendo pero no limitadas a células CHO,
células COS, células VERO, células BHK, células
AE-1, células SP2/0, células L5.1, células de
hibridoma y lo más preferiblemente células humanas tales como
células 293, células PER-C6 y células HeLa),
cualquiera de las cuales puede ser una célula somática, una célula
germinal, una célula normal, una célula enferma, una célula
transformada, una célula mutante, una célula madre, una célula
precursora o una célula embrionaria, y cualquiera de las cuales
puede ser una célula dependiente de anclaje o independiente de
anclaje (es decir, "suspensión").
\vskip1.000000\baselineskip
Los medios, complementos de medios, subgrupos de
medios, tampones de polvo seco y células proporcionadas por la
invención son idealmente aptos para la preparación de kits. Un kit
de este tipo puede comprender uno o más recipientes tales como
viales, tubos de ensayo, botellas, envases, sobres, bidones y
similares. Cada uno de los recipientes puede contener uno o más de
los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios
o tampones de la invención descritos anteriormente, o combinaciones
de los mismos. Tales medios nutritivos, complementos de medios,
subgrupos de medios o tampones pueden estar hidratados o
deshidratados pero son normalmente preparaciones deshidratadas
producidas mediante los procedimientos de la invención. Tales
preparaciones pueden ser estériles.
Un primer recipiente puede contener, por
ejemplo, un medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de
medios o un tampón de la invención, o cualquier componente o
subgrupo de los mismos, tales como cualquiera de aquellos medios
nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones
de la invención que se describieron anteriormente. Los medios
nutritivos, tampones, extractos, complementos, componentes o
subgrupos adicionales pueden estar contenidos en recipientes
adicionales en los presentes kits. Los kits también pueden contener,
en uno o más recipientes adicionales, una o más células tales como
las células bacterianas, células de levaduras, células vegetales o
células animales descritas anteriormente. Tales células pueden
liofilizarse, secarse, congelarse o conservarse de otra manera, o
pueden secarse por pulverización. Además, los kits de la invención
pueden comprender además uno o más recipientes adicionales, que
contengan, por ejemplo, L-glutamina, opcionalmente
complejada con uno o más cationes divalentes (véase la patente
estadounidense n.º 5.474.931). Los kits pueden comprender además
uno o más recipientes adicionales que contengan un disolvente que va
a usarse en la reconstitución de los medios nutritivos,
complementos de medios, subgrupos de medios y/o tampones de polvo
seco; tales disolventes pueden ser acuosos (incluyendo disoluciones
tampón, soluciones salinas, disoluciones de medio nutritivo,
disoluciones de complemento de medio nutritivo (incluyendo sueros
tales como sueros bovinos (particularmente sueros de ternero o
sueros bovinos fetales) o sueros humanos), o combinaciones de los
mismos) u orgánicos. Otros ingredientes que no son compatibles para
su mezclado con los medios nutritivos, tampones, extractos,
complementos, componentes o subgrupos de la invención pueden estar
contenidos en uno o más recipientes adicionales para evitar el
mezclado de los componentes incompatibles. Un kit a modo de ejemplo
puede comprender un recipiente que contiene polvo seco para
reconstitución opcionalmente de un volumen suficiente para contener
el disolvente de reconstitución, las instrucciones para la
reconstitución y medios para acceder al polvo seco tal como una tira
de desgarro o un orificio para introducir el disolvente de
reconstitución.
El número y los tipos de recipientes contenidos
en un kit dado para preparar un medio nutritivo, complemento de
medio, subgrupo de medio o tampón puede variar dependiendo del tipo
de medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón que
vaya a prepararse. Normalmente, el kit contendrá los recipientes
respectivos que contienen los componentes o complementos necesarios
para preparar un medio, complemento de medios, subgrupo de medios o
tampón particular. Sin embargo, pueden incluirse recipientes
adicionales en el kit de la invención de modo que puedan prepararse
diferentes medios, complementos de medios, subgrupos de medios o
tampones mezclando diferentes cantidades de diversos componentes,
complementos, subgrupos, tampones, disolventes, etc., para preparar
diferentes formulaciones de medios, complementos de medios,
subgrupos de medios o tampones.
\vskip1.000000\baselineskip
Inesperadamente, la presente invención prevé la
preparación de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos
de medios, tampones que contienen lípidos y células a un coste
reducido e inconveniencias reducidas. Las reducciones de los costes
se deben a varios factores. Por ejemplo, las formulaciones de
medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones de
la presente invención pueden producirse con instalaciones de
producción mucho más pequeñas dado que no se requieren los grandes
tanques de agitación para las formulaciones 1X. Además, las
formulaciones de medios, complementos de medios, subgrupos de medios
y tampones de la presente invención pueden prepararse según sea
necesario usando las técnicas de producción "en el momento
oportuno" que reducen los costes de inventario, almacenamiento y
mano de obra. El tiempo requerido para la preparación y el envío de
las formulaciones de medios, complementos de medios, subgrupos de
medios y tampones puede reducirse desde 6-8 semanas
hasta tan sólo un día. Los medios con ajuste de pH de manera
automática también proporcionan ahorros significativos de costes y
tiempo, y reducen la tendencia de introducción de contaminación en
los medios reconstituidos que puede producirse durante el proceso
de ajuste del pH según los procedimientos convencionales que usan
medios líquidos en volumen o de polvo seco tradicionales. La
presente invención también permite la preparación de componentes de
medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o
tampones que pueden usarse para preparar cantidades muy grandes de
medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones 1X
(por ejemplo, 100.000 litros o más) lo que requeriría sólo una
prueba de control de calidad en comparación con las múltiples
pruebas de control de calidad para los múltiples lotes producidos
según otras técnicas utilizadas comúnmente. Es importante destacar
que las formulaciones de medios, complementos de medios, subgrupos
de medios y tampones de la presente invención son más sistemáticas
entre lotes dado que los componentes individuales son más estables.
Los polvos secos de células de la invención también son ventajosos
desde el punto de vista tecnológico y económico, dado que pueden
almacenarse las células, en pequeño volumen, durante periodos de
tiempo prolongados con poca necesidad de equipo especializado más
allá del que normalmente está disponible en el laboratorio. Además,
las células preparadas mediante los presentes procedimientos se
conservan sin exponerse a reactivos de crioconservación que pueden
ser tóxicos para las células. La conveniencia mejorada reducirá la
carga de suministro de lípidos a las células en cultivo. Los
procedimientos mejorados de proporcionar lípidos en las
formulaciones de medios secos deben dar como resultado un mejor
rendimiento de las células en cultivo en la realización de sus
tareas fisiológicas o pretendidas.
En resumen, la presente invención se refiere
a:
Un procedimiento de producción de un polvo de
medio nutritivo aglomerado, un polvo de complemento de medio
aglomerado, un polvo de subgrupo de medio nutritivo aglomerado o un
polvo de tampón en aglomerado, comprendiendo dicho procedimiento
aglomerar un polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de
medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón, con
un disolvente que comprende al menos un lípido disuelto en el mismo,
suministrando dicho disolvente dicho al menos un lípido para su
incorporación en dicho polvo de medio nutritivo, polvo de
complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo
de tampón. El al menos un lípido se compleja con una
ciclodextrina.
En determinadas realizaciones de la invención,
la aglomeración comprende la aglomeración en lecho fluidizado.
En determinadas realizaciones de la invención,
el disolvente esta en fase líquida. En otras realizaciones, el
disolvente esta en fase sólida.
El lípido puede estar en forma de una sal, el
lípido pude tener uno o más grupos hidroxilo.
En determinadas realizaciones de la invención,
el disolvente es una mezcla. La mezcla puede ser una mezcla de
líquidos. La mezcla también puede comprender al menos un disolvente
polar y/o al menos un disolvente apolar y/o al menos un disolvente
orgánico. Por ejemplo, la mezcla puede comprender un 20%-95% de
disolvente orgánico, por ejemplo, un 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90% ó
95% de disolvente orgánico.
Cuando el disolvente es una mezcla, la mezcla
puede comprender, por ejemplo, disolventes en una razón del 1% al
99% de (a) dicho al menos un disolvente polar con (b) dicho al menos
un disolvente orgánico o dicho al menos un disolvente apolar. La
mezcla puede comprender disolventes en una razón de, por ejemplo, el
1, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 33, 40, 50, 60, 67, 70, 75, 80, 85,
90, 95, 98 ó 99% de (a) dicho al menos un disolvente polar con (b)
dicho al menos un disolvente orgánico o dicho al menos un disolvente
apolar.
Cuando el disolvente es una mezcla, la mezcla
puede comprender un 40-60% de dicho al menos un
disolvente orgánico o dicho al menos un disolvente apolar. En
ciertas realizaciones, la mezcla comprende un 50% de (a) dicho al
menos un disolvente polar y un 50% de (b) dicho al menos un
disolvente orgánico o dicho al menos un disolvente apolar.
Cuando el disolvente es una mezcla, la mezcla
puede comprender, por ejemplo, agua y al menos un disolvente
seleccionado del grupo constituido por dimetilsulfóxido, alcoholes,
éteres y cetonas. La mezcla puede comprender, por ejemplo, al menos
un disolvente seleccionado del grupo constituido por
dimetilsulfóxido, alcoholes, éteres y cetonas. La mezcla puede
comprender aproximadamente un 40-60% de etanol. En
una realización, la mezcla comprende aproximadamente un 50% de
etanol. El disolvente puede comprender una mezcla de al menos dos
disolventes seleccionados del grupo constituido por disolventes
apolares y disolventes orgánicos.
En ciertas realizaciones de la invención, dicho
suministro se realiza en condiciones que comprenden al menos una de
temperatura controlada, humedad controlada y presión parcial
controlada de dicho(s) disolvente(s).
En ciertas realizaciones de la invención, dicho
lípido se selecciona del grupo constituido por ácido linoleico,
ácido lipoico, ácido araquidónico, ácido palmítico, ácido oleico,
ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido
linolénico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, esfingomielina,
cardiolipina, vitamina A, vitamina E, vitamina K, prostaglandina y
un esterol. El esterol puede ser, por ejemplo, un esterol vegetal o
uno animal. En ciertas realizaciones, el esterol es colesterol.
La invención también se refiere a polvos de
medio nutritivo aglomerados, polvos de complemento de medio
aglomerados, polvos de subgrupo de medio nutritivo aglomerados y
polvos de tampón aglomerados preparados según cualquiera de los
procedimientos de la invención. El polvo de la invención, en ciertas
realizaciones, tiene una formación de polvo fino reducida en
comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado, una
solubilidad más completa en comparación con un polvo de medio
nutritivo no aglomerado, menos material insoluble en comparación con
un polvo de medio nutritivo no aglomerado y/o una disolución más
rápida en comparación con un polvo de medio nutritivo no
aglomerado.
El polvo de la invención, en ciertas
realizaciones, está libre de suero, libre de componentes de
mamíferos y/o libre de componentes animales.
La invención también proporciona un
procedimiento de cultivo de una célula que comprende: (a)
reconstituir un polvo aglomerado de la invención con un disolvente
para formar una disolución líquida; y (b) poner en contacto una
célula con dicha disolución líquida en condiciones que favorecen el
cultivo de dicha célula. La célula puede ser, por ejemplo, una
célula seleccionada del grupo constituido por célula bacteriana,
célula de insectos, célula de levaduras, célula de nematodos,
célula de aves, célula de anfibios, célula de reptiles y célula de
mamíferos. Cuando la célula es una célula de mamíferos, la célula
puede ser, por ejemplo, una célula CHO, una célula COS, una célula
VERO, una célula BHK, una célula AE-1, una célula
SP2/0, una célula L5.1, una célula PerC6, una célula 293, una
célula de hibridoma, o una célula humana. Según ciertos aspectos de
la invención, el crecimiento de dicha célula a los 3, 4, 7, 10, 14,
28, 30, 60 ó 90 días es del 50%-120% en comparación con el
crecimiento de dicha célula en el mismo punto de tiempo en medio
líquido con lípido añadido. Por ejemplo, el crecimiento de dicha
célula a los 3, 4, 7, 10, 14, 28, 30, 60 ó 90 días puede ser, por
ejemplo, del 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 100%, 105%, 110% ó 120% en
comparación con el crecimiento de dicha célula en el mismo punto de
tiempo en medio líquido con lípido añadido.
Resultará fácilmente evidente para un experto en
las técnicas relacionadas que son obvias otras adaptaciones y
modificaciones adecuadas de los procedimientos y aplicaciones
descritos en el presente documento y pueden realizarse sin
apartarse del alcance de la invención o cualquier realización de la
misma. Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la
misma se entenderá más claramente mediante referencia a los
siguientes ejemplos, que se incluyen en el presente documento sólo
con fines de ilustración y no se pretende que limiten de la
invención.
Los ejemplos 1-16 contienen
información general relativa a la aglomeración y al uso de medios de
polvo seco. Los ejemplos 17 y 18 ilustran más particularmente la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Con un aparato de lecho fluidizado de mesa de
laboratorio (Stera-1; Niro,
Inc./Aeromatic-Fielder; Columbia, Maryland): colocar
100-500 g de DPM dentro de la cámara. Colocar en el
aparato y usar la palanca para sellar la unidad.
2. Iniciar el flujo de aire para fluidizar
(levitar) el DPM. Puesto que el DPM tradicional es de tamaño de
partícula relativamente fino, se necesitará un nivel
4-6. Encender el dispositivo de vacío para captar
partículas de DPM finas, que pasan a través de los filtros
superiores. Asegurarse de que el polvo fluidizado está
aproximadamente centrado dentro de la cámara con respecto al tamiz
de malla inferior y los filtros superiores.
3. Poner en marcha el dispositivo de inyección
(unidad de pulverización) conectando en primer lugar la tubería de
aire comprimido y poniendo en marcha después la bomba que está
conectada a una fuente de agua. El objetivo es admitir \sim6 ml
de agua por minuto (debe conocerse la tasa de flujo para cualquier
bomba dada en base a RPM y el diámetro del tubo). Con el fin de
prevenir la aglutinación de DPM, añadir alternativamente agua
durante \sim1 minuto y detener después durante \sim1 minuto,
permitiendo que se produzca el secado en la cámara.
4. Si los filtros se recubren con DPM durante la
ejecución de manera que el retorno de aire no desprenda polvo,
bajar la velocidad del ventilador al nivel 2-3 hasta
que todos los filtros se hayan desobstruido mediante soplado.
Después aumentar la velocidad del ventilador en funcionamiento hasta
el nivel anterior.
5. La aglomeración se completará cuando se hayan
añadido \sim35 ml de agua por cada 500 g de DPM. Este volumen
variará dependiendo de la formulación de DPM. Se observará un flujo
descendente de gránulos aglomerados relativamente grandes en la
cámara (parte inferior) hacia el final de la ejecución. Las
partículas visiblemente grandes y la ausencia de polvo fino indican
que el proceso está completo.
6. Permitir que el DPM aglomerado se seque
completamente durante 5-7 minutos.
7. Al final de la ejecución, purgar los filtros
4 veces.
8. Apagar la unidad, desconectar el tubo de agua
y recoger el DPM aglomerado en un recipiente hermético.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos enfoques deben ajustarse cuando se usa un
aparato de lecho fluidizado a escala de proceso o a escala de
producción. Por ejemplo, cuando se usa el aparato
MP-1 (Niro, Inc./Aeromatic-Fielder;
Columbia, Maryland), el siguiente protocolo ha producido resultados
satisfactorios:
- 1.
- Sellar la unidad (inflar las juntas).
- 2.
- Poner en marcha el ventilador para precalentar.
- 3.
- Detener el ventilador cuando la temperatura del aire de entrada sea igual al punto de referencia.
- 4.
- Desinflar las juntas, cargar el material, inflar las juntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las etapas 5-8 deben llevarse a
cabo en el plazo de un minuto:
- 5.
- Iniciar el lote.
- 6.
- Poner en marcha el ventilador y encender el limpiador de filtro.
- 7.
- Fijar el rendimiento en % de presión de aire de atomización de la boquilla (comprobar el vacío en la boquilla).
- 8.
- Conectar la tubería de alimentación de líquido.
- 9.
- Poner en marcha el bombeo en el tamiz y en la bomba.
- 10.
- Reinicializar el tiempo de lote.
- 11.
- Pulverizar todo el líquido a una tasa fija (26 g/min.). Usar \sim 250 ml de agua por 2 kg de polvo.
- 12.
- Detener el bombeo en la bomba y en el tamiz cuando se añade todo el líquido.
- 13.
- Reducir el flujo de aire hasta el valor de secado (por ejemplo desde 100 hasta 60).
- 14.
- Cuando el producto alcanza la temperatura deseada (\sim40ºC), ir al tamiz de "ajuste inicial" y ajustar la "duración de lote" para un valor de 2-3 minutos más que el presente "tiempo de lote".
- 15.
- Detener el lote.
- 16.
- Desinflar las juntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Parámetros de los instrumentos típicos (para los
aparatos de mesa, a escala de proceso y a escala de producción):
Temperatura de secado:
60-65ºC
Temperatura del aire de salida: \sim33ºC
Presión de eyección: 500 kPa
Presión de atomización: 150-200
kPa
Parada del retorno de aire: 1 tras la
pulverización, 2 durante la pulverización.
Capacidad del ventilador: 5 al inicio de la
ejecución, 6 después de que sea evidente la aglomeración.
Magnahelics: Resistencia de filtro
150-250, resistencia de la placa de control
perforada \sim50, volumen de aire: menos de 50.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se indicó anteriormente, normalmente no
se añade bicarbonato de sodio al DPM durante la fabricación
mediante molienda con molino de bolas o liofilización, debido a las
complicaciones potenciales de capacidad de tamponamiento y de
emisión de gases encontradas tras el almacenamiento de los medios en
polvo. Por tanto, este procedimiento de producción convencional
necesita la adición de bicarbonato de sodio, y el ajuste del pH,
tras la reconstitución de los medios. Sin embargo, con los presentes
procedimientos, estas etapas adicionales pueden obviarse añadiendo
el bicarbonato de sodio (o cualquier sal de tamponamiento)
directamente al medio en polvo durante la fabricación.
Existen dos maneras de incluir bicarbonato de
sodio (o cualquier sal de tamponamiento) dentro del DPM: (a) por
medio del dispositivo de inyección y (b) como parte del DPM.
Debido a la solubilidad del bicarbonato de sodio
y las cantidades que generalmente es necesario añadir a un medio de
cultivo de células de mamíferos típico, será necesario inyectar
volúmenes bastante grandes de líquido en el polvo
(significativamente superiores a los 35 ml de agua mencionados
anteriormente). Esto es todavía posible y de hecho puede ser
preferible si se añade otro componente que requiere de manera
similar un volumen relativamente grande de líquido con el fin de
añadirse al DPM, tal como es el caso con el suero por ejemplo. En
este caso, debe tenerse cuidado de añadir el líquido de manera
secuencial, dejar secar, etc. una serie de veces para asegurarse de
que el DPM no llegue a aglutinarse dentro del dispositivo. Es más o
menos correcto usar los 6 ml por minuto durante \sim1 minuto y
después permitir secar durante otros 2 minutos.
La cantidad de líquido a añadir se determina tal
como sigue: preparar bicarbonato de sodio a 75 g/l en agua.
Ejemplo: 250 g de DPM en la cámara que va a aglomerarse. Asumir que
se requieren 10,0 g de DPM para 1 l de medio líquido 1X. Por tanto,
250 g representan 25 l de medio líquido 1X. Para cada l de líquido,
asumir (por ejemplo) un requisito de 2 g de bicarbonato de sodio.
Esto significa que se necesitan 50 g de bicarbonato. Ahora, dado
que la disolución de bicarbonato está a 75 g/l, entonces deben
añadirse 0,67 l de disolución de bicarbonato a los 250 g de DPM.
La disolución de bicarbonato de sodio se añadirá
de manera similar al procedimiento para la "aglomeración de un
DPM típico" anterior excepto que se necesita un mayor tiempo de
secado entre los ciclos dado que el pH de la disolución de
bicarbonato de sodio es \sim8,00, lo que puede degradar los
componentes de los medios. Es importante que el polvo nunca se
"empape" por la adición de disolución de bicarbonato demasiado
rápido sin que se permita el tiempo suficiente para el secado
completo del polvo de bicarbonato entre los ciclos. También, se
requieren mayores tiempos de secado de fluido puesto que es
importante tener un contenido en humedad final tan bajo como sea
posible dado que la humedad dará como resultado la liberación de gas
de dióxido de carbono dando como resultado la pérdida de la
capacidad de tamponamiento y la formación de una "almohada" si
el polvo está en un paquete de lámina metálica.
Puede molerse bicarbonato de sodio en el DPM de
manera similar a para otros componentes de los medios antes del
tratamiento de lecho fluidizado. Sin embargo, en el proceso de
molienda, el bicarbonato debe añadirse como componente final. Todos
los demás componentes de los medios deben molerse como de costumbre
y entonces se detiene el molino y se añade el bicarbonato
finalmente, con una molienda adicional para alcanzar partículas de
tamaño apropiado. Es importante que todo el procesamiento posterior
a la molienda (colocación en recipientes, etc.) se haga en un
entorno de humedad controlada ajustado tan bajo como sea
operacionalmente posible (\sim20-40%). El
procesamiento de lecho fluidizado debe llevarse a cabo entonces tan
pronto como sea posible tras la molienda. (Si no se procesa el
mismo día, el DPM debe envolverse doblemente y colocarse dentro de
un recipiente sellado con absorbedores de humedad).
El propio procedimiento de lecho fluidizado se
realiza de manera similar al ejemplo dado anteriormente (con el uso
de 35 ml por 500 g de DPM) excepto que los tiempos de secado tras la
inyección de agua (\sim6 ml/min.) deben prolongarse de nuevo: 1
min. de inyección de agua y 2 minutos de ciclos de secado. Se
observará que el color del DPM será rojo
oscuro-púrpura claro debido a la presencia de rojo
fenol. Puesto que el DPM no tiene esencialmente contenido en
humedad, esto no representa una situación degradativa, y es la razón
por la que es esencial el procesamiento de lecho fluidizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se indicó anteriormente, todos los
medios en polvo de cultivo de células de mamíferos disponibles
comercialmente requieren la adición de una o más sales tampón (por
ejemplo, bicarbonato de sodio) cuando se prepara líquido 1X, y
después el ajuste del pH, de manera que la disolución estará a un pH
adecuado. Sin embargo, los presentes procedimientos pueden usarse
para obviar tanto la adición de bicarbonato de sodio (tal como se
describió anteriormente en el ejemplo 2) como la necesidad de ajuste
del pH. La tecnología de lecho fluidizado se usa para introducir un
ácido o base (dependiendo de la necesidad) a un medio de polvo seco
que comprende una o más sales de tamponamiento. Según este aspecto
de la invención, cualquier sal de tamponamiento o combinación de
las mismas, y cualquier ácido o base, puede usarse dependiendo del
pH y la capacidad de tamponamiento deseados en el medio de cultivo
de células reconstituido en última instancia.
Si se añade bicarbonato de sodio directamente al
DPM como polvo, es posible para el usuario final añadir simplemente
agua y mezclar para producir una disolución que ya contiene
bicarbonato (véase anteriormente) y de pH apropiado. Es necesario
en primer lugar determinar cuánto ajuste de pH se requiere. (1)
Colocar 1 l de agua en un vaso de precipitados. Añadir DPM al
líquido y mezclar. (La cantidad a añadir/l viene dada por las
especificaciones para ese polvo, por ejemplo, 10 g/l, 13 g/l). En
este caso, el peso del bicarbonato de sodio también debe
considerarse en la determinación de cuánto se añade por litro. (2)
Después de que el polvo se haya disuelto, añadir HCl 5 N para
ajustar la disolución al pH deseado. Registrar la cantidad. (3)
Convertir este número en cantidad de HCl 1 N. Calcular cuánto HCl 1
N es necesario para el ajuste del polvo total que va a aglomerarse.
(Ejemplo: se necesitan 5 ml de HCl 1 N para ajustar 1 l de medio 1X
A a un pH 7,2 a partir de un pH sin ajustar de 7,9. Ese 1 l de
medio 1X representa, por ejemplo, 13,0 g de DPM. Por tanto, para
cada 13,0 g de DPM, se necesitan 5 ml de HCl 1 N. Si quiere
ajustarse el pH de 250 g de DPM, entonces es necesario añadir 250
divido entre 13,0 = 19,2 x 5 ml o 96 ml de HCl 1 N al polvo para
hacer que se ajuste automáticamente el pH.
Este HCl 1 N debe añadirse ahora al DPM. La
mejor manera para ello es usar el dispositivo de inyección,
añadiendo HCl 1 N en lugar de agua. En general, el protocolo es
similar al anterior con las siguientes excepciones: (1) el HCl 1 N
debe añadirse lentamente a los medios que contienen bicarbonato de
sodio. Si se añade demasiado rápido, puede desprenderse dióxido de
carbono, dando como resultado una capacidad de tamponamiento
subóptima. Debido al volumen de HCl 1 N requerido generalmente, se
necesitan varios ciclos de 1 minuto encendido, 2 minutos apagado.
Debe obtenerse un estado de polvo seco al final de cada ciclo de
manera que exista un sistema dinámico en el que el DPM tiene
características de un procedimiento fluido pero en realidad es un
polvo seco. (Sorprendentemente, a medida que se añade HCl al polvo,
el color aparente cambia de púrpura rojizo oscuro a un color
amarillo-naranja claro incluso aunque el polvo se
mantiene esencialmente seco en todo momento debido a la evaporación
continua dentro del sistema). Dado que la cantidad total de HCl se
ha calculado para producir un pH esencialmente neutro, el polvo
nunca se expone realmente a condiciones "ácidas" siempre que el
lecho fluidizado se ajuste adecuadamente (véase anteriormente; la
posición de las partículas de polvo dentro de la cámara durante la
operación). Es importante asegurarse de que todo el polvo se mueve
a través del sistema (es decir, se levanta, aglomera y deposita
continuamente) y que no tenga zonas "muertas" dentro de la
cámara.
Una vez que el polvo se recoge tras la
ejecución, puede añadirse a agua y reconstituirse en cualquier
momento siempre que se haya mantenido en una ubicación y envase
"secos" adecuados. No se necesita ajuste del pH. Por tanto,
esto proporciona un medio de polvo seco con ajuste automático del
pH, en el que el pH del medio líquido preparado reconstituyendo el
medio de polvo seco no requiere ajuste del pH.
\vskip1.000000\baselineskip
Hasta ahora, los medios de polvo seco que
contienen suero no han estado disponibles comercialmente. Usando los
presentes procedimientos (por medio de las tecnologías de lecho
fluidizado y secado por pulverización), se ha tenido éxito en la
adición de suero a un polvo de una manera en la que se mantiene la
funcionalidad (cultivo
celular).
celular).
El dispositivo de inyección del aparato de lecho
fluidizado puede formar una niebla con suero y albúmina concentrada.
Se intentó observar si el suero añadido al DPM y secado de esta
manera sería funcional.
Procedimiento para la adición de suero: (1)
Determinar el peso del DPM patrón que va a aglomerarse. (2) A partir
de esto, basándose en los g/l para el polvo particular, calcular el
volumen de medio 1X que prepararán los g de polvo. (3) Calcular el
volumen de suero que será necesario a un nivel de porcentaje dado de
complementación (por ejemplo, 100 g de polvo que van a usarse en 10
g/l producen 10 equivalentes en l de polvo). A una complementación
de suero al 5%, se requerirá que se añadan 500 ml de suero mediante
el dispositivo de inyección.
\newpage
Protocolo para la adición de suero: El suero y
la albúmina son muy viscosos. Debe comprobarse el patrón de
pulverización de la boquilla para el patrón y el tamaño de la
gotita. Con el tubo de muestra en la disolución que va a añadirse al
polvo, someter a prueba la pulverización contra un cartón u otro
telón de fondo. Comprobar la uniformidad y el tamaño pequeño de la
gotita. Si no es una "niebla", aumentar la presión de
atomización en 50 kPa y someter a prueba de nuevo. Hacer esto hasta
que la presión suficiente dé como resultado un patrón de niebla
fina.
Para el uso en aplicaciones de cultivo celular,
es necesario conocer el peso/ml de suero-DPM que va
a usarse por l de medio 1X. Para ello, pesar de manera precisa los
viales o tubos de ensayo que almacenarán el suero durante el
secado. Colocar una cantidad constante (conocida) de suero en cada
uno de los viales. Luego colocar los viales en un Speed Vac o
liofilizador. Eliminar el agua hasta sequedad. Luego pesar de nuevo
los viales, esta vez conteniendo suero liofilizado. Calcular el
peso del suero y expresarlo por ml de volumen original. El peso del
DPM aglomerado con suero para usar por l entonces será el peso de
"uso" de DPM patrón más el peso del suero a un nivel
determinado.
determinado.
Por ejemplo, asumir que el medio A (DPM) va a
usarse a 10 g/l. La complementación de suero ha de ser al 5% v/v.
Esto significa que además del peso del DPM patrón, el peso del suero
será igual al 5% = 50 ml para añadir por l de medio. Asumir que el
polvo de suero pesa 0,06 g/ml. Entonces el peso del suero en polvo =
50 x 0,06 g/l = 3 g. Por tanto, el peso del DPM que contiene suero
que se añadirá a 1 l de agua es el peso del polvo de suero (3 g) más
el peso del DPM patrón (10 g) por litro = 13 g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Reducir o eliminar las técnicas de molienda
(sistema de entrada de alta energía que rompe los componentes en
partículas micrométricas) cuando se fabrica un DPM. Tal como se
indicó anteriormente, el medio de polvo seco normalmente se fabrica
por medio del proceso de molienda, que es laborioso y tiene una
serie de problemas. Algunos procedimientos de la presente invención
proporcionan la producción de un medio en polvo seco usando la
tecnología de lecho fluidizado, que supera estas limitaciones
técnicas y de laboriosidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combina el DPM molido normalmente con
bicarbonato de sodio (directamente tal como se recibe del proveedor,
no se necesita molienda con molino de bolas adicional). [RPM 1640
con bicarbonato de sodio a 2 g/equivalentes en l]. Esta mezcla se
combina durante 20 minutos. Entonces se coloca el polvo dentro de la
cámara de lecho fluidizado y se fluidiza tal como anteriormente
para los medios que contienen bicarbonato o los medios que contienen
bicarbonato con control automático de pH.
\vskip1.000000\baselineskip
Se coloca bicarbonato de sodio en la cámara
directamente con el DPM molido y se combina (mezcla) durante un
breve periodo de tiempo, que va seguido de aglomeración. Esto
elimina la combinación en una unidad separada.
\vskip1.000000\baselineskip
O bien todos los productos químicos del DPM se
añaden directamente a la cámara de lecho fluidizado y se mezclan de
manera preliminar seguido por aglomeración o bien, más
probablemente, a algunos de los productos químicos más gruesos,
"pegajosos", etc. se les proporciona un tratamiento de
molturación breve en una muela giratoria y luego se colocan dentro
del lecho fluidizado para la combinación y la aglomeración
final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha combinado la adición de bicarbonato de
sodio "comercial" con DPM molido y control automático de pH.
También se ha combinado el suero con DPM.
Para combinar suero con DPM que contiene
bicarbonato de sodio con control automático de pH, un
protocolo
es:
es:
- 1.
- Añadir bicarbonato de sodio (polvo, del proveedor) al DPM (molido o molturado).
- 2.
- Combinar los ingredientes (mezclar, o bien unidad externa o bien lecho fluidizado).
\newpage
- 3.
- En un recipiente separado, reconstituir 1 l del DPM (que contiene bicarbonato) con agua (1X) y determinar la cantidad de HCl 1 N o NaOH 1 N que se requiere para ajustar el pH de la disolución a 7,5. En base a litros, conociendo la masa del polvo que va a aglomerarse (y por tanto los equivalentes en l), calcular la cantidad de HCl 1 N o NaOH 1 N para el polvo total que va a aglomerarse a la cantidad calculada anteriormente. Añadir esta cantidad por medio del dispositivo de lecho fluidizado (boquilla de inyección). (Aunque el DPM no es "líquido", es importante tener un polvo tan cerca de la neutralidad como sea posible pero no de un pH ácido tal que se liberaría bicarbonato cuando se añade suero, dado que la humedad está implicada en el procedimiento. A un pH 7,6 o superior, una disolución concentrada de bicarbonato de sodio no desprenderá gas de CO_{2}, sino se desprenderá gas a pH inferior.)
- 4.
- La adición de suero (aglomeración prolongada), en base al porcentaje de complementación y g que van a aglomerarse.
- 5.
- Usando el mismo 1 l de líquido 1X de (3) anterior, determinar la cantidad de HCl 1 N o NaOH 1 N necesaria para ajustar el pH al pH deseado (por ejemplo, 7,2). Usando esta información, calcular la cantidad que va a usarse para el peso del polvo que se ha aglomerado con suero (conociendo las especificaciones de g/l). Añadir esta cantidad por medio del dispositivo de fluido (boquilla de inyección).
- 6.
- Se usa irradiación con rayos gamma para esterilizar los medios en polvo.
\vskip1.000000\baselineskip
En un procedimiento similar, puede producirse un
DPM que contiene suero combinando una cantidad particular de DPM
con una cantidad particular de suero en polvo (preparado, por
ejemplo, mediante secado por pulverización tal como se describe en
el ejemplo 8 a continuación) y aglomerando después la mezcla. Por
ejemplo, para la preparación de un medio que contiene FBS en polvo
al 10%, pueden añadirse 55,5 g de FBS en polvo a 500 g de medio de
cultivo en polvo y se mezclan los polvos bien mediante agitación.
Esta mezcla puede aglomerarse entonces con agua tal como se
describió anteriormente, y producirá, tras la reconstitución, un
medio de cultivo que contiene FBS al 10% que puede ser de pH
ajustado automáticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Se usó un aparato de lecho fluidizado de mesa
de laboratorio (Strea-1). Para la producción de
suero en polvo, no se coloca nada dentro de la cámara. Se utiliza
la palanca para sellar la unidad.
2) Se añadió suero mediante el dispositivo de
inyección (unidad de pulverización). A medida que se añade el suero
a la cámara, se aumentó el flujo de aire lo suficiente y se
ralentizó el flujo del suero lo suficiente de modo que se produjo
evaporación del agua y el suero se secó suficientemente de manera
que se formó polvo instantáneamente dentro de la cámara. No había
recubrimiento húmedo o líquido en ningún lugar de la cámara.
3) La velocidad de la bomba se fijó para
permitir \sim1 ml/minuto a la cámara.
4) La velocidad del flujo de aire se fijó a un
nivel de \sim8-9.
5) Para limpiar los filtros de manera
intermitente, se redujo la velocidad del ventilador hasta
\sim2-3. Esto se hizo de manera rutinaria cada
5-10 minutos. (El nivel de flujo de aire de
8-9 es tan alto que los filtros no purgarán el polvo
y se limpiarán por sí mismos).
6) Tras una ronda de purga del filtro, la
velocidad del ventilador se aumentó hasta los niveles anteriores y
se encendió la bomba. Una vez que se fijaron estos parámetros, se
ejecutó de manera continua la bomba excepto cuando se limpiaban los
filtros tal como se indica).
7) Después de que todo el suero líquido se
hubiera añadido al aglomerador, se llevó a cabo el secado final
durante cinco minutos.
8) Entonces se purgaron los filtros para recoger
tanto polvo como fuera posible, y se apagó la máquina y se retiró el
producto. Se colocó el suero en polvo en un recipiente hermético y
se protegió de la luz.
Parámetros de los instrumentos típicos
Temperatura de secado:
60-65ºC
Temperatura del aire de salida: \sim33ºC
Presión de eyección: 500 kPa
Presión de atomización: 200-250
kPa
Parada de retorno de aire: 2, entre
pulverización
Capacidad del ventilador: 8-9 en
toda la ejecución
Magnahelics: Resistencia de filtro
150-250, resistencia de la placa de control
perforada \sim50, volumen de aire: menos de 50.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si la aglomeración del FBS
afectaba a la distribución o estructura de proteínas, se ejecutaron
muestras de FBS aglomerado y FBS líquido en
SDS-PAGE, teñido para proteínas y escaneado
densitométricamente. Tal como se muestra en la figura 1, el FBS
aglomerado preparado según los presentes procedimientos (figura 1A)
mostró un perfil de proteínas casi idéntico al que se observaba con
el FBS líquido (figura 1B). Estos resultados indican que la
producción controlada de FBS en polvo seco mediante los presentes
procedimientos no afecta sustancialmente la estructura o
distribución de los principales componentes del suero.
Para determinar si la aglomeración del FBS
afectaba a su capacidad para apoyar el crecimiento celular y el
pase, se sembraron en placa células SP2/0 en DMEM que contenía o
bien FBS ("seco") aglomerado al 2% o bien FBS líquido al 2% y
se examinaron las tasas de crecimiento y la recuperación de pase.
Tal como se muestra en la figura 2A, las células sembradas en placa
en un medio que contenía FBS aglomerado mostraron una cinética de
crecimiento similar a la que mostraban las células sembradas en
placa en medios que contenían FBS líquido. De manera similar, las
células en los medios que contenían FBS aglomerado se recuperaron
del pase con tasas de crecimiento prácticamente idénticas a las de
las células en medios que contenían FBS líquido (figura 2B). En
conjunto, estos resultados indican que el FBS aglomerado funciona
aproximadamente de un modo equivalente al FBS líquido en el apoyo
del crecimiento y el pase de células cultivadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Como alternativa al procesamiento de lecho
fluidizado, se examinó la viabilidad de producir suero en polvo
seco mediante la tecnología de secado por pulverización. Se usó un
secador por pulverización de laboratorio de tres pies de diámetro
(Mobile Minor Spray Drier; NIRO, Columbia, Maryland) para preparar
el suero en polvo. Se aspiró el FBS líquido en el secador por
pulverización y se atomizó a través de una boquilla Schlick 940
ubicada en el centro del dispensador de aire, y se introdujo el aire
de secado en el atomizador a través del dispensador de aire
superior del aparato. El secado por pulverización se llevó a cabo en
las siguientes condiciones: temperatura del aire de entrada =
200ºC; temperatura del aire de salida = 70ºC, presión de aire de
atomización para la boquilla = 200 kPa; flujo de aire = 80,0
kg/hora; tasa de pulverización = 65 g/minuto. Durante el desarrollo
de estos procedimientos, se usó una temperatura del aire de salida
inicial de 60ºC; sin embargo, se encontró que esta temperatura era
demasiado baja, y se ajustó la tasa de pulverización de nuevo a un
nivel para lograr una temperatura de salida de aproximadamente 70ºC
que se encontró que era óptima. Tras el secado por pulverización,
se recogió el suero en polvo en el ciclón del aparato y se filtró el
aire de proceso a través de un filtro de escape antes de la
recirculación dentro del
aparato.
aparato.
Tras la producción, se caracterizó el suero en
polvo con respecto a sus propiedades físicas, en comparación con el
FBS líquido del mismo lote de fuente. Se reconstituyeron las
muestras tomadas de las diferentes fases del lote de producción
(muestras "A" y "B") a una concentración de 60,44 g/l en
agua destilada libre de endotoxinas (Invitrogen Corporation) y se
examinaron para determinar los niveles de endotoxinas usando una
prueba de lisado de amebocitos de Limulus (Invitrogen
Corporation), para determinar los niveles de hemoglobina (midiendo
espectrofotométricamente la absorbancia a 525 nm), y mediante
espectrofotometría UV/Vis. Los resultados se muestran en la tabla 1
y en las figuras 3A y 3B.
\newpage
Tal como se observa en la tabla 1, el FBS en
polvo mostró niveles de endotoxinas y hemoglobina similares a
aquéllos del FBS líquido que sirvió como material de fuente para la
producción del FBS en polvo. Además, las muestras tomadas de las
diferentes fases del procedimiento de producción mostraron niveles
de endotoxinas y hemoglobina casi idénticos, lo que indica que los
presentes procedimientos dan como resultado la producción de
material con una consistencia física aproximadamente uniforme por
todo el lote de producción. Cuando se examinaron las muestras de
FBS en polvo y líquido mediante espectrofotometría UV/visible
(figura 3), la línea observada para el FBS en polvo (figura 3A) no
podía distinguirse de la obtenida para el FBS líquido de fuente
(figura 3B). En conjunto, estos resultados indican que el polvo de
suero preparado mediante los presentes procedimientos de secado por
pulverización tiene características físicas casi idénticas a
aquéllas de los sueros líquidos a partir de los cuales se preparan
los polvos. Tomados conjuntamente con los del ejemplo 7 anterior
(véase, por ejemplo, la figura 1), estos resultados demuestran que
estos procedimientos dan como resultado la producción de sueros en
polvo con características físicas sin alterar con respecto a
aquéllas de sueros líquidos de fuente.
\vskip1.000000\baselineskip
Una de los motivos por los que nunca se incluye
bicarbonato de sodio en los medios en polvo es que cualquier
humedad, incluso en el aire, puede dar como resultado una condición
ácida dentro de la bolsa que dará como resultado la liberación de
gas de CO_{2}. Las bolsas se hincharán y producirán lo que se ha
denominado "almohadas". Con el procesamiento de lecho
fluidizado, se reduce esencialmente la humedad dentro del aparato
hasta niveles insignificantes antes de la finalización del
procedimiento. Se ha preparado medios en polvo
RPMI-1640 que contienen bicarbonato de sodio y no
se han observado evidencias de formación de "almohadas".
Con el fin de preparar un medio en polvo con pH
ajustado, es necesario añadir el producto químico de ajuste de pH
(normalmente HCl o NaOH) al polvo para llevar el pH hasta
aproximadamente 7,0-7,4 tras la adición al agua.
Una vez que se añade bicarbonato de sodio al polvo, muchos medios en
polvo se reconstituyen en el agua en el lado básico de la
neutralidad y necesitan la adición de HCl. Se esperaría que sea
problemático añadir HCl a un polvo que contiene bicarbonato de
sodio. Sin embargo, puesto que el líquido añadido (HCl 5 N en este
caso) nunca da como resultado un estado humedecido o "líquido"
dentro del aparato de lecho fluidizado, el bicarbonato de sodio no
emite gas de CO_{2} y conserva completamente su capacidad de
tamponamiento. Esto se ha examinado en los presentes estudios
mediante experimentos de titulación de pH: se encontró que
cantidades iguales de ácidos, en dos experimentos separados
(figuras 4A y 4B), reducen el pH de medios aglomerados y medios
aglomerados con pH ajustado automáticamente en una cantidad idéntica
a la de para un medio convencional con bicarbonato de sodio añadido
al líquido en el momento de la reconstitución. Estos resultados
indican que tanto la aglomeración con ajuste posterior del pH, como
la aglomeración con ajuste del pH durante el proceso de
aglomeración, funcionan igualmente bien para producir medios de
cultivo en polvo con capacidad de tamponamiento significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar el efecto de la aglomeración de
los medios de cultivo sobre la tasa de disolución de los medios, se
aglomeraron muestras de Opti-MEM I^{TM} o DMEM con
agua o con FBS (sólo al 2% para Opti-MEM I; al 2% o
al 10% para DMEM). Tras la reconstitución de los medios aglomerados
en agua, la disolución en el tiempo del Opti-MEM I
se produjo mucho más rápido que la disolución de
Opti-MEM I en polvo convencional (figura 5A); los
resultados fueron idénticos para Opti-MEM aglomerado
con agua y con FBS. Sin embargo, de un modo interesante, mientras
que el DMEM aglomerado con agua se disolvió en agua mucho más rápido
que el DMEM en polvo convencional, el DMEM aglomerado con FBS no lo
hizo (figura 5B).
Debido a la estructura abierta de los medios en
polvo aglomerados (a diferencia de los medios en polvo
tradicionales), la acción capilar lleva al agua a proximidad
cercana con todas las partículas de polvo. Esto evita la aparición
de "bolas" de polvo, una complicación observada tras la
reconstitución de la mayoría de los medios en polvo convencionales
que conduce a tiempos de disolución más largos. Además de la
disolución más rápida, los medios aglomerados también demostraron
una formación de polvo fino reducida. Estos resultados indican que
los medios de cultivo aglomerados con agua, y algunos de los medios
de cultivo aglomerados con FBS, se disuelven mucho más rápido y
producen menos polvo fino que los medios de cultivo en polvo
tradicionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Muchos usos de los medios de cultivo requieren
adiciones de proteínas de gran peso molecular tales como suero o
albúminas. Estas moléculas pueden estar en forma de disoluciones o
incluso polvo en el caso de la albúmina. Sin embargo, con el fin de
asegurar la uniformidad de los medios en polvo, estas proteínas
normalmente no se añaden como polvo sino como líquido tras la
reconstitución de los medios en polvo en volumen para dar un medio
líquido. Esto presenta algunos inconvenientes puesto que, por
ejemplo, el suero debe almacenarse en el congelador para mantener
el rendimiento en el tiempo. Esto añade gastos e inconvenientes
puesto que el suero debe añadirse asépticamente a los medios,
aumentando las posibilidades de contaminación. Si la filtración se
realiza tras la adición de suero, se necesita otra etapa de
procesamiento. Por tanto habría ventajas en poder proporcionar suero
como parte integral de los medios en polvo.
Por tanto, los medios de cultivo se aglomeraron
con agua o con diversas concentraciones de FBS. Se añadió FBS a los
medios en polvo inyectándolo en los medios en polvo seco suspendidos
en el aire a tasas de evaporación altas, tal como se explicó de
manera general anteriormente. El nivel de complementación de suero
fue del 2% en medios Opti-MEM I, y del 2% o del 10%
en DMEM. Después se evaluaron el crecimiento y el éxito de pase de
diversas líneas celulares en estos medios.
Tal como se muestra en la figura 6, las células
SP2/0 mostraron tasas de crecimiento similares cuando se hicieron
crecer en Opti-MEM I aglomerado con o bien agua o
bien con FBS (figura 6A), en comparación con células hechas crecer
en condiciones de cultivo convencionales (suero líquido añadido a
medios en polvo reconstituidos con agua). Se observaron resultados
similares con las células SP2/0 cultivadas en DMEM aglomerado con
agua y con FBS complementado con FBS al 2% (figura 6B), y con
células SP2/0 (figura 7A), células AE-1 (figura 7B)
y células L5.1 (figura 7C) cultivadas en DMEM aglomerado con agua y
con FBS complementado con FBS al 10%. Además, las células SP2/0
mostraron tasas de recuperación de pase aproximadamente similares
cuando se cultivaron en Opti-MEM I aglomerado con
agua y DMEM complementado con FBS al 2% (figuras 8A y 8B,
respectivamente), tal como en las células SP2/0, células
AE-1 y células L5.1 cultivadas en DMEM aglomerado
con agua y con FBS complementado con FBS al 10% (figuras 9A, 9B y
9C, respectivamente) y las células SP2/0 cultivadas en DMEM
aglomerado con agua complementado con FBS al 5% (figura 10).
Además, las células SP2/0 mostraron características de pase
idénticas en medios aglomerados con agua producidos en grandes lotes
y en DMEM en polvo con pH ajustado automáticamente que contenía
bicarbonato de sodio tal como lo hicieron en DMEM líquido
convencional complementado con FBS al 5% (figura 10).
En conjunto, estos resultados indican que los
complementos de medios de cultivo tales como sueros de animales
(por ejemplo, FBS) pueden aglomerarse directamente en medios de
cultivo, y que la complementación de los medios de cultivo durante
el proceso de aglomeración de esta manera produce un medio de
cultivo que proporciona un apoyo óptimo en el crecimiento y el pase
de una variedad de células cultivadas. Además, estos resultados
indican que los presentes polvos de medios de cultivo pueden
producirse satisfactoriamente en grandes lotes, incluyendo los
medios con ajuste automático de pH que contienen bicarbonato de
sodio.
\vskip1.000000\baselineskip
Como consecuencia natural de los experimentos
mostrados en el ejemplo 7, las células AE-1 y
células SP2/0 se sembraron en placa en DMEM que contenía o bien FBS
secado por pulverización al 2% o al 10% preparado tal como se
describió en el ejemplo 8, o bien que contenía FBS líquido al 2% o
al 10%, y se examinaron las tasas de crecimiento y la recuperación
de pase de las células. Las células se inocularon en matraces de 25
cm^{2} por triplicado a una densidad de 1 x 10^{5} células/ml
en 10 ml de los medios. Se determinó la densidad de las células
viables en los días 3-7, y se sometió a prueba cada
línea celular en dos ocasiones. Los resultados se muestran en las
figuras 11-13.
Tal como se muestra en la figura 11, las células
AE-1 cultivadas en medios que contienen FBS en polvo
mostraron una cinética de crecimiento similar a aquellas células
cultivadas en medios que contenían FBS líquido convencional. Tal
como se esperaba, las células mostraron un crecimiento más rápido
hasta una densidad superior en medios de cultivo que contenían FBS
al 10% que en medios que contenían FBS al 2%, y mostraron picos de
crecimiento aproximadamente en el día cuatro. Se observó una
cinética similar para dos experimentos separados (figuras 11A y
11B), lo que indica que estos resultados eran reproducibles. Se
obtuvieron resultados análogos en dos experimentos en los que se
midieron las tasas de crecimiento de células SP2/0 en medios que
contenían FBS en polvo o líquido (figuras 12A y 12B). Además, las
células AE-1 cultivadas en medios que contenían FBS
en polvo al 5% se recuperaron del pase con tasas de crecimiento
idénticas a las células en medios que contenían FBS líquido (figura
13).
Estos resultados indican que el FBS en polvo
preparado mediante los procedimientos de secado por pulverización
dados a conocer funciona aproximadamente de un modo equivalente al
FBS líquido apoyando el crecimiento y pase de las células
cultivadas. Junto con aquéllos de los ejemplos 7 y 8, estos
resultados indican que estos procedimientos pueden usarse para
producir FBS en polvo, mediante tecnologías de lecho fluidizado o
secado por pulverización, que muestra características de
rendimiento y físicas casi idénticas a aquéllas del FBS líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
Recientemente, ha aumentado la preocupación
sobre la pureza biológica de los medios y los componentes de los
medios (incluyendo complementos) usados para la bioproducción,
particularmente en la industria de la biotecnología. La irradiación
con rayos gamma es un proceso de esterilización que se sabe que
funciona bien con determinados líquidos y polvos que no son
normalmente susceptibles a la esterilización por exposición al calor
o a gases tóxicos. Por tanto, se irradiaron con rayos \gamma
muestras de medios de cultivo aglomerados con agua o con FBS con
una fuente de cobalto a 25 kGy durante varios días, y se examinaron
las tasas de crecimiento de diversos tipos de células.
En un conjunto de experimentos, se inocularon
células SP2/0 en diversos medios a 1 x 10^{5} células/ml y se
cultivaron a 37ºC. A diversos intervalos, se obtuvieron muestras
asépticamente y se determinaron los recuentos celulares mediante
contador Coulter y se determinó la viabilidad mediante la exclusión
con azul trípano. Los medios se prepararon disolviendo suficientes
medios en polvo para preparar una disolución 1X en 1 l de agua,
agitando y filtrando a través de un filtro de 0,22 \mum. Los
resultados se muestran en el gráfico de la figura 14. Aquellas
condiciones en el gráfico que indican "FBS en polvo" en el
gráfico hacen referencia a la adición de FBS en polvo (preparado
como en los ejemplos 7 u 8 anteriores) al medio 1X reconstituido
preparado a partir o bien de medios en polvo convencionales o bien
de medios aglomerados (irradiados o no irradiados). Aquellas
condiciones en el gráfico que indican "DMEM + FBS aglomerado
irradiado" hacen referencia al uso de lecho fluidizado para
preparar los medios aglomerados pulverizando
FBS en los medios en polvo (convencionales o aglomerados) para preparar unos medios aglomerados con FBS.
FBS en los medios en polvo (convencionales o aglomerados) para preparar unos medios aglomerados con FBS.
Tal como se muestra en la figura 14, la
irradiación con rayos \gamma de medios basales en polvo
convencionales y medios basales aglomerados no afectaron
perjudicialmente a la capacidad de estos medios de apoyar el
crecimiento de células SP2/0. Además, mientras que la irradiación
afectaba negativamente a los medios en polvo que contenían FBS en
polvo, y al propio FBS en polvo, este efecto disminuía con el
aumento de la concentración de suero.
Para examinar más ampliamente estos efectos de
la irradiación con rayos \gamma, se inocularon muestras de
células VERO en VP-SFM^{TM} que se había
reconstituido o aglomerado de manera convencional tal como
anteriormente. Sin embargo, a los medios en polvo en la cámara de
aglomeración se les añadieron factor de crecimiento epidérmico
(EGF) y quelato de citrato férrico, complementos tradicionales para
estos medios, por medio de la boquilla de pulverización durante la
aglomeración. Entonces se usaron los medios directamente o se
irradiaron con rayos \gamma tal como se describió anteriormente.
Se inocularon las células a 3 x 10^{5} células/matraz en matraces
T-25 y se incubaron a 37ºC. Los recuentos celulares
y la viabilidad se llevaron a cabo tal como se describió
anteriormente, con los resultados mostrados en la figura 15.
Tal como se observa en la figura 15, las células
VERO mostraron un éxito de crecimiento y pase aproximadamente
equivalente cuando se cultivaron en medios aglomerados que se habían
irradiado con rayos \gamma como en medios aglomerados que no se
habían irradiado con rayos \gamma. Además, la irradiación de los
medios no tuvo ningún efecto sobre los complementos de cultivo de
bajo nivel EGF y quelato de citrato férrico que estaban presentes en
los medios.
Estos resultados indican que la irradiación con
rayos \gamma puede usarse como técnica de esterilización en la
preparación de muchos medios de cultivo aglomerados en volumen,
incluyendo aquéllos que contienen suero, EGF u otros complementos,
mediante los presentes procedimientos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar la eficacia de los presentes
procedimientos en la producción de complementos de medios estériles,
se irradió holotransferrina humana liofilizada mediante la
exposición a una fuente de rayos \gamma de cobalto a 25 kGy
durante aproximadamente 3 días a -70ºC o a temperatura ambiente.
Entonces se cultivaron 293 células en medios que se habían
complementado con transferrina irradiada o con transferrina control
que no se había irradiado (almacenada a -70ºC o a temperatura
ambiente), y se comparó el crecimiento celular al de los medios de
cultivo que contenían transferrina convencionales o medios que no
contenían transferrina.
Se recogieron las células 293 de fase
semilogarítmica que crecían en medio 293 libre de suero (293 SFM),
se lavaron una vez a 200 x g durante 5 minutos y volvieron a
suspenderse en 293 SFM libre de transferrina para la determinación
del recuento y la viabilidad. Se sembraron en placa las células en
matraces Ehrlenmeyer de 125 ml por triplicado a una densidad de 3 x
10^{5} células/ml en un volumen de 20 ml en 293 SFM (control
positivo), 293 SFM libre de transferrina (control negativo), en 293
SFM que contenía transferrina no irradiada almacenada a -70ºC o a
temperatura ambiente, o en 293 SFM que contenía transferrina
preparada tal como se describió anteriormente. Se colocaron los
matraces en un agitador rotatorio fijado a aproximadamente 125 rpm,
en un incubador a 37ºC equilibrado con una atmósfera del 8% de
CO_{2}/92% de aire. Se determinaron los recuentos celulares
diarios usando un contador de partículas Coulter y se determinaron
las viabilidades mediante exclusión con azul trípano según los
procedimientos convencionales. Cuando las células alcanzaron una
densidad de aproximadamente 1,2 a 1,7 x 10^{6} por matraz, el
contenido de uno de los matraces de cada muestra se recogió,
centrifugó, volvió a suspenderse en un medio recién preparado y se
pasó a tres matraces nuevos. Entonces se llevaron a cabo los
recuentos celulares y las viabilidades de los pases anteriores y
posteriores tal como se describió anteriormente. Se sometieron a
prueba cuatro pases consecutivos de células incubadas en las
condiciones anteriores.
Tal como se muestra en las figuras
16A-16D, las células cultivadas en medios que
contenían transferrina que había irradiado con rayos \gamma o
bien a -70ºC o bien a temperatura ambiente mostraron una cinética de
crecimiento y una supervivencia casi idénticas en el primer pase
(figura 16A), segundo pase (figura 16B), tercer pase (figura 16C) y
cuarto pase (figura 16D) a las de las células cultivadas en 293 SFM
convencional o en 293 SFM que contenía transferrina que no se había
irradiado con rayos \gamma. Sin embargo, las células cultivadas
en medios libres de transferrina, sobrevivieron bien durante el
primer pase (figura 16A) pero detuvieron su crecimiento y mostraron
una pérdida significativa en la viabilidad tras el subcultivo
(figura 16B).
Estos resultados demostraron que la irradiación
con rayos \gamma puede usarse como técnica de esterilización en la
preparación de complementos de medios de cultivo en polvo en
volumen, tal como transferrina. Además, estos datos indican que los
complementos de medios de cultivo tal como la transferrina pueden
irradiarse con rayos \gamma a temperatura ambiente sin pérdida
significativa de la actividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar adicionalmente el impacto de la
irradiación con rayos \gamma sobre los sueros, se irradiaron
muestras de FBS en polvo secado por pulverización a 25 kGy a -70ºC o
a temperatura ambiente (TA), y se analizaron comercialmente para las
concentraciones de diversos constituyentes bioquímicos en los
sueros. Como controles, también se analizaron muestras de FBS
líquido y FBS secado por pulverización no irradiado. Los resultados
se muestran en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Estos resultados indican que el proceso de
irradiación con rayos \gamma no afectaba significativamente a las
concentraciones de la mayoría de los constituyentes bioquímicos de
FBS. Estos resultados también indican que tras el secado por
pulverización, varios de los componentes de FBS (fosfatasa alcalina,
AST y LD, y posiblemente glucosa) sufren una reducción significativa
en la concentración en comparación con sus concentraciones en el FBS
líquido de partida.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar el impacto de la irradiación con
rayos \gamma sobre la capacidad de los sueros de polvo seco para
apoyar el crecimiento celular, se usaron muestras de FBS secado por
pulverización irradiadas en diversas condiciones para complementar
los medios de cultivo, y se hicieron crecer las células adherentes y
en suspensión durante hasta tres pases en estos medios. Como
células en suspensión modelo, se usaron las líneas hibridoma SP2/0
y AE-1, mientras que se usaron los cultivos de VERO
y BHK como células adherentes típicas. Las células se cultivaron en
medios que contenían sueros de prueba o sueros control (secados por
pulverización pero no irradiados) durante hasta tres pases según
los procedimientos generales explicados de manera general en el
ejemplo 14 anterior. En cada punto de pase, se recogieron las
células y se subcultivaron, mientras que se contó una alícuota tal
como anteriormente para determinar las células viables/ml. Los
resultados en cada punto se expresaron como un porcentaje del
recuento de células viables obtenido en medios complementados con
FBS líquido, y se muestran en las figuras 17A, 17B, 17C y 17D.
Pueden extraerse varias conclusiones de los
resultados de estos estudios. En primer lugar, la irradiación con
rayos \gamma de FBS no parece reducir la capacidad del FBS secado
por pulverización para apoyar el crecimiento de las células en
suspensión y adherentes (compárense los conjuntos de datos
irradiados con el conjunto de datos no irradiados en cada figura).
De hecho, las células BHK (figura 17D) en realidad crecieron mejor
en los medios que contenían FBS en polvo que se habían irradiado a
-70ºC que en los sueros no irradiados. En segundo lugar, los sueros
irradiados a -70ºC parecen funcionar mejor que aquéllos irradiados a
temperatura ambiente en su capacidad para apoyar el crecimiento
celular, excepto tal vez para las células VERO (figura 17C).
Finalmente, los resultados de estos estudios fueron muy específicos
del tipo de célula: las células en suspensión (figuras 17A y 17B)
crecieron mejor en FBS secado por pulverización, irradiado o no
irradiado, que las células adherentes (figuras 17C y 17D); y entre
las células adherentes, las células BHK (figura 17D) crecieron mejor
en FBS secado por pulverización que las células VERO (figura
17C).
Estos resultados demuestran que la irradiación
con rayos \gamma puede usarse como técnica de esterilización en
la preparación de sueros en polvo en volumen, tal como FBS. Además,
a diferencia de aquéllos notificados para la transferrina en el
ejemplo 14 anterior, estos datos sugieren que la temperatura óptima
para la irradiación de sueros, con el fin de mantener la capacidad
de los sueros para apoyar el crecimiento celular, es probable que
sea inferior a la temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 17 y
18
Los lípidos (particularmente esteroles y ácidos
grasos) son nutrientes críticos para el cultivo de alta densidad de
células eucariotas. La inclusión de componentes lipídicos en los
medios en forma seca ha sido un reto técnico. Los complementos
lipídicos se suministran normalmente para la adición separada tras
la reconstitución y filtración del polvo, aumentando la
manipulación y las posibilidades de error en una instalación de
fabricación biofarmacéutica. La tecnología de granulación avanzada
(AGT^{TM}) es un formato de medios en forma seca novedoso que
tiene ventajas significativas. Dentro de un medio granulado
individual se incorporan todos los componentes de una formulación
compleja, para incluir tampones, factores de crecimiento y
oligoelementos. La formulación de pH automático, baja en polvo
fino, resultante simplemente requiere la adición a agua para
producir un medio 1X reconstituido completo. La tecnología de
ciclodextrina así como el uso de sales de sodio y disoluciones
hidroalcohólicas de lípidos pueden usarse junto con el proceso AGT
para suministrar el lípido que puede usarse en un formato de medio
seco.
Los lípidos sometidos a prueba fueron colesterol
y varios ácidos grasos que se proporcionaron o bien como un
complemento aséptico para medios líquidos o bien como parte de una
formulación de AGT completa. Los controles incluían medio sin
lípido. La línea celular usada fue ECACC n.º 85110503, un auxótrofo
del colesterol. Las células se cultivaron en medio
CD-hibridoma, que está definido químicamente y no
contiene componentes derivados de animales. Los resultados
analíticos de CG indicaron una excelente disponibilidad de lípidos
tras la filtración cuando se incorporan formas lipídicas
complejadas con ciclodextrina en el proceso AGT. El crecimiento y la
viabilidad de las células era comparable cuando crecieron en o bien
un medio completo derivado de AGT o bien un medio líquido control
con complementación de lípido. El pico de las densidades celulares
de ambos formatos de medios alcanzó 3,5 x 10^{6} células/ml en un
cultivo de células del lote. El uso de las sales, por ejemplo, una
sal de sodio de un ácido lipoico en AGT ha demostrado ser eficaz
para suministrar el lípido a las células en cultivo.
Para la preparación, se disolvió ciclodextrina
en agua a una concentración del 62,5% (62,5 g en 100 ml de agua).
Esto puede variar algo menos pero se acerca aproximadamente a la
disolución máxima de ciclodextrina en agua a temperatura ambiente.
Se prefiere mantener una razón de ciclodextrina con respecto a
lípido tan alta como sea práctica puesto que la capacidad de la
ciclodextrina para mantener el reparto (complejación física con)
del lípido y almacenarlo en disolución tras la dilución en agua
depende de los niveles de ciclodextrina. (\sim0,125% o una
disolución mayor de ciclodextrina es ventajosa en el medio 1X).
Entonces se añadieron lípidos directamente a la disolución de
ciclodextrina a una concentración para que estuviera a la
concentración deseada cuando se diluyó en medios de cultivo celular
acuosos. Se permitió que el lípido se disolviera con agitación.
Además de la adición directa del lípido a la ciclodextrina, también
es posible añadir el lípido al alcohol antes de la adición a la
ciclodextrina. (Esto puede desearse si la cantidad de lípido que va
a añadirse es tan pequeña que la adición por sí misma es
problemática físicamente). Puesto que la disolución de
ciclodextrina-lípido resultante es bastante
viscosa, puede ser preferible diluir la disolución de
ciclodextrina-lípido anterior por ejemplo, con agua
para el uso conveniente. Tales disoluciones pueden dar como
resultado un concentrado de por ejemplo 500X o 250X. (Un experto
habitual apreciará que a medida que se diluye la disolución de
ciclodextrina-lípido, será necesario añadir más
volumen al medio de cultivo celular para producir la concentración
de lípido deseada).
Tipos de lípido de importancia para el cultivo
celular: colesterol (homólogos tanto animales como vegetales),
ácido linoleico, ácido lipoico, ácido araquidónico, ácido palmítico,
ácido oléico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido mirístico,
ácido linolénico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina,
esfingomielina, cardiolipina, vitamina A, vitamina E, vitamina K,
prostaglandina, etc.
Experimento de cultivo celular con el complejo
ciclodextrina-lípido:
(Las células se sometieron a subpase cada 3 ó 4
días)
1 = Medio granulado (aglomerado) CD hibridoma
con lípidos añadidos por medio de pulverización en complejos
ciclodextrina-lípido durante (como parte del)
proceso de aglomeración.
2 = Medio CD hibridoma con lípidos añadidos como
adición de complemento de ciclodextrina-lípido tras
la reconstitución.
3 = Medio CD Hibridoma sin la adición de
lípidos.
- Conclusión: Los lípidos suministrados mediante tecnología de granulación usando pulverización de ciclodextrina-lípido son comparables con los lípidos añadidos usando ciclodextrina-lípido añadido como complemento a un medio reconstituido 1X.
\vskip1.000000\baselineskip
Habiendo descrito ahora completamente la
presente invención en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo
con el fin de la claridad de la comprensión, será obvio para un
experto habitual en la técnica que la misma puede llevarse a cabo
modificando o cambiando la invención dentro de un intervalo amplio y
equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin
afectar el alcance de la invención o cualquier realización
específica de la misma, y que tales modificaciones o cambios están
abarcados dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes
de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas
del nivel de habilidad de los expertos en la técnica a la que
pertenece esta invención.
Claims (43)
1. Procedimiento de producción de un polvo de
medio nutritivo aglomerado, un polvo de complemento de medio
aglomerado, un polvo de subgrupo de medio nutritivo aglomerado o un
polvo de tampón aglomerado, comprendiendo el procedimiento:
aglomerar un polvo de medio nutritivo, polvo de
complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo
de tampón, con un disolvente que comprende al menos un lípido
disuelto en el mismo,
suministrar el disolvente al menos un lípido
para su incorporación en el polvo de medio nutritivo, polvo de
complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo
de tampón, y
en el que el al menos un lípido se compleja con
una ciclodextrina.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la ciclodextrina es
\beta-metilciclodextrina.
3. Procedimiento según cualquier reivindicación
anterior, en el que la aglomeración comprende aglomeración en lecho
fluidizado.
4. Procedimiento según cualquier reivindicación
anterior, en el que el disolvente está en fase líquida.
5. Procedimiento según cualquier reivindicación
anterior, en el que el lípido está en forma de una sal.
6. Procedimiento según cualquier reivindicación
anterior, en el que el lípido tiene uno o más grupos hidroxilo.
7. Procedimiento según cualquier reivindicación
anterior, en el que el disolvente es una mezcla.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que la mezcla es una mezcla de líquidos.
9. Procedimiento según la reivindicación 7 o la
reivindicación 8, en el que la mezcla comprende al menos un
disolvente polar.
10. Procedimiento según la reivindicación 7 o la
reivindicación 8, en el que la mezcla comprende al menos un
disolvente apolar.
11. Procedimiento según la reivindicación 7 o la
reivindicación 8, en el que la mezcla comprende al menos un
disolvente orgánico.
12. Procedimiento según la reivindicación 7 o la
reivindicación 8, en el que la mezcla comprende un 20%-95% de
disolvente orgánico.
13. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que la mezcla comprende al menos un disolvente seleccionado del
grupo constituido por: (a) al menos un disolvente polar; y (b) al
menos un disolvente orgánico o al menos un disolvente apolar.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que la mezcla comprende los disolventes en razón del 1% al 99% de
(a) el al menos un disolvente polar con (b) el al menos un
disolvente orgánico o el al menos un disolvente apolar.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que la mezcla comprende un 40-60% del al menos un
disolvente orgánico o del al menos un disolvente apolar.
16. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que la mezcla comprende un 50% de (a) el al menos un disolvente
polar y el 50% de (b) el al menos un disolvente orgánico o el al
menos un disolvente apolar.
17. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que la mezcla comprende agua y al menos un disolvente
seleccionado del grupo constituido por dimetilsulfóxido, alcoholes,
éteres y cetonas.
18. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la mezcla comprende agua y alcohol.
19. Procedimiento según la reivindicación 8 ó
18, en el que la mezcla comprende agua y etanol.
20. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que la mezcla comprende al menos un disolvente seleccionado del
grupo constituido por dimetilsulfóxido, alcoholes, éteres y
cetonas.
\newpage
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que la mezcla comprende aproximadamente un 40-60%
de etanol.
22. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que la mezcla comprende aproximadamente un 50% de etanol.
23. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el disolvente comprende una mezcla de al menos dos
disolventes seleccionados del grupo constituido por disolventes
apolares y disolventes orgánicos.
24. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el disolvente es agua.
25. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la ciclodextrina se disuelve en agua, y después se añade una
mezcla de lípido/alcohol a la disolución de ciclodextrina, antes de
la aglomeración.
26. Procedimiento según cualquier reivindicación
anterior, en el que el suministro se lleva a cabo en condiciones que
comprenden al menos una de temperatura controlada, humedad
controlada y presión parcial controlada del/de los
disolvente(s).
27. Procedimiento según cualquier reivindicación
anterior, en el que el lípido se selecciona del grupo constituido
por ácido linoleico, ácido lipoico, ácido araquidónico, ácido
palmítico, ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido
mirístico, ácido linolénico, fosfatidiletanolamina,
fosfatidilcolina, esfingomielina, cardiolipina, vitamina A, vitamina
E, vitamina K, prostaglandina y un esterol.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en
el que dicho esterol es un esterol vegetal o uno animal.
29. Procedimiento según la reivindicación 27, en
el que el esterol es colesterol.
30. Polvo de medio nutritivo aglomerado, polvo
de complemento de medio aglomerado, polvo de subgrupo de medio
nutritivo aglomerado o polvo de tampón aglomerado, preparados según
el procedimiento de las reivindicaciones 1-27.
31. Polvo según la reivindicación 30 que tiene
una formación de polvo fino reducida en comparación con un polvo de
medio nutritivo no aglomerado.
32. Polvo según la reivindicación 30 que tiene
una solubilidad más completa en comparación con un polvo de medio
nutritivo no aglomerado.
33. Polvo según la reivindicación 30 que tiene
menos material insoluble en comparación con un polvo de medio
nutritivo no aglomerado.
34. Polvo según la reivindicación 30 que tiene
una disolución más rápida en comparación con un polvo de medio
nutritivo no aglomerado.
35. Polvo según la reivindicación 30, en el que
el polvo de medio nutritivo está libre de suero.
36. Polvo según la reivindicación 30, en el que
el polvo de medio nutritivo está libre de componentes de
mamíferos.
37. Polvo según la reivindicación 30, en el que
el polvo de medio nutritivo está libre de componentes animales.
38. Procedimiento de cultivo de una célula que
comprende: (a) reconstituir el polvo aglomerado según cualquiera de
las reivindicaciones 30 a 37 con un disolvente para formar una
disolución líquida; y (b) poner en contacto la célula con la
disolución líquida en condiciones que favorecen el cultivo de la
célula.
39. Procedimiento según la reivindicación 38, en
el que la célula es una célula seleccionada del grupo constituido
por célula bacteriana, célula de insectos, célula de levaduras,
célula de nematodos, célula de aves, célula de anfibios, célula de
reptiles y célula de mamíferos.
40. Procedimiento según la reivindicación 38, en
el que la célula es una célula de mamíferos.
41. Procedimiento según la reivindicación 40, en
el que la célula de mamíferos se selecciona del grupo constituido
por una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK,
una célula AE-1, una célula SP2/0, una célula L5.1,
una célula PerC6, una célula 293 y una célula de hibridoma.
42. Procedimiento según la reivindicación 40, en
el que la célula de mamíferos es una célula humana.
43. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 38 a 42 en el que el crecimiento de la célula a los
3, 4, 7, 10, 14, 28, 30, 60 ó 90 días es del 50%-120% en comparación
con el crecimiento de la célula en el mismo momento en un medio
líquido con lípido añadido.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33411501P | 2001-11-30 | 2001-11-30 | |
| US334115P | 2001-11-30 | ||
| US33711701P | 2001-12-07 | 2001-12-07 | |
| US337117P | 2001-12-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2341645T3 true ES2341645T3 (es) | 2010-06-24 |
Family
ID=26989049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02791342T Expired - Lifetime ES2341645T3 (es) | 2001-11-30 | 2002-12-02 | Medios para cultivo celular. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030153079A1 (es) |
| EP (3) | EP2253699A1 (es) |
| JP (3) | JP2005530480A (es) |
| AT (1) | ATE462781T1 (es) |
| AU (2) | AU2002365893C1 (es) |
| CA (1) | CA2468742A1 (es) |
| DE (1) | DE60235835D1 (es) |
| DK (1) | DK1461420T3 (es) |
| ES (1) | ES2341645T3 (es) |
| NZ (1) | NZ533689A (es) |
| WO (1) | WO2003048313A2 (es) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6383810B2 (en) * | 1997-02-14 | 2002-05-07 | Invitrogen Corporation | Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof |
| US20060003447A1 (en) * | 2003-12-30 | 2006-01-05 | Richard Fike | Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof |
| EP2295533A3 (en) * | 2000-11-06 | 2011-07-13 | Life Technologies Corporation | Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof |
| EP2253699A1 (en) | 2001-11-30 | 2010-11-24 | Life Technologies Corporation | Dry powder cell culture products containing lipid and methods of production thereof |
| AT413700B (de) * | 2004-03-05 | 2006-05-15 | Igeneon Krebs Immuntherapie | Mediumzusätze für zellkultur enthaltend aceton |
| US20090226598A1 (en) * | 2008-02-11 | 2009-09-10 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Substrate Coating Apparatus Having a Solvent Vapor Emitter |
| HUP0900603A2 (en) * | 2009-09-25 | 2012-02-28 | Biomarker Kft | Cell culture medium |
| EP2673357A2 (en) | 2011-02-07 | 2013-12-18 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for stabilizing susceptible compounds |
| CN104080905B (zh) * | 2011-12-22 | 2016-11-16 | 生命技术公司 | 细胞培养基和方法 |
| EP2674482A1 (en) * | 2012-06-15 | 2013-12-18 | Merck Patent GmbH | Process for producing cell culture media |
| US9765293B2 (en) | 2012-07-25 | 2017-09-19 | 3M Innovative Properties Company | Agglomerated microbiological media |
| BR112015002686A2 (pt) * | 2012-08-07 | 2017-09-19 | 3M Innovative Properties Co | método para produção de um meio nutritivo aglomerado, artigo, composição, cápsula, kit e dispositivo de cultura de filme fino |
| GB2545287A (en) | 2013-12-20 | 2017-06-14 | Harvard College | Organomimetic devices and methods of use and manufacturing thereof |
| WO2016085787A1 (en) | 2014-11-25 | 2016-06-02 | Corning Incorporated | Cell culture media extending materials and methods |
| WO2016198499A1 (en) * | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Glycotope Gmbh | IMPROVED METHOD FOR PRODUCTION OF γ-CARBOXYLATED POLYPEPTIDES |
| WO2017195888A1 (ja) * | 2016-05-12 | 2017-11-16 | 国立大学法人 東京大学 | 固体培地での微生物の増殖能を増強する方法 |
| CN113215085B (zh) * | 2021-05-07 | 2024-05-10 | 澳门大学 | 一种脂类物质添加剂及其应用 |
| CA3220634A1 (en) * | 2021-06-11 | 2022-12-15 | Upside Foods, Inc. | Comestible cell-based meat products comprising dry cell powder and methods of making such products |
Family Cites Families (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2835586A (en) * | 1953-07-27 | 1958-05-20 | Instant Milk Company | Dried milk product and method of making same |
| DK123067B (da) * | 1970-09-25 | 1972-05-15 | Niro Atomizer As | Fremgangsmåde til behandling af et pulverformigt, fedtholdigt mælkeprodukt. |
| DK125813B (da) | 1971-04-16 | 1973-05-07 | Niro Atomizer As | Apparat til tørring af fugtige pulvere. |
| US4072570A (en) * | 1972-04-11 | 1978-02-07 | Beatrice Foods Co. | Preparation of a tuberculosis test medium by reconstituting a storage stabilized dry powdered Lowenstein-Jensen medium |
| US4053642A (en) * | 1972-05-02 | 1977-10-11 | Stichting Bedrijven Van Het Nederlands Instituut Voor Zuivelonderzoek | Starter culture production |
| US4073951A (en) * | 1974-04-18 | 1978-02-14 | Sargeant Ralph G | Agglomeration method |
| IL44853A (en) * | 1974-05-17 | 1975-11-25 | Isorad Isotopes & Radiation | Process for the preparation of sterile culture media and culture medium thus obtained |
| DD119304A1 (es) | 1975-04-23 | 1976-04-12 | ||
| US4615978A (en) * | 1979-06-28 | 1986-10-07 | The State Of Oregon, By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Bacterial growth medium and method of use |
| JPS57194787A (en) * | 1981-05-28 | 1982-11-30 | Ajinomoto Co Inc | Culture medium for animal cell |
| JPS5813541A (ja) * | 1981-07-16 | 1983-01-26 | Kureha Chem Ind Co Ltd | エイコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸のシクロデキストリン包接化合物 |
| US4511592A (en) * | 1982-03-11 | 1985-04-16 | Scm Corporation | Preparation of acidulated meat emulsions |
| DK157053B (da) * | 1982-06-14 | 1989-11-06 | Niro Atomizer As | Fremgangsmaade til fremstilling af et agglomereret, pulverformet maelkeprodukt |
| US4544637A (en) * | 1982-09-14 | 1985-10-01 | Igi Biotechnology, Inc. | Culture media from clarified diary whey lactose permeates |
| US4621058A (en) * | 1983-04-11 | 1986-11-04 | Mid-America Dairymen, Inc. | Method of preparing cheese starter media |
| US4673649A (en) | 1983-07-15 | 1987-06-16 | University Patents, Inc. | Process and defined medium for growth of human epidermal keratinocyte cells |
| US4620908A (en) * | 1983-10-03 | 1986-11-04 | Biocell Laboratories, Inc. | Method for destroying microbial contamination in protein materials |
| US4689297A (en) | 1985-03-05 | 1987-08-25 | Miles Laboratories, Inc. | Dust free particulate enzyme formulation |
| US4632980A (en) * | 1985-04-03 | 1986-12-30 | Immunologics | Ozone decontamination of blood and blood products |
| US4975246A (en) * | 1985-09-30 | 1990-12-04 | Charm Stanley E | High temperature, short time heating system and method of heating heat-sensitive material |
| US4820627A (en) * | 1986-03-24 | 1989-04-11 | Em Diagnostic Systems, Inc. | Method of preparing particles suitable for tabletting into diagnostic reagents |
| GB8700354D0 (en) * | 1987-01-08 | 1987-02-11 | Distillers Co | Culture of micro-organisms |
| DK158532C (da) | 1987-07-14 | 1990-10-29 | Niro Atomizer As | Toerreapparat, der arbejder med fluid bed, og lejeplade dertil |
| US5006204A (en) | 1988-08-10 | 1991-04-09 | A/S Niro Atomizer | Apparatus for crystallizing whey |
| EP0441092A1 (en) * | 1990-02-08 | 1991-08-14 | Niro Holding A/S | A method and apparatus for heat treating a particulate product |
| EP0474949B1 (en) | 1990-09-11 | 1994-11-17 | Niro Holding A/S | A method and apparatus for treating a pulverulent or particulate material or product with gas |
| US5700426A (en) * | 1991-03-08 | 1997-12-23 | Foundation Nationale De Transfusion Sanguine | Method for decontaminating or sterilizing "in situ" a vacuum sealed container and device for implementing such method |
| DE69104183T2 (de) | 1991-04-05 | 1995-05-11 | Niro Holding As | Wirbelbettvorrichtung und Verfahren zu ihrer Herstellung. |
| GB9107628D0 (en) * | 1991-04-10 | 1991-05-29 | Moonbrook Limited | Preparation of diagnostic agents |
| ES2053410T1 (es) | 1991-06-17 | 1994-08-01 | Life Technologies Inc | Metodo para la preparacion de un medio de cultivo de celulas. |
| US5155039A (en) * | 1991-07-22 | 1992-10-13 | Chrisope Technologies, Inc. | Apparatus for methods for preserving, transporting storing, re-hydrating and delivering viable micro-organisms |
| US5235606A (en) * | 1991-10-29 | 1993-08-10 | University Of Michigan | Amplification of ultrashort pulses with nd:glass amplifiers pumped by alexandrite free running laser |
| US5325606A (en) | 1992-12-23 | 1994-07-05 | Niro A/S | Process and apparatus for drying and calcining sodium bicarbonate |
| US5366696A (en) * | 1993-01-07 | 1994-11-22 | 1077075 Ontario Inc. | Oxygenation apparatus for oxygenating a carrier liquid by spraying |
| ZA944234B (en) * | 1993-06-15 | 1995-02-10 | Commw Scient Ind Res Org | Fumigation of particulate commodities |
| US5631159A (en) * | 1993-09-22 | 1997-05-20 | Creative Biomolecules, Inc. | Lipid-modified serum free media |
| US5817280A (en) | 1993-11-15 | 1998-10-06 | Niro Holding A/S | Fluid bed for producing and/or processing a particulate material |
| US5580856A (en) * | 1994-07-15 | 1996-12-03 | Prestrelski; Steven J. | Formulation of a reconstituted protein, and method and kit for the production thereof |
| US5811406A (en) * | 1995-06-07 | 1998-09-22 | Regents Of The University Of California | Dry powder formulations of polynucleotide complexes |
| CA2230954A1 (en) * | 1995-09-18 | 1997-03-27 | Gummadi J. Franklin | Thin film culture plate device containing granulated medium particles |
| US5843024A (en) * | 1996-05-17 | 1998-12-01 | Breonics, Inc. | Solution and process for resuscitation and preparation of ischemically damaged tissue |
| US5773279A (en) * | 1996-11-27 | 1998-06-30 | Neogen Corporation | Culture medium and method for repair of microbial cells |
| GB9625175D0 (en) * | 1996-12-04 | 1997-01-22 | Medi Cult As | Serum-free cell culture media |
| US6627426B2 (en) * | 1997-02-14 | 2003-09-30 | Invitrogen Corporation | Methods for reducing adventitious agents and toxins and cell culture reagents produced thereby |
| US6383810B2 (en) * | 1997-02-14 | 2002-05-07 | Invitrogen Corporation | Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof |
| US7078057B2 (en) * | 1999-12-20 | 2006-07-18 | Kerkhof Nicholas J | Process for producing nanometer particles by fluid bed spray-drying |
| EP2253699A1 (en) | 2001-11-30 | 2010-11-24 | Life Technologies Corporation | Dry powder cell culture products containing lipid and methods of production thereof |
| DE102007032419B4 (de) * | 2007-07-10 | 2013-02-21 | Outotec Oyj | Verfahren und Anlage zur Reduktion von eisenoxidhaltigen Feststoffen |
-
2002
- 2002-12-02 EP EP10153158A patent/EP2253699A1/en not_active Withdrawn
- 2002-12-02 EP EP02791342A patent/EP1461420B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-02 US US10/307,451 patent/US20030153079A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-02 EP EP10152981A patent/EP2251417A1/en not_active Withdrawn
- 2002-12-02 WO PCT/US2002/038230 patent/WO2003048313A2/en active Application Filing
- 2002-12-02 CA CA002468742A patent/CA2468742A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-02 ES ES02791342T patent/ES2341645T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-02 AT AT02791342T patent/ATE462781T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-12-02 JP JP2003549492A patent/JP2005530480A/ja not_active Withdrawn
- 2002-12-02 DK DK02791342.5T patent/DK1461420T3/da active
- 2002-12-02 AU AU2002365893A patent/AU2002365893C1/en not_active Ceased
- 2002-12-02 DE DE60235835T patent/DE60235835D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-02 NZ NZ533689A patent/NZ533689A/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-05-16 US US11/434,513 patent/US20060270038A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-12-31 AU AU2008264233A patent/AU2008264233A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-08-21 JP JP2009191870A patent/JP2010000088A/ja not_active Withdrawn
-
2011
- 2011-09-09 JP JP2011197001A patent/JP2011239794A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1461420A2 (en) | 2004-09-29 |
| JP2005530480A (ja) | 2005-10-13 |
| US20060270038A1 (en) | 2006-11-30 |
| NZ533689A (en) | 2007-06-29 |
| CA2468742A1 (en) | 2003-06-12 |
| DE60235835D1 (de) | 2010-05-12 |
| JP2010000088A (ja) | 2010-01-07 |
| AU2002365893B2 (en) | 2008-10-09 |
| AU2002365893A1 (en) | 2003-06-17 |
| ATE462781T1 (de) | 2010-04-15 |
| US20030153079A1 (en) | 2003-08-14 |
| EP1461420B1 (en) | 2010-03-31 |
| EP1461420A4 (en) | 2005-08-03 |
| AU2002365893C1 (en) | 2009-07-09 |
| EP2253699A1 (en) | 2010-11-24 |
| WO2003048313A3 (en) | 2004-01-15 |
| EP2251417A1 (en) | 2010-11-17 |
| DK1461420T3 (da) | 2010-05-17 |
| WO2003048313A2 (en) | 2003-06-12 |
| AU2008264233A1 (en) | 2009-01-29 |
| JP2011239794A (ja) | 2011-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6166744B2 (ja) | 乾燥粉末細胞および細胞培養試薬およびその生産の方法 | |
| ES2516790T3 (es) | Células en polvo seco y reactivos de cultivo celular y métodos para la producción de estos | |
| ES2341645T3 (es) | Medios para cultivo celular. | |
| JP2002515758A5 (es) |