ES2288018T3 - Formulaciones inyectables de igf que contienen succinato como tampon. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica inyectable que comprende el factor de crecimiento humano tipo insulina 1 (IGF-1) o su variante biológicamente activa y un tampón, en el que dicho tampón consiste sustancialmente en succinato a una concentración de 10 mM a 40 mM y un contraión, y en el que dicha variante es un polipéptido que tiene actividad de IGF-1 y una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% respecto a la secuencia de aminoácidos para el IGF-1 humano.

Description

Formulaciones inyectables de IGF que contienen succinato como tampón.

Campo de la invención

El campo de la invención es las formulaciones inyectables de agentes farmacéuticamente activos para su uso in vivo. Las formulaciones a las cuales se refiere la invención son diseñadas para reducir al mínimo el dolor asociado a los componentes en las formulaciones inyectables, distintos a los componentes activos. La invención particularmente se refiere a formulaciones farmacéuticas que son tamponadas con succinato y que proporciona menos dolor en la inyección. El factor de crecimiento tipo insulina I humano (hIGF-I) es el agente farmacéuticamente activo.

Antecedentes de la invención

Numerosos estudios han demostrado que la inyección subcutánea puede ser dolorosa (Ipp et al. (1990) Pediatrics 85: 134-135); Zindel (1989) Conn. Med. 53: 741-744); Gazzaniga et al. (1993) Int. Surg. 78: 271-275). Poca información existe sobre las causas del dolor en las inyecciones debido a las variables de la formulación. Se ha postulado que los factores que causan el dolor incluyen el volumen de la inyección, la velocidad de la inyección, osmolalidad, pH, sitio de inyección, tamaño y la calidad de la aguja de la inyección, presencia de sustancias irritantes y la temperatura de la solución (Fransson et al. (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48: 1012-1015).

La mayoría de las formulaciones farmacéuticas inyectables contienen un tampón para estabilizar al agente farmacéuticamente activo contra la degradación química que podría ocurrir si el pH cambiara considerablemente. Los sistemas tampón más comúnmente usados en las formulaciones farmacéuticas inyectables son citratos, acetatos y fosfatos. Sin embargo, la inyección de tales formulaciones ha estado asociada con el dolor. Por ejemplo, se ha publicado que la inyección de una solución salina es menos dolorosa que la inyección con tampón citrato (Fleischaker et al. (1993) J. Clin. Pharmacol. 33: 182-190).

Frenken et al. (1993) Am. J. Kidney Dis.. 22: 553-556) publicaron un estudio clínico en el cual fue evaluado el papel del citrato 20 mM por causar dolor después de la administración subcutánea de epoetina \alpha. Los resultados sugirieron que el citrato de sodio 20 mM (pH 6,9) causaba un dolor significativo comparado con la solución salina. Los resultados de otro estudio por este mismo grupo sugirieron que (1) la inyección de volúmenes más pequeños era beneficiosa; (2) el ajuste de la osmolaridad de Eprex para llevarlo hasta la isotonicidad no redujo el dolor; y (3) la inclusión de alcohol bencílico en la inyección diluida disminuyó el dolor, probablemente debido a efectos anestésicos (Frenken et al. (1994) Nephrol. Dial. Transplant. 9: 1295-1298).

La inyección de IGF-I ha sido asociada con el dolor. En la bibliografía se muestra que los tampones preferidos en las formulaciones de IGF-I son tampones de acetato, fosfato y citrato. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.374.620 menciona el posible uso de un tampón de succinato en formulaciones farmacéuticas que contienen IGF-I y GH. Sin embargo, la Patente de EE.UU. Nº 5.374.620 muestra que el acetato de sodio, opcionalmente en combinación con citrato de sodio, es el tampón preferido.

Fransson et al. (1996) (J. Pharm. Pharmacol. 48: 1012-1015) estudiaron formulaciones para reducir al mínimo el dolor con la inyección subcutánea de hIGF-I. En el estudio se evaluó cómo el pH, la concentración de tampón, y la presencia de hIGF-I afectan a la tolerancia local frente a la inyección subcutánea de la solución. El estudio divulgó que (1) un tampón con alta capacidad tamponante (fosfato 50 mM) a pH 6,0 hecho isotónico con NaCl causaba considerablemente más dolor que una formulación de tampón fosfato 10 mM; (2) formulaciones de hIGF tamponadas con fosfato a pH 7 fueron bien toleradas; (3) formulaciones tamponadas con hIGF-I de fosfato 10 mM, fueron tan bien toleradas como la formulación a pH 7; y (4) hIGF-I por sí mismo no causó dolor.

El documento WO 94/15584 se refiere a formulaciones inyectables para la administración subcutánea de IGF-I diseñado para reducir el dolor. La referencia muestra el uso de tampón fosfato para reducir el dolor de la inyección subcutánea.

El documento EP-A-0 284 249 describe una composición de linfoquina liofilizada que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una linfoquina tal como un interferón y, entre otros componentes, un tampón tal como una combinación de ácido succícino y succinato de sodio. El documento US-5.151.265 describe una composición farmacéutica líquida que comprende \gamma-interferón no liofilizante. La composición incluye un tampón, que puede ser citrato, succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato o acetato y mantiene la composición a un pH de 4,0 a 6,0. El documento WO 96/40894 describe composiciones para el tratamiento de resistencia a la insulina por la inhibición de la fosforilación de serina de proteína quinasa C. Tales composiciones pueden incluir un tampón con succinato. El documento US-5.681.814 describe formulaciones de IGF1 que comprenden una solución tamponada, osmólita y estabilizadora, y opcionalmente un tensioactivo. Los ejemplos de tampón incluyen al succinato.

El documento WO 95/31213 describe formulaciones líquidas de interferón-\beta estabilizadas con un poliol, un azúcar no reductor o un aminoácido. También son descritas composiciones que comprenden el tampón succinato. El documento JP 09/304379 describe métodos profilácticos para reducir el riesgo de trombosis empleando la administración de TFPI (el inhibidor de la vía del factor tisular) para alcanzar niveles más altos en el plasma. El TFPI puede ser formulado de acuerdo con cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo formulaciones que incluyen
tampones.

Los sujetos inyectados con formulaciones de IGF-I tamponadas con fosfato o acetato cuentan que padecen menos dolor que con una formulación de citrato. Sin embargo, queda un nivel significativo de dolor asociado a la inyección de formulaciones de IGF-I tamponadas con fosfato o acetato. En consecuencia, un objeto de la invención es proporcionar mejores composiciones farmacéuticas que causen un menor dolor en la inyección.

Un objeto específico de la invención es proporcionar una composición farmacéutica que permita la inyección de hIGF-I con menos dolor.

Un objeto más específico de la invención es proporcionar una composición farmacéutica en la que el agente farmacéuticamente activo sea estable y así poder ser almacenado durante largos períodos de tiempo sin una degradación física y/o biológica significativa.

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Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de los inventores de que las formulaciones farmacéuticas tamponadas con succinato causan menos dolor en la inyección que las formulaciones que contienen los tampones más comúnmente usados, tales como tampones de fosfato, acetato y citrato. En particular, los inventores han descubierto que los tampones de succinato reducen el dolor asociado a la inyección de las formulaciones de IGF-I. Basado en este descubrimiento, es ahora posible desarrollar composiciones farmacéuticas para IGF-I y otros agentes farmacéuticamente activos con menos dolor debido a la inyección. Antes, la bibliografía médica no aconsejaba el uso del tampón succinato para reducir al mínimo el dolor asociado a la inyección.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica inyectable que comprende el factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I) humano o su variante biológicamente activa y un tampón, en el que dicho tampón consiste sustancialmente en succinato a una concentración de 10 mM a 40 mM y un contraión, y en el que dicha variante es un polipéptido que tiene actividad de IGF-I y una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% respecto a la secuencia de aminoácidos para el IGF-I humano.

El uso de succinato como tampón proporciona menos dolor en la inyección. En una realización preferida, la composición de la invención comprende succinato de sodio y IGF-1.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser almacenadas durante largos períodos de tiempo manteniendo la integridad física y biológica del agente farmacéuticamente activo. La invención también se refiere a métodos para administrar cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente y en este documento.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1

Estabilidad de rhIGF-I como una función del pH. En este estudio, fue formulado con rhIGF tampón de citrato-fosfato en un intervalo de pH de 4,0-7,0. Fue medida la integridad del porcentaje del pico principal (el pico que contiene la molécula natural) durante un período de ocho semanas a una temperatura de 50ºC. La medida fue con CN(ciano)-RP-HPLC.

Figura 2

Estabilidad de rhIGF-I como una función del pH. En este estudio, fue formulado con rhIGF tampón de citrato-fosfato en un intervalo de pH de 4,0-7,0. El porcentaje de actividad mitogénica fue medida durante un periodo de ocho semanas a una temperatura de 50ºC.

Figura 3

Efecto de varias especies de tampón a pH 6,0 y pH 6,5 respecto a la estabilidad de rhIGF. En este estudio, fueron formulados varios tampones con rhIGF-1. La integridad del pico principal fue medida durante un periodo de ocho semanas a una temperatura de 50ºC. La integridad fue medida con CN-RP-HPLC.

Figura 4

Efecto de varias especies de tampón a pH 6,0 y pH 6,5 respecto a la estabilidad de rhIGF. La medida del porcentaje de monómero (molécula natural) restante fue durante un periodo de ocho semanas a una temperatura de 50ºC. El resto del porcentaje de monómero fue medido por SDS-PAGE no reductora.

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Figura 5

Efecto de tampones de citrato de sodio y succinato de sodio a varias concentraciones respecto a la estabilidad de rhIGF-I. La estabilidad fue medida durante un periodo de ocho semanas en 50ºC. La medida fue hecha por ensayo del porcentaje de monómero por SDS-PAGE no reductora.

Figura 6

Efecto de tampones de citrato de sodio y succinato de sodio a varias concentraciones respecto a la estabilidad de rhIGF-I. La estabilidad fue medida por ensayo de actividad mitogénica durante un periodo de ocho semanas a 50ºC.

Figura 7

Datos de un modelo de activación nociceptor diseñado para predecir el dolor con la inyección inducida por formulaciones. En este modelo, es usada la capsaicina (un compuesto conocido por causar dolor en la inyección) (Santos et al. (1997) Neuropeptides 31: 381-389) para generar una curva estándar. Las formulaciones entonces fueron analizadas y les fue dado un valor basado en la curva estándar. Todas las formulaciones entonces fueron comparadas con la solución salina normal. Dos tampones fueron analizados y comparados con la solución salina normal: ácido acético 87 mM, acetato de sodio 13 mM, pH 4,0; y succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0. C1, C2 y C3 son diferentes concentraciones de capsaicina.

Figura 8

Efectos irritantes locales de formulaciones farmacéuticas inyectadas subcutáneamente. Se inyectó a conejos con solución salina, un vehículo control (tampón sin el agente farmacéutico), y una muestra de ensayo (tampón más el agente farmacéutico) en tres sitios separados. A: succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0; B: citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 135 mM, pH 6,0; C: ácido acético 87 mM, acetato de sodio 13 mM, cloruro de sodio 50 mM; D: metionina 1 mM, cloruro de sodio 135 mM, pH 6,0; E: succinato de sodio 10 mM; arginina
125 mM, cloruro de sodio 20 mM, pH 6,0; y F: sacarosa del 1,9%, cloruro de sodio 97 mM, pH 4,8.

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Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a una composición farmacéutica inyectable que comprende IGF-1 y un tampón, en el que dicho tampón consiste sustancialmente en un tampón de succinato. Las formulaciones farmacéuticas tamponadas con succinato causan menos dolor en la inyección que formulaciones similares que contienen tampones distintos a succinato, tales como tampones de citrato, fosfato o acetato.

La invención además proporciona una composición de la invención para el uso en un método de tratamiento, prevención o diagnóstico de una enfermedad o condición, en un sujeto humano o animal mediante inyección.

Por "tampón succinato" se entiende un tampón que comprende una sal de ácido succícino. En una realización preferida, el catión del succinato es el sodio. Sin embargo, se espera que cualquier catión sea eficaz. Otros cationes de succinato posibles incluyen potasio, amonio, calcio y magnesio. En una realización, el agente farmacéuticamente activo IGF-1 proporciona el catión.

Las composiciones farmacéuticas de la invención son tamponadas sustancialmente o esencialmente por un tampón succinato. Será entendido, sin embargo, que otros compuestos pueden estar presentes en las composiciones de la invención que tienen una capacidad tamponante relativamente menor. Los ejemplos de tales compuestos son el agente farmacéuticamente activo en sí mismo, agentes estabilizantes, y otros similares.

El tampón de succinato puede ser usado en un intervalo de concentraciones de 10 mM hasta 40 mM. Los intervalos de concentración adecuados incluyen aproximadamente 11-30 mM; 12-25 mM; 13-20 mM; 14-19 mM; y aproximadamente 15 mM. Los intervalos de concentración preferidos del tampón succinato son menos de 40 mM, menos de 35 mM, menos de 30 mM, menos de 25 mM, menos de 20 mM y menos de 15 mM. Lo más preferiblemente, la concentración de tampón succinato es de aproximadamente 10 mM.

Preferiblemente, el agente farmacéuticamente activo IGF-1 está presente en las composiciones de la invención en una concentración útil para la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de dicho agente a un sujeto. El agente farmacéuticamente activo puede prepararse a partir de cualquier fuente, incluyendo la purificación a partir de un mamífero, la producción recombinante o la síntesis química.

En la presente invención, el agente farmacéuticamente activo es IGF-I humano (hIGF-I) o su variante biológicamente activa. Lo más preferiblemente, el agente farmacéuticamente activo es el IGF-I recombinante (rhIGF-1).

El término "IGF-I", según se usa en este documento, se refiere al factor de crecimiento tipo insulina I, en su forma natural y sus variantes biológicamente activas. Las variantes biológicamente activas adecuadas pueden ser los fragmentos, análogos y derivados de IGF-I. Preferiblemente, el IGF-I es de la misma especie que la especie que sufre el tratamiento. Sin embargo, el IGF-I de la presente invención puede ser codificado por cualquier especie animal incluyendo aviar, canino, bovino, porcino, equino y humano.

Puede ser purificado IGF-I a partir de una fuente natural, puede ser químicamente sintetizado o producido recombinantemente. El IGF-I humano ha sido purificado a partir de plasma y se ha establecido su secuencia de aminoácidos completa (Rinderknecht et al. (1978) J. Biol. Chem. 253: 2769-2776). Las secuencias con extensas homologías respecto a IGF-I humano están presentes en el IGF-I purificado a partir del plasma de otras especies.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir variantes biológicamente activas de IGF-I. Las variantes de IGF-I se diferencian de las moléculas de IGF-I naturales debido a la modificación química o a inserciones de aminoácidos, deleciones, sustituciones (incluyendo aminoácidos químicamente modificados), y truncamientos del extremo carboxi- o amino-terminal o fusiones. Tales variantes deben conservar sustancialmente o completamente las actividades de IGF-I suficientes para el tratamiento beneficioso de un trastorno dado. En particular, las variantes deben conservar la capacidad de unirse a sitios del receptor de IGF-I. Los expertos en la técnica conocen las variantes de IGF-I. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.374.620.

Por "sustancialmente" se entiende una actividad que puede ser cuantitativamente diferente, siendo cualitativamente la misma. Cuando una proteína tiene múltiples actividades, una variante puede tener sustancialmente la misma actividad si tiene menos que todas las actividades, siempre que una de estas sea conservada. Preferiblemente, la variante tiene al menos la misma actividad que la molécula natural.

La actividad de IGF-I puede ser medida usando bioensayos de IGF-I estándar conocidos por los expertos en la técnica. Los ensayos representativos incluyen ensayos de radioreceptor conocidos usando membranas placentarias (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.324.639; Hall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 973-976; y Marshall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 283-292), un bioensayo que mide la capacidad de la molécula de realzar la incorporación de timidina tritiada, en una manera dependiente de la dosis, en el ADN de fibroblastos de BALB/C 3T3 (véase, por ejemplo, Tamura et al. (1989) J. Biol. Chem. 262: 5616-5621), incorporado en este documento como referencia.

Por "fragmento de IGF-I" se entiende un péptido que es sólo una parte de la secuencia de IGF-I intacta y estructura. Esto incluye, pero no está limitado, a una deleción del extremo C-terminal o una deleción del extremo N-terminal de IGF-I. El término "fragmento" se entiende que incluye cualquier parte de la proteína que proporcione un segmento que sustancialmente o completamente conserve la(s) función(ones) biológica(s) esencial(s) de la proteína. Los fragmentos pueden prepararse a partir de cualquier fuente, tal como, por ejemplo, a partir de secuencias peptídicas naturales, secuencias peptídicas sintéticas o químicamente sintetizadas, y secuencias peptídicas manipuladas genética-
mente.

Por "análogo" se entiende un análogo de IGF-I o de un fragmento de IGF-I que comprende una secuencia de IGF-I natural y una estructura que tiene una o varias sustituciones de aminoácidos, inserciones, o deleciones. Un análogo abarca una proteína que es la misma o sustancialmente similar en función a la proteína natural. Por ejemplo, un análogo de la proteína IGF-I es una proteína que no tiene la misma secuencia de aminoácidos que la proteína IGF-I, pero que es suficientemente homóloga para conservar sustancialmente o completamente la actividad biológica. Los péptidos que tienen uno o varios peptoides (imitan al péptido) también están abarcados por el término "análogo" (véase la Publicación Internacional Nº WO 91/04282).

Las modificaciones adecuadas de IGF-I, fragmentos de IGF-I, o sus análogos respectivos, incluyen, pero no están limitadas, a glicosilación, fosforilación, PEGilación, u otra adición de restos ajenos, siempre que la actividad de IGF-I sea sustancialmente o completamente conservada. Tales modificaciones pueden mejorar la solubilidad del compuesto, absorción, semivida biológica, disminuir la toxicidad de la molécula, o eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Los derivados y específicamente, los restos químicos capaces de mediar tales efectos son descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1980). Los procedimientos para acoplar tales restos a una molécula son conocidos en la técnica.

Las variantes de IGF-I generalmente tendrán al menos un 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente de 90% a 95% o más, y lo más preferiblemente un 98% o más de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de la molécula IGF-I de referencia. Una variante puede diferenciarse por únicamente 10, únicamente 5, únicamente 4, 3, 2, o hasta 1 resto de aminoácido. Por "identidad de secuencia" se entiende que los mismos restos de aminoácidos son encontrados dentro de la variante de IGF-I y la molécula IGF-I de referencia cuando un segmento especificado y contiguo de la secuencia de aminoácidos de la variante es alineado y comparado con la secuencia de aminoácidos de la molécula de referencia. La identidad de secuencia es determinada de acuerdo con el Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin, el programa GAP, Versión 8 (disponible en el Grupo "Genetics Computer", Madison, Wisconsin), usando los ajustes por defecto.

Para los objetivos de alineación óptima de las dos secuencias, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos de la variante puede tener restos de aminoácidos adicionales o restos de aminoácidos suprimidos respecto a la secuencia de aminoácidos de la molécula de referencia. El segmento contiguo usado para la comparación respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia comprenderá al menos veinte (20) nucleótidos contiguos, y puede tener 30, 40, 50, 100, o más nucleótidos. Las correcciones para la identidad de secuencia aumentada asociada con la inclusión de huecos en la secuencia de aminoácidos de la variante pueden ser hechas asignando fallos de huecos. Los métodos de alineación de secuencia son conocidos en la técnica.

Considerando el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos, algunas posiciones de restos de aminoácidos pueden diferenciarse como consecuencia de las sustituciones de aminoácidos conservadoras, que no afectan a las propiedades de la función de la proteína. En estos casos, el porcentaje de la identidad de secuencia puede ser ajustado hacia arriba para considerar la semejanza en aminoácidos sustituidos de manera conservadora. Tales ajustes son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Meyers y Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4: 1117.

La técnica proporciona una guía sustancial en cuanto a la preparación y el uso de tales análogos, como se discute más abajo. Un fragmento de IGF-I generalmente incluirá al menos aproximadamente 10 restos de aminoácidos contiguos de la molécula de cadena entera, preferiblemente aproximadamente 15-25 restos de aminoácido contiguos de la molécula de cadena entera, y lo más preferiblemente aproximadamente 20-50 o más restos de aminoácidos contiguos de IGF-I de cadena entera. En la preparación de las variantes de IGF-I, cualquier experto en la técnica puede determinar fácilmente qué modificaciones respecto a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la proteína natural causarán una variante que permita la preparación de la forma altamente concentrada de la variante de IGF-I conforme a los métodos descritos en la presente invención. Éstas generalmente serán sustituciones de aminoácidos conservadoras que conservan la carga del resto sustituido (por ejemplo, ácido aspártico por ácido glutámico).

Se conocen varios análogos de IGF-I y fragmentos en la técnica e incluyen los descritos en, por ejemplo, Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 4904-4907; Biochem. Biophys. Res. Commun. (1987) 149: 398-404; J. Biol. Chem. (1988) 263: 6233-6239; Biochem. Biophys. Res. Commun. (1989) 165: 766-771; Forsbert et al. (1990) Biochem. J. 271: 357-363; Patentes de EE.UU. N^{os} 4.876.242 y 5.077.276; y N^{os} de Publicación Internacional WO87/01038 y WO89/05822. Los análogos representativos incluyen uno con una deleción de Glu-3 de la molécula madura, análogos con hasta 5 aminoácidos truncados del extremo N-terminal, un análogo con un truncamiento de los 3 primeros aminoácidos del extremo N-terminal (denominados des(1-3)-IGF-I, des-IGF-I, tIGF-I, o IGF de cerebro), y un análogo que incluye los 17 primeros aminoácidos de la cadena B de insulina humana en el lugar de los 16 primeros aminoácidos de IGF-1 humano.

Los métodos para preparar fragmentos de IGF-I, análogos y derivados están disponibles en la técnica. Véase, de forma general, las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.738.921, 5.158.875 y 5.077.276; N^{os} de Publicación Internacional WO85/00831, WO 92/04363, WO 87/01038 y WO 89/05822; y Patentes Europeas N^{os} EP 135094, EP 123228 y EP 128733.

El IGF-I puede ser de cualquier especie animal incluyendo, pero no limitado, a aviar, canino, bovino, porcino, equino y humano. Preferiblemente, el IGF-I es de una especie de mamífero cuando el tratamiento es de un trastorno sensible al IGF-I de mamífero, y más preferiblemente es de un mamífero de la misma especie que el mamífero que sufre el tratamiento para tal trastorno. Se reconoce que el IGF-I puede prepararse mediante métodos recombinantes usando la secuencia correspondiente que codifica para IGF-I de la especie animal de interés. Tales métodos recombinantes son discutidos más abajo detalladamente.

Las variantes biológicamente activas de IGF-I deberían conservar las actividades de IGF-I, particularmente la capacidad de unirse a los sitios del receptor de IGF-I. La actividad de IGF-I puede ser medida usando bioensayos de IGF-I estándar. Ensayos representativos incluyen los conocidos ensayos de radioreceptor que usan membranas placentarias (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.324.639; Hall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 973-976; y Marshall et al. (1974) J Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 283-292), un bioensayo que mide la capacidad de la molécula de realzar la incorporación de timidina tritiada, en una manera dependiente de la dosis, en el ADN de fibroblastos de BALB/C 3T3 (véase, por ejemplo, Tamura et al. (1989) J. Biol. Chem. 262: 5616-5621), y similares; incorporado en este documento como referencia. Preferiblemente, la variante tiene al menos la misma actividad que la molécula natural.

El IGF-I usado en la fabricación de las composiciones de la presente invención puede estar en su forma sustancialmente purificada, natural, producida recombinantemente o químicamente sintetizada. Por ejemplo, el IGF-I puede ser aislado directamente a partir de la sangre, tal como a partir del suero o del plasma, por métodos conocidos. Véase, por ejemplo, Phillips (1980) New Eng. J. Med. 302: 371-380; Svoboda et al. (1980) Biochemistry 19: 790797; Comell y Boughdady (1982) Prep. Biochem. 12: 57; Cornell y Boughdady (1984) Prep. Biochem. 14: 123; Patente europea Nº EP 123.228; y Patente de EE.UU. Nº 4.769.361.

De forma alternativa, el IGF-I puede ser sintetizado químicamente, por cualquiera de diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica de los péptidos. Véase, por ejemplo, Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2216-2220, Stewart y Young (1984) "Solid Phase Peptide Synthesis" (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois), y Barany y Merrifield (1980) "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", ed. Gross y Meienhofer, Vol. 2 (Academic Press, New York, 1980), págs. 3-254, para las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y Bodansky (1984) "Principles of Peptide Synthesis" (Springer-Verlag, Berlín); y Gross y Meienhofer, ed. (1980) "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1 (Academic Press, Nueva York), para la síntesis en solución clásica. El IGF-I también puede prepararse químicamente por el método de la síntesis múltiple de péptidos simultánea. Véase, por ejemplo, Houghten (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135; y Patente de EE.UU. Nº 4.631.211.

La ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante puede ser el modo más eficiente de producir IGF-I. Se conoce la secuencia de ADN humana que codifica para IGF-I y puede ser introducida en células huésped para su expresión. El IGF-I puede ser producido mediante técnicas de ADN recombinante en E. coli, levadura, células de insecto y mamífero. El IGF-I secretado puede prepararse añadiendo una secuencia señal a la secuencia de ADN que codifica para IGF-1. Además, la secuencia de ADN que codifica para IGF-I puede ser manipulada para preparar fragmentos de IGF-I, análogos o derivados. Tales técnicas de ADN recombinante están generalmente disponibles en la técnica. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Nº WO 96/07424, en la que la proteína recombinante de IGF-I humana es producida en levadura.

La concentración apropiada de IGF-I en las composiciones de la invención depende de la solubilidad en el tampón específico usado y la cantidad terapéutica deseada para la dosis dada. Típicamente, la concentración de IGF-I en las composiciones líquidas de la invención estará en el intervalo de 0,01-200 mg/ml. Preferiblemente, la concentración de IGF-I es 0,1-20,0 mg/ml, y más preferiblemente 2,0-10,0 mg/ml.

La composición farmacéutica que comprende IGF-I y un tampón de succinato también puede contener otros componentes que faciliten el tratamiento con IGF. Tales componentes incluyen proteínas de unión de IGF-I, receptores de IGF-I, y la subunidad ácido-lábil del complejo de unión de IGF. Es generalmente conocido que la acción de IGF-I en el cartílago está modulada por proteínas de unión de IGF-I, al menos seis de las cuales (de IGFBP-1 a IGFBP-6) han sido aisladas (véase Baxer et al. (1989) Prog. Growth Factors Res. 1:49-68; y Rechler et al. (1992) Growth Regul. 2:55-68). De éstas, IGFBP-3 es la proteína de unión primaria para IGF-I. Su presencia puede realzar el efecto estimulador de IGF-I en la síntesis de proteoglucano (véase Chevalier et al. (1996) British J. Rheumat. 35:515-522). Además, se ha demostrado que una glicoproteína ácido lábil también se asocia con el complejo de proteína formado por IGF-I y sus proteínas de unión. Así, la composición farmacéutica de la invención puede contener tal glicoproteína ácido lábil y proteínas de unión de IGF-I, cuando se prueba para facilitar el efecto deseado de IGF-I en el mantenimiento y/o la regeneración del cartílago.

La cantidad de IGFBP que se administran con IGF-I puede ser determinada de acuerdo con la relación molar entre IGF-I y las IGFBP. Esta relación molar puede estar en el intervalo de 0,5:1 a 3:1, preferiblemente 1:1 (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.187.151). Todas tales referencias a los componentes que facilitan el mantenimiento promovido por IGF y/o la regeneración del cartílago en este documento son incorporadas como referencia.

La composición farmacéutica de IGF-I conforme a la presente invención puede comprender además a uno o varios otros agentes terapéuticos que sean eficaces en el tratamiento de otros trastornos en el individuo, siempre que las acciones bioquímicas de los agentes terapéuticos adicionales no interfieran con la eficacia de la acción pretendida del tratamiento con IGF-I. Los ejemplos de tales agentes incluyen antibióticos, agentes antinflamatorios y otros similares.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o varios inhibidores de proteasa. Un inhibidor de proteasa ejemplar es pentosan polisulfato de sodio (PPS), un polisacárido polisulfatado.

Las composiciones de la invención pueden incluir opcionalmente a agentes estabilizantes incluyendo, aminoácidos (tales como arginina, lisina y glicina), azúcares (tales como sacarosa, manitol y trehalosa), sales (tales como NaCl y MgCl_{2}), tensioactivos, PEG, conservantes, agentes antimicrobianos, agentes complejantes (tales como el EDTA) y antioxidantes. Para hIGF-1, las formulaciones pueden incluir bajos niveles de metionina, tal como 1 mM, para reducir la oxidación y conservar contra la agregación o la precipitación de la proteína.

Preferiblemente, la composición farmacéutica es isotónica con las células del sujeto. Preferiblemente, la composición farmacéutica es isotónica con los eritrocitos del sujeto. Más preferiblemente, la composición farmacéutica es isotónica con los eritrocitos humanos. Así, en una realización, la composición farmacéutica contiene una concentración suficiente de al menos un agente tonicificante tal que la composición sea isotónica.

Por "isotónico" se entiende una solución en la cual una célula ni se encogerá, ni se hinchará. Un ejemplo de una solución isotónica es el cloruro de sodio del 0,9% en agua. Típicamente, una solución isotónica tendrá aproximadamente la misma presión osmótica que la fase fluido de las células de un sujeto o tejido. Sin embargo, una solución que es isosmótica con el fluido intracelular no será isotónica si éste contiene un soluto que impregne libremente las membranas celulares. Para determinar si una solución es isotónica, es necesario identificar la concentración de solutos en los cuales las células conservarán su tamaño normal y forma. Se conocen métodos para determinar la isotonicidad de una solución para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Setnikar et al. (1959) JAPhA Sci Editor
48: 628.

En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende además cloruro de sodio. El cloruro de sodio es incluido para proporcionar la isotonicidad a la formulación. Por lo tanto, la concentración de cloruro de sodio en la formulación dependerá de la contribución de los otros componentes tonificantes. Preferiblemente, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 140 mM.

Los expertos en la técnica tienen familiaridad con una variedad de solutos farmacéuticamente aceptables útiles en proporcionar isotonicidad en composiciones farmacéuticas. Así, las composiciones de la invención además comprenden componentes que pueden ser usados para proporcionar isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio, glicina, manitol, glicerol, sacarosa y otros carbohidratos, ácido acético, otros ácidos orgánicos o sus sales, y cantidades relativamente menores de citratos o fosfatos. El experto ordinario en la técnica conocerá agentes adicionales que sean adecuados para proporcionar una tonicidad óptima.

El pH de la composición farmacéutica afecta tanto al nivel del dolor en la inyección como a la estabilidad del ingrediente farmacéuticamente activo. Un ingrediente farmacéuticamente activo dado tendrá mayor estabilidad en un cierto intervalo de pH de un tampón particular. El pH óptimo que proporciona el equilibrio deseado de estabilidad y mínimo o ningún dolor en la inyección puede ser determinado por los expertos en la técnica. Sin embargo, el intervalo de pH podría comprender formulaciones con un pH 4,0-7,5. Los pH adecuados incluyen 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5. Intervalos de pH adecuados son 4,5-7,2; 4,6-7,1; 4,7-7,0; 4,8-6,9; 4,9-6,8; 5,0-6,7; 5,1-6,6; 5,2-6,5; 5,3-6,4; 5,4-6,3; 5,5-6,2; 5,7-6,1 y 5,8-6,0. El intervalo preferido es pH 4,6-6,6. Lo más preferiblemente, el pH es 5,6. Para composiciones que contienen IGF-I, el pH preferido es 6,0.

La composición farmacéutica puede ser formulada como una solución, suspensión o emulsión. También puede estar en forma de polvo liofilizado, que pueda ser convertido en una solución, suspensión o emulsión antes de la administración. El almacenaje también puede ser facilitado añadiendo proteínas tales como albúmina humana que pueden reducir la pérdida de actividad de la proteína farmacéuticamente activa. Así, la albúmina podría funcionar como una proteína estabilizante durante el procedimiento de liofilización. Los métodos para formular una composición farmacéutica son generalmente conocidos en la técnica. Una discusión profunda de la formulación y selección de vehículos farmacéuticamente aceptables, estabilizadores, e isomolitos puede ser encontrada en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990) (18 ed., Mack Pub. Co., Eaton, Pensilvania).

El agente farmacéuticamente activo también puede ser formulado en una forma de liberación sostenida para prolongar la presencia del agente farmacéuticamente activo en el mamífero tratado, generalmente durante más de un día. Se conocen muchos métodos de preparación de formulaciones de liberación sostenida en la técnica y son descritas en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990) 18 ed., Mack Pub. Co., Eaton, Pensilvania. Generalmente, el agente puede ser atrapado en matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos. Las matrices pueden ser formadas en películas o microcápsulas.

Los ejemplos de tales matrices incluyen poliésteres, copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al. (1983) Biopolymers 22: 547-556), poliactidas (Patente de EE.UU. Nº 3.773.919 y documento EP 58.481), poliglicolato de poliactato (PLGA), hidrogeles (véase, por ejemplo, Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12: 98105), acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LupronDepot®, y poly-D-(-)-ácido 3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Microcápsulas adecuadas también pueden incluir hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-metilmetacrilato preparadas por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial. Además, también pueden ser usadas micro-emulsiones o sistemas de liberación de fármaco coloidales tales como liposomas y microesferas de albúmina. Véase "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990) (18 ed., Mack Pub. Co., Eaton, Pensilvania).

Las composiciones de la invención, que comprenden al agente farmacéuticamente activo y un compuesto de succinato, pueden ser almacenadas durante largos períodos de tiempo manteniendo la integridad física y biológica del agente farmacéuticamente activo. El almacenaje puede ser en forma líquida o como una formulación seca, que puede ser reconstituida añadiendo un líquido. Cuando los agentes farmacéuticamente activos son proteínas, el almacenaje puede ser facilitado por procedimientos de secado, tales como la liofilización. En consecuencia, la proteína puede ser almacenada en forma de una composición liofilizada. Así, en una realización, la invención proporciona una composición farmacéutica liofilizada que comprende un compuesto de succinato y el agente farmacéuticamente activo.

El intervalo de temperaturas en la cual el almacenaje de una preparación líquida de un agente farmacéuticamente activo y succinato es posible es de 2ºC a 8ºC, con una semivida de almacenaje esperada de 18-24 meses o más larga. El intervalo de temperaturas en la cual el almacenaje de una preparación seca de un agente farmacéuticamente activo y succinato es posible es de 2ºC a 30ºC, con una semivida de almacenaje esperada de 18 a 24 meses o más larga. Las formulaciones pueden ser almacenadas, sin embargo, hasta 5 años. Un intervalo más para la formulación en seco es de 22ºC a 30ºC. Las temperaturas preferidas incluyen, pero no están limitadas, a de 2ºC a 8ºC para líquido, y temperatura ambiente (es decir, 25ºC-30ºC) para seco. Las formulaciones líquidas y secas son estables durante aproximadamente 18-24 meses o más tiempo. Se ha demostrado que la formulación específica descrita de rhIGF-I es estable durante al menos un año a 2-8ºC en forma líquida.

La composición farmacéutica preferiblemente es esterilizada por filtración de membrana y es almacenada en recipientes de dosis unitarias o multidosis tales como viales sellados o ampollas. En una realización de la invención, el espacio de cabeza de los viales puede ser insuflado con nitrógeno al rellenarlo. La invención también comprende dispositivos para dosificar convenientemente, tales como jeringuillas prerrellenas, autoinyectores, paquetes de ampollas, o sistemas sin aguja, para hacer la administración o la inyección más fácil.

Una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición de la invención es administrada a un sujeto. Por cantidad farmacéuticamente eficaz se entiende una cantidad que es útil en el tratamiento, la prevención o el diagnóstico de una enfermedad o condición.

Por el término "administrar" se entiende cualquier método adecuado para suministrar un agente farmacéuticamente activo a un sujeto, incluyendo parenteral, intranasal, intrapulmonar, oral, tópica, anal o implantación quirúrgica o inserción. Las rutas parenterales de administración típicas incluyen inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraarterial e intraperitoneal o infusión. Preferiblemente, la administración es por inyección. En realizaciones preferidas, la inyección es subcutánea. Las formas inyectables de las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitadas, a soluciones, suspensiones y emulsiones.

Por "sujeto" se entiende cualquier animal. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, preferiblemente el sujeto es un ser humano. Los mamíferos de importancia particular otra que el ser humano incluyen perros, gatos, vacas, caballos, oveja y cerdos.

Cuando la administración es para el objetivo del tratamiento, la administración puede ser para un objetivo profiláctico o terapéutico. Cuando se proporciona profilácticamente, la sustancia es proporcionada antes de cualquier síntoma. La administración profiláctica de la sustancia sirve para prevenir o atenuar cualquier síntoma subsecuente. Cuando se proporciona terapéuticamente, la sustancia es proporcionada en (o un poco después de) el inicio de un síntoma. La administración terapéutica de la sustancia sirve para atenuar cualquier síntoma real.

La composición farmacéutica que comprende IGF-I reconstituido debe ser formulada en una forma de dosificación unitaria e inyectable o infusible tal como solución, suspensión o emulsión. También puede estar en forma de polvo liofilizado, que puede ser convertido en una solución, suspensión o emulsión antes de la administración. La composición farmacéutica que comprende IGF-I reconstituido preferiblemente es esterilizada por filtración de membrana y es almacenada en dosis unitarias o recipientes de multidosis tales como viales sellados o ampollas.

Un vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser mezclado con el agente farmacéuticamente activo y el tampón de succinato. Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende un vehículo que es usado de manera convencional en la técnica para facilitar el almacenaje, la administración, y/o el efecto de cura de los ingredientes terapéuticos. El vehículo también puede reducir cualquier efecto secundario indeseable del IGF-I. Un vehículo adecuado debe ser estable, es decir, incapaz de reaccionar con otros ingredientes en la formulación. No debe producir un efecto local significativo o sistémico adverso en los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas para el tratamiento. Tales vehículos son conocidos de forma general en la técnica. Los vehículos adecuados para esta invención son macromoléculas grandes estables usadas de manera convencional tales como albúmina, gelatina, colágeno, polisacáridos, monosacáridos, polivinilpirrolidona, ácido poliláctico, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, aceites fijados, oleato de etilo, liposomas, glucosa, sacarosa, lactosa, manosa, dextrosa, dextrano, celulosa, manitol, sorbitol, polietilenglicol (PEG), y otros similares. Los vehículos de liberación lenta, tales como el ácido hialurónico, también pueden ser adecuados. Véase particularmente Prisell et al. (1992) Int. J. Pharmaceu. 85: 51-56, y la Patente de EE.UU. Nº 5.166.331. La inclusión del ácido hialurónico y otros polímeros puede tener un efecto beneficioso adicional sobre el trastorno sensible a IGF-I osteoartritis. Véase particularmente Bragantini (1987) Clin. Trials J. 24 (4): 333-340; Dougados et al. (1993) Osteoarthritis and Cartilage 1: 97-103; y Lussier et al. (1996) J Rheum.
23: 1579-1585.

La composición farmacéutica puede comprender además a un agente de solubilización o denominado potenciador de la solubilidad. Los compuestos que contienen un grupo guanidinio, más preferiblemente la arginina, son potenciadores de la solubilidad adecuados.

El método para formular una composición farmacéutica es generalmente conocido en la técnica. Una discusión cuidadosa de la formulación y selección de vehículos farmacéuticamente aceptables, estabilizadores, e isomolitos puede ser encontrada en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (18 ed.; Mack Pub. Co.: Eaton, Pensylvania, 1990).

Las composiciones farmacéuticas que comprenden IGF-I son útiles en la terapia dirigida al tratamiento de condiciones sensibles a IGF-I. Por "condición sensible a IGF-I" se entiende cualquier condición que responde a corto plazo o a largo plazo positivamente o negativamente frente a IGF-I. Tales condiciones sensibles a IGF-I pueden ser una condición normal. Por ejemplo, un mamífero puede sufrir terapia con IGF-I para aumentar la masa muscular normal donde sea deseable una mayor masa de músculo, tal como en un atleta. Al contrario, la condición sensible a IGF-I puede ser una condición anormal que sea crónica, y así ocurre más o menos continuamente, o que sea aguda, como ocurre después del daño en un sitio, tal como una herida ósea o en una articulación.

Las condiciones sensibles a IGF-I incluyen condiciones agudas o crónicas incluyendo, pero no limitadas, a trastornos hiperglucémicos, incluyendo todas las formas de diabetes; enfermedad crónica pulmonar; trastornos renales agudos y crónicos; daño hepático agudo y crónico; cirrosis hepática; respuestas inflamatorias, tales como artritis reumatoide, artritis psoriática, síndrome de Reiter y enfermedad inflamatoria del intestino; síndrome del intestino corto; daño isquémico que implica el corazón, hígado o cerebro, o tales como son el resultado de la necrosis tubular renal; trastornos inmunológicos, tales como inmunodeficiencias incluyendo tolerancia inmune disminuida o daño de tejido inducido por quimioterapia; rechazo de órganos después del trasplante; enfermedades o insuficiencias de la estructura o función cardíaca, tales como enfermedades del corazón crónicas, cardiomiopatía, apoplejía, y paro cardíaco congestivo; retraso del crecimiento; osteoporosis; cicatrización de heridas; daño óseo; condiciones oftálmicas; infertilidad; trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad motoneurona, esclerosis múltiple, distrofia muscular, neuropatía diabética, neuropatías desmielinizantes periféricas, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y una secuela de lesiones medulares traumáticas; y trastornos articulares del cartílago, tales como osteoartritis y daños relacionados con traumas. Cualquier trastorno sensible a IGF-I puede beneficiarse de la administración de las composiciones farmacéuticas que comprenden el jarabe de IGF-I o IGF-I reconstituído obtenido a partir de éste de la presente invención.

Por "tratamiento" se entiende el tratamiento de una condición existente normal que es realzada por el agente farmacéuticamente activo, el tratamiento terapéutico de una condición existente anormal, y procedimientos preventivos o profilácticos realizados antes de la aparición de un trastorno anormal.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser útiles para el tratamiento de cualquier mamífero. Los mamíferos ejemplares incluyen gatos, perros, caballos, vacas, oveja, cerdos, y más preferiblemente seres humanos.

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Ejemplos Métodos

El IGF-I para uso en estos experimentos fue producido recombinantemente en cepas de levadura de Pichia pastoris y fue purificado esencialmente como se describe en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.324.639, 5.324.660 y 5.650.496 y la Publicación Internacional Nº. WO 96/40776.

HPLC de fase inversa

La separación y la cuantificación de especies de rhIGF-I fueron logradas con cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa de ciano (CN-RP-HPLC). Las separaciones fueron logradas en un Zorbax 300SB-CN, 4,6 mm ID x 15 cm, 5 \mu, columna de ciano con detección de la muestra a 214 nm. Las muestras fueron diluidas en agua a una concentración común de 0,8 mg/ml y los volúmenes de inyección fueron 20 l (\sim16 \mug de proteína por inyección). La elución fue alcanzada con un gradiente de acetonitrilo/agua/0,2% de ácido trifluoroacético (TFA) a partir de aproximadamente acetonitrilo del 25% (ACN) a 34% de ACN en 25 minutos.

El perfil de CN-RP-HPLC de rhIGF-I contiene picos que representan al rhIGF-I "auténtico", que es totalmente activo, y varios otros picos que contienen especies menores de rhIGF-I. Estas especies menores son las variantes del rhIGF-I "auténtico" que contienen pequeños cambios químicos respecto a la molécula de proteína (por ejemplo, los restos de metionina oxidados, glicosilación, etc.) En el Tiempo 0, el pico cromatográfico correspondiente al rhIGF-I "auténtico" comprende aproximadamente el 95% del área total de todos los picos. Este pico, que contiene el rhIGF-I "auténtico" se denomina "Pico Principal". Para estimar la cinética de degradación de rhIGF-I por CN-RP-HPLC en los estudios de estabilidad, el porcentaje del área del Pico Principal es seguido como una función del tiempo bajo un grupo dado de condiciones de almacenaje. Según rhIGF-I se degrada, el porcentaje del área del Pico Principal es encontrado que disminuye según aumenta el porcentaje del área de picos correspondiente a los productos de degradación de rhIGF-I.

SDS-PAGE no reductora

Los agregados covalentes de rhIGF-I, que ocurren debido a la formación de disulfuros intermoleculares, pueden ser detectados en geles de SDS-PAGE no reductora. Para este análisis, fue corrida Tris-glicina del 18% en SDS-PAGE no reductora. Los geles fueron corridos a un voltaje constante y teñidos con Coomassie Coloidal. Los geles desteñidos fueron explorados con un densitómetro y las bandas fueron convertidas a las áreas de los picos.

En el Tiempo 0, rhIGF-I comprende una sola banda monomérica en SDS-PAGE no reductora. Esta banda (es decir, la banda del monómero) comprende el 100% del área total del pico en el Tiempo 0. Para determinar la cinética de degradación de rhIGF-I por SDS-PAGE no reductora en los estudios de estabilidad, el porcentaje del área de monómero es seguido como una función del tiempo bajo un grupo dado de condiciones de almacenaje. Según rhIGF-I se degrada, el porcentaje del área del monómero es encontrado que disminuye y el porcentaje del área de otras bandas correspondiente a los productos de degradación de rhIGF-I (por ejemplo, los dímeros, trímeros, etc.) son encontrados que aumentan.

Bioensayo mitogénico

Las bioactividades de muestras de rhIGF-I fueron determinadas usando un ensayo mitogénico de acuerdo con el procedimiento de W. Lopaczynski et al. (1993) Regulatory Peptides, 48: 207-216. Este ensayo está basado en la inducción dependiente de la dosis de una proliferación de células por rhIGF-1. La respuesta es medida con tinción con MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio), que se reduce a un producto coloreado por las enzimas mitocondriales de células vivas MG-63 (Colección de Cultivo del Tipo Americana (ATCC CRL 1427)). El ensayo ha sido estandartizado contra un WHO de referencia para proporcionar la actividad de rhIGF-I en Unidades Internacionales (UI). La actividad en % de rhIGF-I es determinada en estudios de estabilidad por la comparación de la actividad de la muestra con un estándar de referencia de actividad conocida.

Ejemplo 1

Este Ejemplo ilustra la estabilidad de rhIGF-I como una función del pH de la formulación. Para la Figura 1, el tampón de citrato-fosfato en un intervalo de pH de 4,0-7,0 fue formulado con rhIGF-1. El porcentaje de la integridad del pico principal (el pico que contiene la molécula natural) fue medido durante un periodo de ocho semanas a una temperatura de 50ºC. La medida fue con CN(ciano)-RP-HPLC. Para la Figura 2, el tampón de citrato-fosfato en un intervalo de pH de 4-7 fue formulado con rhIGF. El porcentaje de actividad fue medido durante un periodo de ocho semanas a una temperatura de 50ºC. La medida de la actividad era por bioensayo mitogénico. Los resultados del Ejemplo 1 indican que el pH 6,0 permite el mantenimiento de una estabilidad adecuada de rhIGF-I en una formulación farmacéutica.

Ejemplo 2

Este Ejemplo ilustra la estabilidad de rhIGF a pH 6,0 y pH 6,5 como una función de especies tampón. Para la Figura 3, fueron formulados varios tampones con rhIGF-1. La integridad del pico principal fue medida durante un periodo de ocho semanas a una temperatura de 50ºC. La integridad fue medida por CN-RP-HPLC. Para la Figura 4, la medida del porcentaje de monómero (la molécula natural) restante fue durante un periodo de ocho semanas a una temperatura de 50ºC. El porcentaje de monómero restante fue medido por SDS-PAGE no reductora. Los resultados mostrados en este Ejemplo indican que (1) las formulaciones a pH 6,0 proporcionan una mayor estabilidad que las formulaciones a pH 6,5; y (2) los tampones de citrato de sodio y succinato de sodio son altamente compatibles con rhIGF-I a un pH 6,0.

Ejemplo 3

Este Ejemplo ilustra la estabilidad de rhIGF-I como una función de la concentración de citrato de sodio y succinato de sodio a pH 6,0. Para la Figura 5, la estabilidad fue medida durante un periodo de ocho semanas a 50ºC. La medida fue hecha mediante un ensayo del porcentaje de monómero por SDS-PAGE no reductora. Para la Figura 6, la estabilidad fue medida mediante un ensayo de actividad durante un periodo de ocho semanas a 50ºC. La medida de actividad fue hecha mediante un ensayo mitogénico. El resultado en este Ejemplo indica que los tampones de succinato son más compatibles con rhIGF-I que los tampones de citrato, y que una concentración de 10 mM es óptima para la estabilidad de rhIGF-I.

Ejemplo 4

Este Ejemplo muestra datos de un modelo de activación nociceptor diseñado para predecir el dolor de la inyección producida por formulaciones. En este modelo, capsaicina (un compuesto conocido que causa dolor en la inyección) es usado para generar una curva estándar. Las formulaciones entonces fueron analizadas y se les dió un valor basado en la curva estándar. Todas las formulaciones entonces fueron comparadas con solución salina normal. Dos tampones fueron analizados y comparados con la solución salina normal: acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0; y succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0. La formulación de acetato generó una respuesta de la curva estándar que indicaba un dolor de inyección significativo. La formulación de succinato 10 mM fue encontrada que no era más dolorosa que la solución salina normal.

Ejemplo 5

El estudio descrito en este Ejemplo fue realizado para evaluar los efectos irritantes potenciales locales de formulaciones farmacéuticas en conejos blancos de Nueva Zelanda cuando se le administraban inyecciones subcutáneas durante siete días consecutivos. A cada conejo le fue administrado muestras de ensayo (tampón más IGF), controles de vehículo (tampón solo) y solución salina en tres sitios diferentes. A los conejos les fue administrado 0,5 ml de solución salina/vehículo/muestra de análisis apropiada, en cada uno de los sitios designados de ensayo, una vez a diario durante siete días consecutivos vía inyección subcutánea. Los sitios de ensayo fueron examinados según sus signos de eritema y edema y el signo fue anotado antes de la medicación cada día y durante ocho y nueve días de acuerdo con un sistema de clasificación basado en Draize (Appraisal of the Safety of Chemicals in Food, Drugs, and Cosmetics (1959), the Association of Food and Drug Officias of the United States, págs. 49-51). Todos los sitios de inyección y cualquier lesión gruesa fueron fijados y tratados según bloques de parafina. Las secciones de tejido fueron teñidas con hematoxilina y eosina y fueron examinadas al microscopio por un patólogo veterinario oficial. El tratamiento histológico fue realizado por HistoTechnics, Powell, Ohio. Los resultados de la histopatología indican que los sitios de inyección de la solución salina y del vehículo control exhibieron una inflamación relativamente suave y eran comparables a excepción de un sitio de control de solución salina con inflamación severa. Los sitios de inyección de la muestra de ensayo que exhibían la mayor parte de la inflamación ocurrieron en las muestras de ensayo C y D. Las muestras de ensayo restantes no fueron notablemente diferentes entre sí, pero causaron ligeramente mayor inflamación que la solución salina y que las muestras de vehículo control. Los vehículos control A, B, D, E, y F, fueron comparables con la solución salina. En consecuencia, mientras que la irritación suave externa dérmica fue notada en varios sitios esporádicamente en todo el estudio, no fue necesariamente ninguna indicación de la histopatología resultante. Es de señalar en la histopatología en el sitio de inyección que las muestras de ensayo C y D, según se consideraban, eran excepcionales, con una inflamación sólo moderada comparada con las muestras de ensayo restantes, que exhibieron sólo ligeramente una inflamación mayor en su solución salina/vehículos control respectivos.

Fueron usadas las formulaciones siguientes:

(1)

\;

La solución salina fue usada como una solución del 0,9%;

(2)

\;

Las muestras de ensayo incluyeron el tampón del vehículo (debajo) más 8,0 mg/ml de rhIGF-1;

(3)

\;

Vehículo Control A - succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0;

\quad

Vehículo Control B - citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 135 mM, pH 6,0;

\quad

Vehículo Control C - acetato de sodio 0,1M, cloruro de sodio 50 mM;

\quad

Vehículo Control D - metionina 1 mM, cloruro de sodio 135 mM, pH 6,0;

\quad

Vehículo Control E - succinato de sodio 10 mM, arginina 125 mM, cloruro de sodio 20 mM, pH 6,0;

\quad

Vehículo Control F - citrato de amonio 7,4 mM, sacarosa del 1,9%, cloruro de sodio 97 mM, pH 4,8.

Los resultados son mostrados en la Figura 8. Los resultados muestran que el succinato (muestra de ensayo A) proporcionó un medio eficaz para la inyección subcutánea.

Claims (14)

1. Una composición farmacéutica inyectable que comprende el factor de crecimiento humano tipo insulina 1
(IGF-1) o su variante biológicamente activa y un tampón, en el que dicho tampón consiste sustancialmente en succinato a una concentración de 10 mM a 40 mM y un contraión, y en el que dicha variante es un polipéptido que tiene actividad de IGF-1 y una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% respecto a la secuencia de aminoácidos para el IGF-1 humano.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho contraión se seleccionada a partir de sodio, potasio, amonio y dicho IGF-1.

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que la concentración de succinato es de 10 mM a 30 mM.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que la concentración de succinato es de 10 mM a 20 mM.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que la concentración de succinato es aproximadamente 10 mM.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha composición tiene un pH de 4,0 a 7,0.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho pH es de 4,6 a 6,6.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que dicho pH es aproximadamente 6,0.

9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una concentración suficiente de al menos un agente tonicificante tal que la composición es isotónica.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que dicho agente tonicificante es cloruro de sodio.

11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho IGF-1 humano es IGF-1 recombinante humano.

12. La composición de la reivindicación 1 ó 11, en la que dicha composición tiene un pH de aproximadamente 6,0, la concentración de dicho succinato es aproximadamente 10 mM, y la composición comprende además cloruro de sodio aproximadamente 140 mM.

13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha composición es un líquido.

14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha composición es liofilizada.