KR20010035122A - 인슐린의 방출제어제제 및 그 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인슐린의 방출제어제제 및 그 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인슐린의 균일한 미세결정(microcrystal)을 고분자 물질로 마이크로캡슐화 (microencapsulation)하여 얻은 마이크로파티클로 이루어진 인슐린 방출제어제제 및 그 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 마이크로캡슐화 공정에서 일어나는 인슐린의 변성을 감소시켜 제제의 안정성을 증가시키고, 고분자 운반체에 대한 인슐린의 함유비율을 증가시킨 것으로, 폐를 통해 투여되기에 적합하며 생체내에서 장시간 지속적으로 안정적인 약효를 발휘할 수 있다.
Description
본 발명은 인슐린 결정을 마이크로캡슐화(microencapsulation)한 방출제어제제 및 그 방법에 관한 것이다.
방출제어시스템(controlled release system)
약물은 적용에 편리하고 약리 효과가 최적으로 발현될 수 있는 제형(formulation)으로 가공된 후 여러 경로를 통해 생체에 투여된다. 투여된 약물은 제형으로부터 방출된 후 흡수, 분포, 대사, 배설의 과정을 거치면서 생체내에서 약리효과를 나타내게 된다. 생체내에서 약물이 안정적이고 효과적으로 발현되며 의도된 작용부위에 선택적으로 작용될 수 있도록 하기 위해서는 약물의 생체내 거동을 각종 기술로 제어할 필요가 있다. 이와 같이 약물의 부작용을 줄이고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 제형을 약물 전달 시스템(Drug Delivery System; DDS)이라 한다.
DDS에 대한 정의는 완전히 확립되어 있지는 않은 상태이나, 광의의 해석으로는 표적송달시스템(targeting system)과 화학적송달시스템(chemical Delivery System)을 포함하여 약물의 생체내 거동을 제어하는 광범위한 제형설계를 모두 포괄하는 의미로 사용되며, 협의의 해석으로는 방출제어(controlled release) 형식의 전달시스템을 의미하는 것으로 사용되어 왔다.
의약품의 방출제어(controlled drug release) 방법은 1970년대 이후 약제학 분야에서 급속히 발전되어 왔다. 저분자량의 방출제어시스템(controlled release system)이 주로 의약분야에 적용이 되어왔으며, 특히 신체의 특정 부위에 의약품을 전달하는데 활용되어 왔다.
방출제어시스템(controlled release system)은 경구 투여를 위한 캡슐형, 매트릭스형, 경구 및 주사용의 마이크로캡슐(microcapsule), 마이크로스피어 (microsphere), 마이크로파티클(microparticle), 나노파티클(nano-particle) 그리고 리포좀(liposomes) 또는 이식체 (implants) 등의 다양한 형태로 존재한다 (J. Kost. 1995).
마이크로캡슐화(microencapsulation)
방출제어제제에서 중요한 위치를 차지하고 있는 것이 마이크로캡슐화(micro-encapsulation) 기술이다. 이 분야에서는 나노테크놀로지가 약제학 분야의 약물전달시스템(drug delivery system)의 발전과 접목되면서 마이크로파티클 (microparticle)의 생산이 빠르게 발전되었다.
예를 들어, 수용성 약품인 슈도에페드린(Pseudoephedrine HCl)을 O/W 분산 또는 공용매법(oil-in-water(dispersion or cosolvent method)) 또는 W/O/W 다중유화법(water-in-oil-in-water(multiple emulsion method)), 유제-용매 증발법 (emulsion-solvent evaporation method)을 이용하여 고분자 마이크로스피어 내에 내에 가두어둔 실험에서 적절한 양의 약물을 적재할 수 있다는 것이 밝혀졌다 (R. Bodmeier et. al. 1991).
마이크로캡슐 (microcapsule)은 고체 또는 액체약물이 중심핵에 위치한 구형입자를 말하며, 마이크로스피어 (microsphere)는 고분자물질 중에 고체 또는 액체약물이 분산되어 있는 것으로 다핵의 마이크로캡슐이라고 할 수 있다. 또한, 마이크로파티클(microparticle)은 마이크로캡슐과 마이크로스피어를 모두 포괄하는 개념으로, 고분자 매트릭스나 지질 등의 미립자를 약물 운반체로 사용하는 미립자성 약물운반체를 의미한다. 이하, 본 명세서에서는 달리 특정하지 않는한 이 용어들은 상기와 같은 의미로 사용된다.
마이크로파티클은 입자의 직경을 0.1㎛에서 수백 ㎛까지 다양하게 제조할 수 있다. 이 중 입자경이 1㎛ 이하의 것을 나노스피어(또는 나노파티클)라 부른다. 대부분의 마이크로스피어는 보통 고체상태로 보존하다가 사용할 때 현탁시킨다. 마이크로스피어는 예전부터 방사선 진단약으로 사용되어 왔으나 최근에는 약물운반체로 주목받고 있다.
약물 운반체
방출제어시스템에 사용되는 물리적 지지체(운반체)로는 다양한 합성 및 천연고분자가 있으며, 이 중 생체 내에서 분해되는 고분자로는 알부민, 젤라틴, 콜라겐, 피브리노겐, 폴리락티드(polylactides : PLA), 폴리글리콜리드(polyglycolides : PGA), 폴리 β-히드록시 부틸산(poly β-hydroxy butyric acid; PHB), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리언하이드라이드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters) 등과 이러한 물질들의 공중합물인 PLGA 등이 있다. 이러한 고분자들은 1960년대 외과용 봉합사로서 개발된 이후, 1970년대부터 스테로이드, 항말라리아제, 마약길항제, 항암제 등의 서방화제제의 기제로서 많은 연구가 이루어져 왔으며, Tice 등이 수용성화합물, 예를 들면 항생물질 및 황체호르몬-유리호르몬(luteinizing hormone-releasing hormone; LHRH) 유도체를 microsphere 제제로 제조하여 서방화를 이룰 수 있다고 발표한 후 더욱 관심의 대상이 되고 있다 (Tice, T. R. (1984) Pharm. Tech. 8, 26-36).
PLGA
펩타이드(peptides)를 고분자 중합물질에 마이크로캡슐화 (micro-encapsulation)할 때는 다음과 같은 요건들을 충족시켜야 한다.
1) 생분해성 중합체로 만들어져야 한다.
2) 공정과정이 펩타이드의 변성을 일으키지 말아야 한다.
3) 마이크로캡슐화 효율(Encapsulation efficiency)이 충분히 높아야 한다.
현재 펩타이드와 단백질의 마이크로캡슐화(microencapsulation)에 관한 연구들은 PLA (poly-(lactic acid)); 또는 PLA와 PGA (poly-(glycolic acid))의 공중합체물인 PLGA (poly-lactic-co-glycolide)를 이용한 W/O/W(water-in-oil-in-water) 용매 증발 기술(solvent evaporation technique)이 주를 이룬다.
현재, PLGA와 PLA는 독성학적, 임상 자료가 충분히 뒷받침되어 있는 고분자이며, 무독성, 생친화성, 생분해성 고분자로 FDA로부터 인체 사용을 허가 받은 물질이다. 이들의 분해 산물인 글리콜산(glycolic acid)과 젖산(lactic acid)은, 체내 대사과정을 거쳐 제거된다. 이 고분자 중합체의 가수분해 속도는 온도, 촉매의 존재, pH의 확실한 변화가 있을 때만 변화되므로, 체내의 위치에 따른 분해 속도 변화가 관찰되지 않는다. 이것은 약품 전달 제형(drug delivery formulation)으로 이용되기에 적절한 요건을 만족시킨다. 분해 속도는 고분자의 분자량, 결정성(crystallinity), 그리고 PLGA의 락티드/글리콜리드의 비율에 의해 결정된다. 젖산은 비대칭(asymmetric) 탄소 원자를 가지고 있어, 두 개의 광학적 이성질체(optical isomer)를 갖는다. 따라서 이들의 중합체는 L-, D-, 그리고 D, L-젖산으로 구성되어 있으며, L-, D-중합체는 결정형(crystalline form)을, 그리고 D, L-중합체는 부정형(amorphous)을 띠며 빠르게 분해된다 (Patrick Convreur, Maria Jose, Blanco-Prieto, Francis Puisienx, Bernard Reques, Elias Fattal, Multiple emulsion technology for the design of microspheres containing peptides and oligopeptide. Advanced Drug Delivery Review 28 (1997) 85-96).
PLGA는 수용성과 비수용성 의약품의 마이크로스피어, 마이크로캡슐 등 방출제어제제의 제조에 사용된다. 소 혈청 알부민(bovine serum albumin : BSA)을 모델 단백질로 사용하여 o/o(oil/oil), o/w(oil/water), (w/o)/w 유상액 방법(emulsion method)으로 마이크로스피어를 생산하였을 경우, 제조 용액((formulation medium) 내에 투여한 전체 단백질 중 50∼70%가 마이크로스피어 내에 포함되는 것으로 나타났으며, 입자의 크기는 차례대로 500㎛, 25∼100㎛, 10∼20㎛였다. BSA의 방출 형태는 각 제조 방법에 따라 다르게 나타났는데, (w/o)/w 유상액 방법((water/oil)/water emulsion method)으로 제조하고 진공 건조한 마이크로스피어의 경우 방출 양이 많았으며, 카보폴 -R 951(Carbopol-R 951)을 포함한 o/w 방법으로 제조한 미세 입자의 경우 초기 방출량이 많은 것으로 나타났다. 각각의 경우 방출 지속기간은 각각 54일, 36일, 34일로 나타났다.
또한, PLGA를 이용하여 이중 유상액 방법(double emulsion method)으로 마이크로스피어를 제조할 경우, 폐 전달에 적절한 크기로 제조된다고 보고되어 있다. CNTF(Ciliary neurotrophic fact)를 PLGA(30:70)를 사용하여 마이크로스피어를 제조한 경우(D. Maysinger. et. al. 1996), 상 분석을 통해 마이크로스피어의 입자크기가 평균 1.76±0.0186㎛로 보고되었다.
인슐린
방출제어제제의 대상으로 가장 많이 연구되고 있는 것 중의 하나가 인슐린이다. 현재 인슐린은 주사제, 펌프의 형태로 많이 사용되고 있으며 대부분 속효성으로 40, 80, 100 IU/㎖의 Zn-인슐린 현탁액, 또는 중성 용액의 형태이고, 일반적으로 100 IU/㎖을 많이 사용한다. 인슐린은 용액상태일 때가 결정상태일 때 보다 효과를 빨리 나타내지만 작용 지속시간이 짧다. 따라서, 환자들은 식전이나 취침 전에 대부분 주사의 형태로 사용하고 있으며, 활동에 따라 속효성과 지속성 인슐린을 구별하여 투약하고 있다. 현재 사용되는 이러한 인슐린제제들은 잦은 투약으로 인해 환자들의 일상 생활에 불편을 초래하고, 자칫 투약시간을 놓칠 경우 급격한 혈당저하 및 저혈당 쇼크 등을 일으킬 위험을 갖고 있다.
인슐린 결정은 인슐린 용액에 비해 약효가 오래 지속되는 것으로 알려져 있으며, 주사할 경우 36시간 동안 효능을 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다. 이는 인슐린 결정이 체내에서 인슐린을 천천히 용해시키기 때문인데, 이점을 잘 활용하면 우리몸 안의 췌장에서 인슐린이 생성되고 분비되는 것과 같이 혈액내에서 인슐린의 활성을 보다 오래 지속시킬 수 있다. 이점에 착안하여 슐리히트크룰 (Schlichtkrull)은 당뇨병 치료용으로 사용할 수 있는 작은 인슐린 결정의 생성을 시도하였으며(1956), 이후 제약분야에서는 체내에서 천천히 용해되도록 인슐린 또는 인슐린 유도체의 결정을 작게 만드는 결정화 방법이 계속 연구되어 왔다. 지금까지 많은 인슐린 결정화 방법이 보고 되었으며, 그 대부분은 인슐린 용액의 pH 변화를 이용하는 것들이다. [미국특허 제3,719,655호, 미국특허 제4,959,351호)
그러나, 종래의 인슐린 결정화 방법들은 폐를 통한 인슐린 투여에 이용할 수 있는 10㎛ 이하의 미세 인슐린 결정을 고수율로 얻기가 힘들었다. 이에 본 발명자들은 본 발명에 앞서 미세한 인슐린 결정을 고수율로 형성할 수 있는 인슐린의 결정화 방법에 대해 연구한 결과, 인슐린 용액의 용해도 조절에 의해 결정의 핵으로 작용할 수 있는 미세한 인슐린 입자를 용액내에 자체적으로 형성시킨 후 용액 중의 인슐린 용해도를 감소시켜 결정화시킴으로서 10㎛ 이하, 특히 5㎛의 미세한 인슐린 결정을 고수율로 제조할 수 있는 인슐린 미세결정의 제조방법을 개발하여 1999년 4월 27일자로 선특허출원한 바 있다 (1999년 특허출원 제14957호).
생체 투여후 장시간에 걸쳐 지속적으로 혈중 글루코스의 농도를 감소시킬 수 있는 인슐린의 방출제어제제에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며, 이 중 확실한 발전을 보이는 몇몇 시스템들이 개발되었다. 인슐린 전달 방법으로 연구 중인 대부분의 시스템들은 DDS 내의 고분자 속에 고정화된 글루코스 옥시다제(glucose-oxidase)와 혈액 내 존재하는 글루코스의 반응을 바탕으로 하고 있다. 글루코스와 글루코스 옥시다제의 반응 결과 전달 시스템(delivery system)의 미세 환경 내에서 pH 저하를 일으키면, 이것이 고분자 시스템을 팽창(swelling)시킴으로써 인슐린의 방출을 증가시킨다. 이에 사용되는 고분자 시스템은 N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(N,N-dimethylaminoethyl methacrylate)나 폴리아클릴아마이드(poly-acrylamide)가 있다.
인슐린을 구강투여하기 위한 방법으로, 소화기관 내에서 변성되는 것을 막기위해 나노스피어(nanosphere)를 제조하기도 한다. 이는 장내에 존재하는 M 세포를 통하여 흡수되기 전까지 고분자 매트릭스로 단백질의 변성을 막으며, 작은 크기를 이용하여 세포막 장벽(membrane barrier)을 통과하는 방법이다. 편리한 투여방법이 장점이나, 복강 전달에 비하여 그 효과가 11% 정도밖에 미치지 못한다는 단점이 있다 (Gerardo P. Carino, Jules S. Jacob, Edith Mathiowitz, Nanosphere based oral insulin delivery. Journal of controlled release 65 (2000) 261-269).
현재 활발히 연구가 진행되고 있는 분야의 하나는 폐전달(pulmonary delivery)이다. 폐전달의 경우 비강전달에 비하여 넓은 테니스코트(100m2) 만한 표면적을 제공해 줄 뿐 아니라 얇은 폐 상피세포벽 너머에 있는 수많은 혈관을 통해 빠른 흡수가 가능하다. 미국 당뇨협회 회의(1998)에서 발표된 몇몇 회사의 임상실험 결과, 주사를 이용할 때 만큼의 인슐린 효과를 얻을 수 있는 것으로 나타났으며, 현재 천 여명 이상의 환자를 동원한 임상실험(clinical trial) 3상(phase Ⅲ)이 진행 중인 것으로 알려져 있다. 이러한 폐전달을 이용한 단백질의약품 전달시스템의 개발은 지금까지 주사를 통해서만 공급되어 왔던 많은 단백질 의약품들을 보다 손쉽고 편안하게 투여할 수 있는 길을 제시해줄 것으로 전망된다.
본 발명은 이러한 인슐린의 폐전달과 관련하여 보다 효과적인 인슐린 방출제어제제를 제공하는 것에 관한 것이다.
단백질 의약품의 안정성(Stability)
작은 펩타이드의 경우 그 분해가 일어나는 경우가 드물다 할지라도 안정성(stability)은 핵심적인 과제이다. 마이크로파티클의 제조 공정에서 단백질 또는 펩타이드는 과도한 스트레스에 노출된다. 따라서 단백질 의약품의 마이크로캡슐화 제조공정은 열, 전단 스트레스(shear stress), 극심한 pH 변화, 유기 용매, 동결과 건조에의 과도한 노출을 배제시켜야 한다. 저장 기간 동안 마이크로캡슐화된 단백질이 수화될 수 있으며 이러한 환경에서 단백질은 더욱 쉽게 변성, 응집(aggregate)될 수 있다. 또한 투여 후 고분자가 분해되기 시작하면, 고분자의 내부와 주위에 분해로 인한 부산물(acidic monomer)로 인해 고농축된 산성 미세 환경(microenvironment)이 조성된다. 이러한 환경에서 단백질은 쉽게 응집되고 가수분해, 화학적 변화를 일으킬 수 있다. 마지막으로 단백질이 고분자와 가역적 혹은 비가역적 흡착을 일으킴으로써 약물 전달 속도에 영향을 미칠 수 있으며, 궁극적으로는 단백질의 변성, 응집 및 불활성화를 일으키게 된다.
치료 목적으로 쓰이는 펩타이드 중에서, 인슐린은 단백질 분해 효소의 표적(target)이 될 뿐만 아니라, 용액이나 현탁액(suspension) 내에서도 화학적, 물리적인 변성을 받기 쉽다 (J. Brange, L. Andersen, E.D. Laursen, G. Meyn, E. Rasmussen, Toward understanding insulin fibrillation, J. Pharm. Sci. 86 (1997)517-525).
액상 용액 내에서 인슐린의 화학적 분해로 아미드 분해 산물(deamidated product: desamido A21 in acidic media, desamido B3 in neutral solution)이 생기거나, 트랜스아미데이션(transamidation) 반응에 의해 공유결합을 한 인슐린 이량체(dimer)가 형성될 수 있다 (R.T. Darrington, B.D. Anderson, Evidence for a common intermediate in insulin deamidation and covalent dimer formation; effects of pH and aniline trapping in dilute acidic solutions, J. Pharm. Sci. 84 (1995) 274-282).
다른 구형 단백질들처럼 인슐린도 폴딩(folding)이나, 각 분자의 어셈블리 (assembly)를 통해 소수성 표면이 내부에 감춰져 있는 3차원 구조를 가지고 있다. 반면 자연적인 형태(native conformation)의 변화는 여러 가지 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 그 중에서 열, 물리적 힘, 그리고 소수성 표면에의 노출은 단백질의 구조에 변화를 일으켜, 단백질의 응집(aggregation)과 불용성의 침전(preciitates)을 만든다 (B.V. Fisher, P.B. Porter, Stability of bovine insulin, J. Pharm. Pharmacol. 33 (1981) 203-206).
단백질 의약품의 변성은 면역성(immunogenicity)이나 항원성(antigenicity)을 유도하여 항체의 생성을 수반할 수 있으며, 이는 투입된 단백질의 활동을 방해할 뿐만 아니라 인체 내에 자연적으로 생성되는 동일 단백질의 작용에도 영향을 미칠 수 있어 매우 위험하다 (http://bric.postech.ac.kr/webzine/content/review/ appliedbio/test1/html). 따라서, 의약품의 안정성은 생산과정과 함께 제형측면에서도 고려되어야 한다. 본 발명은 제형에 함유되는 인슐린의 안정성을 확보하면서 마이크로캡슐화하는 방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술을 이용하여 단백질 의약품을 개발하는데 있어서 제형(formulation)과 약물전달(delivery)은 매우 중요한 문제가 된다. 특히 이들 생·의약 제품들은 분자량이 크고 3차원적 구조로 인해 그 역가(activity)와 물리적인 특성이 크게 좌우되기 때문에 일반 화학합성 약물에 비해 쉽게 변성되며, 그 결과 구조안정을 위해 제형화(formulation)가 중요한 과제가 된다.
인슐린의 경우, 마이크로캡슐화 과정에서 변성을 일으켜 아미드 분해 산물(deamidated product)이 형성되기 쉽고, 공정 중 손실로 전체 단백질의 50% 가량의 손실이 일어난다. 또한, 마이크로파티클의 건조과정에서 단백질 표면으로 흡착되어(partition) 일어나는 초기 방출(initial burst)은 저혈당(hypoglycemic effect)을 일으킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 마이크로캡슐화(microencapsulation) 과정에서 인슐린의 단백질 변성을 최소화하고 안정성을 증가시킨 인슐린 방출제어제제 및 그 방법을 제공하는 것이다.
이를 위해 본 발명에서는 인슐린의 미세결정을 고분자 운반체를 사용하여 마이크로캡슐화한 방출제어제제(controlled release preparation)를 제공한다. 본 발명의 인슐린 방출제어제제는, 폐를 통한 흡입투여제, 주사제, 경구투여제, 경피흡수제 등의 형태로 제조될 수 있으며, 특히 폐를 통한 투여를 위해 마이크로파티클의 크기를 폐로 전달하기에 적합한 10㎛ 이하로 할 수 있다. 본 발명의 인슐린 방출제어제제는 지속적인 약효발현으로 인슐린 투여횟수를 줄일 수 있는 방출지연형 제제(sustained release system)이며, 또한 급격한 혈당저하를 방지하기 위해 인슐린의 초기 방출량이 제어된다.
본 발명의 다른 목적은 인슐린의 마이크로캡슐화 효율 증가 및 최적화에 관한 것이다.
마이크로캡슐화(microencapsulation)에 사용되는 생분해성 고분자들은 각각의 물성 및 구체적인 조성에 따라 분해 속도가 다르지만 대체로 완전히 분해되는데 상당 시간이 소요된다. 인체에 대한 안전성이 입증된 PLGA의 경우 구체적인 조성에 따라 분해 속도가 다르지만 일반적으로 약 50∼100일 정도가 분해에 소요되는 것으로 알려져 있다. 따라서 생분해성 고분자를 운반체로 사용하는 마이크로캡슐제제를 계속적으로 투여할 경우 체내에 고분자 축적을 일으킬 수 있으므로, 마이크로캡슐화(microencapsulation)에 있어 동량의 고분자 운반체를 사용하여 보다 많은 양의 약물을 포획시키는 것은 제형기술의 목표가 된다.
액체 상태의 약물을 마이크로캡슐화할 경우 약물의 용해도에 따라 마이크로파티클 내에 포획될 수 있는 약물의 농도가 결정된다. 용해도가 높지 않은 약물의 경우 적은 양만이 포획되게 되는데, 이러한 경우 적절한 용량의 약물을 전달하기 위해서는 더 많은 양의 마이크로파티클을 체내에 투여해야 하는 문제점이 생긴다.
이러한 문제점은 마이크로파티클 제제를 폐를 통해 전달할 때 더 심각해 질 수 있다. 일반적으로 폐로 전달된 물질은 내부로 흡수되거나, 비흡수성인 물질의 경우 대식세포에 의한 정화과정(clearance process)을 통하여 제거된다. 정화과정은, 기도에서는 24시간 이내에 제거되지만 폐포에서는 더 많은 시간이 걸리게 된다 (Camner, P. 1994). 또한 폐 내부에 물질이 많이 존재할 수록 이 정화과정이 느리게 진행된다는 보고도 있다. 따라서, 특히 폐를 통해 투여하는 약물의 경우에는 고분자 운반체에 대한 약물의 비를 증가시켜 체내에 투여되는 고분자 물질의 양을 줄여야 할 필요성이 있다.
또한, 본 발명에서는 인슐린의 균일한 미세결정을 이용하여 마이크로파티클을 제조함으로써 마이크로파티클 내에 함유되는 인슐린의 함량을 필요에 따라 조절할 수 있는 인슐린 방출제어제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 인슐린의 마이크로캡슐 제제를 사용 직전에 다시 용액에 분산시켜 사용해야 하는 불편함을 개선하기 위하여 인슐린의 마이크로파티클제제를 액상 보존하는 방법에 관한 것이다.
마이크로파티클은 동결건조하여 보관하고 사용 전에 분산시켜 사용하는 것이 일반적이다. 그러나 단백질 의약품의 경우 동결건조 과정에서 약물의 변성이 일어날 수 있으며, 건조로 인한 약물의 마이크로파티클 표면 흡착으로 인해 초기 방출(initial burst) 현상이 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 필요시 약물 투여를 용이하게 하고 환자에게 위험을 초래할 수 있는 초기 방출 효과를 방지하기 위하여 인슐린 마이크로파티클 제제를 동결건조하지 않고 인슐린 등전점을 이용하여 용액 내에서 보존하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명에서는 인슐린 결정의 마이크로파티클과 함께 속효성 인슐린 부분을 제제에 포함시켜 제조함으로써 한 번의 투여로 속효성과 지속성의 효과를 동시에 얻을 수 있는 인슐린의 방출제어제제 및 그 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시예에 의해 더 잘 알게 될 것이다.
도 1은 인슐린 미세결정을 이중 유상액 방법을 사용하여 마이크로캡슐화 (microencapsulation)한 광학현미경 사진으로, A는 인슐린 용액을 캡슐화한 것(×400), B는 인슐린 미세 결정을 캡슐화한 것(×400), C는 인슐린 용액을 캡슐화한 것(×200), D는 인슐린 미세 결정을 캡슐화한 것(×200)을 보여준다.
도 2는 인슐린 미세결정과 인슐린 용액을 이중 유상액 방법을 사용하여 마이크로캡슐화한 전자 현미경 사진으로, A는 인슐린 용액을 캡슐화한 것(×1300, scale bar: 30㎛), B는 인슐린 용액을 캡슐화한 것의 표면(×5000, scale bar: 6㎛), C는 인슐린 용액을 캡슐화한 것의 단면(×9000, scale bar: 6㎛), D는 인슐린 결정을 캡슐화한 것(×1300, scale bar: 30㎛), E는 인슐린 결정을 캡슐화한 것의 표면(×4700, scale bar: 6㎛),F는 인슐린 결정을 캡슐화한 것의 단면(×9000, scale bar: 6㎛)이다.
도 3은 solution/PLGA와 crystal/PLGA의 입자크기를 입자 분석기를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 인슐린 미세결정과 이를 이용하여 제조한 본 발명의 마이크로파티클 (crystal/PLGA)의 입자크기의 차이를 입자 분석기를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 Solution/PLGA와 crystal/PLGA를 7일간 용출시킨 후, RP-HPLC로 아미드 분해 산물을 측정한 것으로, A는 비동결건조 solution/PLGA, B는 비동결건조 crystal/PLGA, C는 동결전조 solution/PLGA, D는 동결건조 crystal/PLGA이다.
도 6은 CH2Cl2의 제거 공정중 solution/PLGA와 crystal/PLGA의 약물함량의 감소를 측정한 것이다.
도 7은 CH2Cl2의 제거 공정중 solution/PLGA와 crystal/PLGA의 마이크로파티클 외부로 방출된 인슐린 양을 측정한 것이다.
도 8는 Solution/PLGA와 crystal/PLGA의 제조시 첨가한 인슐린의 농도와 약물 함유량과의 관계를 나타낸 것이다.
도 9는 인슐린 결정, 캡슐화한 인슐린 결정, 캡슐화하여 동결건조한 인슐린 결정의 용출 추이를 나타낸다.
도 10은 pH 3, pH 6, pH 7.4의 PBS 용액에서 동결건조하지 않은 crystal/PLGA의 마이크로파티클 내부의 인슐린 잔존량을 나타낸다.
도 11은 PBS, 인슐린 용액, 인슐린 결정, Crystal/PLGA를 흰쥐에 복강내 투여한 후의 혈당 감소를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 따른 인슐린 결정의 마이크로캡슐화(microencapsulation) 에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에서는, 먼저 인슐린의 균일한 미세결정을 얻은 후 이를 고분자 물질로 마이크로캡슐화 (microencapsulation)한다.
인슐린의 균일한 미세결정을 얻는 방법은 다음과 같다. 인슐린 등전점 이하의 산성 인슐린 용액의 pH를 염기를 이용하여 약 pH 9.0 내지 10.5까지 변화시켜 인슐린 용액내에 씨로 작용할 수 있는 미세 입자를 형성시킨 후, 이 인슐린 용액의 인슐린 용해도를 낮춤으로써 바람직하게는 10㎛, 특히 바람직하게는 5㎛ 이하의 인슐린 미세결정을 얻는다 (특허출원 1999년 제14957호).
일반적으로 마이크로파티클은 매트릭스 고분자를 약물과 같이 유화(분산)시킨 후 가열하여 변성시키거나, 포르말린 등을 이용하여 화학적으로 가교시키거나, 방사선 중합, 액중 건조 등의 조작을 하여 경화(hardening)시켜 만든다. 마이크로파티클의 입자 크기는 약물의 체내거동을 결정하는 가장 중요한 인자가 되는데, 조제 조건을 잘 선택하여 입자 크기를 조절할 수 있다.
펩타이드는 N-, C-말단이 고리형성이나 아미드 형성, 에스테르화 등에 의해 블로킹(blocking)되어 있지 않을 경우에는 친수성을 띤다. 따라서, 친수성으로 인해 펩타이드와 단백질은 소수성 고분자로 이루어지는 고분자 매트릭스 시스템 내에 마이크로캡슐화(microencapsulation)되기 어렵다. 이러한 특성으로 인해 W/O/W 용매증발법 (W/O/W solvent evaporation method)을 이용한 미세입자의 제조방법이 개발되었다.
다중 유화 용매증발법(multiple emulsion solvent evaporation method)은 증류수나 완충용액에 녹인 약물(inner water phase; IWP)과; 물과 혼합되지 않고 휘발성이 강한 유기용매에 용해되어 있는 고분자 용액(organic solvent; OS)으로 구성된다. IWP를 유기용매 상에 유화시켜 1차 유상액(primary emulsion; W/O)을 만든 다음, 이 유상액을 유화제가 포함되어 있는 액상(outer water phase; OWP)에 부으면서 교반하여 2차 유상액(W/O/W)을 만든다. 만들어진 다중 유상액(multiple emulsion)을 계속적으로 교반하여 유기용매를 증발시켜 고분자의 침전을 유발시킴으로써 고체의 약물 보유 마이크로파티클(drug-loaded microparticle)을 형성한다.
OWP에 유화제의 존재는 구형의 마이크로파티클의 형성에 중요한 역할을 한다. 유화제는 유기 용매의 제거 동안 미세 입자들의 엉김(coagulation)을 방지하는 역할을 한다. 유화제로는 일반적으로 폴리비닐알코올(poly(vinylalchol); PVA)을 사용하나 폴리비닐피롤리돈(polyvinlypirrolidone), 알기네이트(alginates),메틸셀룰로오스(methylcellulose), 젤라틴(gelatine) 등도 사용될 수 있다.
유기 용매의 제거는 정상 기압 하에서 또는 감압 상태에서 할 수 있다. 용매의 완벽한 제거는 다음과 같은 세 가지 방법을 통해 할 수 있다.
1) Interrupted process : 상온에서 증발을 수행하다 부분적으로 굳은 미세 입자를 저농도의 유화제 용액이나 유화제가 없는 용액으로 옮겨 증발을 계속하는 방법
2) Continuous process : 유기 용매가 완전히 제거될 때까지 상온에서 계속적으로 교반 시키는 방법.
3) Rotary evaporator를 사용하여 약 30℃에서 제거하는 방법
용매가 제거된 후 굳은 마이크로캡슐은 여과나 원심 분리를 통하여 분리하고, 유화제를 제거하기 위해 수 차례 세척 후 진공건조하거나 동결건조한다.
본 발명의 마이크로캡슐화(microencapsulation) 방법은, 바람직하게는 이중 유상액 방법(double emulsion method)을 이용한다.
고분자 물질로는, 생체에서 분해되는 고분자 물질이 사용된다. 예를 들어, 알부민, 젤라틴, 콜라겐, 피브리노겐; 폴리락티드(polylactides : PLA) 및 폴리글리콜리드(polyglycolides : PGA)와 같은 히드록시 산; 폴리락티드 코 글리콜리드 (poly(lactide-co-glycolides : PLGA), PEG, 폴리 β-히드록시 부틸산(poly β-hydroxy butyric acid; PHB), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리언하이드라이드 (polyanhydrides), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리락티드 코 글리콜리드(poly(lactide-co-glycolides : PLGA), 폴리언하이드라이드, 폴리우레탄, 폴리(부틸산), 폴리(발레릴 산) 및 폴리(락티드-코-카프로락톤) 등과 그 유도체, 그리고 이들의 공중합체 및 혼합물이 사용될 수 있다. 여기서 사용되는 ″유도체″라는 용어는 화학기, 예를 들어 알킬, 알킬렌의 치환, 부가, 수산화, 산화 및 당업자에 의해 통상적으로 행해질 수 있는 다른 변형을 갖는 고분자를 포함한다. 일반적으로, 생분해성 고분자 물질들은 비효소적 및 효소적 가수분해 모두에 의해, 그리고 표면 또는 벌크 침식에 의해 생체내에서 분해된다.
이중유상-유기용매증발 공정(double-emulsification solvent evaporation procedure)을 이용하여 인슐린 결정을 마이크로캡슐화(microencapsulation)하는 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저, 상기와 같은 방법으로 용액상태로 존재하는 인슐린 결정을 얻은 후 이를 원심분리하여 상등액을 제거하고, 증류수로 씻어 용액 내에 존재하는 인슐린 분자를 제거한 상기 상등액에 현탁시켜 사용한다.
이때 상기 현탁액은, 1% 초산용액에서 만든 1% 키토산 용액에 염기를 첨가하여 인슐린 결정이 녹지 않을 조건, 즉 인슐린의 등전점(isoelectric precipitation)인 pH 4.5∼6.5로 맞춘 키토산 용액을 사용하여 인슐린 결정을 현탁시켜 만들 수도 있다. 또한, 이때 키토산 대신 PBS(phosphate buffered saline)를 사용할 수도 있으며, 인슐린을 결정화한 후 상등액을 그대로 사용할 수도 있다.
상기와 같이 준비한 인슐린 현탁액을 고분자 용액 (예를 들어, PLGA/DCM 용액)에 첨가하여 1차 유상액을 만들고, 이것을 유화제(예를 들어, 1% PVA 용액)에 천천히 첨가하여 2차 유상액을 만든다. 이후 교반하여 고분자를 응고시킨 후 원심 분리로 입자를 회수하고, 증류수로 3회 세척한 후, 동결건조하여 본 발명의 마이크로파티클을 얻는다.
상기와 같은 과정을 통해 제조된 본 발명의 마이크로파티클은 작고 균일한 양상의 입자 분포를 보이며 바람직하게는 부피평균직경 0.1㎛ 이상을 갖는다. 특히 폐를 통한 투여제의 형태로 제형화할 경우에는 바람직하게는 부피평균직경 약 10㎛ 이하의 크기를 갖도록 만들 수 있으며, 입자크기는 마이크로파티클 내의 인슐린 결정의 양에 영향을 받지 않는다.
본 발명에서는 실시예를 통해 인슐린 결정을 마이크로캡슐화한 본 발명의 마이크로파티클과 인슐린 용액을 마이크로캡슐화한 마이크로파티클을 비교하였다. 인슐린 용액의 마이크로캡슐화에서는 인슐린을 초산용액에 녹여 사용하였다.
여러 비교실험 결과, 인슐린 결정을 마이크로캡슐화(microencapsulation)한 경우에는 마이크로캡슐(또는 ″crystal/PLGA″로 표시함)이 형성되었고, 액상의 인슐린 용액을 마이크로캡슐한 경우에는 마이크로스피어(또는 ″solution/PLGA″로 표시함)가 형성되었다 (도 1 참조). 이러한 제형 구조의 영향으로 본 발명의 마이크로파티클인 crystal/PLGA가 액상 인슐린을 마이크로캡슐화한 solution/PLGA에 비해 입자의 크기에 있어 더 작고 균일한 양상을 보여 주었다 (도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명에 따라 인슐린 결정을 마이크로캡슐화할 경우 유기 용매와의 접촉면이 감소하여 공정에서 발생할 수 있는 단백질의 변성이 감소하는 등 제형의 안정성이 크가 증가하였다 (도 6 및 도 7 참조).
이 밖에도 crystal/PLGA의 경우 solution/PLGA에 비해 높은 마이크로캡슐화 (microencapsulation) 효율을 보여 주었으며 (도 8 참조), 하드닝 (hardening) 공정 중 일어날 수 있는 단백질의 손실 또한 감소하였다.
본 발명자들의 실험결과, 인슐린은 0.1N 초산 용액(pH 2.0)에 약 254 IU/0.3㎖의 농도까지 용해되는 것으로 나타났으며, 이에 비해 인슐린 결정은 용해도에 대한 제한이 없으므로 425 IU/0.3㎖ 이상의 인슐린을 마이크로캡슐화 공정에 도입할 수 있었다. crystal/PLGA의 경우, 인슐린 농도가 증가할 수록 약물 함량도 선형적으로 증가하고 캡슐화 효율이 약 79%로 일정하게 나타났으나, solution/PLGA의 경우 약물 함량은 인슐린의 용해도를 고려하였을 때 최대 3%이며 캡슐화 효율이 인슐린 농도가 증가할 수록 감소되었다. 따라서, 인슐린 결정을 사용하여 고분자로 마이크로캡슐화할 경우 사용되는 고분자 운반체에 대한 약물의 비를 증가시킴으로써 체내에 투여되는 고분자 화합물의 양을 감소시켜 정화과정에 대한 폐의 부담을 줄일 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에서는 인슐린 등전점을 이용하여 마이크로파티클 제제를 동결건조하지 않고 등전 완충 용액 내에서 보존하는 인슐린 마이크로파티클 제제의 액상 보존 방법을 제공한다. 인슐린의 등전점인 pH 4.5∼6.5의 등전 완충 용액 내에서 인슐린 결정의 마이크로파티클 제제를 보존할 경우 15시간 후에도 마이크로파티클 내에 96%의 인슐린이 잔존하는 것으로 확인되었다. 이러한 액상 상태의 인슐린 마이크로파티클 제제의 경우, 사용시 용액에 분산시킬 필요없이 그대로 환자에 투여할 있으므로 투여가 용이하고, 동결건조과정에서의 단백질 변성이 없으므로 체내에 투여시 초기 방출 효과 또한 상당히 줄어들게 된다.
생체내에서의 약효 발현을 확인하기 위한 동물실험에서, 인슐린 결정을 마이크로캡슐화한 crystal/PLGA는 마이크로캡슐화하지 않은 인슐린 결정에 비해 낮은 혈당 농도를 장시간 유지시켜 주는 것으로 나타났다. 이는 제형화 결과, 본 발명의 마이크로파티클이 생체내에서 장시간에 걸쳐 안정적으로 약효가 지속되는 것을 보여주는 것이다(도 11참조).
인슐린 결정을 마이크로캡슐화(microencapsulation)한 본 발명의 마이크로파티클은, 생체내에서 인슐린의 약효가 장시간 지속적으로 유지되는 인슐린 방출제어제제로서 사용되게 된다.
상기 인슐린 방출제어제제는 약제학적으로 허용가능한 부형제나 운반체 또는 보조제를 부가적으로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 인슐린 방출제어제제는 상기 인슐린 결정의 마이크로파티클을 pH 4.5∼6.5의 등전 완충 용액 내에 보존하는 형태를 갖는다.
상기 인슐린 방출제어제제는 폐를 통한 흡입투여제; 경구투여형 제제; 주사제; 경피흡수제 등의 여러 형태로 제조될 수 있으며, 가장 바람직하게는 폐를 통한 흡입 투여를 목적으로 제제화 된다.
또한, 기존의 알려진 제형화 기술에 따라, 본 발명의 마이크로파티클(예를 들어, crystal/PLGA)과 속효성 인슐린 부분을 함께 제제에 포함시켜 속효성과 지속성의 효과를 동시에 얻을 수 있는 인슐린의 방출제어제제를 제조할 수 있다. 이때 속효성 부분은 인슐린 용액이나 기존의 속효성 인슐린제제 등을 이용할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.
실시예 1
인슐린 결정의 마이크로캡슐화(microencapsulation)
(1) 인슐린 분말을 pH 2.0 초산에 녹인 뒤 1N과 10N NaOH를 이용하여 산도를 변화시키면 pH 4.5를 지나면서 집합체(aggregates)가 생성되기 시작하고, pH를 더 증가시키면 pH 6.0을 지나면서 5㎛ 이하의 미세 인슐린 결정이 62% 이상 생성되며, pH 9.0 내지 10.5에서의 인슐린 용액을 pH 6으로 급격히 감소시키면 수 초 내지 2분 안에 5㎛ 이하의 미세 인슐린 결정이 90% 이상 생성된다. 이러한 방법으로 용액상태로 존재하는 미세 인슐린 결정을 준비하였다.
(2) 상기 (1)에서 준비한 용액상태의 인슐린 미세결정을 4,500rpm에서 15분간 원심분리한 후, 상등액을 제거하였다.
(3) 상기 (2)에서 얻은 인슐린 결정을 (2)의 상등액 0.3㎖에 섞어주었다.
(4) 상기 (3)에서 준비한 혼합액을 유리 시험관에 준비한 4㎖ PLGA/CH2CL2용액에 부어주고 조직 파쇄기(tissue traror)를 사용하여 유상액을 만들었다.
(5) 상기 (4)에서 만든 유상액을 50㎖의 폴리비닐알콜 (polyvinyl alcohol) (1%) 용액에 점차적으로 부어 주며 이중 유상액을 만들었다.
(6) 3시간 동안 교반하여 상기 (5)에서 얻은 이중 유상액의 CH2Cl2를 제거한 후, 2,300rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 증류수로 3번 씻어주었다.
이렇게 인슐린 결정을 만들어 마이크로캡슐화한 결과, 인슐린 결정의 마이크로캡슐 제제(crystal/PLGA)를 얻을 수 있었다.
실시예 2
인슐린 용액의 마이크로캡슐화(microencapsulation)
인슐린 미세결정 대신, 0.1N 초산 용액에 용해시킨 인슐린 용액를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 인슐린을 마이크로캡슐화하여, 마이크로스피어 제제(solution/PLGA)를 얻었다.
실시예 3
인슐린 미세 입자의 크기 측정
실시예 1 및 2에서 얻어진 마이크로파티클 입자들을 광학현미경(Inverted microscope, model CK2, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하여 그 결과를 도 1에 나타내었으며, SEM(scanning electron microscopy)으로 표면을 관찰하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 입자 분석기(CILAS particle size analyzer 1064, France)를 이용하여 실시예 1 및 2에서 얻은 마이크로파티클의 입자크기를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었으며, 실시예 1의 (1)에서 제조한 인슐린 결정과 실시예 1에서 만든 인슐린 결정의 마이크로캡슐의 입자크기를 분석하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 1a 및 1c는 실시예 2에서 얻은 마이크로스피어 제제(solution/PLGA)의 광학현미경 사진(각각 ×400,×200)이며; 도 1b 및 1d는 실시예 1에서 얻은 마이크로캡슐 제제(crystal/PLGA)의 광학현미경 사진(각각 ×400,×200)이다. 도 1로 부터 확인할 수 있는 바와 같이, 매우 균일한 구형의 마이크로파티클이 제조되었다.
도 2를 보면, 실시예 1에서 제조한 crystal/PLGA의 경우 표면에 구공(pore)이 적게 나타나고, 내부 구조를 살펴보면 내부에 인슐린 미세결정이 들어있는 마이크로 캡슐의 형태임을 알 수 있다. 반면, 실시예 2에서 제조한 solution/PLGA의 경우에는 표면에 구공이 많이 형성되어 있으며, 내부가 다핵으로 구성되어 있는 마이크로스피어의 형태임을 알 수 있다.
또한, 도 3을 보면, 전체적으로 실시예 1에서 얻은 마이크로캡슐 (crystal/PLGA)이 실시예 2에서 얻은 마이크로스피어(solution/PLGA)에 비해 입자크기가 작은 것을 알 수 있다. 인슐린 결정과 마이크로캡슐화된 인슐린 결정을 비교한 도 4를 보면, 마이크로캡슐화된 것이 인슐린 결정에 비해 약간 크기가 약간 증가하였음을 알 수 있다. 그러나 실시예 1에서 얻은 마이크로캡슐은 실험구 마다 약간 차이가 있으나 부피평균직경이 약 5.09±0.92 ㎛로 폐를 통하여 전달 가능한 크기였으며, 특히 폐를 통해 투여하기에 적합한 5㎛ 이하의 입자가 부피-직경으로 약 60%를 차지하며, 수-직경으로 약 99%를 차지하는 것으로 나타났다.
실시예 4
안정성 시험
실시예 1의 crystal/PLGA와 실시예 2의 solution/PLGA를 pH 7.4의 PBS 용액에 분산시키고, 37℃에서 방출시켰다. 7일간 방출시킨 후, 원심 분리하여 상등액을 회수하고, RP-HPLC로 분석하여 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 5
안정성 시험
실시예 1의 crystal/PLGA와 실시예 2의 solution/PLGA를 동결건조한 후, 각각 pH 7.4의 PBS 용액에 분산시키고, 37℃에서 방출시켰다. 7일간 방출시킨 후, 원심 분리하여 상등액을 회수하고, RP-HPLC로 분석하여 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5로부터 실시예 4와 5의 경우 모두에서 아미드 분해 산물(deamidated product)가 관찰되었음을 알 수 있다. 보다 정확하게 파악하기 위해 이것을 전체 인슐린 peak의 면적에 대한 비율로 계산하고, 동결건조한 것과 동결건조하지 않은 것을 비교하여 다음의 표 1에 나타내었다.
시료 | 인슐린(%) | 아미드 분해 인슐린(%) | |
비동결건조(non freeze-dried) | solution/PLGA | 93.17±0.64 | 6.83±0.64 |
crystal/PLGA | 98.74±0.20 | 1.26±0.20 | |
동결건조(freeze-dried) | solution/PLGA | 93.52±3.12 | 6.48±3.12 |
crystal/PLGA | 97.80±0.47 | 2.01±0.47 |
표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 crystal/PLGA의 경우 실시예 2의 solution/PLGA에 비해 아미드 분해가 훨씬 적게 일어났으며, 이것은 영국 약전과 미국 약전에서 명시한 3% 보다도 적은 양이었다.
따라서 인슐린 결정을 마이크로캡슐화 하였을 경우, 그 안정성이 인슐린 용액을 마이크로캡슐화한 것에 비해 월등하게 뛰어나고 동결건조를 거친 후에도 안정성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6
공정중 인슐린의 손실
실시예 1과 2의 마이크로파티클의 제조 공정 중, CH2Cl2를 제거하는 공정에서 일정 시간 간격으로 시료를 취하였다. 이것을 마이크로파티클과 OWP(outer water phase)로 분리하였다. 마이크로파티클은 CH2Cl2에 용해한 후, 0.1N 초산 용액을 첨가하여 내부에 포획된 인슐린을 추출하였다. OWP는 pH를 2로 감소시켜 남아 있을 수 있는 인슐린 미세 결정을 용해시켰다. 이들을 모두 브래드포드 방법(Bradford assay)으로 정량하여 그 결과를 도 6과 도 7에 나타내었다.
Solution/PLGA의 경우 drug content의 감소가 관찰되었으나, crystal/PLGA의 경우 이러한 감소가 관찰되지 않았다 (도 6).
OWP로 방출된 인슐린 양 또한 soltuion/PLGA의 경우 계속 증가하여 3시간 후, 전체 system 내에 첨가한 인슐린 양의 9% 가량이 외부로 방출되는 것을 볼 수 있었다(도 7).
따라서 인슐린 미세결정을 마이크로캡슐화 하였을 경우, 인슐린 용액을 마이크로캡슐화한 경우에 비해 공정중 손실이 월등히 작은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7
마이크로파티클 내 약품 함량과 캡슐화 효율
실시예 1의 (1)과 같은 방법으로 준비한 인슐린 현탁액(suspension)을 일정양 취하여, 3mg, 6mg, 10.5mg, 15mg의 인슐린 결정을 얻는다. 이것을 원심분리한 후 상등액을 버리고, 0.3㎖의 crystal soup에 분산시킨 후, 실시예 1과 같은 방법으로 마이크로파티클을 제조하였다. 또한, 별도로 3mg, 6mg, 10.5mg, 15mg의 인슐린을 취하여 0.3㎖의 0.1N 초산 용액에 녹여 실시예 2와 같은 방법으로 마이크로파티클을 제조하였다.
이것을 동결 건조한 후, 약 5mg을 각각 취하여 실시예 6과 같은 방법으로 내부의 인슐린을 추출하여 약품 함량과 캡슐화 효율을 측정하여 그 결과를 도 8 및 다음의 표 2에 나타내었다.
인슐린 양(mg) | 마이크로캡슐화 효율 (%) | S.D | S.E | |
solution/PLGA | 3 | 72.91 | 7.98 | 4.61 |
6 | 63.10 | 6.52 | 3.76 | |
10.5 | 52.72 | 6.77 | 3.91 | |
15 | 42.75 | 6.90 | 3.98 | |
crystal/PLGA | 3 | 73.99 | 18.85 | 10.88 |
6 | 69.66 | 18.18 | 10.50 | |
10.5 | 80.47 | 13.24 | 7.64 | |
15 | 79.85 | 7.96 | 4.59 |
본 결과는 3회 실험결과의 평균이다.
S.D.; standard deviation
S.E.; standard error
crystal/PLGA의 경우, 인슐린의 농도가 증가할수록 약품 함량이 선형적으로 증가하였으며, 캡슐화 효율도 약 79%로 일정하게 나타났다. 그러나, solution/ PLGA의 경우에는, 약품 함량은 인슐린의 용해도를 고려하였을 때 최대 3%이며, 캡슐화 효율은 농도가 증가할수록 감소되었다.
이를 통해, 인슐린 미세결정을 캡슐화하였을 경우 인슐린 용액을 캡슐화하는 기존의 방법에 비해 마이크로파티클 내 약품 함량이 증가되며, 공정중 손실도 낮아져 캡슐화 효율 또한 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8
용출 실험
인슐린 방출에 대한 마이크로캡슐화(microencapsulation)의 영향을 평가하기 위하여, 인슐린 결정을 마이크로캡슐화한 후 일부는 동결건조하고 일부는 동결건조하지 않은 채 인슐린 결정과 함께 방출실험을 하였다.
인슐린 결정(●)과; 실시예 1에서 제조한 마이크로캡슐을 동결건조한 것(○)과; 실시예 1에서 제조한 마이크로캡슐을 동결건조하지 않은 것(▼)을 0.4㎖의 PBS 용액 (pH 7.4)에 섞은 후, 37℃에서 방출시켰다. 일정 시간 간격으로 원심분리하여 상등액을 회수하고, 새 용액을 보충하였다. 브래드포드 방법(Bradford assay)을 사용하여, 방출된 인슐린의 양을 측정하였으며, 그 결과는 도 9와 같다.
도 9에서 볼 수 있듯이 초기 방출(initial burst) 후, 영차(zero-order) 방출을 보이는 biphasic release를 나타내었다. 인슐린 결정의 경우 초기 방출량이 28% 정도인 것에 비해, 마이크로캡슐화한(crystal/PLGA) 후 동결건조하였을 때는 36% 정도로 약 8%가 증가하였다. 반대로 동결건조하지 않은 마이크로파티클(crystal/PLGA)에서는 초기 방출량이 약 24%로 인슐린 결정에 비해 4% 정도 감소되었으며, 동결건조한 것에 비해서는 12% 감소되었다. 이것은 고분자 막에 의해 방출량이 제어된 것으로 생각할 수 있다.
또한, 인슐린 미세결정의 경우 지속적으로 많은 양이 방출되어 4시간 후에는 완전히 방출되어 잔존량이 남아있는 않았다. 그러나, 마이크로캡슐화 (microencapsulation)된 경우는 초기에 많은 양이 방출된 후, 적은 양의 인슐린이 지속적으로 방출되어 방출 4시간 후에도, 동결건조하지 않은 경우에는 38%, 동결건조한 경우에는 18%의 인슐린이 마이크로파티클 내부에 잔존하였다.
결과적으로, 동결건조하지 않은 마이크로캡슐의 경우 인슐린의 초기 방출을 감소시킬 수 있었으며, 마이크로캡슐화(microencapsulation)한 경우, 특히 동결건조하지 않은 마이크로캡슐화의 경우에는 인슐린 결정에 비해 보다 오랫동안 지속적으로 인슐린이 균일하게 방출되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9
등전점을 이용한 저장성 실험
실시예 1에서 제조한 마이크로캡슐을 동결건조하지 않은 상태에서 용출실험을 수행하였다. 인슐린이 완전히 용해되는 pH 3(●); isoelectric precipitation zone인 pH 6(○); 그리고 체내 방출 조건인 pH 7.4(▼)의 PBS 용액에서 실시예 8과 같이 수행하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
실험결과, pH 6(○)에서는 4시간 후, 전체 인슐린 양의 20%정도가 빠져나가고 80%가 잔존하는 반면, pH 3(●)과 pH 7.4(▼)에서는 각각 15%, 38%가 잔존하였다. 결과적으로, pH 3이나 pH 7.4의 방출 양상과 달리 pH 6에서는 소량이 서서히 방출되는 것으로 관찰되었다.
또한 pH 6의 PBS에서 4℃로 저장하였을 경우에는, 15시간 후에도 96%의 인슐린이 마이크로파티클 내에 잔존하고 있음이 확인되었다.
실시예 10
인슐린 제형에 따른 전 임상 실험
인슐린을 PBS 완충액(pH7.2)에 녹인 인슐린 용액과; 실시예 1에서 사용한 인슐린 미세 결정; 실시예 1의 공정을 거쳐 제조한 마이크로캡슐을 실험용 흰 쥐(SD Rat)에 복강내 주사로 투여하였다. 인슐린 용액은 PBS 완충액(pH 2.14)에 완전히 녹인 후, 수산화나트륨(NaOH)과 염산(HCl)을 이용하여 pH 7.2로 맞추었다. 각 제제에 따른 최적 투여량(optimal dose)을 선정하여 투여하였다. 인슐린 용액의 경우, 투여용량은 2 IU/kg이며, 흰 쥐 9 마리에 복강 주사 투여하였다. 인슐린 미세 결정은 평균입자 크기가 4.16㎛이고 수율 94.25%의 것으로서, 투여용량은 5 IU/kg으로 하였고 흰 쥐 9마리에 복강 주사 투여하였다. 마이크로 캡슐화한 인슐린 미세결정은 20 IU/kg, 흰 쥐 8마리에 복강 투여하였다. 대조군으로는 흰 쥐 9마리에 PBS 7.2의 용액을 투여하였다. 마리 당 주사량은 쥐 무게 별로 인슐린 현탁액에서와 같이 하였다. 결과는 도 11과 같다.
대조군(●)에 비하여 인슐린을 주사한 쥐(○,▼,▽)에서 혈당치의 현격한 감소를 확인할 수 있었다. 약효 지속 시간이 인슐린 용액(○)의 경우 약 6시간 정도였으며, 인슐린 결정(▼)의 경우 약 8시간으로 나타났으나, 이에 비해 마이크로캡슐(crystal/PLGA)(▽)의 경우는 12시간 정도로 나타났다.
마이크로캡슐화한 crystal/PLGA(▽)가 인슐린 결정(▼)에 비해 더 낮은 혈당치를 더 오래 지속시키는 것으로 나타났다.
즉, 인슐린 용액(○)은 2시간 경과 시점에서 최저 혈당치를 나타냈고, 인슐린 미세결정(▼)도 2시간 경과 시점에서 최저였으며, 인슐린 마이크로캡슐(▽)은 3시간 경과 시점에서 최저 혈당이 되는 것으로 나타났다. 체내 혈당농도의 패턴으로 인슐린의 방출 패턴을 역으로 확인할 수 있으므로, 최저 혈당치일 때 인슐린 방출은 최대치임을 상대적으로 알 수 있다.
인슐린 용액(○)과 인슐린 미세결정(▼)에서는 2시간 경과 시점을 기준으로 혈당의 회복세를 보여 6∼8시간 후에는 정상수준으로 회복되었으나, 이에 비해 인슐린 마이크로캡슐(▽)은 3 시간 경과시점을 기준으로 12시간 후에야 정상 혈당으로 회복되었다. 이는 마이크로캡슐이 체내에서 인슐린을 서서히 방출함으로써, 약효 지속시간을 연장시킨다는 것을 보여주는 것이다.
또한, 인슐린 용액은 5 IU/kg을 초과할 경우, 그리고 인슐린 미세결정은 10 IU/kg을 초과하여 투여할 경우, 저혈당으로 쥐가 죽게 된다. 그러나, 인슐린 마이크로캡슐의 경우(▽)는 20 IU/kg에서도 혈당이 떨어졌다가 천천히 정상수준으로 회복되는 것으로 보아, 고분자 물질에 의해 체내에서 약물이 서서히 분비되어 약효를 나타낼 때까지의 시간을 지연시킴으로써 당뇨환자의 수면 중 저혈당으로 인한 쇼크나 사망에 유효한 것으로 기대되었다.
다음의 표 3은 인슐린의 제형에 따른 투여량(Dose),혈당 농도 감소결과의 최저치(MRPG), 최저혈당시간, 혈당농도 그래프 아래의 면적(AUC), 총 혈당 감소량(TRPG)을 제시하였다. 이 표를 통해 인슐린 약물의 생체내 약물동태를 알 수 있다.
투여량(IU/㎏) | MRPG(㎖/dl) | 최저 혈당 시간(h) | AUC(㎎ h/dl) | %TRPG | |
대조군 | 0 | 63±1.39 | 12 | 803.01 | 8.74 |
인슐린 용액 | 2 | 25.56±1.24 | 2 | 582.9 | 35.52 |
인슐린 결정 | 5 | 25.78±1.56 | 2 | 553.47 | 39.22 |
crystal/PLGA | 20 | 11.25±0.41 | 3 | 346.75 | 56.14 |
AUC: Area under the serum glucose concentration-time curve
MRPG: Minimum reduction of plasma glucose
TRPG: Total reduction in plasma glucose
%TRPG: 100×[1-(AUC/Time×maximum point)
상기 실시예들로부터 확인되는 바와 같이, 인슐린 미세결정을 마이크로캡슐화한 본 발명의 인슐린 방출제어제제는, 마이크로캡슐화 공정에서 일어나는 인슐린의 변성을 감소시키고 제제의 안정성을 증가시켜 생체내에서의 인슐린의 초기 방출(initial burst) 및 저혈당 위험을 감소시키게 된다. 또한, 폐로 투여하기에 적합한 작고 균일한 입자의 형태로 마이크로파티클이 얻어지고, 마이크로캡슐화 효율(고분자 운반체에 대한 약물의 비)도 증가되어 폐 또는 주사를 통해 투여하기에 적합한 형태가 된다. 본 발명의 인슐린 방출제어제제는 체내에서 장시간 지속적으로 안정적인 약효를 발휘하게 되므로, 당뇨환자에 있어 인슐린의 투여횟수를 줄이면서도 보다 안정적으로 혈당을 콘트롤 할 수 있게 한다.
Claims (13)
- 인슐린 결정을 생분해성 고분자로 마이크로캡슐화 (micro-encapsulation)하여 얻은 마이크로파티클로 이루어진 인슐린 방출제어제제.
- 제1항에 있어서,상기 제제는 상기 마이크로파티클을 pH 4.5∼6.5의 등전 완충 용액 내에 보존하는 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 방출제어제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 인슐린 미세결정은 부피평균직경 0.1㎛ 이상인 것을 특징으로 하는 인슐린 방출제어제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 생분해성 고분자는 알부민, 젤라틴, 콜라겐, 피브리노겐; 폴리락티드(polylactides : PLA) 및 폴리글리콜리드(polyglycolides : PGA)와 같은 히드록시 산; 폴리락티드 코 글리콜리드(poly(lactide-co-glycolides : PLGA), PEG, 폴리 β-히드록시 부틸산(poly β-hydroxy butyric acid; PHB), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리언하이드라이드 (polyanhydrides), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리락티드 코 글리콜리드(poly(lactide-co-glycolides : PLGA), 폴리언하이드라이드, 폴리우레탄, 폴리(부틸산), 폴리(발레릴 산) 및 폴리(락티드-코-카프로락톤); 이들의 유도체와 공중합체 및 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 인슐린 방출제어제제.
- 제4항에 있어서,상기 고분자는 폴리락티드 코 글리콜리드 (poly(lactide-co-glycolides : PLGA)인 것을 특징으로 인슐린 방출제어제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 제제는 폐를 통한 흡입투여제; 경구투여형 제제; 주사제; 경피흡수제 중 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 방출제어제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 제제는 부피평균직경 10㎛ 이하의 인슐린 미세 결정을 마이크로캡슐화하여 얻은 부피평균직경 10㎛ 이하의 마이크로파티클로 이루어지며, 폐를 통한 흡입투여제의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 방출제어제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 제제에는 약제학적으로 허용가능한 부형제나 운반체 또는 보조제가 포함되는 것을 특징으로 인슐린 방출제어제제.
- 부피평균직경 10㎛ 이하의 인슐린 미세결정을 생분해성 고분자로 마이로캡슐화 (micro-encapsulation)하여 얻은 마이크로파티클과; 속효성 인슐린 부분을 함께 포함하는 인슐린 방출제어제제.
- (a) 인슐린 등전점 이하의 산성 인슐린 용액의 pH를 염기를 이용하여 약 pH 9.0 내지 10.5까지 변화시켜 인슐린 용액내에 씨로 작용할 수 있는 미세 입자를 형성시킨 후, 이 인슐린 용액의 인슐린 용해도를 낮춤으로써 인슐린 결정을 얻는 단계와;(b) (a)에서 얻은 인슐린 결정을 생분해성 고분자로 마이크로캡슐화 하는 단계와;(c) (b)에서 얻은 마이크로파티클에, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 보조제 또는 운반체를 부가하여 통상의 약제학적 방법으로 제형화하는 단계를 포함하는 인슐린 방출제어제제의 제조방법.
- 제10항에 있어서,상기 제형화 단계에는 인슐린 마이크로파티클을 pH 4.5∼6.5의 등전 완충 용액 내에 보존하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서,상기 마이크로캡슐화는 이중 유상액 방법(double emulsion method)을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서,상기 인슐린 결정을 pH 4.5∼6.5의 키토산 용액에 현탁시켜 마이크로캡슐화하는 것을 특징으로 하는 방법.
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