DE69428860T2

DE69428860T2 - Insulin Formulierung

Info

Publication number: DE69428860T2
Application number: DE69428860T
Authority: DE
Inventors: James Arthur Hoffmann
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1993-08-13
Filing date: 1994-08-09
Publication date: 2002-05-02
Anticipated expiration: 2014-08-10
Also published as: NO942959D0; DK0646379T3; TW326394B; CN1109364A; EP0646379B1; BR9403204A; CZ193794A3; NZ264197A; PH30757A; EP0646379A1; IL110581A0; CO4230235A1; KR950005324A; ZA945939B; AU7024794A; PL177002B1; RU2135205C1; NO942959L; US5534488A; AU674975B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Humanmedizin, insbesondere die Behandlung von Diabetes. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Formulierungen, die das humane Insulinmolekül enthalten, das bei einer Verabreichung die Grundspiegel von Insulin, die im normalen menschlichen Körper gefunden werden, enger nachahmt.
Ein therapeutisches Hauptziel bei der Behandlung von Diabetes ist die physiologische Kontrolle der Blutglucosespiegel. Es sind viele verschiedene Produkte und Formlulierungen im Handel für diesen Zweck erhältlich. Für den schnellen Anstieg der Glucosebelastung, die während der Mahlzeiten auftritt, sind die schnellwirkenden Insulinprodukte, wie Human Regular oder die sogenannten monomeren Insulinanaloga am geeignetsten.
Eine weitere wichtige Quelle der Glucosebelastung bei Patienten ist der geringe Basalglucoseausstoß aus der Letter. Dieser Ausstoß kommt primär von postprandialen metabolischen Prozessen, wie Gluconeogenese und Glycogenolyse. Bei diabetischen Patienten kann dieser basale Glucoseausstoß sich über Nacht wesentlich erhöhen und zu ausgedehnten Perioden von Hyperglykämie, speziell während der frühen Morgenstunden bei einem Vorfall, der als Dämmerungsphänomen bezeichnet wird, führen. Von diesen Hyperglykamieperioden wurde gezeigt, daß sie ein wichtiger Beitrag zu hohen Spiegeln an glycosylierten hoteinen sind, wie sie oft klinisch als glykosyliertes Hämoglobin gemessen werden. Der Aufbau dieser derivatisierten Proteinprodukte ist bei den Langzeitkomplikationen beteiligt, die mit Diabetes assoziiert sind, wie Neuropathie, Nephropathie und Retinopathie.
Die ideale Insulinformulierung, um mit diesem basalen Glucoseausstoß fertig zu werden, wäre eine, die zu einer langsamen, stetigen Infusion von Insulin in den Blutstrom führen würde, die zu der geringen Mengen an Glucoseausstoß aus der Leber paßt. In Anbetracht dieser idealen Bäsalzeitwirlgung ist das beste parenterale Produkt, das zu dieser Beschreibung paßt, im Handel erhältliches Ultralent-Insulin vom Rind. Wenn es einmal am Tag injiziert wird, ergibt es eine geringe, stetige Freisetzung von Insulin in den Blutstrom ohne merkenswerten Insulinpeak. Ein Hauptproblem des Ultralent vom Rind rührt jedoch von der Tatsache her, daß Rinderinsulin sich in der Aminosäuresequenz von humanem Insulin unterscheidet. Der menschliche Körper kann Rinderinsulin als fremdes Protein erkennen. Eine chronische Injektion dieser immunogenen Substanz in Diabetespatienten kann zur Bildung von Antikörpern gegen dieses Insulin führen. Dies kann zu Veränderungen in der Wirkzeit und der Stärke von Insulin und anderen Problemen führen, die aus dem aktivierten Immunsystem des Patienten entstehen. Aus diesen Gründen bleibt Ultralent vom Rind eine nicht-ideale parenterale Insulinformulierung.

Artenunterschiede bei Ultralent-Insulinen

Der Fortschritt der rekombinanten DNA Technolgie und neue enzymatische Techniken zur Umwandlung von Schweineinsulin in Humaninsulin resultierten in ausreichender Versorgung von Humaninsulin, das 1980 verfügbar wurde. Um die oben erwähnten mit Ultralent vom Rind assoziierten Probleme zu beseitigen, war ein logischer Schritt die Herstellung von humanen Ultralentkristallen und ihre Formulierung in eine im Handel erhältliche, parenterale Fonnulierung. Die Kristallformen, Kristallzustände, Kristallgrößen, Herstellverfahren und Formulierungszusammensetzungen von Ultralentprodukten vom Menschen und Rind sind im wesentlichen identisch.
Jedoch führten mehrere Jahre klinischer Erfahrung zu den definitiven Indikationen daß diese Produkte nicht identisch sind. Tatsächlich zeigten klinische Berichte, daß Ultralentfonnulierungen vom Menschen schneller wirken, als Ultralentfonnulierungen vom Rind, während von Ultralent vom Schwein gezeigt wurde, daß es bei der Wirkzeit zwischen den zwei anderen Arten liegt. In der klinischen Praxis hat dies oft dazu geführt, daß Ärzte und Diabetologen für Ultralent vom Menschen ein Injektionsprotokoll zweimal am Tag empfohlen haben. Zusätzlich beobachtet man einen signifikanten Peak der Insulinabsorption in den Blutstrom nach etwa 12 Stunden nach der subkutanen Verabreichung. Dieses Phänomen vermindert nicht nur die Fähigkeit des Produkts, dem stetigen Basalglucoseausstoß der Leber entgegenzuwirken, sondern führt auch selbst zu Hyperinsulinämie, die selbst zu makrovaskulären Komplikationen führen kann.
Die Gründe für die Unterschiede in der Wirkzeit zwischen Utralentprodukten vom Menschen und Rind sind nicht vollständig verstanden. Das Vorkommen von Antikörpern gegenüber dem Rinderinsulin ist nicht die primäre Ursache für diesen Unterschied in der Wirkzeit. Einige Forschung hat gezeigt, daß das Ultralentinsulin vom Menschen schneller aus der Injektionsstelle absorbiert wird, als das Ultralent vom Rind. Ein weiterer Einblick in diese Frage kam von Verdünnungstests, die in der Patentbeschreibung weiter beschrieben sind. Aufgrund von Modifikationen vorher beschriebener Tests haben diese Verdünnungstests gezeigt, daß Ultralentkristalle vom Rind nach einer Verdünnung einfach länger brauchen, um sich aufzulösen, als der vergleichbare Ultralentkristall vom Menschen. Unterschiede in den Aminosäuresequenzen zwischen Insulin vom Rind und Mensch erzeugen wahrscheinlich geringe Unterschiede in der Insulinhexamerpackung in den Kristallen, die zu Unterschieden in ihren anschließenden Solvatalionsraten führen. Nach der Injektion in das subkutane Gewebe führt diese verzögerte Auflösung der Rinderkristalle wahrscheinlich zu der verlängerten Absorption und biologischen Wirkzeit.
Die Synthese von Humaninsulinanaloga ist ein Weg, bei dem die Wirkzeitverlängerung untersucht wurde.
Insbesondere wurden Modifikationen, wie Gly(A21)-Arg(B27)-Thr-Nlt (830)-Humaninsulin (Jorgensen et al., British Medical Journal 299, 415-419 (1989)) und Modifikationen an der Glu(B13)-Position (Hansen, Biophysical Chemistry 39, 107-110 (1991)) durchgeführt. Jedoch macht in diesen Fällen die Einführung einer neuen Aminosäuresequenz das Molekül für den menschlichen Körper fremd und daher potentiell genauso immunogen oder sogar noch irurnunogener als Rinderinsulin. Die Verwendung des natürlichen Humaninsulinmoleküls wäre besser als die Einführung eines neuen Insulinmoleküls. In jedem Fall wurden keine hoch mit Zink angereicherten humanen Ultralent-Formulierungen und auch keine Mittel zur Herstellung solcher Formulierungen zum Zweck der Verlängerung der Wirkzeit der immunologisch bevorzugten humanen Ultralent-Formulüerung mit einer gleichen oder besseren biologischen Wirkzeit im Vergleich zur pharmakokinetisch bevorzugten Rinder-Ultralentformulierung beschrieben.

Zink und Insulin

Es wurde nun für viele Jahre festgestellt, daß Insulin erfolgreich mit Zinkatomen unter Erhaltung von mehreren Typen von stabilen Kristallen mit längeren Wirkzeiten als lösliches oder amorphes unkristallisiertes Insulin co-kristallisiert werden kann. Das Fischprotein Protamin wurde als Insulinkomplexierungsmittel zur Verlängerung der Wirkzeit von Insulin verwendet, aber dessen Heterogenität und Potential für eine Immunogenität macht es für eine medizinisch chronische subkutane Verabreichung weniger attraktiv.
In den frühen 50er Jahren wurde eine neue Formulierung von Rinderinsulinkristallen entwickelt, die nur Insulin und Zink in einem Acetatpuffer bei neutralem pH enthalten (Haitas-MOller et al., Science 116, 394-398 (1952)). Dieses Lent-Insulin vermeidet Phosphationen, die stark mit den Zinkionen unter Bildung von unlöslichen Zinkphosphatderivaten wechselwirken. Formulierungen, die nur das kristalline Insulin in Acetatpuffer enthalten, werden Ultralent genannt. Kristalle, die auf diesem Weg hergestellt werden, werden hier als Ultralent- Insulinkristalle bezeichnet.
Obwohl nur 2 Zinkatome erforderlich sind, um mit jedem Insulinhexamer die richtigen Ultralent-Kristalle zu bilden, befindet sich ein definierter molarer Zinküberschuß in jeder Ultralent-Formulierung und es wird festgestellt, daß dieser geeignet ist, um Ultralent vom Rind eine Wirkung für eine einmalige Injektion pro Tag zu verleihen (Schlichtkrull. in Insulin Crystals. Enjar Munksgaard Publishers, Copenhagen (1958)). Dieselbe Arbeit beschreibt (Seite 92) folgendes: "Es scheint, daß die Wirkdauer etwas kürzer wird, wenn Schweineinsulin anstelle von Rinderinsulin in Ultralent verwendet wird. Daher ist es zur Sicherstellung eines konstanten Zeitverlaufs der therapeutischen Suspensionen notwendig, streng bei ein und derselben Art zu bleiben oder ein festes Verhältnis zwischen Insulin von unterschiedlichen Arten zu finden". Ähnlich wurde berichtet, daß Ultralent-Schweineinsulin bei Diabetikern schneller absorbiert wird, als Ultralent-Rinderinsulin (Brange in Galenics of Insulin, Seite 28, Springer- Verlag, Berlin (1987)). Obwohl diese Artenunterschiede erwähnt wurden und Schweineinsulin näher an der Struktur des humanen Insulins ist und daher weniger immunogen als Rinderinsulin ist, wurden mögliche Formulierungsänderungen zur Verlängerung der Wirkzeit von Ultralent-Scheineinsulin, um es äquivalent oder länger wirksam als Rinder-Ultralent zu machen, weder vorgeschlagen noch gezeigt. Tatsächlich hat ein früherer Bericht (Hallas-M ller. Diabetes 5, 7-12 (1956)) vorgeschlagen, daß Zinkmengen über 0,2 mg pro 100 Insulineinhieten nicht zur weiteren Verlängerung der Wirkzeit von Lent (oder Ultralent) Insulinformulierungen jeder Art beitragen würden.
Es wird berichtet, daß etwa 0,09 mg Zink pro 100 Einheiten Insulin an die unlöslichen Rinder- Ultralentkristalle gebunden sind (14 Zinkatome pro Insulinhexamer), während eine relativ geringe freie Zinkkonzentration von etwa 0,05 mg pro ml im Überstand ungebunden bleibt. Diese beiden Konzentrationen werden absichtlich konstant gehalten, sogar wenn die Insulinformulierungsstärke von 40 E/ml auf 100 E/ml erhöht wird (Brange, in Galenies of Insulin, Seite 37, Springer-Verlag, Berlin (1987)).
In einem kürzlich erschienenen US Patent (US 5 070 186 A) wird beschrieben, daß Insulinformulierungen, die eine hohe Konzentration (0,02-0,5 M) eines weiteren divalenten Metallkations, nämlich Magnesium enthalten, zu schneller wirkenden Insulinprodukten führen. Jedoch wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß die Zugabe von festem Zinkchlorid oder -acetat oder konzentrierten wäßrigen Lösungen hiervon direkt zur humanen Ultralentformulierung in einer Zinkendkonzentration von etwa 0,5 bis 20 mg pro 100 Einheiten Insulin die Auflösung der Kristalle verzögert und dessen biologische Wirkzeit verlängert, um so langsam oder sogar noch langsamer zu sein, als die von Ultralent vom Rind. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß diese Modifizierung zu einem gleichzeitigen Abfall des pH von ehwa 7,4 bis auf pH 6,2 führt. Es wurde ferner festgestellt, daß diese Modifizierung dazu führt, daß das meiste zugegebene Zink im Überstand und ungebunden zum unlöslichen Insulinkristall verbleibt. Es ändert auch nicht signifikant die scheinbare Form oder Größe der Kristalle oder der chemischen Stabilität des Insulins in den Formulierungen nach bestimmten Lagerperioden.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Insulinformulierung, die eine Suspension aus Ultralent- Insulinkristallen in einer Zinkkonzentration der gesamten Formulierung zwischen etwa 0,5 Milligramm bis etwa 20 Milligramm pro 100 Einheiten Insulin enthält. Mehr als 50% des gesamten Zinks in der Formulierung verbleibt in der löslichen Fraktion anstelle im Komplex mit Insulin. Diese Insulinformulierung hat im allgemeinen einen pH von etwa 6,0 bis etwa 7,4. Diese Zink-modifizierte Formulierung zeigt Eigenschaften eines sehr lang anhaltenden humanen Insulinprodukts.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird, werden die folgenden Ausdrücke und Abkürzungen wie folgt definiert.
Zinkkonzentration der gesamten Fonnulierung - die gesamte Konzentration an Zink in der Formulierung, egal ob das Zink mit dem Insulin komplexiert ist oder in löslicher Form vorliegt.
Ultralent-Insulin - Formulierungen, die Insulinkristalle enthalten, die mit Acetatpuüer im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Hallas-MOller, et al.. Science 11 G. 39 = 1-398 (1952) hergestellt wurden. Kristalle. die auf diese Weise hergestellt wurden, werden als Ultralent-Insulinkristalle bezeichnet.
E - die internationale Standardeinheit der Insulinaktivität.
Zn - Zink.
Alle Aminosäureabkürzungen, die in der Beschreibung verwendet werden, sind die, die vom United States Patent and Trademark Office akzeptiert wurden, wie dies in 37 C. F. R. § 1.322 (b) (2) (1990) beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Insulinfonnulierung, die eine Suspension aus Ultralentkristallen in einer Zinkkonzentration der gesamten Formulierung von etwa 0,5 Milligramm bis etwa 20 Milligramm pro 100 Einheiten Insulin enthält. Mehr als 50% des gesamten Zinks in der Formulierung verbleiben in der löslichen Fraktion, anstatt im Komplex mit dem Insulin. Die Insulinformulierung hat im allgemeinen einen pH von etwa 6,0 bis etwa 7,4. Zusätzlich enthält die erfindungsgemäße Insulinfonnulierung keine anderen Proteine, wie Protamin. Die Formulierung kann Konservierungsstoffe oder Isotonizitätsmittel enthalten und sie kann auch einen Puffer enthalten. der nicht stark mit dem Zink wechselwirkt. Diese Zink-modifizierte Formulierung zeigt Eigenschaften eines sehr lang anhaltenden humanen Insulinprodukts.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können durch die Zugabe von Zink zu vorher hergestellten Suspensionen an Ultralent-Insulinkristallen oder durch die Zugabe von zusätzlichem Zink nach dem Kristallisationsschritt des derzeitigen Ultralent-Herstellungsprozesses hergestellt werden. Das Zink kann in fester Form zugegeben werden oder es kann als Lösung zugegeben werden. Alternativ dazu kann eine Suspension an Ultralent-Kristallen zum festen Zink oder zur Zinklösung gegeben werden. Es können mehrere unterschiedliche Zinksalze in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Repräsentative Beispiele für Zinksalze sind unter anderem Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat. Der Fachmann erkennt, daß es viele andere Zinksalze gibt, die zur Herstellung der durch Zink modifizierten Ultralent-Insulinformulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Vorzugsweise wird Zinkacetat oder Zinkchlorid zur Herstellung der durch Zink modifizierten Ultralent-Insulinfonnulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet, da diese Salze keine neuen chemischen Ionen zu im Handel erhältlichen Ultralent-Formulierungen hinzufügen.
Die hierin beschriebene Erfindung betrifft daher die wesentliche Erhöhung der Konzentration an Zink im Überstand von humanen Ultralentformulierungen ohne die Ultralentkristalle selbst signifikant zu modifizieren. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß diese mit Zink angereicherte Ultralentformulierung die Auflösungsgeschwindigkeit der unlöslichen Insulinkristalle verzögern kann und die biologische Wirkzeit verglichen mit umnodifizierten humanen Ultralentfonnulierungen verlängern kann.
Die Vermeidung einer dramaztischen Modifizierung des Ultralentkristalls kann aus mehreren Gründen wichtig sein. Erstens wurden die Ultralentformulierungen in der chronischen Verabreichung an Diabetiker jetzt für 40 Jahre verwendet und humanes Ultralent selbst für fast 10 Jahre. Daher liegt eine Sicherheitserfahrung bei diesen neuen mit Zink modifizierten Formulierungen vor. Zweitens könnte eine wesentliche Erhöhung des Zinkgehalts in der Komplexierung mit Insulinkristallen zu einer Aggregation der Kristalle führen. Mit der Zeit könnte dies zur Klumpenbildung in der Formulierung führen, die sie unbrauchbar macht. Untersuchungen der mit Zink modifizierten humanen Ultralent-Insulinfonnulierungen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, haben keine signifikant modifizierten oder verklumpten Insulinkristalle ergeben. Schließlich könnte eine Modifizierung des Zink-Insulinkristalls zu einer Veränderung der Insulinstruktur selbst führen. die deren biologische Eigenschaften oder sogar deren Immunogenität verändern könnte.
Der hiermit einhergehende Abfall des pH, der bei der Herstellung dieser modifizierten Ultralentfonnulierungen auftritt, kann auch wichtig sein. Die Erhöhung der Menge an löslichen Zinkionen erhöht bekanntlich die chemische Spaltung von Insulin zwischen den Resten A8 (Threonin) und A9 (Serin), sogar wenn Insulin als unlösliche Kristalle vorkommt (Brange et al., Pharmaceutical Research 9. 715-726 (1992)). Eine geringe Verringerung des pH der Insulinfonnulierungen unter pH 7 minimiert diese Spaltungsreaktion und daher wird die Langzeitstabilität verbessert. Es ist auch möglich, daß dieser pH Abfall teilweise für die minimale Wechselwirkung des überschüssigen Zinks mit dem Insulinkristall verantwortlich ist, da von Proteinwechsehvirkungen mit Zink bekannt ist, daß sie bei saureren pH Werten verringert werden (Schlichtkrull in Insulin Crystals, Ejnar Munksgaard Publishers, Copenlhagen (1958)).
Die neuen mit Zink modifizierten humanen Ultralentformulierung, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, haben mehrere zusätzliche Merkmale. Das Fonnulierungsverfahren kann lange nach der Herstellung der ursprünglichen humanen Ultralentformulierung ausgeführt werden. Es könnten sogar verschiedene Mengen an Zink auf diese Weise in einer Apotheke oder in der Klinik zugegeben und in Abhängigkeit der gewünschten Wirkzeit auf den Bedarf der einzelnen Patienten zugeschnitten werden. Zusätzlich sind keine neuen Hilfsstoffe, Komplexierungsmittel, Chemikalien oder organische Lösemittel für diese Formulierungen erforderlich und so können Bedenken bezüglich einer unbekannten Toxizität einer chronischen Verabreichung von neuen chemischen Einheiten über viele Jahre vermieden werden. Schließlich ist der pH Bereich der schließlichen Lösung von pH 6,0 bis pH 7,4 nahe genug am pH des subkutanen Gewebes (pH 7,4), daß keine Reizung erfolgen sollte.
Die vorliegende Erfindung liefert Formulierungen von humanen Ultralentkristallen, die zur Behandlung von Diabetes durch subkutane Injektion geeignet sind, wie Injektionen, die eine langsame Absorption von Insulin bewirken, so daß erforderlichenfalls nicht mehr als eine Injektion pro Tag verabreicht werden muß. Die Formulierungen können auch ein Konservierungsmittel enthalten, wie Methylparatien, ein Isotonizitätsmittel, wie Natriumchlorid und einen gesamten Zinkgehalt von etwa 0,5 bis 20 mg pro 100 Insiilineinheiten und der pH beträgt etwa 6,0 bis 7,4. Der Fachmann erkennt, daß viele andere Konservierungsstoffe und Isotonizitätsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verfügbar sind. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die gesamte Zinkkonzentration etwa 0,5 bis 7 mg pro 100 Insulineinheiten und der pH beträgt etwa 6,2 bis 7,2. Eine weitere bevorzugte Ausfühungsform ist ein pH für alle Zinkmengen, der sich ergibt, wenn die geeignete Menge an festem Zinkchlorid, festem Zinkacetat oder einer konzentrierten wäßrigen Lösung dieser Reagenzien zu einer vorgeformten humanen Ultralentlösung zugegeben wird, daß heißt das keine weiteren pH Einstellungen gemacht werden.
Zum Vergleich von Zink- und Insulinkonzentrationen, die in anderen Literatur- und Patentdokumenten erwähnt sind, zeigt die Tabelle I die Äquivalenz von Zink und Insulin in Kombination, während die Tabelle II die Äquivalenz von Zink in Lösung zeigt. Tabelle I Zink/Insulinkombination Tabelle II Zink in Lösung
Die folgenden Beispiele werden als Mittel zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Sie sollen keine Beschränkung hiervon darstellen.

Beispiel 1

Herstellung von Zink modifizierten humanen Ultralentformulierungen

Humulin Ultralent (Lilly, Indianapolis, IN) und Ultralent (Rind) Insulin Extended Insulin Zinc Suspension USP (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), beide mit einer Stärke von 100 Insulineinheiten pro ml (E100) werden verwendet. Diese Formulierungen, die eine Gesamtzinkkonzentration von etwa 0,15 mg/ml enthalten, werden entweder direkt oder verdünnt auf eine Insulinstärke von E40 mittels Sterile Diluent for Uliralent Insulin (Lilly) verwendet, das 0.05 mg/ml Zink enthält. Zu vorher eingewogenen Proben an festem Zinkchlorid (EM Science, Cherry Hill, NT) werden direkt die E 100 oder E40 Lösungen der Ultralent-Insuline gegeben. Alternativ dazu werden zu E100 Formulierungen von Humulin Ultralent verschiedene Mengen an konzentrierten, nicht-pH eingestellten Lösungen von Zinkchlorid (100 mg/ml in Wasser) oder Zinkacetat (ii. Baker. Phillipsburg, NJ, 200 mg/ml in Wasser) gegeben. Die gesamten Zinkmengen werden entweder aus der Kombination der berechneten Zinkmengen im Insulin, dem Verdünnungsmittel und den Reagenzen abgeschützt oder experimentell durch Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt.

Beispiel 2

pH der mit Zink modifizirrten humanen Ultralentformulierungen

Die pH Werte von derzeitigen pharmazeutischen Fonnulierungen von Ultralent betragen alle etwa pH 7,4.
Die mit Zink modifizierten Formulierungen von Ultralent werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und ihre pH Werte werden bestimmt. Die Daten sind in der folgenden Tabelle III angegeben. Tabelle III
a Abschätzt
Es wird deutlich, daß die pH Werte dieser Formulierungen leicht abfallen, wenn das Zinkreagenz zugegeben wird. Die mit Zinkacetat hergestellten Proben zeigen einen geringeren pH Abfall verglichen mit Zinkchlorid. In weiteren hierin beschriebenen Beispielen werden außer für Beispiel 3B keine zusätzlichen pH Einstellungen bei Lösungen vorgenommen, die auf diese Weise hergestellt wurden.
Es wurde auch festgestellt, daß die Zugabe von kleinen Mengen an Natriumhydroxidlösungen zu diesen mit link versetzten Formulierungen nach der Zugabe der Zinkreagenzien vorgenommen werden können, um den pH etwas anzuheben. Die Einstellung der Formulierungen nach oben in Richtumg pH 7,4 durch die Zugabe von größeren Mengen an Natriumhydroxid verursacht jedoch eine unmittelbare Bildung von klumpigen Niederschlägen, vermutlich Zinklrydroxid-artig, die die Formulierungen für weitere Zwecke unbrauchbar machen. Andererseits verursacht die Zugabe von sauren Lösungen, wie Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure zur Verringerung des pH nach der Herstellung der mit Zink versetzten Ultralentformulierungen keine Niederschlagsprobleme, aber die HPLC Analysen der Überstände zeigen, daß ein kleiner zusätzlicher Prozentsatz der Ultralentkristalle während dieses Ansäuerungsprozesses löslich geworden ist. Die Ansäuerung mittels verdünnter E; ; sigsäure funktioniert am besten bei der ]vlinimierung oder Vermeidung der Auflösung des Insulins, wie in Beispiel JB. Daher sollte die Erfindung nicht nur auf den pH beschränkt werden, der entsteht, wenn ein spezifisches Zinkreagenz zugegeben wird, da kleine pH Einstellungen dieser mit Zink versetzten Ultralentsuspensionen zufriedenstellend durchgeführt werden können.

Beispiel 3

Zinkmengen in Zink modifizierten humanen Ultralentformulierimgen

A. Es werden drei mit Zink versetzte humane Ultralentformulierungen wie die Probe 8 in Beispiel 2 hergestellt. Ein ml jeder dieser drei Suspensionen mit einem geschätzten Zinkgehalt von 0,7 bis 2,5 mg pro 100 Insulineinheiten und eine unveränderte Humulin Ultralentinsulinfonnulierung werden per Hand für 30 Minuten bei 25ºC geschüttelt und dann bei 5ºC für 20 Stunden gelagert. Jede Suspension wird durch ein 0,2. um Acrocliscfiltere (Gelman Sciences, AnnArbor, MI) durchgedrückt. Das Filtrat wird mit 0,9 ml 0,1 N HCl verdlünnt. Die unslöslichen Kristalle, die auf dem Filter verbleiben, werden erneut durch langsames Durchpressen von 10 ml 0,1 N HCl durch jedes Filter gelöst. Die Zinkmengen in diesen Lösungen werden durch Atomabsorption bestimmt und auf die Zinkmengen in den ursprünglichen Formulierungsüberständen oder Insulinkristallen zurückgerechnet. Die Daten aus diesen Experimenten sind in Tabelle IV gezeigt. Tabelle IV
Dieses Experiment zeigt, daß das meiste des zusätzlich zugegebenen Zinks im Überstand bleibt und weder komplexiert noch kovalent mit den Insulinkristallen gebunden ist.
EL 20 ml einer Formulierung, die etwa 2,5 mg/ml Zink enthält, werden wie Probe 8 von Beispiel 2 hergestellt. Die Hälfte dieser Suspension (pH 6.81) wird nicht eingestellt belassen, während die andere Hälfte durch die Zugabe eines kleinen Volumens verdünnter Essigsäure auf pH 6,15 eingestellt wird. Die Suspensionen werden bei 5ºC gela- gert. Zu verschiedenen Zeiten werden die Zinkmengen in den Überständen und den unlöslichen Kristallen wie oben beschrieben bestimmt. Die Daten aus diesen Experimenten sind in der folgenden Tabelle V gezeigt. Tabelle V
Dieses Experiment zeigt, daß die pH Einstellungen mit verdünnter Essigsäure die Verteilung von Zink zwischen dem Überstand und den unlöslichen Insulinkristallen nicht verändert. Es zeigt auch, daß die Zinkverteilung sich während der Lagerung nicht signifikant verändert. Das meiste Zink verbleibt in der Überstandfraktion in beiden dieser Formulierungen.

Beispiel 4

Stabilität von Zink-modifizierten humanen Ultralentformulierungen

A. Mehrere mit Zink versetzte humane Ultralentformulierungen, die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurden, werden mikroskopisch bei einer 43 fachen Vergrößerung untersucht. Alle Suspensionen zeigen die typische rhombohedrische Form der Ultralentkristalle, die in unveränderten Formulierungen gefunden werden. Die Größen.
Formen und die Integrität der Kristalle in den mit Zink modifizierten Suspmsionen sind im wesentlichen von der unmodifizierten Suspension nicht zu unterscheiden. Das Vorkommen von signifikanten Mengen an fremdartigen, unlöslichen nicht-kristallinen Partikeln in diesen Formulierungen wird nicht detektiert.
Diese Formulierungen zeigen auch dieselben Aufwirbelungsmuster, wie unveränderte Ultralentformulielungen. Nach dem Aufwirbeln zeigen die kristallinen Suspensionen auch dieselben Absetzeigenschaften, wie unverändertes Ultralent sowohl bezüglich der Zeit, um ein vollständiges Absetzen der Kristalle zu erreichen, als auch des ungefähren Packvolumens der Kristalle.
3. Eine mit Zink versetzte Formulierung von humanem Ultralentinsulin, die etwa 7,5 mg/ml Zink enthält (ähnlich zu Probe 9 von Beispiel 2) wird hergestellt. Nicht modifiziertes Ultralent (Probe 7 von Beispiel 2) wird als Kontrolle verwendet. Beide Proben werden für etwa 1 Jahr bei 5ºC gelagert. Nach dieser Zeit werden die Insulinkristalle in verdünnter Chlorwasserstoffsäure rückgelöst und auf einem Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatograplüesystem (HPLC) auf Reinheit untersucht. Eine 4,6 · 250 mm Zorbax C-8 Säule, die Partikel mit 150 Å großen Poren enthält, wird bei 40ºC verwendet. Das Insulin wird bei einer Flußrate von 07 ml/min in einem Gradienten aus Acetonitril eluiert, worin 0,225 M Ammoniumsulfat bei etwa pH 2 enthalten sind.
Nach 1 Jahr beträgt die Reinheit des nicht modifizierten Ultralentinsulins 96,4% mit mehreren nicht identifizierten Peaks jeweils im 0,2% Bereich und dem A21-Desamidoinsulinpeak mit etwa 1%. Die Ultralentformulierung, die 7,5 mg/ml Zink enthält, zeigt nach 1 Jahr eine insgesamte Insulinreinheit von 96,8% mit mehreren nicht identifzierten Peaks im 0,1-0,2% Bereich und dem A21-Desamidoinsulinpeak mit etwa 1%. Ein neuer unbekannter Peak, der vor Insulin eluiert, aber nicht in der unmodifizierten Ultralentprobe beobachtet wird, ist mit einer Menge von 0,3% vorhanden.
Diese Experimente zeigen, daß die mit Zink modifizierten Formulierungen die Stabilität der Ultralentkristalle in Bezug auf ihre Größe und Form behalten. Ebenfalls verändern die großen Mengen an Zink in der Ultralentformulierung nicht signifikant die chemische Reinheit des Insulinmoleküls nach einer Lagerung für 1 Jahr bei SW.

Beispiel 5

Auflösungstest der Zusammensetzung

Dieser Test ist eine Modifizierung eines früher veröffentlichten Tests, den man in Graham und Pomeroy, J. Pharm. Pharmacol. 36, 427-430 (1983) findet, wobei die Beschreibung hiervon hiermit eingeführt ist. Er verwendet die Geschwindigkeit der Insulinkristallauflösung nach einer signifikanten Verdünnung mit einem nicht Zinkbindenden Puffer als Methode, die Geschwindigkeit vorherzusagen, mit der sich die kristalline Formulierung nach einer subkutanen Injektion in Tiere auflöst. Dies rührt daher, daß bei Insulinsuspensionen der Geschwindigkeitslimitierende Schritt, bei der Erzeugung der biologischen Reaktion vorwiegend die Auflösungsgeschwindigkeit des unlöslichen Insulins nach der Injektion ist. Daher kann man vorhersagen, daß eine Insulinfonnulierung, die sich in diesem Test langsamer als humanes Ultralent auflöst, wahrscheinlich in biologischen Modellen langsamer wirken wird.
Es werden drei mit Zink versetzte humane Ultralentformulierungen, die 0,35, 0,7 und 2,5 mg/ml Zink enthalten, auf eine Weise hergestellt, die ähnlich zu Probe 8 in Beispiel 2 ist. 0,5 ml Portionen dieser Suspensionen und 0,5 ml Portionen von unveränderten E100 Ultralentformulierungen vom Menschen und Rind werden jeweils zu 50 ml eines 0,1 M Trispuffers (Trishydroxvmethylaminomethan, Mallinckrodt, Paris, KY) mit pH 7,5 gegeben, der bei 25ºC in einem 80 ml Glasbecher gerührt wird. Nach 3 und 8 Stunden werden Aliquots der gerührten Suspensionen entnommen und durch ein 0.2 um Acrodisc® Filter gepreßt. Die Menge an Insulin im Filtrat wird durch Umkehrphasen-FeLC quantifiziert. Der maximale Insulingehalt wird durch HPLC eines unliltrierten, angesäuerten Aliquots bestimmt. Es existiert im wesentlichen kein aufgelöstes Insulin zu Beginn der Auflösungstests. Die Daten aus diesen Experimenten sind in der folgenden Tabelle VI gezeigt. Tabelle VI
Dieses Experiment zeigt, daß sich unverändertes humanes Ultralentinsulin viel schneller auflöst, als unverändertes Ultralentinsulin vom Rind. Es wurde auch gezeigt, daß die Zugabe. von Zink zum humanen!!T..lltralent bis zu einer Menge von et< va 0,7 mg pro 100 Insulineinheiten die Insulinkristalle dazu bringt, sich mit etwa derselben Geschwindigkeit aufzulösen, wie unverändertes Ultralent vom Rind. Wenn man das humane Ultralent mit einer Zinkmenge von etwa 2,5 mg pro 100 Insulineinheiten versetzt, weist es eine Auflösungsgeschwindigkeit auf, die sogar langsamer ist, als die von unverändertem Ultralentinsulin vom Rind.

Beispiel 6

Auflösungstest mit kontinuierlichem Fluß

Dieser Test ist eine Modifizierung der Durchflußtests, der vorher von Brange in Galenics of Insulin, Seite 46, Springer-Verlag, Berlin (1987) und Graham und Pomeroy, J. Pharm. Pharmacol. 36, 427-430 (1983) beschrieben wurde, wobei die Beschreibung hiervon hiermit eingeführt ist. 2 ml Aliquots von unverändertem Ultralentinsulin vom Mensch und Rind und eine Probe von humanem Ultralent, die etwa 0,7 mg Zink pro 100 Insulineinheiten enthält (wie in Beispiel 5 beschrieben), werden jeweils mit 48 ml eines 0, l M Trispuffers bei pH 7,5 verdünnt. Jede gesamte 50 ml Suspension wird unmittelbar durch ein 0,2 gm Acrodisc® Filter gepreßt und mit 5 ml Wasser gewaschen. Jedes Filter wird dann an den Elutionsauslaß eines FPLC Systems angeschlossen (Pharmacia, Piscataway, NJ). Frischer 0,1 M Tris pH 7,5 Puffer wird durch jedes Filter mit einer Flußrate von 2 ml pro Minute durchgepumpt. Die Absorption des Eluenten nach den Filtern wird kontinuierlich, spektroskopisch auf die Elution von Insulin für mehr als zwei Stunden bei einer Wellenlänge von 214 Nanometer verfolgt. Verschiedene Anteile der Eluenten werden auch durch Umkehrphasen-HPLC untersucht, um das Vorkommen von Insulin vom Mensch oder Rind zu bestätigen.
Das Insulin in Ultralentkristallen vom Rind wird nur sehr langsam im frischen Trispuffer aufgelöst. Die Elution des Rinderinsulins wird durch HPLC Analyse eines Teils des Eluenten bestätigt. Das Insulin in den unveränderten humanen Ultralentkristallen zeigt eine schnelle Auflösungsgeschwindigkeit die nach etwa 35 Minuten maximal ist und während dem ganzen Experiment bleibt eine relativ hohe Auflösung erhalten. Die humane Ultralentfornmlierung, die 0,7 mg/ml Zink enthält, zeigt eine Reaktion, die sehr ähnlich zur unveränderten humanen Ultralentprobe ist und nicht zur Formulierung vom Rind. Dies legt nahe, daß der frühe Filtrationsschritt im Test das gesamte ungebundene Zink aus dieser Formulierung entfernt und die verbleibenden Kristalle verhalten sich wie die unveränderten humanen Ultralentkristalle. Diese Daten zeigen auch dramatisch den inhärenten Unterschied in den Auflösungsgeschwindigkeiten von Insulinkristallen vom Menschen und Rind. Die Daten aus diesen Experimenten sind in der folgenden Tabelle VII angegeben. Tabelle VII Relative Absorption

Beispiel 7

Kaninchentests mit Ultralentformulierungen

Rinder-Ultralent- (E40) und humane Ultralentformulierungen mit einer Stärke von E40, die hergestellt werden, wie dies für die Proben 1-6 von Beispiel 2 gezeigt wird, werden in Dinem normalen Kaninchenmodell getestet. Die in diesem Beispiel verwendeten Kaninchen sind New Zealand Whites, vorwiegend weiblich, die alle 2,7-4 kg wiegen und 0,5 bis 4 Jahre alt sind und für 16 Stunden vor der Verabreichung der Probe gefastet haben. Die Insulinsuspensionen werden jeweils in 10 Kaninchen subkutan hinten am Nackm mit einer Dosis von 0,2 Einheiten pro Kilogramm injiziert. Zu verschiedenen Zeiten werden 100 ul Volumina Blut aus den marginalen Ohrvenen erhalten und mit einem Volumen 900 ul Antikoagulans (EDTA-Natriumfluorid) gemischt und auf den Glucosegehalt analysiert. Die Glucosewerte werden standardisiert, um prozentual die ursprüngliche Blutglucose widerzuspiegeln, die vor der Probeninjektion gemessen wurde. Die Daten aus diesen Experimenten sind in Tabelle VIII gezeigt. Tabelle VIII
Das Zeit-Wirkungsprofil im Kaninchenmodell ist viel kürzer als beim Menschen. Diese Zeit- Wirkungsverdichtung führt zur Unfähigkeit des Modells, einen signifikanten Unterschied zwischen den unveränderten Ultralentformulierungen vom Menschen und Rind zu zeigen (Probe 1 gegenüber 7). Trotz dieser Limitierung zeigt dieses Experiment, daß die biologische Wirkung von humanem Ultralentinsulin dramatisch verändert wird, wenn ausreichend Zink zur Formulierung gegeben wird. Wie in den Beispielen 4-6 gezeigt, wird das Einsetzen einer starken biologischen Reaktion über L Stunde verzögert, was einen Tiefstand zwischen 2 und 4 Stunden ergibt. Der maximale Abfall in der Blutglucose wird ebenfalls vermindert von etwa 40% in den Proben 1-3 (1 Stunde Tiefstand) auf nur etwa einen Abfall von 20% in den Proben 4-6 (2-4 Stunden Tiefstand). Daher zeigen die Formulierungen mit einem ausreichenden Zinkgehalt deutlich eine verlängerte Wirkzeit und sind viel langsamer, als die unveränderten Ultralentfonnulierungen vom Menschen oder Rind.

Claims

1. Humaninsulinformulierung, die eine Suspension aus Ultralent Insulinkristallen mit einer Zinkkonzentration der gesamten Formulierung zwischen 0,5 Milligramm bis 20 Milligramm pro 100 Einheiten Insulin enthält.

2. Insulinformulierung nach Anspruch 1, worin die Formulierung ferner Konservierungsstoffe enthält.

3. Insulinformulierung nach Anspruch 2, worin die Formulierung ferner Isotonizitätsmittel enthält.

4. Insulinformulierung nach Anspruch 3, worin die Formulierung ferner einen Puffer enthält.

5. Insuilinformulierung nach Anspruch 4, worin die Formulierung eine Zinlkkonzentration zwischen 0,5 Milligramm bis 7 Milligramm der gesamten Formulierung pro 100 Einheiten Insulin enthält.

6. Verfahren zur Herstellung der Insulinformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die die Kombination von Zink mit Ultralent Insulinkristallen umfaßt.

7. Verführen nach Anspruch 6, worin das verwendete Zink ein Zinksalz ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkiodid, Zinkfluorid und Zinksulfat.

8. Pharmazeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes mellitus bei Humanpatienten über subkutane Injektionen.