PT646379E

PT646379E - Formulacao de insulina

Info

Publication number: PT646379E
Application number: PT94305883T
Authority: PT
Inventors: James Arthur Hoffmann
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1993-08-13
Filing date: 1994-08-09
Publication date: 2002-03-28
Also published as: DK0646379T3; PL304600A1; ZA945939B; KR950005324A; PL177002B1; RU2135205C1; ES2164691T3; CN1109364A; NZ264197A; BR9403204A; CZ193794A3; YU50494A; DE69428860T2; UA27874C2; IL110581A0; AU7024794A; PH30757A; JPH07149660A; AU674975B2; EP0646379A1

Description

DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO DE INSULINA" O presente invento está no domínio da medicina humana, particularmente no tratamento de diabetes. Mais especificamente, o invento refere-se a formulações compreendendo a molécula de insulina humana que quando administrada, c mimicamente o mais próximo possível dos níveis basais da insulina encontrada no corpo humano normal.

Um objectivo terapêutico principal no tratamento de diabetes é o controlo fisiológico dos níveis de glucose do sangue. Muitos produtos comerciais e formulações diferentes estão disponíveis para este fim. Para o rápido crescimento provocado da glucose que ocorre na altura das refeições, os mais apropriados são os produtos de insulina que actuam rapidamente, tais como o Humulin Regular ou os assim designados análogos de unsulina monoméricos.

Outra fonte importante da carga de glucose em pacientes é o fornecimento dc glucose basal de baixo nível a partir do fígado. Este fornecimento resulta principalmente de processos metabólicos pós-prandiais tais como a gluconeogenése e a glicogenólise. Em sujeitos diabéticos, este fornecimento de glucose basal pode aumentar substancialmente à noite e resultar em largos períodos de hiperglicémia, especialmente durante as primeiras horas da manhã num incidente referido como o fenómeno do amanhecer. Estes períodos de hiperglicemia têm sido demonstrados como sendo um contribuinte importante para os elevados níveis de proteínas glicadas, frequentemente medidas clinicamente como hemoglobina glicosilada. O desenvolvimento destes produtos

de proteína derivatizada está implicado com complicações a longo teimo associadas a diabetes tais como neuropatia, nefropatia e retinopatia. A formulação de insulina ideal para tratar este fornecimento de glucose basal seria a que resultasse numa infusão lenta e estável de insulina na corrente sanguínea que correspondesse ao baixo nível de glucose que sai do fígado. Em termos deste tempo de acção basal ideal, o melhor produto parentérico que se ajusta a esta descrição é a comercialmente disponível insulina Ultralente bovina. Injectada apenas uma vez por dia, esta dá origem a uma baixa, estável libertação de insulina para a corrente sanguínea sem qualquer pico de insulina assinalável.

Um importante problema com insulina Ultralente bovina, contudo, surge do facto de que a insulina bovina é diferente na sequência de aminoácidos da insulina humana. O corpo humano pode reconhecer a insulina bovina como uma proteína estranha. A injecção crónica desta substância imunogénica em pacientes diabéticos pode resultar na formação de anticorpos em relação à insulina. Isto pode conduzir a alterações no tempo da acção e potência da insulina e a outros problemas que se levantam pelo sistema imunitário activado do paciente. Por estas razões a insulina Ultralente bovina permanece como uma formulação de insulina parentérica não ideal.

Diferenças de Espécies em Insulinas Ultralente O advento da tecnologia de recombinação do DNA e as novas técnicas enzimáticas para converter a insulina do porco em insulina humana resultaram ambas em abundantes fornecimentos da insulina humana que se tomaram disponíveis a partir do início de 1980. Para ultrapassar estes problemas associados à Ultralente bovina referida atrás, um passo lógico é a preparação de -3- -3- .1 «Ί ft í/%... 1/ i cristais de Ultralente humana e a sua formulação em formulações pai entéricas comercialmente disponíveis. As formas dos cristais, os formatos dos cristais, a dimensão dos cristais, o método de preparação e as composições da formulação de produtos de Ultralente humanos e bovinos são essencialmente idênticos.

Contudo, vários anos de experiência clínica conduziram a indicações definitivas de que estes produtos não eram idênticos. De facto, os relatórios clínicos indicaram que a Ultralente Humana era mais rápida a actuar do que a formulação de Ultralente bovina enquanto que foi demonstrado que a Ultralente de porco c intermédia em tempo de acção, entre as outras duas espécies. Na prática clínica isto conduziu a que muitos médicos e especialistas em diabetes recomendassem um protocolo de injecção de duas vezes por dia para a Ultralente humana. Adicionalmente, é observado um pico significativo de absorção de insulina na corrente sanguínea após 12 horas depois da administração subcutânea. Este fenómeno não apenas diminui a capacidade deste produto de contrariar o estável fornecimento de glucose basal do fígado, como também resulta em hiperinsulinemia que por si só pode conduzir a complicações macrovasculares.

As razões para as diferenças em tempo de acção entre os produtos de Ultralente humana c bovina não são completamente entendidos. A presença de anticorpos em relação á insulina bovina não é a causa primária para esta diferença em tempo de acção. Alguma investigação demonstrou que a insulina da Ultralente humana era mais rapidamente absorvida a partir do local de injecção do que a da Ultralente bovina. Um olhar mais profundo sobre esta questão é obtido a partir dos ensaios de dissolução descritos adiante neste fascículo de patente. Com base nas modificações dos testes previamente descritos, estes testes de dissolução demonstraram que o cristal de Ultralente bovina, por diluição, simplesmente demoram muito mais tempo a dissolver do que o comparável Μ -4- /

(U cristal de Ultralente humana. As diferenças nas sequências de aminoácidos entre a insulina humana e a bovina provavelmente geram pequenas diferenças no empacotamento do hexamero de insulina nos cristais o que resulta em diferença nas suas velocidades de solvatação subsequentes. Após injecção no tecido subcutâneo, este atraso na dissolução dos cristais bovinos provavelmente conduz à sua mais prolongada absorção e tempo de acção biológica. A síntese dos análogos de insulina humana é uma via através da qual tem sido explorado o prolongamento do tempo de acção. Em particular, as modificações tais como Gly^A21^Arg^B27^Thr-NH2^B30^ da insulina humana (Jorgensen et al.. British Medicai Journal 299. 415-419 (1989)) e modificações na posição Gh/313-* (Hansen, Biophvsical Chemistrv 39. 107-110 (1991)) foram feitas. Contudo, em cada um destes casos a introdução de uma nova sequência de aminoácidos toma a molécula estranha ao corpo humano e deste modo potencialmente tão imunogénica ou mesmo mais imunogénica do que a insulina bovina. É claro que usar a molécula de insulina humana natural será melhor do que a introdução de uma nova molécula de insulina. Em qualquer caso, não foram relatadas formulações de Ultralente humana enriquecidas com zinco nem meios de preparar tais formulações com o fim de prolongar o tempo de acção da formulação de Ultralente humana preferida, para equivaler ou melhorar o tempo de acção biológica da farmacocineticamente preferida formulação Ultralente bovina.

Zinco e Insulina

Sabe-se há muitos anos que a insulina pode ser co-cristalizada com sucesso com átomos de zinco para se obterem numerosos tipos de cristais estáveis com maiores tempos de acção que a insulina por cristalizar solúvel ou amorfa. A proteína de peixe protamina tem sido também usada como agente de complexação para prolongar o tempo de acção da insulina, mas a sua heterogeneidade e o potencial para a imunogenicidade toma-a menos atractiva como medicamento cronicamente administrado subcutaneamente.

No princípio dos anos 1950s foi desenvolvida uma nova formulação de insulina bovina que contém apenas insulina e zinco num tampão de acetato a pH neutro (Hallas-Moller, et al.. Science 116. 394-398 (1952)). Esta insulina de Lente evita que os iões fosfato, que interagem fortemente com os iões zinco, formem derivados de fosfato de zinco insolúveis. As formulações contendo apenas a insulina cristalina em tampão acetato são chamadas de Ultralente. Os cristais separados desta maneira serão aqui referidos como cristais de insulina Ultralente.

Embora apenas sejam necessários 2 átomos de zinco para serem complexados com cada hexamero de insulina para formar os cristais Ultralente apropriados, existe um excesso molar definido de zinco em cada formulação Ultralente e verificou-se que era adequado dar uma injecção de Ultralente bovina por tempo de acção diária (Schlichtkrull, em Insulin Crystals, Ejnar Munksgaard Publishers, Copenhaga (1958)). Este mesmo trabalho (p. 92) relatava, “Parece que a duração da acção é de algum modo encurtada quando a insulina de porco é substituída por insulina bovina na Ultralente. Em consequência, de modo a assegurar uma temporização constante das suspensões terapêuticas, é necessário sermos fiéis a uma e à mesma espécie ou a encontrar uma proporção fixa entre a insulina das diferentes espécies”. Similarmente, foi relatado que a insulina Ultralente de porco era mais rapidamente absorvida em diabéticos do que na insulina Ultralente bovina (Brange, em Galenics of Insulin. p. 28, Springer-Verlag, Berlin (1987)). Contudo, mesmo embora estas diferenças de espécies fossem verificadas, e a insulina de porco seja mais próxima da estrutura da insulina humana, e por isso menos imunogénica do que a insulina bovina, -6- possíveis alterações das formulações para prolongar o tempo de acção da Ultralente de porco, para a tomar equivalente a ou mais prolongada do que a Ultralente bovina, não foram nem demonstradas nem propostas. De facto, um relatório anterior (Hallas-Moller, Diabetes 5. 7-12 (1956)) sugere que os níveis de zinco acima de 0,2 mg por 100 unidades de insulina não auxiliam no prolongamento do tempo de acção das formulações de insulina Lente (ou Ultralente) de quaisquer espécies.

Aproximadamente 0,09 mg de zinco por 100 unidades de insulina são relatadas como se ligando aos cristais insolúveis de Ultralente bovina (14 átomos de zinco por hexamero de insulina) enquanto que uma concentração relativamente baixa de zinco, de cerca de 0,05 mg por ml, permanece por ligar no sobrenadante. Ambos estes níveis são projectados para permanecerem constantes mesmo quando a força da formulação de insulina aumenta de 40 U/ml para 100 U/ml (Brange, em Galenics of Insulin. p. 28, Springer-Verlag, Berlin (1987)).

Num recente fascículo de patente US (US 5,070,186) foi relatado que as formulações de insulina contendo uma elevada concentração (0,02-0,5 M) de outro catião metálico divalente, magnésio, resultavam em produtos de insulina de actuação mais rápida. Contudo, descobriu-se agora, surpreendentemente, que a adição dc cloreto ou de acetato de zinco sólido ou em soluções aquosas concentradas, diretamente à formulação de Ultralente humana, até uma concentração de zinco total final de cerca de 0,5 a 20 mg por 100 unidades de insulina, atrasa a dissolução dos cristais e pode prolongar o seu tempo de acção biológica, de modo a que seja tão lento ou mesmo mais lento do que a da Ultralente bovina. Descobriu-se também que esta modificação resultava numa queda concomitante de pH, desde um pH de cerca de 7,4 até um pH tão baixo como pH 6,2. Foi ainda descoberto que esta modificação resultava em que a maior parte do zinco adicionado residia no sobrenadante e sem estar ligado ao -7-

cristal de insulina insolúvel. Também nEo alterava signifiealivamente a forma ou o tamanho aparente dos cristais ou a estabilidade química da insulina nas formulações após certos períodos de armazenamento. O presente invento refere-se a uma formulação de insulina compreendendo compreendendo uma suspensão de cristais de insulina Ultralente com uma concentração de zinco na formulação total de entre cerca de 0,5 miligramas a cerca de 20 miligramas por 100 unidades de insulina. Mais do que cinquenta por cento do zinco total na formulação reside na fracção solúvel, em vez de estar no complexo com a insulina. Esta formulação de insulina possui geralmente um pH de entre cerca de 6,0 a cerca de 7,4. Esta formulação modificada com zinco apresenta características de um produto de insulina humana de muito longa duração.

Para os fins do presente invento, tal como aqui descrito e reivindicado, os seguintes termos e abreviações são como definidos abaixo.

Concentração de zinco da formulação total toda a concentração de zinco dentro da formulação, quer o referido zinco esteja complexado com a insulina quer esteja na forma solúvel.

Insulina Ultralente -formulações contendo cristais de insulina preparados em tampão acetato em acordo substancial com os ensinamentos de Hallas-Moller, et al. Science 116. 394-398 (1952). Os cristais preparados desta maneira serão referidos aqui como cristais de insulina Ultralente. U - unidade padrão internacional de actividade de insulina.

Zn - zinco. -8- 4|t h*.

L

Todas as abreviações de aminoávidos usadas nesta descrição são as aceites pelo Gabinete de Marcas e Patentes dos Estados Unidos, como apresentado em 37 C.F.R. §1,822 (b) (29 (1990). O presente invento está relacionado com uma formulação de insulina compreendendo uma suspensão de cristais Ultralente com uma concentração total de zinco na formulação de entre 0,5 miligramas até cerca de 20 miligramas por 100 unidades de insulina. Mais do que cinquenta por cento do zinco total da formulação reside na ffaeção solúvel, em vez de no complexo com a insulina. Esta formulação de insulina possui geralmente um pH de entre cerca de 6,0 até cerca de 7,4. Adicionalmente, a formulação de insulina do presente invento não contém outras proteínas como a protamina. A formulação pode conter agentes conservantes ou de isotonicidade e pode também conter um tampão que não interaja fortemente com o zinco. Esta formulação modificada com zinco apresenta características de um produto de insulina humana de longa duração.

As formulações do presente invento podem ser feitas por adição de zinco a suspensões previamente preparadas de cristais de insulina Ultralente ou por adição extra de zinco após o passo de cristalização do actual processo de fabrico de Ultralente. O zinco pode ser adicionado sob a forma sólida ou pode ser adicionado em solução. Altemativamcntc, pode ser adicionada uma suspensão de cristais de Ultralente ao zinco sólido ou à solução de zinco.Vários sais de zinco diferentes podem ser usados no presente invento. Exemplos representativos dos sais de zinco incluem acetato de zinco, brometo de zinco, cloreto de zinco, fluoreto de zinco, iodeto de zinco ou sulfato de zinco. Os peritos na matéria reconhecerão que há muitos outros sais de zinco que podem também ser usados na produção de formulações de insulina Ultralente modificadas com zinco do presente invento. Preferencialmente, o acetato de zinco ou o cloreto de zinco é usado para criar as formulações de insulina Ultralente modificadas com zinco do presente invento, uma vez que estes sais não adicionam novos iões químicos as formulações de Ultralente disponíveis. O invento aqui descrito, em consequência, é dirigido para um aumento substancial da concentração de zinco no sobrenadante das formulações de Ultralente humana sem modificar significativamente os próprios cristais de Ultralente. Verificou-se, surpreendentemente, que esta formulação de Ultralnte enriquecida em zinco pode atrasar a velocidade de dissolução dos cristais de insulina insolúveis e prolongar o tempo de acção biológica, em comparação com as formulações de Ultralente humana não modificadas.

Evitar uma modificação dramática do cristal de Ultralente pode ser importante por várias razões. Primeiro, as formulações de Ultralente têm sido usadas em administração crónica a diabéticos desde há 40 anos e a própria Ultralente humana desde há próximo de 10 anos. Em consequência, pode ser estabelecido um registo de segurança com estas novas formulações modificadas com zinco. Em segundo lugar, um aumento substancial do nível de zinco na complexação com os cristais de insulina pode conduzir a uma agregação dos cristais. Ao longo dos períodos de tempo, isto pode formar conglomerados na formulação o que a pode tomar não utilizável. Exames das formulações das insulina Ultralente humana modificadas com zinco descritas neste invento revelaram que não houve cristais de insulina significativamente modificados ou aglomerados. Finalmente, a modificação do cristal zinco-insulina pode conduzir à alteração da própria estrutura da insulina que pode alterar as suas propriedades biológicas ou mesmo a sua imunogenicidade. A concomitante queda do pH que ocorre na preparação destas formulações de Ultralente modificadas pode também ser importante. O aumento do nível dos iões de zinco solúveis é conhecido como aumentando a clivagem química da insulina entre os resíduos A8 (treonina) e A9 (serina), mesmo quando I -10-

,ιΒΙϊΒΒ*®!***,;' 4. *"Ά a insulina está presente sob a forma de cristais insolúveis (Brangc, ct al.. Pharmaceutical Research 9. 715-726 (1992)). O abaixamento ligeiro do pH das formulações de insulina, abaixo de pH 7, minimiza esta reacção de clivagem e deste modo a estabilidade a longo termo é melhorada. E também possível que esta queda de pH possa ser parcialmente responsável pela mteracção mínima do excesso de zinco com o cristal de insulina uma vez que as interacções das proteínas com o zinco são conhecidas como sendo reduzidas a pHs mais acídicos (Schlichtkrull, em Insulin Crvstals. Ejnar Munskgaard Publishers, Copenhaga (1958)).

As novas formulações de Ultralente humana modificadas com zinco descritas neste invento possuem vários atributos adicionais. O método de formulação pode ter lugar logo após a formulação de Ultralente humana original ter sido preparada. Vários níveis de zinco podem mesmo ser adicionados desta forma numa farmácia ou numa clínica e serem feitos à medida, dependendo do tempo de acção desejado, às necessidades dos pacientes individuais. Também não são necessários excipientes, agentes de complexação, químicos ou solventes orgânicos para estas formulações, de modo a que são evitadas preocupações no que diz respeito a toxicidade desconhecida da administração crónica de novas entidades químicas durante muitos anos. Finalmente, a gama de pH da solução final, pH a 6,0 a 7,4, é suficientemente próxima do pH do tecido subcutâneo (pH 7,4) pelo que não deve haver irritação. O presente invento proporciona formulações dos cristais de Ultralente humana adequados para tratar diabetes por injecção subcutânea, dando tais injecções uma lenta absorção da insulina de modo a que, se desejado, não seja necessário administrar mais do que uma injecção por dia. As formulações podem também conter um agente de conservação, tal como o metilparabeno, um agente de isotonicidade tal como o cloreto de sódio e um teor total de zinco de cerca de 0,5 a 20 mg por 100 unidades de insulina e o pH é de cerca de 6,0 a 7,4. -11 -

At ψ}λ, rh S Ί i*

Um perito na matéria reconhecerá que existem disponíveis muitos outros conservantes e agentes isotonicidade que podem ser usados no presente invento. Numa concretização preferida, a concentração total de zinco é de cerca de 0,5 a 7 mg por 100 unidades de insulina e o pH é de cerca de 6,2 a 7,2. Outra concretização preferida é um pH para todos os níveis de zinco que resulte na quantidade apropriada de cloreto de zinco sólido, acetato de zinco sólido ou uma solução aquosa concentrada destes reagentes que é adicionada a uma solução de Ultralente humana pré-formulada, ou seja, não são efectuados mais ajustes de pH.

Para comparação das concentrações de zinco e de insulina verificadas noutra literatura e em documentos de patentes, a Tabela I apresenta a equivalência de zinco e de insulina em combinação, enquanto que a Tabela II apresenta a equivalência de zinco em solução.

Tabela I

Combinação zinco/insulina mEq Zn/g de insulina %Zn em cristal de insulina anidro μΜ Ζη/μΜ de insulina μΜ Ζη/μΜ de hexamero insulina mg Zn/100 unidades de insulina μg (gama) Zn/unidade de insulina 0,12 0,38 0,33 2 0,013 0,13 0,31 1 0,90 5,4 0,035 0,35 0,89 2,75 2,51 15,1 0,1 1 2,66 8 7,75 46,5 0,3 3 4,43 12,7 12,8 77 0,5 5 66 68,5 192,5 1155 7,5 75 177 85,3 514,2 3086 20 200

Tabela II

Zinco em solução mEq Zn/1 % Zn mg Zn/ml mM Zn/1 0,306 0,001 0,01 0,153 0,612 0,002 0,02 0,306 1,53 0,005 0,05 0,765 3,06 0,01 0,1 1,53 6,12 0,02 0,2 3,06 15,3 0,05 0,5 7,65 30,6 0,1 1 15,3 61,2 0,2 2 30,6 153 0,5 5 76,5 306 1 10 153 612 2 20 306 São proporcionados os Exemplos seguintes como meio de ilustração do presente invento. Estes não são construídos como impondo a este uma limitação.

Exemplo 1

Preparação de Formulações de Ultralente Humana Modificadas com Zinco

Foram empregues Humulina Ultralente (Lilly, Indianapolis, IN) e Insulina Ultralente (bovina) Expandida com Suspensão de Insulina Zinco USP (Novo Nordisk, Bgsvaerd, Dinamarca), ambos com uma concentração de 100 unidades de insulina por ml (UI00). Estas formulações, contendo uma concentração total de zinco de cerca de 0,15 mg/ml, foram quer usadas directamente quer diluídas até uma concentração de U40 usando Diluente Estéril -13-

f

I

I para Insulina Ultralente (Lilly) que contém 0,05 mg/ml de zinco. A amostras pré-pesadas de cloreto de zinco sólido (EM Science, Cherry Hill, NJ) foram adicionadas directamente as soluções UI00 e U40 de insulinas Ultralente. Altemativamente, às formulações de UI00 de Humulina Ultralente foram adicionadas várias quantidades de soluções de cloreto de zinco concentradas sem ajuste de pH (100 mg/ml em água) ou de acetato de zinco (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, 200 mg/ml em água). Os níveis totais de zinco foram quer estimados a partir da combinação dos níveis de zinco calculados na insulina, diluente e reagentes quer determinados experimentalmente por espectroscopia de absorção atómica.

Exemplo 2 PH das Formulações de Ultralente Humana Modificada com Zinco

Os pHs das formulações farmacêuticas correntes de Ultralente eram todos cerca de pH 7,4. As formulações de Ultralente modificadas com zinco foram preparadas tal como descrito no Exemplo 1 e os seus pHs foram determinados. Os dados são apresentados abaixo na Tabela III.

Tabela 3

Amostra Concentração de insulina (U/ml) Método de Adição de Zn Reagente de Zn usado amg total final de Zn/ml formulação Mg Zn/100 u insulina PH Final 1 40 Nenhum Nenhum 0,09 0,23 7,38 2 40 Sólido Cloreto 0,25 0,63 7,30 3 40 Sólido Cloreto 0,59 1,48 7,03 4 40 Sólido Cloreto 1,09 2,73 6,80 5 40 Sólido Cloreto 2,40 6,00 6,75 6 40 Sólido Cloreto 7,31 18,28 6,34 7 100 Nenhum Nenhum 0,15 0,15 7,37 8 100 Sólido Cloreto 2,60 2,60 6,84 9 100 Sólido Cloreto 7,40 7,40 6,41 10 100 Sólido Cloreto 12,20 12,20 6,21 11 97 Aquoso Cloreto 1,59 1,64 6,80 12 94 Aquoso Cloreto 2,92 3,11 6,73 13 93 Aquoso Cloreto 3,81 4,10 6,63 14 91 Aquoso Cloreto 4,55 5,00 6,59 15 83 Aquoso Cloreto 8,18 9,86 6,41 16 91 Aquoso Acetato 5,60 6,15 6,75 17 83 Aquoso Acetato 10,09 12,16 6,51 aEstimado

De modo claro, os pHs destas formulações descem ligeiramente à medida que o reagente de zinco é adicionado. As amostras preparadas com acetato de zinco mostraram uma menor queda do pH quando comparado com cloreto de zinco. Outros exemplos aqui descritos, excepto para o Exemplo B, não foram cfcctuados ajustes dc pH para as soluções preparadas desta maneira.

Verificou-se, também, que a adição de quantidades diminutas de soluções de hidróxido de sódio a estas formulações fortificadas com zinco, após adição de reagentes de zinco, pode ser efectuada para levantar o pH em pequeno grau. O ajuste das formulações até um pH de 7,4 por adição de maiores quantidades de hidróxido de sódio provoca, contudo, uma formação imediata de precipitados de agregados, presumivelmente espécies do tipo hidróxido de zinco, que tomaram as formulações não usáveis para fins adicionais. Por outro lado, a adição de soluções acídicas como o ácido clorídrico ou ácido acético para baixar o pH após a preparação de Ultralentes modificadas com zinco não provoca quaisquer problemas de precipitação, mas as análises de HPLC dos sobrenadantes revelou uma pequena percentagem adicional de cristais de Ultralente que se tinham solubilizado durante o processo de acidificação. A acidificação usando ácido acético diluído funcionava melhor para minimização ou eliminação da solubilização da insulina, tal como no Exemplo 3B. Em consequência, uma vez que menores ajustes de pH destas suspensões de Ultralente fortificadas com zinco podem ser satisfatoriamente efectuados, este invento não deve ser limitado ao único pH que resulta quando é adicionado um reagente de zinco específico.

Exemplo 3 Níveis de Zinco em formulações de Ultralente Humana Modificada com Zinco A. Três formulações de Ultralente humana fortificada com zinco foram preparadas tal como na Amostra 8 do Exemplo 2. Um ml de cada uma destas três suspensões, que estimavam níveis de zinco totais de 0,7 a 2,5 mg por 100 unidades de insulina, c uma formulação dc insulina Humulina Ultralente inalterada foram agitadas à mão durante 30 minutos a 25°C, e então armazenadas a 5°C durante 20 horas. Cada suspensão foi então feita passar num filtro de 0,2 micron Acrodisc® (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). O filtrado foi diluído com 9 ml de HC1 0,1N. Os cristais insolúveis que permaneceram no filtro foram redissolvidos com passagem lenta de 10 ml de HC1 0,1 N através de cada filtro.

Os níveis de zinco nestas soluções foram determinadas por absorção atómica e calculadas em relação aos níveis de zinco nos sobrenadantes da formulação original ou cristais de insulina. Os dados destas experiências são apresentados na Tabela IV.

Tabela IV

Amostra mg/ml Zinco ligado mg/ml Zinco livre Percentagem de Zinco total no sobrenadante 1 0,12 0,07 36,8% 2 0,19 0,63 76,8% 3 0,18 1,30 87,8% 4 0,20 2,60 92,9%

Esta experiência mostrou que muito do zinco extra adicionado permanecia no sobrenadante e não estava quer complexado quer covalentemente ligado aos cristais de insulina. B. 20 ml de uma formulação contendo cerca de 2,5 mg/ml de zinco foi preparada tal como na Amostra 8 do Exemplo 2. Metade desta suspensão (pH 6,81) foi deixada por ajustar, enquanto que a outra foi ajustada a pH 6,15 por adição de um pequeno volume de ácido acético diluído. As suspensões foram armazenadas a 5°C. Em vários períodos, os níveis de zinco nos sobrenadantes e nos cristais insolúveis foram determinados tal como descrito acima. Os dados destas experiências são apresentados na Tabela V abaixo.

Tabela V

Dias a 5°C mg/ml de zinco ligado mg/ml de zinco livre Percentagem de Zn total no sobrenadante 0 0,27 2,18 89,0% 2 0,26 2,75 91,4% 4 0,37 2,14 85,3% Amostra 7 0,39 2,50 86,5% apH 6,81 10 0,35 2,50 87,7% 15 0,42 2,25 84,3% 21 0,36 2,75 88,4% 28 0,35 3,25 90,3% 0 0,29 2,14 88,1% 2 0,28 2,18 88,6% 4 0,25 2,12 89,4% 7 0,40 2,50 86,2% Amostra 10 0,30 3,00 90,9% ApH 6,15 15 0,33 2,50 88,3% 21 0,35 2,50 87,7% 28 0,33 2,75 89,3%

Esta experiência mostrou que o ajuste de pH com ácido acético diluído não alterou a distribuição de zinco entre o sobrenadante e os cristais de insulina insolúveis. Demonstrou também que a distribuição de zinco não se alterava significativamente durante o armazenamento. A maior parte do zinco permanecia na fracção sobrenadante em ambas estas formulações.

Exemplo 4

Estabilidade de Formulações de Ultralente Humana Modificada com Zinco A. Várias formulações de Ultralente humana fortificada com zinco, preparadas tal como descrito no Exemplo 2, foram examinadas microscopicamente com um aumento de 43X. Todas as suspensões mostraram a forma romboédrica típica dos cristais de Ultralente verificada nas formulações não alteradas. As dimensões, formas e integridade dos cristais nas suspensões modificadas com zinco eram virtualmente indistinguíveis das da suspensão não modificada. A presença de quantidades significativas de partículas estranhas não cristalinas insolúveis nestas formulações não foi detectada.

As formulações mostraram também os mesmos padrões de redemoinho que as formulações Ultralente inalteradas. Após agitação, as suspensões cristalinas mostraram também as mesmas características de assentamento que as de Ultralente inalteradas, ambas em termos de tempo para se alcançar a completa sedimentação dos cristais e do volume de empacotamento aproximado dos cristais. B. Foi preparada uma formulação de insulina Ultralente humana fortificada com zinco contendo cerca de 7,5 mg/ml de zinco (semelhante à amostra 9 do Exemplo 2). Foi usada Ultralente não modificada (Amostra 7 do Exemplo 2) como controlo. Ambas as amostras foram armazenadas a 5°C durante aproximadamente 1 ano. Nesta altura, os cristais de insulina foram redíssolvidos em ácido clorídrico diluído e avaliados no que respeita à pureza num sistema de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de fase reversa. Foi empregue uma coluna 4,6 x 250 mm Zorbax C-8 contendo partículas com uma tamanho de poro de 150 angstrom a 40°C. A insulina foi eluída com um caudal de 0,7 ml/min com um gradiente de acetonitrilo contendo 0,225 M de sulfato de amónio a cerca de pH 2. - 19-

Após 1 ano, a pureza da insulina Ultralente não modificada era de 96,4%, com vários picos não identificados na gama de 0,2% cada e um pico de A21desamido insulina a cerca de 1%. A formulação de Ultralente contendo 7,5 mg/ml de zinco após 1 ano mostrou uma pureza de insulina global de 96,8%, com vários picos por identificar na gama de 0,1-0,2% e um pico de A21desamido insulina a cerca de 1%. Um novo pico desconhecido que foi eluído antes da insulina mas que não foi visto na amostra de Ultralente não modificada estava presente com um nível de 0,3%.

Estas experiências demonstraram que as formulações modificadas com zinco mantêm a estabilidade dos cristais de Ultralente em termos do seu tamanho e forma. Também se verificou que o facto de existiram altos níveis de zinco na formulação Ultralente não alterava significativamente a pureza química da molécula de insulina após armazenamento depois de um ano a 5°C.

Exemplo 5

Ensaio de Dissolução de Compósito

Este ensaio é uma modificação de um ensaio anteriormente publicado em Graham e Pomeroy, J. Pharm- Pharmacol. 36, 437-430 (1983), cujos ensinamentos são aqui incorporados como referência. Este usa uma velocidade de dissolução de cristais de insulina após uma diluição significativa com um tampão que não se ligue ao zinco como modo de prever a velocidade a que a formulação cristalina se dissolverá após injecção subcutânea em animais. Isto é feito assim porque, para as suspensões de insulina, o passo limitante da velocidade na geração da resposta biológica é predominantemente a velocidade de diluição da insulina insolúvel após injecção. Em consequência, pode-se prever que uma formulação de insulina que se dissolve mais lentamente neste ensaio comparada com a Ultralente humana, do mesmo modo, actuará mais lentamente em modelos biológicos.

Três formulações de Ultralente humana fortificadas com zinco contendo 0,35, 0,7 e 2,5 mg/ml de zinco foram preparadas de um modo semelhante à Amostra 8 do Exemplo 2. Porções de 0,5 ml destas suspensões e porções de 0,5 ml de formulações Ultralente UI00 humana e bovina inalteradas, foram cada uma adicionadas a 50 ml de um tampão 0,1M tris (tris-hidroximetilaminometano, mallinckrodt, Paris, KY), pH 7,5 sendo agitado a 25°C numa proveta dc 80 ml. Aos tempos de 3 e 8 horas, foram removidas aliqiiotas das suspensões agitadas e feitas passar através de um filtro de 0,2 micron Acrodisc®. A quantidade de insulina no filtrado foi quantificada por HPLC de fase reversa. O teor de insulina máximo foi determinado por HPLC de uma aliquota não filtrada acidificada. Havia essencialmente insulina não solubilizada no início dos ensaios de disolução. Os dados destas experiências são apresentados na Tabela VI abaixo.

Tabela VI

Espécie Ultralente mg/ml do nível de Percentagem de Percentagem de zinco estimado insulina solúvel insulina solúvel _máximo (3 horas) máximo (8 horas)

Humana 0,15 16,3% 44,7% Humana 0,35 4,5% 10,7% Humana 0,70 2,4% 6,3% Humana 2,50 1,1% 3,2% Bovina 0,15 3,2% 6,2%

Esta experiência demonstrou que a Ultralente humana inalterada se redissolve muito mais rapidamente do que a Ultralente bovina inalterada. Demonstra também que a adição de zinco à Ultralente humana, até um nível de cerca de 0,7 mg por 100 unidades de insulina, toma os cristais insolúveis a dissolverem-se com cerca da mesma velocidade que a da Ultralente bovina inalterada. Ao dar-se à Ultralente humana um nível de zinco de cerca de 2,5 mg por 100 unidades de insulina este aspecto confere-lhe uma velocidade de dissolução ainda mais baixa do que a da insulina Ultralente bovina inalterada.

Exemplo 5

Ensaio de Dissolução de Fluxo contínuo

Este ensaio é uma modificação dos testes de passagem de fluxo relatados anteriormente por Brange, em Galenics of Insulin. p. 46, Springer-Verlag, Berlin (1987) e Graham e Pomeroy, J. Pharm. Pharmacol. 36, 427-430 (1983), cujos ensinamentos são aqui incorporados como referência. Aliquotas de 2 ml de insulina Ultralente humana e bovina inalterada e uma amostra de Ultralente humana contendo cerca de 0,7 mg de zinco por 100 unidades de insulina (tal como descrito no Exemplo 5) foram cada uma diluídas com 48 ml de tampão tris 0,1M a pH 7,5. Cada suspensão inteira de 50 ml foi imediatamente feita passar através de um filtro de 0,2 micron Acrodisc® e lavada com 5 ml de água. Cada filtro foi então colocado em linha com a tubagem de eluente de um sistema FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ). Tampão tris 0,1M a pH 7,5 fresco foi bombado através de cada filtro com um caudal de 2 ml por minuto. A absorvância do eluente, passados os filtros, foi continuamente monitorizada espectroscopicamente em relação à eluição da insulina durante mais do que duas horas com um comprimento de onda de 214 nanómetros. Várias porções dos eluentes foram também examinadas por HPLC de fase reversa para confirmar a presença da insulina humana ou bovina. -22- . I ui A insulina dos uris lais de Ullralenle bovina era apenas rnuilo lentamente dissolvida no tampão tris fresco. A eluição da insulina bovina foi confirmada por análise por HPLC de uma porção de eluente. A insulina nos cristais de Ultralente humana mostrou uma velocidade rápida de dissolução com um pico a cerca de 35 minutos e mantinha uma relativamente elevada dissolução ao longo da experiência. A formulação de Ultralente humana contendo 0,7 mg/ml de zinco apresentava uma resposta muito semelhante à da amostra de Ultralente humana inalterada, e não à da formulação bovina. Isto sugere que o passo anterior de filtração no ensaio removia todo o zinco não ligado desta formulação e os cristais remanescentes comportavam-se como os cristais de Ultralente humana inalterada. Estes dados demonstram também dramaticamente a diferença inerente nas velocidades de dissolução dos cristais de insulina humana e bovina. Os dados destas experiências são apresentados abaixo na Tabela VII.

Tabela VII

ABSORVÂNCIA RELATIVA TEMPO (minutos) Ultralente BOVINA Ultralente HUMANA Ultralente HUMANA 0,7 mg/ml Zn 0 0 0 0 2,5 12,5 3,5 12,5 5 9,0 8,0 11,5 10 8,0 23,0 19,0 15 7,8 38,0 31,7 20 7,9 52,0 45,0 25 8,0 59,0 60,0 -23- yf Η - ii Λ ' 30 7,4 63,0 72,0 35 8,1 64,0 79,5 40 8,0 61,0 79,0 45 8,3 57,5 73,0 50 7,8 52,0 68,0 55 8,2 45,5 60,0 60 8,5 40,0 52,2 65 8,5 36,0 45,5 70 8,8 31,5 39,5 75 9,0 29,5 36,3 80 9,7 26,0 25,0 90 9,6 23,0 22,1 100 10,4 20,2 22,1 110 11,0 18,5 24,3 120 11,2 16,6 24,0 130 12,0 15,1 21,6

Exemplo 7

Ensaios de Formulações de Ultralente em Coelhos

Formulações de Ultralente bovina (U40) e humana, de concentração U40, preparadas tal como apresentado para as Amostras 1-6 do Exemplo 2, foram testadas com um modelo normal para coelhos. Os coelhos usados neste exemplo eram coelhos brancos da Nova Zelândia, sobretudo fêmeas, pesando todos 2,7-4 kg, com uma idade de 0,5-4 anos e presos 16 horas antes da administração da amostra. As suspensões de insulina foram cada uma injectada em 10 coelhos subcutaneamente na parte de trás do pescoço com uma -24- -24- /

ν </'5 ’ΐ^,' dosagem de 0,2 unidades por quilograma. Em vários períodos, foram oblidos 100 μΐ volumes de sangue a partir das veias marginais das orelhas, misturado com 900 μΐ volumes de anticoagulante (EDTA-fluoreto de sódio) e analisado em relação ao teor de glucose. Os valores de glucose foram padronizados para reflectir a percentagem original de glucose no sangue medida antes da injecção da amostra. Os dados destas experiências são apresentados na Tabela VIII.

Tabela VIII

Espécie de mg/ml % Original de Glucose no Sangue

Ultralente nível de zinco Horas após injecção

Amostra estimado 12 3 4 1 Humana 0,09 60,6 65,2 89,0 90,4 2 Humana 0,25 56,7 67,8 91,4 91,4 3 Humana 0,59 60,4 58,9 78,1 85,5 4 Humana 1,07 81,8 78,6 95,2 95,6 5 Humana 2,40 92,8 80,9 80,3 88,6 6 Humana 7,31 96,0 84,1 80,9 85,9 7 Bovina 0,15 60,1 68,7 96,7 95,7 O perfil de tempo de acção no modelo de coelho é muito mais curto do que nos humanos. Esta compressão do tempo de acção conduziu à inabilidade deste modelo para mostrar uma diferença significativa entre as formulações de Ultralente humana e bovina inalteradas (Amostra l.vs.7). Apesar desta limitação, esta experiência demonstra que a acção biológica da insulina Ultralente humana é dramaticamente alterada quando é adicionado suficiente zinco à formulação. -25-

Como é mostrado nas Amostras 4-6, o início de uma forte resposta biológica é atrasado para lá de 1 hora, tendo um ponto mais baixo entre 2 a 4 horas. A queda máxima da glucose no sangue é também diminuída, em cerca de 40% nas Amostras 1-3 (ponto mais baixo 1 hora) a apenas uma queda de cerca de 20% nas Amostras 4-6 (ponto mais baixo 2-4 horas). Em consequência, as formulações com suficiente teor de zinco apresentaram claramente um tempo de acção prolongado muito mais lento do que quer as formulações de Ultralente humana quer bovina.

Lisboa, 13 de Dezembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Formulação de insulina humana compreendendo uma suspensão de cristais de insulina Ultralente com uma concentração total de zinco na formulação de entre 0,5 miligramas a 20 miligramas por 100 unidades de insulina.
2. Formulação de insulina da reivindicação 1, em que a formulação compreende ainda conservantes.
3. Formulação de insulina da reivindicação 2, em que a formulação compreende ainda agentes de isotonicidade.
4. Formulação de insulina da reivindicação 3, em que a formulação compreende ainda um tampão.
5. Formulação de insulina da reivindicação 4, em que a formulação compreende uma concentração total de zinco na formulação de entre 0,5 miligramas a 7 miligramas por 100 unidades de insulina.
6. Processo para a preparação de uma formulação de insulina tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que compreende a combinação de zinco com cristais de insulina Ultralente.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o zinco usado é um sal de zinco seleccionado do grupo constituído por acetato de zinco, brometo de zinco, cloreto de zinco, iodeto de zinco, fluoreto de zinco e sulfato de zinco. - 2-
8. Formulação farmacêutica tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para uso no tratamento da diabetes mellitus, em pacientes humanos, através de injecções subcutâneas. Lisboa, 13 de Dezembro de 2001 l -1 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR COKUON, 14 1200 LISBOA