ES2664189T3

ES2664189T3 - Polimorfos de 4-(4-cloro-2-hidroxibenzoil)aminobutanoato de sodio

Info

Publication number: ES2664189T3
Application number: ES03719286.1T
Authority: ES
Inventors: Satej Bhandarkar; Shingai Majuru; Halina Leuchyk
Original assignee: Emisphere Technologies Inc
Current assignee: Emisphere Technologies Inc
Priority date: 2002-01-09
Filing date: 2003-01-09
Publication date: 2018-04-18
Anticipated expiration: 2023-01-09
Also published as: US20080033204A1; US20050272639A1; US7893297B2; US7208178B2; JP2005520803A; US7420085B2; US20090010882A1; WO2003057650A2; WO2003057650A3; JP4508646B2; ES2412306T3; US20070161708A1; US7462368B2; EP1469827A4; US20050250852A1; CA2471144A1; EP2272501B1; AU2003223158B2; EP2272501A1; HK1153136A1

Abstract

Polimorfo cristalino de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino]butanoato de sodio anhidro de la forma I que presenta un espectro de difracción de rayos X de polvo que tiene picos en grados 2θ ± 0,2º 2θ a 5,2, 11,2, 15,7, 18,5, 20,1, 21,8, 23,4, 23,8, 26,9 y 29,8.

Description

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La composición o el sistema de administración pueden incluir el de 4-CNAB de sodio amorfo de la presente invención y estar sustancialmente libres o completamente libres de otros polimorfos de 4-CNAB de sodio. Por ejemplo, la composición puede contener la forma amorfa de 4-CNAB de sodio en forma sustancialmente pura. Los términos “sustancialmente libre” y “sustancialmente puro” incluyen aquellas composiciones y sistemas de administración que contienen menos del 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1 o el 2% en peso de otros polimorfos basado en el peso total de composición o el sistema de administración (o alternativamente basado en el peso total de 4-CNAB y sales del mismo o basado en el peso total de 4-CNAB cristalino y sales del mismo o basado en el peso total de 4-CNAB de sodio) en la composición o el sistema de administración).

Agentes activos

Los agentes activos adecuados para su uso en la presente invención incluyen agentes biológicamente activos y agentes químicamente activos, incluyendo, pero sin limitarse a, pesticidas, agentes farmacológicos y agentes terapéuticos.

Por ejemplo, los agentes biológica o químicamente activos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas; polipéptidos; péptidos; hormonas; polisacáridos, y particularmente mezclas de mucopolisacáridos; hidratos de carbono; lípidos; otros compuestos orgánicos; y particularmente compuestos que por sí mismos no atraviesan (o que solo atraviesa una fracción de la dosis administrada) la mucosa gastrointestinal y/o son susceptibles de escisión química mediante ácidos y enzimas en el tracto gastrointestinal; o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos adicionales incluyen, pero no se limitan a, los siguientes, incluyendo fuentes sintéticas, naturales o recombinantes de los mismos: hormonas de crecimiento, incluyendo hormonas de crecimiento humanas (hGH), hormonas de crecimiento humanas recombinantes (rhGH), hormonas de crecimiento bovinas y hormonas de crecimiento porcinas; hormonas liberadoras de hormona de crecimiento; interferones, incluyendo ,  y ; interleucina-1; interleucina-2; insulina, incluyendo porcina, bovina, humana y recombinante humana, opcionalmente que tiene contraiones incluyendo sodio, zinc, calcio y amonio; factor de crecimiento similar a insulina, incluyendo IGF-1; heparina, incluyendo heparina no fraccionada, heparinoides, dermatanos, condroitinas, heparina de bajo peso molecular, heparina de muy bajo peso molecular y heparina de ultra bajo peso molecular; calcitonina, incluyendo de salmón, anguila, porcina y humana; eritropoyetina; factor natriurético auricular; antígenos; anticuerpos monoclonales; somatostatina; inhibidores de proteasa; adrenocorticotropina, hormona liberadora de gonadotropina; oxitocina; hormona liberadora de hormona leutinizante; hormona estimulante del folículo; glucocerebrosidasa; trombopoyetina; filgrastim; prostaglandinas; ciclosporina; vasopresina; cromoglicato de sodio (cromoglicato de sodio o de disodio); vancomicina; desferrioxamina (DFO); hormona paratiroidea (PTH), incluyendo sus fragmentos; antimicrobianos, incluyendo agentes antifúngicos; vitaminas; análogos, fragmentos, miméticos o derivados modificados con polietilenglicol (PEG) de estos compuestos; o cualquier combinación de los mismos: se describen otras formas adecuadas de insulina, incluyendo, pero sin limitarse a, formas sintéticas de insulina, en las patentes estadounidenses n.os 4.421.685, 5.474.978 y 5.534.488.

Sistemas de administración

Las composiciones de la presente invención comprenden (a) una o más de las formas I, II, III, y IV y V de 4-CNAB de sodio o la forma amorfa de 4-CNAB de sodio y (b) uno o más agentes activos. En una realización, el agente de administración se mezcla con el agente activo antes de la administración.

Las composiciones de administración pueden estar en forma de un líquido. Tales líquidos incluyen normalmente un vehículo de dosificación. El vehículo de dosificación puede ser agua (por ejemplo, para calcitonina de salmón, hormona paratiroidea y eritropoyetina), propilenglicol acuoso al 25% (por ejemplo, para heparina) y tampón fosfato (por ejemplo, para rhGH). Otros vehículos de dosificación incluyen polietilenglicoles, sorbitol, maltitol y sacarosa. Pueden prepararse disoluciones de dosificación mezclando una disolución del compuesto agente de administración con una disolución del agente activo, justo antes de la administración. Alternativamente, una disolución del agente de administración (o agente activo) puede mezclarse con la forma sólida del agente activo (o agente de administración). El compuesto agente de administración y el agente activo también pueden mezclarse como polvos secos. El compuesto agente de administración y el agente activo también pueden mezclarse durante el procedimiento de fabricación.

Las disoluciones de dosificación pueden contener opcionalmente aditivos tales como sales de tampón fosfato, ácido cítrico, glicoles u otros agentes dispersantes. Pueden incorporarse aditivos de estabilización en la disolución, preferiblemente a una concentración que oscila entre aproximadamente el 0,1 y el 20% (p/v).

Las composiciones de administración pueden estar alternativamente en forma de un sólido, tal como un comprimido, una cápsula o partícula, tal como un polvo o sobre. Pueden prepararse formas de dosificación sólidas mezclando la forma sólida del compuesto con la forma sólida del agente activo. Alternativamente, puede obtenerse un sólido puede a partir de una disolución de compuesto y agente activo mediante métodos conocidos en la técnica, tales como secado por congelación, precipitación, cristalización y dispersión sólida.

Las composiciones de administración de la presente invención también pueden incluir uno o más inhibidores enzimáticos. Tales inhibidores enzimáticos incluyen, pero no se limitan a, compuestos tales como actinonina o

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circulación. La biodisponibilidad del agente se evalúa fácilmente midiendo una actividad farmacológica conocida en sangre, por ejemplo un aumento del tiempo de coagulación sanguínea provocado por heparina, o una disminución de los niveles de calcio circulantes provocada por calcitonina. Alternativamente, pueden medirse directamente los niveles circulantes del propio agente activo.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitación. Todas las partes se facilitan en peso a menos que se indique de otro modo.

DSC

Se determinaron los puntos de fusión citados mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Se obtuvieron los valores indicados con el software Pyris 1 de Perkin Elmer para Windows. Se calibró el instrumento para la temperatura usando los puntos de fusión del iridio y el zinc, y para la entalpía usando la entalpía de fusión del indio. Se realizaron comprobaciones de calibración de modo rutinario usando un patrón de indio. Se sellaron las muestras en un recipiente de aluminio con una tapa engarzada que tenía un orificio minúsculo en la misma. Entonces se calentaron las muestras en una atmósfera de nitrógeno de desde 30 hasta 250ºC a 10ºC/min. Se trituraron ligeramente con mano y mortero muestras no molidas antes del análisis para mejorar el contacto térmico con las superficies del recipiente de muestra.

XRPD

Se realizó el análisis de difracción de rayos X de polvo usando un difractómetro de polvo XRD-6000 de Shimadzu, disponible de Shimadzu Scientific Instruments, Inc. de Columbia, MD. Se calibró el instrumento usando polvo de silicio, y se encontró que la calibración era correcta cuando se sometió a prueba con un patrón de difracción de bajo ángulo n.º 675 de NIST. Se iluminaron las muestras con radiación K de Cu ( = 1,54056 Å). Se trituraron ligeramente con mano y mortero muestras no molidas de modo que pudiera prepararse una muestra para análisis con una superficie lisa, uniforme. Se usó el espectro de difracción entre 2 y 40º 2 como región de huella dactilar para identificar la estructura cristalina presente en los lotes.

Análisis termogravimétrico (TGA)

Se llevó a cabo un análisis termogravimétrico de 4-CNAB de sodio usando un analizador termogravimétrico TGA7 de Perkin-Elmer con el software Pyris 1 para Windows. Se calibró el instrumento para la temperatura usando los puntos de Curie del alumel y el estaño. Se calentaron las muestras en una atmósfera de nitrógeno desde 30 hasta 300ºC y se registró el porcentaje de cambio en peso en función de la temperatura. Se trituraron ligeramente con mano y mortero los lotes no molidos antes del análisis para mejorar el contacto con las superficies interiores del portamuestras de platino.

Comportamiento de sorción-desorción de agua

Se llevó a cabo un análisis de sorción usando un analizador de sorción de vapor simétrico SGA-100 (disponible de VTI Corporation de Hialeah, Florida). Se calibró el instrumento usando PVP y NaCl. Se secaron las muestras hasta peso constante a 60ºC antes del análisis. Se determinó el contenido de agua de equilibrio de la muestra desde el 5% de humedad relativa (HR) hasta el 95% de HR y luego de vuelta al 5% de HR a 25ºC.

FTIR

Se realizó FTIR en un instrumento Spectrum BX FT-IR de Perkin Elmer usando pastillas de KBr. Se dispersó 1 mg de muestra en 150 mg de KBr. La resolución fue de 4 cm-1 y se promediaron 32 barridos.

Ejemplo 1. Preparación de compuestos

1a. Preparación del ácido libre de 4-CNAB

Se añadió ácido 4-clorosalicílico (10,0 g, 0,0579 mol) a un matraz de fondo redondo de 250 ml de una boca que contenía aproximadamente 50 ml de cloruro de metileno. Se comenzó la agitación y se continuó durante la parte restante de la reacción. Se añadió el agente de acoplamiento 1,1-carbonildiimidazol (9,39 g, 0,0579 mol) como un sólido en porciones al matraz. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos después de haberse añadido la totalidad del agente de acoplamiento y luego se añadió clorhidrato de 4aminobutirato de etilo (9,7 g, 0,0579 mol) a matraz con agitación. Se añadió trietilamina (10,49 ml, 0,0752 mol) gota a gota desde un embudo de adición. Se enjuagó el embudo de adición con cloruro de metileno. Se permitió que agitase la reacción a temperatura ambiente durante la noche.

Se vertió la reacción en un embudo de decantación y se lavó con HCl 2 N y se formó una emulsión. Se dejó en reposo la emulsión durante dos días. Luego se filtró la emulsión a través de Celite en un embudo filtrante con placa porosa. Se puso de vuelta el filtrado en un embudo de decantación para separar las fases. Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, que luego se separó por filtración y se concentró el filtrado mediante evaporación rotatoria. Se hidrólizo el material sólido resultante con NaOH 2 N, se guardó durante la noche con refrigeración, y luego se

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reanudó la hidrólisis. Se acidificó la disolución con HCl 2 N y se aislaron los sólidos que se formaron, se secaron a vacío y se recristalizaron dos veces usando metanol/agua. Precipitaron sólidos durante la noche y se aislaron y secaron. Se disolvieron los sólidos en NaOH 2 N y se llevó el pH de la muestra a pH 5 con HCl 2 N. Se recogieron los sólidos y HPLC reveló un único pico. Luego se recristalizaron estos sólidos en metanol/agua, se aislaron y luego se secaron a vacío, produciendo 4,96 g (33,0%) de ácido 4-(4 cloro-2-hidroxibenzoil)aminobutírico. (C11H12ClNO4; peso molecular de 257,67.) Punto de fusión: 131-133ºC. Análisis por combustión: %C: 51,27(calc.), 51,27 (hallado); %H: 4,69 (calc.), 4,55 (hallado); %N: 5,44 (calc.), 5,30 (hallado). Análisis por H-RMN: (d6-DMSO):  13,0, s, 1H (COOH);  12,1 s, 1H (OH);  8,9, t, 1H (NH);  7,86, d, 1H (H en orto a amida);  6,98, d, 1H (H en orto a OH de fenol);  6,96, d, 1H, (H en meta a amida);  3,33, m, 2H (CH2 adyacente a NH);  2,28, t, 2H (CH2 adyacente a COOH);  1,80, m, 2H (CH2 alifático beta con respecto a NH y CH2 beta con respecto a COOH).

1b. Preparación adicional del ácido libre de 4-CNAB

Se añadió ácido 4-clorosalicílico (25,0 g, 0,1448 mol) a un matraz de fondo redondo de 250 ml de una boca que contenía aproximadamente 75-100 ml de cloruro de metileno. Se comenzó la agitación y se continuó para la parte restante de la reacción. Se añadió el agente de acoplamiento 1,1-carbonildiimidazol (23,5 g, 0,1448 mol) como un sólido en porciones al matraz. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos después de haberse añadido la totalidad del agente de acoplamiento y luego clorhidrato de 4-aminobutirato de etilo (24,3 g 0,1448 mol) se añadió al matraz con agitación. Se añadió trietilamina (26,0 ml, 0,18824 mol) gota a gota desde un embudo de adición. Se enjuagó el embudo de adición con cloruro de metileno. Se permitió que agitase la reacción a temperatura ambiente durante la noche.

Se vertió la reacción en un embudo de decantación y se lavó con HCl 2 N y se formó una emulsión. Se filtró la emulsión a través de Celite en un embudo filtrante con placa porosa. Se puso de vuelta el filtrado en un embudo de decantación para separar las fases. Se lavó la fase orgánica con agua y salmuera, luego se secó sobre sulfato de sodio, que luego se separó por filtración y se concentró el filtrado mediante evaporación rotatoria. Se hidrólizo el material sólido resultante con NaOH 2 N durante la noche. Se acidificó la disolución con HCl 2 N y se recristalizaron los sólidos de color marrón que se formaron usando metanol/agua, separando mediante filtración en caliente un material negro insoluble. Precipitaron sólidos blancos y se aislaron y secaron, produciendo 11,68 g (37,0%) de ácido 4-(4 cloro-2-hidroxibenzoil)aminobutírico. (C11H12ClNO4; peso molecular de 257,67.) Punto de fusión: 129-133ºC. Análisis por combustión: %C: 51,27 (calc.), 51,26 (hallado); %H: 4,69 (calc.), 4,75 (hallado); %N: 5,44 (calc.), 5,32 (hallado). Análisis por H-RMN: (d6-DMSO):  13,0, s, 1H (COOH);  12,1, s, 1H (OH);  8,9, t, 1H (NH);  7,86, d, 1H (H en orto a amida);  6,98, d, 1H (H en orto a OH de fenol);  6,96, d, 1H, (H en meta a amida);  3,33, m, 2H (CH2 adyacente a NH);  2,28, t, 2H (CH2 adyacente a COOH);  1,80, m, 2H (CH2 alifático beta con respecto a NH y CH2 beta con respecto a COOH).

1c. Preparación adicional del ácido libre de 4-CNAB

Se equipó un matraz de fondo redondo de cinco bocas, de 22 l con un agitador superior, una trampa de Dean-Stark de 1 l con refrigerante de reflujo, lectura de temperatura con termopar y manta calefactora. Se realizó la siguiente reacción bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron n-butanol como reactivo (5000 ml) y ácido 4clorosalicílico (2000 g, 11,59 mol) en el matraz de reacción. Se llenó la trampa de Dean-Stark con n-butanol (1000 ml). Se añadió ácido sulfúrico concentrado (50 g). Se calentó la mezcla de reacción hasta reflujo durante aproximadamente 120 horas. Se recogieron aproximadamente 206 ml de agua en la trampa durante este tiempo. Se retiró la manta calefactora y se permitió que se enfriase la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiental. Se drenó y se retiró la trampa de Dean-Stark. Se cargó agua desionizada (1000 ml). Se agitó la mezcla bifásica durante 10 minutos. Se detuvo la agitación y se permitió que se separasen las fases. Se separó por sifonaje la fase acuosa inferior y se desechó. Se cargó una disolución acuosa al 10% en peso de bicarbonato de sodio (1000 ml) en la mezcla de reacción. Se agitó la mezcla durante 10 minutos. Se sometió a prueba la mezcla de reacción con papel de pH para garantizar que el pH de la disolución era mayor de 7. Se añadió agua (500 ml) a la mezcla de reacción. Se detuvo la agitación y se permitió que se separasen las fases. Se separó por sifonaje la fase acuosa inferior y se desechó. Se lavó la mezcla de reacción con otra porción de 500 ml de agua desionizada. Se montó el reactor para destilación atmosférica en un receptor de 5 l tarado. Se destiló la mezcla hasta que se elevó la temperatura del recipiente hasta entre 140 y 150ºC. Se cambió la destilación de destilación atmosférica a destilación a vacío. Se redujo lentamente la presión en el montaje de destilación hasta 100 mmHg. La temperatura del recipiente disminuyó y se eliminó por destilación el n-butanol y n-butil éter (un subproducto de reacción) restantes. Se detuvo el calentamiento y se permitió que se enfriase la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiental. Se interrumpió el vacío con nitrógeno seco. Se transfirió el éster butílico en bruto a un matraz de recipiente de 5 l de un montaje de destilación a vacío. Se destiló el éster butílico en bruto a una presión de entre 0,2 y 0,5 mmHg. Se desechó el frente de destilación recogido a una temperatura de cabeza de <40ºC. Se recogió la fracción de 4-cloro-2-hidroxibenzoato de butilo a una temperatura de cabeza de entre 104 y 112ºC. Esta fracción tenía un peso de 2559 g. El rendimiento fue del 96%.

Se equipó un matraz de fondo redondo de cinco bocas, de 22 l con un agitador superior, refrigerante de reflujo, lectura de temperatura con termopar y una manta calefactora. Se purgó el reactor con nitrógeno. Se cargaron 4cloro-2-hidroxibenzoato de butilo (2559 g, 11,2 moles) y metanol como reactivo (10.000 ml) en el matraz de reacción,

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y se agitó el contenido hasta que se obtuvo una disolución. Se filtró la mezcla de reacción a través de un embudo Buchner y se devolvió al reactor. Se aumentó la velocidad de agitación, y se añadió amoniaco gaseoso rápidamente a la cámara anterior del reactor. Se continuó con la adición de gas amoniaco hasta que la temperatura del reactor alcanzó los 45ºC. Se suspendió la adición de amoniaco y se disminuyó la velocidad de agitación. Se permitió que se enfriase la reacción hasta la temperatura ambiental. Se repitió la adición de amoniaco, tal como se describió anteriormente, hasta que se completó la reacción tal como se indica mediante cromatografía de líquidos. Fueron necesarias siete cargas de amoniaco a lo largo de cinco días para completarse la reacción. Se eliminó aproximadamente la mitad del disolvente mediante destilación atmosférica. Se enfrió la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiental y se añadieron 5 l de agua desionizada. Se añadió ácido clorhídrico concentrado (aproximadamente 500 ml) lentamente al reactor hasta que el pH de la mezcla de reacción estuvo entre 4 y 5. Se recogió el precipitado resultante mediante filtración a vacío a través de un embudo grande de vidrio sinterizado. Se lavó la torta de filtración de producto con 2000 ml de agua desionizada, y se secó a 50ºC durante 32 horas dando 1797 g de 4-cloro-2-hidroxibenzamida. El rendimiento fue del 94%.

Se equipó un matraz de fondo redondo de cinco bocas, de 22 l con un agitador superior, refrigerante de reflujo, embudo de adición, lectura de temperatura con termopar y una manta calefactora. Se purgó el reactor con nitrógeno. Se cargaron acetonitrilo (4700 ml) y 4-cloro-2-hidroxibenzamida (1782 g, 10,4 mol) en el matraz de reacción y se inició la agitación. Se cargó piridina (1133 ml, 14,0 mol) en el reactor. Se enfrió la suspensión de reacción resultante hasta menos del 10ºC con un baño de hielo. Se puso cloroformiato de etilo (1091 ml, 1237 g, 11,4 mol) en el embudo de adición y se cargó lentamente a la mezcla de reacción con agitación de tal manera que la temperatura de la mezcla de reacción no superase los 15ºC durante la adición. Se mantuvo la temperatura de la mezcla de reacción entre 10 y 15ºC durante 30 minutos después de completarse la adición de cloroformiato de etilo. Se retiró el baño de hielo, y se calentó la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiental. Luego se calentó lentamente la mezcla de reacción hasta reflujo y se mantuvo a esa temperatura durante 18 horas. El análisis por cromatografía de líquidos de la mezcla de reacción indicó que la reacción solo se completó al 80%. Se eliminó aproximadamente la mitad del disolvente mediante destilación atmosférica. Se enfrió la mezcla de reacción en primer lugar hasta la temperatura ambiental y luego hasta <10ºC con un baño de hielo. Se añadió piridina adicional (215 ml, 2,65 mol) a la mezcla de reacción. Se añadió lentamente cloroformiato de etilo (235 g, 2,17 mol) mediante un embudo de adición a la mezcla de reacción fría. Se mantuvo la mezcla de reacción entre 10 y 15ºC durante 30 minutos después de completarse la adición de cloroformiato de etilo. Se retiró el baño de hielo, y se calentó la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiental. Luego se calentó lentamente la mezcla de reacción hasta reflujo y se mantuvo a esa temperatura durante 18 horas, tiempo después del cual el análisis por cromatografía de líquidos indicó que la reacción era completa. Se enfrió la mezcla de reacción en primer lugar hasta la temperatura ambiental y luego hasta <10ºC con un baño de hielo. Se añadió lentamente agua (1600 ml) mediante un embudo de adición y se mantuvo la suspensión resultante a <10ºC durante 90 minutos. Se recogió el producto sólido mediante filtración a vacío a través de un embudo grande de vidrio sinterizado. Se lavó la torta de filtración de producto con agua desionizada y se secó a vacío a 50ºC durante 18 horas dando 1914 g de 7-cloro-2H-1,3-benzoxazin-2,4(3H)-diona como un sólido de color tostado. El rendimiento fue del 83%.

Se equipó un matraz de fondo redondo de cinco bocas, de 22 l con un agitador superior, refrigerante de reflujo, lectura de temperatura con termopar y manta calefactora. Se realizó la siguiente reacción bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron 7-cloro-2H-1,3-benzoxazin-2,4(3H)-diona (1904 g, 9,64 mol), 4-bromobutirato de etilo (1313 ml, 9,18 mol) y N,N-dimetilacetamida (4700 ml) con una purga de nitrógeno. Se calentó la mezcla de reacción hasta 70ºC. Se cargó carbonato de sodio (1119 g, 10,55 mol) en la disolución transparente en cinco porciones iguales a lo largo de aproximadamente 40 minutos. Se mantuvo la mezcla de reacción a 70ºC durante la noche. Se enfrió la reacción hasta 55ºC. Se retiraron los sólidos inorgánicos mediante filtración a vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado. Se enjuagó el matraz de reacción con 2B-etanol (2000 ml) y se usó este enjuague para lavar la torta de filtración. Se limpió el matraz de reacción con agua desionizada. Se devolvió el filtrado al matraz de reacción limpio. Se enfrió el filtrado en un baño de hielo. Se añadió lentamente agua desionizada (9400 ml) con un embudo de adición. Se permitió que agitase la mezcla enfriada bruscamente durante la noche. Se recuperaron los sólidos resultantes mediante filtración a vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado. Se lavó la torta de producto con agua desionizada. La etil-3-(4-butanoato)-7-cloro-2H-1, 3-benzoxazin-2,4-(3H)-diona tenía un peso de 2476,0 g. El rendimiento fue del 82,2%.

Se equipó el reactor de acero inoxidable, de 12 l con un agitador superior, refrigerante de reflujo, lectura de temperatura con termopar, embudo de adición y manta calefactora. Se realizó la siguiente reacción bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron agua (3 l) y etil-3-(4-butanoato)-7-cloro-2H-1,3-benzoxazin-2,4-(3H)-diona (1118 g, 3,58 mol) en el reactor y se inició la agitación. Se añadió lentamente una disolución de hidróxido de sodio (574 g, 14,34 mol) en agua (2 l) a la suspensión de reacción. Se calentó la reacción hasta 70ºC durante 6 horas, y luego se permitió que se enfriase lentamente hasta la temperatura ambiental. Se filtró la mezcla de reacción a través de un embudo Buchner. Se equipó un matraz de fondo redondo de cinco bocas, de 22 l con un agitador superior, refrigerante de reflujo, lectura de temperatura con termopar y un embudo de adición. Se cargaron agua desionizada (1880 ml) y ácido clorhídrico concentrado (1197 g, 12,04 mol) en el reactor. Se añadió lentamente el hidrolizado de antes mediante el embudo de adición a la disolución de ácido. Se ajustó el pH de la suspensión resultante a 3 añadiendo ácido clorhídrico adicional (160 ml, 1,61 mol). Se recogieron los sólidos producto mediante filtración a través de un embudo de vidrio sinterizado y se secó en un horno de vacío a 50ºC durante 24 horas dando 1109,3 g

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de ácido 4-[(4-cloro-2-hidroxi-benzoil)amino]butanoico como un sólido blanquecino. El rendimiento fue cuantitativo.

Ejemplo 1d. Preparación de la forma I (4-CNAB de sodio anhidro)

Se equipó un matraz de fondo redondo de cinco bocas, de 22 l con un agitador superior, refrigerante de reflujo, lectura de temperatura con termopar y manta calefactora. Se realizó la siguiente reacción bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron acetona como reactivo (13000 ml) y ácido 4-[(4-cloro-2-hidroxi-benzoil)amino]butanoico (500,0 g, 1,94 mol) en el reactor y se inició la agitación. Se calentó la suspensión de reacción hasta 50ºC hasta que se obtuvo una disolución turbia de color marrón. Se bombeó la disolución caliente a través de un filtro de presión caliente revestido con papel n.º 1 de Whatman en un reactor de 22 l limpio. Se calentó el filtrado de color amarillo claro hasta 50ºC mientras se mantenía agitación. Se cargó disolución de hidróxido de sodio (acuosa al 50%; 155 g, 1,94 mol) en el reactor mientras se mantenía agitación vigorosa Después de completarse la adición de base, se calentó el reactor hasta reflujo (60ºC) durante 2,5 horas y luego se permitió que se enfriase lentamente hasta la temperatura ambiental. Se aisló el producto mediante filtración a vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado y se secó en un horno de vacío a 50ºC durante 24 horas dando 527,3 g de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio como un sólido blanquecino. El uso de acetona en la etapa final de la síntesis siempre dio como resultado la producción de la forma cristalina anhidra. El rendimiento fue del 97,2%.

La forma I preparada era un polimorfo cristalino que tenía un inicio del punto de fusión de aproximadamente 215,07ºC y estaba caracterizada por un difractograma de rayos X de polvo sustancialmente tal como se muestra en la figura 1. Un barrido de DSC, espectro de TGA y curva de sorción/ desorción de la forma I preparada se muestran en las figuras 6, 11, y 22, respectivamente. Los espectros de FTIR de la forma I preparada se muestran en las figuras 16A y 16B.

EJEMPLO 1e: Preparación de la forma II -4-CNAB de sodio

Se equipó un matraz de 22 l con un agitador superior. Se añadieron agua desionizada (2000 ml) y ácido 4-[(4-cloro2-hidroxibenzoil)amino]butanoico (380,0 g, 1,47 mol) y se inició la agitación. Se añadió una disolución de hidróxido de sodio (59,0 g, 1,48 mol) en agua (500 ml) al reactor. Se añadió agua (1500 ml) al reactor, y se calentó la suspensión resultante hasta que se obtuvo una disolución completa. Se enfrió la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiental, y luego se concentró hasta sequedad a presión reducida. Se rascaron los sólidos resultantes del matraz y se secaron a vacío a 50ºC dando 401,2 g de 4-[4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio como un sólido blanquecino. El rendimiento fue del 96,9%. La forma II preparada era un polimorfo cristalino que tenía un inicio del punto de fusión de aproximadamente 214,24ºC y estaba caracterizada por un difractograma de rayos X de polvo sustancialmente tal como se muestra en la figura 2. Un barrido de DSC, TGA, espectro de FTIR y curva de sorción/ desorción de la forma II preparada se muestran en las figuras 7, 12A-12B, 17, y 23, respectivamente.

Ejemplo 1f: Preparación de la forma III -4-CNAB de sodio a través del solvato de isopropanol

Se equipó un matraz de fondo redondo, de cuatro bocas, de un litro con un agitador superior, refrigerante de reflujo, lectura de temperatura con termopar y manta calefactora. Se realizó la siguiente reacción bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron isopropanol (400 ml) y ácido 4-[(4-cloro-2-hidroxi-benzoil)amino]butanoico (25,0 g, 0,09 mol) en el reactor y se inició la agitación. Se calentó la suspensión de reacción hasta 50ºC hasta que se obtuvo una disolución turbia de color marrón. Se filtró la disolución caliente a través de un filtro de presión caliente revestido con papel n.º 1 de Whatman en un reactor de 1 l limpio. Se calentó el filtrado de color amarillo claro hasta 62ºC mientras se agitaba. Se cargó disolución de hidróxido de sodio (acuosa al 50%; 7,2 g, 0,09 mol) en el reactor mientras se mantenía agitación vigorosa. Después de completarse la adición de base, se calentó el reactor hasta reflujo (72ºC) y luego se permitió que se enfriase lentamente hasta la temperatura ambiental. Se aisló el producto mediante filtración a vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado y se secó a vacío a 50ºC durante 24 horas dando 23,16 g de 4[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio como un sólido blanquecino. El rendimiento fue del 92%.

La forma III preparada era un polimorfo cristalino que tenía un inicio del punto de fusión de aproximadamente 223,08ºC y estaba caracterizada por un difractograma de rayos X de polvo sustancialmente tal como se muestra en la figura 3 adjunta. Un barrido de DSC, espectro de TGA, espectro de FTIR y curva de sorción/ desorción de la forma III preparada se muestran en las figuras 8, 13, 18, y 24, respectivamente.

Ejemplo 1g: Preparación de la forma IV -4-CNAB de sodio

Se toma la forma I (ejemplo 1d) o la forma II (ejemplo 1e) o la forma V (ejemplo 1h) de 4-CNAB de sodio y se expone la muestra a una humedad relativa del 75% o mayor. Se permiten al menos siete días de exposición a la alta humedad relativa hasta que el espectro de difracción de rayos X de una muestra aleatoria del material coincide con el de la forma IV de 4-CNAB de sodio.

Se preparó la forma IV exponiendo la forma I a una humedad relativa del 90% durante una semana y luego se guardó a una humedad relativa del 80% durante una semana.

La forma IV preparada era un polimorfo cristalino que tenía un inicio del punto de fusión de aproximadamente 213,05ºC y estaba caracterizada por un difractograma de rayos X de polvo sustancialmente tal como se muestra en

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A. Estudios con ratas

Se prepararon composiciones de dosificación oral (v.o.) de compuesto agente de administración (preparado como en el ejemplo 1a o 1b tal como se indica a continuación) y insulina recombinante humana con zinc (disponible de Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, CA (n.º de catálogo 407694)) en agua desionizada. Normalmente, se añadieron 500 mg de compuesto agente de administración a 1,5 ml de agua. Se convirtió el ácido libre del compuesto agente de administración en la sal de sodio mediante agitación de la disolución resultante y adición de un equivalente de hidróxido de sodio. Se agitó en vórtex la disolución, luego se calentó (aproximadamente a 37ºC) y se sonicó. Se ajustó el pH a de aproximadamente 7 a 8,5 con NaOH o HCl. Se añadió NaOH adicional, si era necesario, para lograr una solubilidad uniforme, y volvió a ajustarse el pH. (Por ejemplo, para el compuesto 1a, se añadió un total de 258,5 ml de NaOH 10 N a 501 mg de compuesto en 1,5 ml de agua, pH final de 7,73.) Luego se añadió agua para enrasar a aproximadamente 2,4 ml y se agitó en vórtex. Se añadieron aproximadamente 1,25 mg de insulina de una disolución madre de insulina (15 mg/ml preparada a partir de 0,5409 g de insulina y 18 ml de agua desionizada, ajustando con HCl y NaOH a pH 8,15 y para obtener una disolución transparente usando 40 ml de HCl concentrado, 25 ml de NaOH 10 N y 50 ml de NaOH 1 N) a la disolución y se mezcló mediante inversión. La dosis de administración de compuesto agente de administración final, la dosis de insulina y las cantidades de volumen de dosis se enumeran a continuación en la tabla 1.

Los protocolos de dosificación y toma de muestras fueron tal como sigue. Se dejaron en estado de ayuno ratas Sprague-Dawley macho que pesaban entre aproximadamente 200-250 g durante 24 horas y se les administró ketamina (44 mg/kg) y clorpromazina (1,5 mg/kg) 15 minutos antes de la dosificación y de nuevo según fuese necesario para mantener la anestesia. A un grupo de dosificación de cinco animales se les administró una de las disoluciones de dosificación. Para dosificación oral, se adaptó un catéter de 8 French Rusch de 11 cm a una jeringa de 1 ml con una punta de pipeta. Se llenó la jeringa con disolución de dosificación extrayendo la disolución a través del catéter, que luego se secó con un trapo. Se colocó el catéter por el esófago dejando 1 cm de tubo pasados los incisivos. Se administró la disolución presionando el émbolo de la jeringa.

Se extrajeron muestras de sangre en serie de la arteria de la cola, normalmente a tiempo = 15, 30, 60, 120 y 180 minutos después de la administración. Se determinaron los niveles de insulina en suero con un kit de prueba de ELISA para insulina (n.º de kit DSL-10-1600 de Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX), modificando el protocolo convencional para optimizar la sensibilidad y el intervalo lineal de la curva patrón para los volúmenes y las concentraciones de las muestras usadas en el presente protocolo. Se midieron las concentraciones de insulina humana en suero (U/ml) para cada punto de tiempo para cada uno de los cinco animales en cada grupo de dosificación. Se promediaron los cinco valores para cada punto de tiempo y se representaron gráficamente los resultados como concentración de insulina en suero frente al tiempo. El máximo (pico) y el área bajo la curva (AUC) se notifican a continuación en la tabla 1. Experimentos previos no revelaron niveles medibles de insulina humana tras dosificación oral con insulina humana sola.

Tabla 1. Insulina -Administración oral

Compuesto: Dosis volumétrica (ml/kg) Dosis de compuesto (mg/kg) Dosis de insulina (mg/kg) Insulina humana en suero pico media (U/ml  E.E.) AUC

1a: 1,0 200 0,5 1457  268 58935

1b: 1,0 200 0,5 183  89 8674

1b: 1,0 200 0,5 136  52 5533

1b: 1,0 200 0,5 205  61 7996

1b: 1,0 200 0,5 139  43 5271

B. Estudios con monos

Todos los protocolos con animales observaron los “Principles of Laboratory Animal Care” (Principios de cuidado de animales de laboratorio) y los aprobó el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

El protocolo de dosificación para administrar las cápsulas a cada animal fue el siguiente. Se obtuvieron muestras de plasma de nivel inicial de los animales antes de la dosificación. Se dejaron en estado de ayuno grupos de cuatro macacos cangrejeros, dos machos y dos hembras, que pesaban 2-3 kg durante 4 horas antes de la dosificación y hasta 2 horas después de la dosificación. Se anestesiaron los animales con una inyección intramuscular de 10 mg/kg de clorhidrato de ketamina inmediatamente antes de la dosificación. A cada animal se le administraron dosis variables del compuesto 1 (25-100 mg/kg) en combinación con dosis variables de insulina, 0,25-0,5 mg/kg de insulina como 1 cápsula. Estaba disponible agua en todo el periodo de dosificación y se pusieron a disposición del animal 400 ml de zumo durante la noche antes de la dosificación y en todo el periodo de dosificación. Se restringió al animal con restricciones de arneses. Se puso una cápsula en un dispensador de pastillas, que es una herramienta de plástico con un émbolo de cavidad y punta de caucho dividida para albergar una cápsula. Se insertó el dispensador de pastillas en el esófago del animal. Se presionó el émbolo del dispensador de pastillas para empujar la cápsula fuera de la punta de caucho y al interior del esófago. Luego se retrajo el dispensador de pastillas. Se

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Se promediaron los resultados de los animales en cada grupo para cada punto de tiempo y se notifica el mayor de estos promedios (es decir, concentración de cromoglicolato en suero pico media) a continuación en la tabla 2.

Tabla 2. Cromoglicolato -Administración oral

Compuesto: Dosis volumétrica (ml/kg) Dosis de compuesto (mg/kg) Dosis de cromoglicolato (mg/kg) [cromoglicolato] en suero pico media  D.E. (E.E.)

1b: 1 200 25 0,70  0,36 (0,16)

Ejemplo 4: Hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) -Administración oral

Se prepararon disoluciones de dosificación por sonda nasogástrica (v.o.) de compuesto agente de administración (preparado como en el ejemplo 1a o 1b tal como se indica en la tabla 3 a continuación) y rhGH en tampón fosfato. Se convirtió el ácido libre del compuesto agente de administración en la sal de sodio con un equivalente de hidróxido de sodio. Normalmente, se preparó una disolución del compuesto en tampón fosfato y se agitó, añadiendo un equivalente de hidróxido de sodio (1,0 N) cuando se preparó la sal de sodio. Se añadió NaOH adicional, si era necesario, para lograr una solubilidad uniforme, y volvió a ajustarse el pH. Se prepararon disoluciones de dosificación finales mezclando la disolución de compuesto con una disolución madre de rhGH (15 mg de rhGH/ml preparada mezclando como polvos 15 mg de rhGH, 75 mg de D-manitol, 15 mg de glicina y 3,39 mg de fosfato dibásico de sodio, luego diluyendo con glicerol al 2%) y diluyendo hasta el volumen deseado (habitualmente 3,0 ml). Las dosis de compuesto y rhGH y los volúmenes de dosis se enumeran a continuación en la tabla 3.

Los protocolos de dosificación y toma de muestras típicos fueron tal como sigue. Se dejaron en estado de ayuno ratas Sprague-Dawley macho que pesaban entre 200-250 g durante 24 horas y se les administró ketamina (44 mg/kg) y clorpromazina (1,5 mg/kg) 15 minutos antes de la dosificación y de nuevo según fuese necesario para mantener la anestesia. A un grupo de dosificación de cinco animales se les administró una de las disoluciones de dosificación. Se adaptó un catéter de 8 French Rusch de 11 cm a una jeringa de 1 ml con una punta de pipeta. Se llenó la jeringa con disolución de dosificación extrayendo la disolución a través del catéter, que luego se secó con un trapo. Se colocó el catéter por el esófago dejando 1 cm de tubo pasados los incisivos. Se administró la disolución presionando el émbolo de la jeringa.

Se extrajeron muestras de sangre en serie de la arteria de la cola, normalmente a tiempo = 15, 30, 45 y 60 minutos después de la administración. Se cuantificaron las concentraciones de rHGH en suero mediante un kit de prueba de inmunoensayo para rHGH (n.º de kit K1F4015 de Genzyme Corporation Inc., Cambridge, MA). Algunos estudios previos indicaron niveles iniciales de aproximadamente cero.

Se promediaron los resultados de los animales en cada grupo para cada punto de tiempo. Se notifica el máximo de estos promedios (es decir, la concentración de rhGH en suero pico media) a continuación en la tabla 3. (En los casos en los que no se facilita a continuación ni la desviación estándar (D.E.) ni el error estándar (SE), se combinaron las cinco muestras de cada periodo de tiempo antes de someter a ensayo.)

Tabla 3. rhGH -Administración oral

Compuesto: Dosis volumétrica (ml/kg) Dosis de compuesto (mg/kg) Dosis de rhGH (mg/kg) [rhGH] en suero pico media  D.E. (E.E.) (ng/ml)

1a: 1 200 3 99,35

1a: 1 200 3 42,62

1b: 1 200 3 84,01  73,57 (32,90)

1b: 1 200 3 50,44  34,13 (15,26)

Ejemplo 5 -Interferón -Administración oral

Se prepararon disoluciones de dosificación de compuesto agente de administración (preparado como en el ejemplo 1b) e interferón humano (IFN) en agua desionizada. Se convirtió el ácido libre del compuesto agente de administración en la sal de sodio con un equivalente de hidróxido de sodio. Normalmente, se preparó una disolución del compuesto agente de administración en agua y se agitó, añadiendo un equivalente de hidróxido de sodio (1,0 N) cuando se preparó la sal de sodio. Se agitó en vórtex esta mezcla y se puso en un sonicador (aproximadamente a 37ºC). Se ajustó el pH a de aproximadamente 7,0 a 8,5 con NaOH acuoso. Se agitó en vórtex la mezcla para producir una suspensión o disolución uniforme, también usando sonicación y calor si era necesario. Se añadió NaOH adicional, si era necesario, para lograr una solubilidad uniforme, y volvió a ajustarse el pH. Se mezcló la disolución de compuesto agente de administración con una disolución madre de IFN (de aproximadamente 22,0 a 27,5 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato) y se diluyó hasta el volumen deseado (habitualmente 3,0 ml). Las dosis de compuesto agente de administración e IFN finales, y los volúmenes de dosis se enumeran a continuación en la tabla 4.

Los protocolos de dosificación y toma de muestras típicos fueron tal como sigue. Se dejaron en estado de ayuno ratas Sprague-Dawley macho que pesaban entre 200-250 g durante 24 horas y se les administró ketamina (44 mg/kg) y clorpromazina (1,5 mg/kg) 15 minutos antes de la dosificación y de nuevo según fuese necesario para mantener la anestesia. A un grupo de dosificación de cinco animales se les administró una de las disoluciones de

5 dosificación. Se adaptó un catéter de 8 French Rusch de 11 cm a una jeringa de 1 ml con una punta de pipeta. Se llenó la jeringa con disolución de dosificación extrayendo la disolución a través del catéter, que luego se secó con un trapo. Se colocó el catéter por el esófago dejando 1 cm de tubo pasados los incisivos. Se administró la disolución presionando el émbolo de la jeringa.

Se extrajeron muestras de sangre en serie de la arteria de la cola, normalmente a tiempo = 0, 15, 30, 45, 60 y 90

10 minutos después de la administración. Se cuantificaron las concentraciones de IFN en suero usando el kit de inmunoensayo Cytoscreen para IFN-alfa humano (n.º de catálogo KHC4012 de Biosource International, Camarillo, CA). Algunos estudios previos indicaron niveles iniciales de aproximadamente cero. Se promediaron los resultados de los animales en cada grupo para cada punto de tiempo. Se notifica el máximo de estos promedios (es decir, la concentración de IFN en suero pico media) a continuación en la tabla 4.

15 Tabla 4. Interferón -Administración oral

Compuesto: Dosis volumétrica (ml/kg) Dosis de compuesto (mg/kg) Dosis de IFN (mg/kg) [IFN] en suero pico media (ng/ml)  D.E. (E.E.)

Forma I: 1,0 200 1,0 17,80  13,52 (6,05)

Claims

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10. Método de preparación de la forma IV de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio que comprende la etapa de exponer la forma I, II, III o V de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino]butanoato de sodio o una mezcla del mismo a una humedad relativa de al menos el 75% durante un tiempo suficiente para producir la forma IV de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio, en el que

5 la forma I presenta un espectro de difracción de rayos X de polvo que tiene picos en grados 2 0,2º 2 a 5,2, 11,2, 15,7, 18,5, 20,1, 21,8, 23,4, 23,8, 26,9 y 29,8

la forma II presenta un espectro de difracción de rayos X de polvo que tiene picos en grados 2 0,2º 2 a 10,2, 18,3, 19,5, 19,8, 21,8, 23,5, 26,3, 27,8, 29,4 y 31,8,

la forma III presenta un espectro de difracción de rayos X de polvo que tiene picos en grados 2 0,2º 2 a 10 5,5, 10,8, 11,9, 16,3, 17,3, 21,7, 24,7, 25,0, 26,1 y 26,4,

la forma IV presenta un espectro de difracción de rayos X de polvo que tiene picos en grados 2 0,2º 2 a 5,47, 10,2, 16,3, 19,8, 21,7, 23,5, 27,3, 28,9, 30,6 y 33,3, y

la forma V presenta un espectro de difracción de rayos X de polvo que tiene picos en grados 2 2º 2 a 9,1, 12,3, 17,9, 19,8, 23,0, 24,1, 24,4, 26,1, 28,2 y 28,5.

15 11. Método de preparación de la forma V de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio que comprende la etapa de calentar la forma III de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino]butanoato de sodio hasta una temperatura de entre 160ºC y el punto de fusión de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino]butanoato de sodio anhidro en un entorno libre de aire y agua, en el que

la forma III presenta un espectro de difracción de rayos X de polvo que tiene picos en grados 2 0,2º 2 a 20 5,5, 10,8, 11,9, 16,3, 17,3, 21,7, 24,7, 25,0, 26,1 y 26,4, y

la forma V presenta un espectro de difracción de rayos X de polvo que tiene picos en grados 2 0,2º 2 a 9,1, 12,3, 17,9, 19,8, 23,0, 24,1, 24,4, 26,1, 28,2 y 28,5.
12. Método de preparación de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio amorfo que comprende la etapa de solidificar una masa fundida de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino]butanoato de sodio.

25 13. Método de preparación de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio amorfo que comprende la etapa de liofilizar 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio.
14. Método de preparación de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio amorfo que comprende la etapa de recristalizar 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato de sodio en una disolución acuosaalcohólica, en el que la razón molar de alcohol con respecto a agua es mayor de 10.

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