ES2306719T3 - Compuestos y composiciones para la administracion de principios activos. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (Ver fórmula) o una sal del mismo.

Description

Compuestos y composiciones para la administración de principios activos.

La presente invención se relaciona con compuestos para la administración de principios biológicamente activos, a un objetivo. Estos compuestos son muy adecuados para formar mezclas no covalentes con principios activos para ser administrados a los animales en forma oral, a través del colon, a través de los pulmones, o de otras rutas de administración. Se divulgan también los métodos para la preparación y administración de tales composiciones.

Los medios convencionales para la administración de principios activos a menudo están severamente limitados por barreras biológicas, químicas y físicas. Típicamente, estas barreras son impuestas por el medio ambiente a través del cual ocurre la administración, del medio ambiente del objetivo para administración, y/o del objetivo en sí mismo. Los principios biológica y químicamente activos son particularmente vulnerables a tales barreras.

En la administración a animales de principios biológicamente activos y farmacológica y terapéuticamente químicamente activos, las barreras están impuestas por el organismo. Los ejemplos de barreras físicas son la piel, las bicapas lipídicas y las diferentes membranas de los órganos que son relativamente impermeables a ciertos principios activos pero que deben ser atravesadas antes de alcanzar un objetivo, tal como el sistema circulatorio. Las barreras químicas incluyen, pero no se limitan a, variaciones de pH en el tracto gastrointestinal (GI) y enzimas de degradación.

Estas barreras son de particular importancia en el diseño de los sistemas de administración oral. La administración oral de muchos principios biológica y químicamente activos debería ser la ruta de escogencia para administración a los animales, si no fuera por las barreras biológicas, químicas y físicas. Entre los numerosos agentes que no son típicamente adecuados para administración oral están los péptidos biológica y químicamente activos, tales como la calcitonina y la insulina; polisacáridos, y en particular mucopolisacáridos que incluyen, pero no se limitan a, heparina; heparinoides; antibióticos, y otras sustancias orgánicas. Estos principios pueden volverse rápidamente inefectivos o ser destruidos en el tracto gastrointestinal por hidrólisis ácida, enzimas y similares. Además, el tamaño y estructura de las drogas macromoleculares pueden impedir la absorción.

Los métodos anteriores para la administración oral de principios farmacológicos vulnerables se han basado en la administración conjunta de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y tensoactivos no iónicos tales como polioxietilén oleil éter y n-hexadecilpolietilén éter) para incrementar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, así como la administración conjunta de inhibidores enzimáticos (por ejemplo, inhibidores de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradación enzimática. Los liposomas también han sido descritos como sistemas para administración de drogas como la insulina y la heparina. Sin embargo, se evita el uso extendido de tales sistemas de administración de droga porque: (1) los sistemas requieren de cantidades tóxicas de adyuvantes o inhibidores; (2) las cargas adecuadas de bajo peso molecular, esto es, los principios activos, no están disponibles; (3) los sistemas exhiben pobre estabilidad y una vida inadecuada en estantería; (4) los sistemas son de difícil fabricación; (5) los sistemas fallan en la protección del principio activo (carga); (6) los sistemas alteran en forma adversa al principio activo; o (7) los sistemas fallan en permitir o promover la absorción del principio activo.

Más recientemente, se han utilizado microesferas proteinoides para administrar compuestos farmacéuticos. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.401.516, 5.443.841 y US RE 35.862. Además, se han utilizado ciertos aminoácidos modificados para administrar compuestos farmacéuticos. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.629.020, 5.643.957, 5.766.633, 5.776.888 y 5.866.536.

WO 96/30036 divulga compuestos y composiciones para administrar principios tales como los siguientes compuestos:

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WO 98/34632 divulga compuestos y composiciones para administrar principios activos tales como los siguientes compuestos:

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El problema fundamental de la presente invención es el de proveer un sistema de administración sencillo y económico que se prepara fácilmente y que puede ser administrado un amplio rango de principios activos por medio de diferentes rutas.

El problema se resuelve por medio de un compuesto de fórmula

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o una sal del mismo.

En otra modalidad, la presente invención está dirigida a una composición que contiene al menos un principio biológicamente activo y al menos un compuesto 1 o una sal del mismo. También se proveen métodos para la preparación y administración de tales composiciones.

También se proveen formas unitarias de dosificación que contienen a las composiciones. La forma unitaria de dosificación puede ser en la forma de un sólido (tal como una tableta, cápsula o partícula tal como un polvo o bolsita) o un líquido.

También se proveen métodos para administrar un principio biológicamente activo a un animal que requiera del mismo, especialmente por vía oral, a través del colon, o través de los pulmones, con las composiciones de la presente invención, así como métodos de tratamiento que utilizan tales composiciones. Se provee un método para tratar una enfermedad en un animal que comprende la administración de una composición de la presente invención al animal que requiera de la misma.

Descripción detallada de la invención Compuestos

Los compuestos pueden estar en la forma del ácido carboxílico y/o de sus sales. Las sales incluyen, pero no se limitan a sales orgánicas e inorgánicas, por ejemplo sales de metal alcalino, tales como sodio, potasio y litio; sales de metal alcalinotérreo, tales como magnesio, calcio o bario; sales de amonio; aminoácidos básicos tales como lisina o arginina; y aminas orgánicas, tales como dimetilamina o piridina. Preferiblemente, las sales son sales de sodio. Las sales pueden ser mono o multivalentes, tales como sales monosódicas y sales disódicas. Las sales pueden ser también solvatos incluidos los solvatos de etanol.

Además, se pueden utilizar poliaminoácidos y péptidos que contienen uno o más de estos compuestos.

Un aminoácido es cualquier ácido carboxílico que tiene al menos un grupo amino libre incluidos los aminoácidos sintéticos y de ocurrencia natural. Los poliaminoácidos son o bien péptidos (que son dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico) o son dos o más aminoácidos enlazados por medio de un enlace formado por otros grupos que pueden ser enlazados, por ejemplo, por medio de un enlace éster o un enlace anhídrido. Los péptidos pueden variar en longitud desde dipéptidos con dos aminoácidos hasta polipéptidos con varios cientos de aminoácidos. Uno o más de los aminoácidos o de las unidades peptídicas pueden ser aciladas o sulfonadas.

Los compuestos descritos aquí se pueden derivar de aminoácidos y se pueden preparar fácilmente a partir de aminoácidos por medio de métodos que están dentro de las destrezas de aquellos capacitados en el arte con base en la presente divulgación y los métodos descritos en WO 96/30036, WO 97/36480, y en las patentes estadounidenses Nos. 5.643.957 y 5.650.386. Por ejemplo, los compuestos se pueden preparar por medio de la reacción del único aminoácido con el agente de acilación o de modificación de amina, que reacciona con una fracción amino libre presente en el aminoácido para formar amidas. Se pueden utilizar grupos de protección para evitar reacciones secundarias no deseadas como lo sabrían aquellos capacitados en el arte. Con relación a los grupos de protección, se hace referencia a T.W. Greene, Protecting Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York (1981), cuya divulgación se incorpora aquí como referencia.

Las sales del presente compuesto se pueden elaborar por medio de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, las sales de sodio se pueden elaborar por medio de la disolución del compuesto en etanol y añadiendo hidróxido de sodio acuoso.

El compuesto se puede purificar por medio de recristalización o por fraccionamiento sobre uno o más soportes cromatográficos sólidos, solo o enlazado en tándem. Los sistemas adecuados de solventes para recristalización incluyen, pero no se limitan a, acetonitrilo, metanol, y tetrahidrofurano. El fraccionamiento se puede llevar a cabo sobre un soporte cromatográfico adecuado tal como alúmina, utilizando mezclas de metanol/n-propanol como la fase móvil; cromatografía en fase reversa utilizando mezclas de ácido trifluoroacético/acetonitrilo como la fase móvil; y cromatografía de intercambio iónico utilizando agua o un amortiguador apropiado como la fase móvil. Cuando se lleva a cabo cromatografía de intercambio aniónico, se emplea preferiblemente un gradiente de cloruro de sodio 0 - 500 mM.

De acuerdo a una modalidad, se emplea el compuesto en su forma anhidra.

Principios Activos

Los principios activos adecuados para ser usados en la presente invención son los principios biológicamente activos, incluyendo, pero sin limitarse a, pesticidas, agentes farmacológicos y agentes terapéuticos.

Por ejemplo, los principios biológicamente activos adecuados para ser utilizados en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas; polipéptidos; péptidos; hormonas; polisacáridos, y particularmente mezclas de mucopolisacáridos; carbohidratos, lípidos; otros compuestos orgánicos; y particularmente compuestos que por si mismos no pasan (o que pasa únicamente una fracción de la dosis administrada) a través de la mucosa gastrointestinal y/o que son susceptibles a escisión química por medio de ácidos y enzimas en el tracto gastrointestinal; o cualquier combinación de los mismos.

Ejemplos adicionales incluyen, pero no se limitan a, los siguientes, incluyendo las fuentes sintéticas, naturales o recombinantes de los mismos: hormonas de crecimiento, incluyendo las hormonas de crecimiento humano (hGH), las hormonas recombinantes de crecimiento humano (rhGH), las hormonas de crecimiento bovino, y las hormonas de crecimiento porcino; hormonas para la liberación de la hormona de crecimiento; interferones, incluyendo \alpha, \beta y \gamma; interleuquina 1; interleuquina 2; insulina, incluyendo la porcina, bovina, humana, y la humana recombinante, teniendo opcionalmente contraiones incluidos sodio, cinc, calcio y amonio; factor de crecimiento tipo insulina, incluyendo IGF-1; heparina, incluyendo heparina no fraccionada, heparinoides, dermatanos, condroitinas, heparina de bajo peso molecular, heparina de muy bajo peso molecular y heparina de peso molecular ultra bajo; calcitonina, incluida la de salmón, de anguila, de porcino y humana; eritropoyetina; factor naturético atrial; antígenos; anticuerpos monoclonales; somatostatina; inhibidores de proteasa; adrenocorticotropina, hormona para liberación de gonadotropina; oxitocina; hormona para la liberación de hormona luteinizante; hormona para estimulación del folículo; glucocerebrosidasa; trombopoyetina; filgrastima; prostaglandinas; ciclosporina; vasopresina; cromolín sódico (cromoglicato sódico o disódico); vancomicina; desferrioxamina (DFO); hormona paratiroidea (PTH), incluidos sus fragmentos; antimicrobianos, incluidos los agentes antihongos; vitaminas; análogos, fragmentos, miméticos o derivados modificados de polietilén glicol (PEG) de estos compuestos; o cualquier combinación de los mismos. Se describen otras formas adecuadas de insulina, incluyendo, pero sin limitarse a, formas sintéticas de insulina, en las patentes estadounidenses Nos. 4.421.685, 5.474.978, y 5.534.488, cada una de las cuales es incorporada aquí en su totalidad como referencia.

Sistemas para administración

Las composiciones de la presente invención contienen un agente para administración y uno o más principios activos. En una modalidad, uno o más de los compuestos como agentes para administración, o las sales de estos compuestos, o poliaminoácidos o péptidos a partir de los cuales estos compuestos o sales forman una o más de las unidades de los mismos, pueden ser utilizados como un agente para administración por medio de la mezcla con el principio activo antes de su administración.

Las composiciones para administración pueden estar en la forma de un líquido. El vehículo de dosificación puede ser agua (por ejemplo, para calcitonina de salmón, hormona paratiroidea y eritropoyetina), polietilén glicol acuoso al 25% (por ejemplo, para heparina) y amortiguador de fosfato (por ejemplo, para rhGH). Otros vehículos de dosificación incluyen polietilén glicoles, sorbitol, manitol y sacarosa. Las soluciones para dosificación se pueden preparar por medio de la mezcla de una solución del compuesto para administración del agente con una solución del principio activo, justo antes de su administración. Alternativamente, se puede mezclar una solución del agente para administración (o el principio activo) con la forma sólida del principio activo (o el agente para administración). El compuesto para administración del agente y del principio activo se puede mezclar también como polvos secos. El compuesto para administración del agente y el principio activo se puede mezclar también durante el proceso de fabricación.

Las soluciones para dosificación pueden contener opcionalmente adhesivos tales como sales de amortiguador de fosfato, ácido cítrico, glicoles, u otros agentes para dispersión. Los aditivos para estabilización se pueden incorporar en la solución, preferiblemente en una concentración en el rango aproximadamente entre 0,1 y 20% (p/v).

Las composiciones para administración pueden estar alternativamente en la forma de un sólido, tal como una tableta, cápsula o partícula, tal como un polvo o bolsita. Las formas para dosificación de sólidos se pueden preparar por medio de la mezcla de la forma sólida del compuesto con la forma sólida del principio activo. Alternativamente, se puede obtener un sólido a partir de una solución de un compuesto y del principio activo, por medio de métodos conocidos en el estado del arte, tales como liofilización, precipitación, cristalización y dispersión sólida.

Las composiciones para administración de la presente invención pueden incluir también uno o más inhibidores enzimáticos. Tales inhibidores enzimáticos incluyen, pero no se limitan a, compuestos tales como actinonina o epiactinonina y derivados de los mismos. Otros inhibidores enzimáticos incluyen, pero no se limitan a, aprotinina (Trasylol) y el inhibidor de Bowman-Birk.

La cantidad utilizada de principio activo en una composición para administración de la presente invención es una cantidad efectiva para lograr el propósito del principio activo particular para la indicación objetivo. La cantidad de principio activo en las composiciones es típicamente una cantidad farmacológica, biológica, o terapéuticamente activa. Sin embargo, la cantidad puede ser menor que aquella cantidad cuando se utiliza la composición en una forma de dosificación unitaria ya que la forma de dosificación unitaria puede contener una pluralidad de composiciones compuesto/principio activo o puede contener una cantidad farmacológica, biológica, o terapéuticamente activa. Se puede administrar entonces la cantidad efectiva total en unidades acumulativas que contienen, en total, una cantidad efectiva del principio activo.

La cantidad total de principio activo que va a ser utilizada se puede determinar por medio de métodos conocidos por aquellos capacitados en el arte. Sin embargo, debido a que las composiciones pueden administrar principios activos en forma más eficiente que las composiciones anteriores, se pueden administrar al individuo cantidades menores de principios biológicamente activos que aquellos utilizados en las formas de dosificación unitaria anteriores o sistemas de administración, sin dejar de lograr los mismos niveles en sangre y/o efectos terapéuticos.

Los compuestos ya divulgados administran principios biológicamente activos, particularmente en forma oral, intranasal, sublingual, intraduodenal, subcutánea, bucal, a través del colon, rectal, vaginal, a través de la mucosa, de los pulmones, en forma transdérmica, intradérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular y ocular, así como atravesando la barrera hematoencefálica.

Las formas de dosificación unitaria pueden incluir también un excipiente cualquiera o combinación de los mismos, diluyentes, desintegrantes, lubricantes, plastificantes, colorantes, saborizantes, agentes enmascaradores del sabor, azúcares, edulcorantes, sales, y vehículos de dosificación, incluyendo pero sin limitarse a, agua, 1,2-propanodiol, etanol, aceite de oliva, o cualquier combinación de los mismos.

Los compuestos y las composiciones objeto de la invención son útiles para administrar principios biológicamente activos a cualquier animal, incluyendo, pero sin limitarse a, aves tales como gallinas; mamíferos, tal como roedores, vacas, cerdos, perros, gatos, primates y particularmente humanos; e insectos.

El sistema es particularmente conveniente para administrar principios biológicamente activos que de otra manera serían destruidos o se volverían menos efectivos por causa de las condiciones encontradas antes de que el principio activo alcance su zona objetivo (esto es, el área en la cual el principio activo de la composición a administrar va a ser liberada) y dentro del organismo del animal al cual se le van a administrar. Particularmente, los compuestos y las composiciones de la presente invención son útiles para administrar en forma oral los principios activos, especialmente aquellos que ordinariamente no pueden ser administrados en forma oral, o aquellos para los cuales se desea una mejor administración.

Las composiciones que contienen a los compuestos y a los principios activos tienen utilidad en la administración de principios activos a sistemas biológicos seleccionados y en una biodisponibilidad mayor o mejorada del principio activo comparada con la administración del principio activo sin el agente de administración. Se puede mejorar el suministro administrando más principio activo durante un período de tiempo, o administrando principio activo en un período de tiempo particular (tal como para efectuar una administración más rápida o demorada) o durante un período de tiempo (tal como una administración prolongada).

Después de la administración, el principio activo presente en la composición o en la forma de dosificación unitaria es absorbido en el torrente circulatorio. La biodisponibilidad del principio es evaluada fácilmente midiendo una actividad farmacológica conocida en sangre, por ejemplo un incremento en el tiempo de formación de coágulos en sangre causado por la heparina, o una disminución en los niveles de calcio circulante causada por la calcitonina. Alternativamente, se pueden medir directamente los niveles en circulación del principio activo en sí mismo.

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Descripción de las modalidades preferidas

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitación. Todas las partes se dan en peso a menos que se indique otra cosa.

Ejemplo 1 Preparación del Compuesto 1a. Preparación del compuesto 1

Se añadió ácido 4-clorosalicílico (10,0 g, 0,0579 moles) a un balón de fondo redondo de 250 ml de una boca que contiene aproximadamente 50 ml de cloruro de metileno. Se inició la agitación y se continuó con la misma durante toda la reacción. Se añadió en porciones al balón el agente de acoplamiento 1,1-carbonildiimidazol (9,39 g, 0,0579 moles) como un sólido. Se agitó la reacción a temperatura ambiente aproximadamente durante 20 minutos después de que todo el agente de acoplamiento había sido añadido y luego se añadió clorhidrato de etil-4-aminobutirato (9,7 g, 0,0579 moles) al balón con agitación. Se añadió gota a gota trietilamina (10,49 ml, 0,0752 moles) desde un embudo de adición. Se enjuagó el embudo de adición con cloruro de metileno. La reacción se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante la noche.

Se vertió la mezcla de reacción en un embudo de separación y se lavó con HCl 2 N y se formó una emulsión. Se dejó quieta la emulsión durante dos días. Se filtró luego la emulsión a través de Celite en un embudo de vidrio sinterizado. Se colocó nuevamente el filtrado en un embudo de separación para separar las capas. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio, que fue luego retirado por filtración y se concentró el filtrado por medio de un evaporador rotatorio. Se hidrolizó el material sólido resultante con NaOH 2 N, se lo almacenó durante la noche bajo refrigeración, y luego se recuperó el hidrolizado. Se aciduló la solución con HCl 2 N y se aislaron los sólidos que se formaron, se secó al vacío, y se recristalizó dos veces utilizando metanol/agua. Los sólidos cristalizaron durante la noche y fueron aislados y secados. Se disolvieron los sólidos en NaOH 2 N y se llevó el pH de la muestra hasta un pH 5 con HCl 2 N. Se recolectaron los sólidos y la HPLC reveló un pico único. Estos sólidos fueron luego recristalizados en metanol/agua, se los aisló, y luego se secó al vacío, produciendo 4,96 g (33,0%) de ácido 4-(4 cloro-2-hidroxibenzoil)aminobutírico. (C_{11}H_{12}ClNO_{4}; peso molecular 257,67.) Punto de fusión: 131-13ºC. Análisis de combustión: %C: 51,27 (calculado), 51,27 (encontrado); %H: 4,69 (calculado), 4,55 (encontrado); %N: 5,44 (calculado), 5,30 (encontrado). Análisis por RMN H: (d_{6}-DMSO): \delta 13.0, s, 1H (COOH); \delta 12.1, s, 1H (OH); \delta 8.9, t, 1H (NH); \delta 7.86, d, 1H (H en posición orto con respecto a la amida); \delta 6.98, d, 1H (H en posición orto con respecto al OH del fenol); \delta 6.96, d, 1H, (H en posición meta con respecto a la amida); \delta 3.33, m, 2H (CH_{2} adyacente al NH); \delta 2.28, t, 2H (CH_{2} adyacente a COOH); \delta 1.80, m, 2H (CH_{2} alifático en posición beta con respecto a NH y CH_{2} en posición beta con respecto a COOH).

1b. Preparación Adicional del compuesto 1 Ácido (4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanóico

Se equipó un balón de fondo redondo de cinco bocas y 22 L con un agitador mecánico, una trampa de 1 L tipo Dean-Stark con condensador de reflujo, una termocupla para lectura de la temperatura, y una manta de calentamiento. Se llevó a cabo la siguiente reacción bajo una atmósfera de nitrógeno. Se cargaron los reactivos n-butanol (5000 mL) y el ácido 4-clorosalicílico (2000 g, 11,59 moles) al balón de reacción. Se llenó la trampa tipo Dean-Stark con n-butanol (1000 mL). Se añadió ácido sulfúrico concentrado (50 g). Se calentó la mezcla de reacción a reflujo aproximadamente durante 120 horas. Se recolectaron aproximadamente 206 mL de agua en la trampa durante este tiempo. Se removió la manta de calentamiento y se le permitió a la mezcla de reacción enfriarse hasta temperatura ambiente. Se drenó la trampa tipo Dean-Stark y se la removió. Se cargó agua desionizada (1000 mL). Se agitó la mezcla bifásica durante 10 minutos. Se detuvo la agitación y se le permitió a las fases separarse. Se extrajo por sifón la fase acuosa inferior y se descartó. Se cargó una solución acuosa al 10% en peso de bicarbonato de sodio (1000 mL) en la mezcla de reacción. Se agitó la mezcla durante 10 minutos. Se analizó la mezcla de reacción con papel indicador de pH para garantizar que el pH de la solución fuera superior a 7. Se añadió agua (500 mL) a la mezcla de reacción. Se detuvo la agitación y se permitió que se separaran las fases. Se extrajo por sifón la fase acuosa inferior y se descartó. Se lavó la mezcla de reacción con otra porción de 500 mL de agua desionizada. Se programó el reactor para destilación atmosférica dentro de un recipiente tarado de 5 L. Se destiló la mezcla hasta que la temperatura del recipiente alcanzó entre 140 y 150ºC. Se conmutó el modo de destilación de una destilación a presión atmosférica a una destilación al vacío. Se disminuyó lentamente la presión en el balón de destilación hasta 100 mm Hg. La temperatura del recipiente cayó y se destiló el n-butanol y el n-butil éter (un subproducto de la reacción) restantes. Se detuvo el calentamiento y se le permitió a la mezcla de reacción enfriarse hasta temperatura ambiente. Se interrumpió el vacío con nitrógeno seco. Se transfirió el éster butílico crudo a un recipiente de 5 L utilizado para destilación al vacío. Se destiló el éster butílico crudo a una presión entre 0,2 y 0,5 mm Hg. Se descartó el precursor recolectado a una temperatura de cabeza <40ºC. Se recolectó la fracción de butil-4-cloro-2-hidroxibenzoato a una temperatura de cabeza entre 104 y 112ºC. Esta fracción tenía un peso de 2559 g. El rendimiento fue del 96%.

Se equipó un balón de fondo redondo de cinco bocas y 22 L con un agitador mecánico, un condensador de reflujo, una termocupla para lectura de la temperatura, y una manta de calentamiento. Se purgó el reactor con nitrógeno. Se cargaron en el balón de reacción butil-4-cloro-2-hidroxibenzoato (2.559 g, 1,2 moles) y el reactivo metanol (10.000 mL), y se agitaron los contenidos hasta obtener una solución. Se filtró la mezcla de reacción a través de un embudo Buchner y se lo retornó al reactor. Se incrementó la velocidad de reacción, y se añadió amoniaco gaseoso rápidamente al espacio de cabeza del reactor. Se continuó la adición de gas amoniaco hasta que la temperatura del reactor alcanzó los 45ºC. Se suspendió la adición de amoniaco y se disminuyó la velocidad de agitación. Se le permitió a la mezcla de reacción enfriarse hasta temperatura ambiente. Se repitió la adición de amoniaco gaseoso, como se describió anteriormente, hasta que se completó la reacción como lo mostró la cromatografía líquida. Fueron necesarias siete cargas de amoniaco durante cinco días para completar la reacción. Se removió aproximadamente la mitad del solvente por medio de destilación atmosférica. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se añadieron 5 L de agua desionizada. Se añadió lentamente ácido clorhídrico concentrado (aproximadamente 500 mL) al reactor hasta que el pH de la mezcla de reacción estaba entre 4 y 5. Se recolectó el precipitado resultante por medio de filtración al vacío a través de un embudo grande de vidrio sinterizado. Se lavó la torta filtrada del producto con 2.000 mL de agua desionizada, y se secó a 50ºC durante 32 horas para producir 1.797 g de 4-cloro-2-hidroxibenzamida. El rendimiento fue del 94%.

Se equipó un balón de fondo redondo de cinco bocas y 22 L con un agitador mecánico, un condensador de reflujo, un embudo para adición, una termocupla para lectura de la temperatura, y una manta de calentamiento. Se purgó el reactor con nitrógeno. Se cargaron al balón de reacción acetonitrilo (4700 mL) y 4-cloro-2-hidroxibenzamida (1.782 g, 10,4 moles) y se inició la reacción. Se cargó piridina (1.133 mL, 14,0 moles). Se enfrió la suspensión resultante de la reacción a menos de 10ºC con un baño de hielo. Se colocó cloroformato de etilo (1.091 mL, 1.237 g, 11,4 moles) en el embudo de adición y se lo cargó lentamente en la mezcla de reacción agitada de tal manera que la temperatura de la mezcla de reacción no excedió los 15ºC durante la adición. Se mantuvo la temperatura de la mezcla de reacción entre 10 y 15ºC durante 30 minutos después de que se completó la adición del cloroformato de etilo. Se removió el baño de hielo, y se calentó la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente. Se calentó luego lentamente la mezcla de reacción hasta reflujo y se mantuvo a esa temperatura durante 18 horas. El análisis por cromatografía líquida de la mezcla de reacción indicó que la reacción se completó únicamente en un 80%. Se removió aproximadamente la mitad del solvente por medio de destilación atmosférica. Se enfrió la mezcla de reacción primero hasta temperatura ambiente y luego hasta <10ºC con un baño de hielo. Se añadió piridina adicional (215 mL, 2,65 moles) a la mezcla de reacción. Se añadió lentamente cloroformato de etilo (235 g, 2,17 moles) a través de un embudo de adición a la mezcla de reacción fría. La mezcla de reacción fue mantenida entre 10 y 15ºC durante 30 minutos después de que se completó la adición del cloroformato de etilo. Se removió el baño de hielo, y se calentó la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente. Se calentó luego lentamente la mezcla de reacción hasta reflujo y se mantuvo a esa temperatura durante 18 horas, después de lo cual el análisis por cromatografía líquida indicó que se completó la reacción. La mezcla de reacción fue enfriada primero hasta temperatura ambiente y luego hasta <10ºC con un baño de hielo. Se añadió agua (1.600 mL) lentamente a través de un embudo de adición y se mantuvo la suspensión resultante a <10ºC durante 90 minutos. Se recolectó el producto sólido por medio de filtración al vacío a través de un gran embudo de vidrio sinterizado. Se lavó la torta filtrada del producto con agua desionizada, y se secó a 50ºC durante 18 horas para producir 1.914 g de 7-cloro-2H-1,3-benzoxazina-2,4(3H)-diona como un sólido de color canela. El rendimiento fue del 83%.

Se equipó un balón de fondo redondo de cinco bocas y 22 L con un agitador mecánico, un condensador de reflujo, una termocupla para lectura de la temperatura, y una manta de calentamiento. La siguiente reacción fue llevada a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron 7-cloro-2H-1,3-benzoxazina-2,4(3H)-diona (1.904 g, 9,64 moles), etil 4-bromobutirato (1.313 mL, 9,18 mol), y N,N-dimetilacetamida (4.700 mL) bajo una purga con nitrógeno. Se calentó la mezcla de reacción a 70ºC. Se cargó carbonato de sodio (1.119 g, 10,55 moles) a la solución clara en cinco porciones iguales aproximadamente durante 40 minutos. Se mantuvo la mezcla de reacción a 70ºC durante la noche. Se enfrió la reacción a 55ºC. Se removieron los sólidos inorgánicos por medio de filtración al vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado. Se enjuagó el balón de reacción con 2B-etanol (2.000 mL) y se utilizó este enjuague para lavar la torta del filtrado. Se limpió el balón de la reacción con agua desionizada. Se retornó el filtrado al balón de reacción limpio. Se enfrió el filtrado en un baño de hielo. Se añadió agua desionizada (9.400 mL) lentamente con un embudo de adición. La mezcla enfriada fue agitada durante la noche. Se recuperaron los sólidos resultantes por medio de filtración al vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado. Se lavó la torta del producto con agua desionizada. La etil 3-(4-butanoato)-7-cloro-2H-1,3-benzoxazina-2,4-(3H)-diona tenía un peso de 2.476,0 g. El rendimiento fue de 82,2%.

Se equipó un reactor de acero inoxidable de 12 L con un agitador mecánico, un condensador de reflujo, una termocupla para lectura de la temperatura, un embudo de adición y una manta de calentamiento. La siguiente reacción fue llevada a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron agua (3 L) y etil 3-(4-butanoato)-7-cloro-2H-1,3-benzoxazina-2,4-(3H)-diona (1.118 g, 3,58 moles) al reactor y se inició la agitación. Se añadió lentamente una solución de hidróxido de sodio (574 g, 14,34 moles) en agua (2 L) a la suspensión de la reacción. Se calentó la reacción a 70ºC durante 6 horas, y luego se permitió que se enfriara lentamente hasta temperatura ambiente. Se filtró la mezcla de reacción a través de un embudo Buchner.

Se equipó un balón de fondo redondo de cinco bocas y 22 L con un agitador mecánico, un condensador de reflujo, una termocupla para lectura de la temperatura, y un embudo de adición. Se cargó al reactor con agua desionizada (1.880 mL) y con ácido clorhídrico concentrado (1.197 g, 12,04 moles). El hidrolizado anterior se añadió lentamente a través de un embudo de adición a la solución ácida. Se ajustó el pH de la suspensión resultante en 3 por medio de la adición adicional de ácido clorhídrico (160 mL, 1,61 moles). Se recolectaron los sólidos del producto por medio de filtración a través de un embudo de vidrio sinterizado y se secó en un horno al vacío a 50ºC durante 24 horas para producir 1.109,3 g del ácido 4-[(4-cloro-2-hidroxi-benzoil)amino]butanóico como un sólido completamente blanco. El rendimiento fue cuantitativo.

Ejemplo 1d

Preparación de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato Sódico Anhidro

Se equipó un balón de fondo redondo de cinco bocas de 22 L con un agitador mecánico, un condensador de reflujo, una termocupla para lectura de la temperatura, y una manta de calentamiento. La siguiente reacción fue llevada a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron el reactivo acetona (13.000 mL) y el ácido 4-[(4-cloro-2-hidroxi-benzoil)amino]butanóico (500,0 g, 1,94 moles) al reactor y se inició la agitación. Se calentó la suspensión de la reacción a 50ºC hasta que se obtuvo una solución brumosa de color marrón. Se bombeó la solución caliente a través de un filtro caliente a presión que tenía papel Whatman #1 dentro de un reactor limpio de 22 L. Se calentó el filtrado de color amarillo claro a 50ºC mientras se agitaba. Se cargó en el reactor una solución de hidróxido de sodio (acuoso al 50%; 155 g, 1,94 moles) mientras se mantenía una agitación vigorosa. Después de que se completó la adición de base, se calentó el reactor reflujo (60ºC) durante 2,5 horas y luego se permitió que se enfriara lentamente hasta temperatura ambiente. Se aisló el producto por medio de filtración al vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado y se secó en un horno al vacío a 50ºC durante 24 horas para producir 527,3 g de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato sódico como un sólido de color completamente blanco. El rendimiento fue del 97,2%.

Ejemplo 1e

Preparación de un Hidrato de Canal de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino]butanoato sódico mono hidratado

Se equipó un balón de 22 L con un agitador mecánico. Se añadieron agua desionizada (2.000 mL) y ácido 4-[(4-chloro-2-hydroxybenzoyl)amino]butanóico (380,0 g, 1,47 mol) y se inició la agitación. Se añadió una solución de hidróxido de sodio (59,0 g, 1,48 moles) en agua (500 mL) al reactor. Se añadió agua al reactor (1500 mL), y se calentó la suspensión resultante hasta que se obtuvo una solución completa. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente, y luego se concentró hasta sequedad a presión reducida. Se rasparon los sólidos resultantes del balón y se secó al vacío a 50ºC para producir 401,2 g de un hidrato de canal de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino)-butanoato como un sólido completamente blanco. El rendimiento fue del 96,9%.

Ejemplo 1f

Preparación de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino]butanoato sódico a través del solvato de isopropanol

Se equipó un balón de fondo redondo de cuatro bocas de un litro con un agitador mecánico, un condensador de reflujo, una termocupla para lectura de la temperatura, y una manta de calentamiento. La siguiente reacción fue llevada a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno seco. Se cargaron isopropanol (400 mL) y el ácido 4-[(4-cloro-2-hidroxi-benzoil)amino]butanóico (25,0 g, 0,09 mol) en el reactor y se inició la agitación. Se calentó la suspensión de la reacción a 50ºC hasta que se obtuvo una solución brumosa de color marrón. Se filtró la solución caliente a través de un filtro caliente a presión que tenía papel Whatman #1 dentro de un reactor limpio de 1 L. Se calentó el filtrado de color amarillo claro a 62ºC mientras se agitaba. Se cargó el reactor con una solución de hidróxido de sodio (acuoso al 50%; 7,2 g, 0,09 moles) mientras se mantenía una agitación vigorosa. Después de que se completó la adición de base, se calentó el reactor a reflujo (72ºC) y luego se permitió que se enfriara lentamente hasta temperatura ambiente. Se aisló el producto por medio de filtración al vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado y se secó al vacío a 50ºC durante 24 horas para producir 23,16 g de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)amino]butanoato sódico como un sólido de color completamente blanco. El rendimiento fue del 92%.

Ejemplo 1g

Preparación de la Cápsula

Se prepararon las cápsulas para la dosificación de primates con un contenido de la sal monosódica del compuesto 1 (como se preparó en el ejemplo 1d) e insulina, de la siguiente manera. La sal monosódica del compuesto 1 y cristales de insulina humana QA307X cinc: se tamizó primero al derivado de proinsulina (origen de ADN recombinante) (disponible con Eli-Lilly & Co. De Indianápolis, IN) a través de un tamiz estándar malla 35 de Tyler y la cantidad pesada requerida. Se mezclaron la insulina y la sal monosódica del compuesto 1 tamizada utilizando un método geométrico de tamizado en un mortero de vidrio de tamaño adecuado. Se mezclaron bien los materiales en el mortero con un pistilo de vidrio. Se utilizó una espátula para raspar las paredes del mortero. Se trasfirió la formulación resultante a un bote plástico de pesaje para rellenar la cápsula. Se empacó a mano la formulación en cápsulas de gelatina dura Torpac de tamaño #0 (disponibles con Torpac, Inc. de Fairfield, NJ). El peso del relleno para cada cápsula dependió del peso individual de cada animal. Las dosis del compuesto 1 en cada cápsula fueron de 100 mg/kg, 75 mg/kg y 50 mg/kg (como una sal monosódica). Las dosis de la cápsula de insulina fueron de 0,25 hasta 0,5 mg
por kg.

Ejemplo 2 Insulina - Administración Oral A. Estudios con Ratas

Las composiciones para dosificación oral (PO) del compuesto para administración del agente (preparadas como en el Ejemplo 1a ó 1b como se indicó abajo) y la insulina recombinante humana de cinc (disponible con Calbiochem - Novabiochem Corp., La Jolla, CA (Catálogo # 407694)) fueron preparadas en agua desionizada. Típicamente, se añadieron 500 mg del compuesto para administración del agente a 1,5 ml de agua. El ácido libre del compuesto para administración del agente fue convertido a la sal sódica por medio de agitación de la solución resultante y añadiendo un equivalente de hidróxido de sodio. Se agitó la solución por medio de un vórtice, luego se la calentó (aproximadamente a 37ºC) y se la sonicó. Se ajustó el pH aproximadamente entre 7 y 8,5 con NaOH o HCl. Se añadió NaOH adicional, si era necesario, para lograr una solubilidad uniforme, y se ajustó nuevamente el pH. (por ejemplo, para el compuesto 1a, se añadieron un total de 258,5 ml de NaOH 10 N a 501 mg del compuesto en 1,5 ml de agua, pH final 7,73). Se añadió luego agua para llevar el volumen total aproximadamente hasta 2,4 ml y se agitó por medio de un vórtice. Se añadieron aproximadamente 1,25 mg de insulina a partir de una solución patrón de insulina (15 mg/ml elaborados a partir de 0,5409 g de insulina y 18 ml de agua desionizada, ajustando con HCl y NaOH hasta pH 8,15 y hasta obtener una solución clara utilizando 40 ml de HCl concentrado, 25 ml de NaOH 10 N y 50 ml de NaOH 1 N) a la solución y se mezcló invirtiendo el recipiente. La dosis final del compuesto para administración del agente, la dosis de insulina y las cantidades de las dosis en volumen aparecen enlistados más abajo en la Tabla 1.

Los protocolos para dosificación y muestreo fueron los siguientes. Se mantuvo en ayunas a las ratas macho Sprague-Dawley con un peso aproximadamente entre 200-250 g durante 24 horas y se administró ketamina (44 mg/kg) y clorpromazina (1,5 mg/kg) 15 minutos antes de la dosificación y nuevamente según se requirió para mantener la anestesia. A un grupo de dosificación de cinco animales se le administró una de las soluciones de dosificación. Para dosificación oral, se adaptó un catéter francés Rusch 8 de 11 cm a una jeringa de 1 ml con la punta de una pipeta. Se llenó la jeringa con solución de dosificación retirando la solución a través del catéter, que fue luego secado. Se colocó el catéter por debajo del esófago dejando 1 cm del tubo fuera de los incisivos. Se administró la solución presionando el émbolo de la jeringa.

Se recolectaron las muestras de sangre en forma serial a partir de la arteria de la cola, típicamente a los = 15, 30, 60, 120 y 180 minutos después de la administración. Se determinaron los niveles de insulina en suero con un Kit para Análisis de Insulina por ELISA (Kit # DSL-10-1600 de Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX), modificando el protocolo estándar con el propósito de optimizar la sensibilidad y el rango lineal de la curva estándar para los volúmenes y concentraciones de las muestras utilizadas en el presente protocolo. Se midieron las concentraciones de insulina humana en suero (\muU/ml) para cada tiempo para cada uno de los cinco animales en cada grupo de dosificación. Se promediaron los cinco valores para cada tiempo y se graficaron los resultados como la concentración de insulina en suero versus tiempo. El máximo (pico) y el área bajo la curva (AUC) son reportados más abajo en la Tabla 1. Experimentos previos revelaron niveles no medibles de insulina humana después de la dosificación oral únicamente con insulina humana.

TABLA 1 Insulina - Administración Oral

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B. Estudios con Monos

Todos los protocolos con animales cumplen con los "Principios sobre el Cuidado de los Animales de Laboratorio" y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Uso y Cuidado de los Animales (ACUC).

El protocolo de dosificación para la administración de las cápsulas a cada animal fue el siguiente. Se obtuvo la línea base de las muestras de plasma de los animales antes de la dosificación. Se sometieron a ayuno a grupos de cuatro monos cynomolgus, dos machos y dos hembras, con un peso de 2 - 3 kg durante 4 horas antes de la dosificación y hasta 2 horas después de la dosificación. Los animales fueron anestesiados con una inyección intramuscular de 10 mg/kg de clorhidrato de ketamina inmediatamente antes de la dosificación. Cada animal recibió diferentes dosis del compuesto 1 (25 - 100 mg/kg) en combinación con diferentes dosis de insulina. 0,25 - 0,5 mg/kg de insulina por cada cápsula. Había agua disponible durante todo el período de dosificación y se pusieron a disposición del animal 400 ml de jugo durante la noche antes de la dosificación y durante todo el período de dosificación. Se restringió al animal en un cabestrillo de control. Se colocó una cápsula en una pistola para píldoras, que es una herramienta plástica con un émbolo de encaje y una punta divisora de caucho para acomodar una cápsula. Se insertó la pistola de píldoras en el esófago del animal. Se oprimió el émbolo de la pistola de píldoras para empujar la cápsula fuera de la punta de caucho dentro del esófago. Se retiró luego la pistola de píldoras. Se mantuvo cerrada la boca de los animales y se administraron aproximadamente 5 ml de agua obtenida por ósmosis reversa en la boca por un costado para inducir un reflejo que los obliga a tragar. Se provocó adicionalmente una sensación de estrangulamiento en la garganta del animal para inducir el reflejo de tragar.

Se recolectaron muestras de sangre citrada (de 1 mL cada una) por medio de punción en la vena a partir de una vena apropiada, 1 hora antes de la dosificación y a los 10, 20, 30, 40 y 50 minutos, y 1, 1,5, 2, 3, 4 y 6 horas después de la dosificación. Cada muestra recogida de plasma fue dividida en dos porciones. Una porción fue congelada a -80ºC y enviada a otro sitio para el ensayo de la insulina. La otra porción fue utilizada en el ensayo de la glucosa en sangre. Cuatro monos también recibieron insulina en forma subcutánea (0,02 mg/kg). Se recolectaron muestras de sangre y se las analizó como se describió anteriormente.

Análisis de Insulina. Se midieron los niveles de insulina en plasma utilizando el Kit de Análisis de Insulina por ELISA (DSL, Webster, TX).

Análisis de Glucosa. Las mediciones de glucosa en sangre se llevaron a cabo utilizando el Sistema de Monitoreo de Glucosa ONETOUCH® de Live Scan Inc., Newtown, PA.

Los resultados se muestran en la Tabla 1A a continuación.

TABLA 1A Administración Oral de Insulina a Monos

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Ejemplo 3 Administración Oral de Cromolín

Se prepararon soluciones de dosificación que contienen un compuesto para administración del agente (preparado como en el Ejemplo 1b) y cromolín, sal disódica (cromolín) (Sigma, Milwaukee, Wisconsin) en agua desionizada. El ácido libre del compuesto para administración del agente fue convertido en la sal de sodio con un equivalente de hidróxido de sodio. Se sometió la mezcla a agitación tipo vórtice y se la colocó en un sonicador (aproximadamente 37ºC). Se ajustó el pH aproximadamente en 7 - 7,5 con NaOH acuoso. Se añadió NaOH adicional, si fuera necesario, para lograr una solubilidad uniforme, y ajustar nuevamente el pH. Se sometió la mezcla a una agitación tipo vórtice para producir una solución uniforme, utilizando también sonicación y calor si fuera necesario. Se mezcló una solución del compuesto para administración del agente con cromolín a partir de una solución patrón (175 mg de cromolín/ml en agua desionizada, se ajusta el pH, si fuera necesario, con NaOH o HCl aproximadamente en 7,0, se almacenó la solución patrón envuelta en papel aluminio y congelada, luego descongelada y calentada aproximadamente hasta 30ºC antes de utilizarla). Se agitó la mezcla por medio de un vórtice para producir una solución uniforme, utilizando también sonicación y calor si fuera necesario. Se ajustó el pH aproximadamente en 7 - 7,5 con NaOH acuoso. Se diluyó luego la solución con agua hasta el volumen y la concentración deseados (usualmente 2,0 ml) y se almacenó envolviendo en papel aluminio antes de usar. Las dosis finales del compuesto para administración del agente y de cromolín, y los volúmenes de las dosis se enlistan más bajo en la Tabla 2.

Los protocolos para dosificación y muestreo fueron los siguientes. Se mantuvo en ayunas a las ratas macho Sprague-Dawley con un peso aproximadamente entre 200-250 g durante 24 horas y se administró ketamina (44 mg/kg) y clorpromazina (1,5 mg/kg) 15 minutos antes de la dosificación y nuevamente según se requirió para mantener la anestesia. A un grupo de dosificación de cinco animales se le administró una de las soluciones de dosificación. Se adaptó un catéter francés Rusch 8 de 11 cm a una jeringa de 1 ml con la punta de una pipeta. Se llenó la jeringa con solución de dosificación retirando la solución a través del catéter, que fue luego secado. Se colocó el catéter por debajo del esófago dejando 1 cm del tubo fuera de los incisivos. Se administró la solución presionando el émbolo de la
jeringa.

Se recolectaron las muestras de sangre a través de la arteria de la cola, típicamente a las 0,25, 0,5, 1,0 y 1,5 horas después de la dosificación. Se midieron las concentraciones de cromolín en suero por medio de HPLC. Se prepararon las muestras de la siguiente manera: se combinaron 100 \mul de suero con 100 \mul de HCl 3 N y 300 \mul de acetato de etilo en un tubo eppendorf. Se sometió el tubo a agitación tipo vórtice durante 10 minutos y luego se centrifugó durante 10 minutos a 10.000 rpm. Se trasfirieron 200 \mul de una capa de acetato de etilo a un tubo eppendorf que contiene 67 \mul de amortiguador de fosfato 0,1 M. Se sometió el tubo a agitación tipo vórtice durante 10 minutos y luego se centrifugó durante 10 minutos a 10.000 rpm. Se trasfirió luego la capa de amortiguador de fosfato a un vial de HPLC y se la inyectó dentro del HPLC (columna = Keystone Exsil Amino 150 x 2 mm i.d., 5 \mum, 100 \ring{A} (Keystone Scientific Products, Inc.); fase móvil = 35% de amortiguador (KH_{2}PO_{4} 68 mM ajustado a un pH 3,0 con H_{3}PO_{4} al 85%)/65% de acetonitrilo; volumen de la inyección = 10 \mul; velocidad de flujo = 0,30 ml/minuto; tiempo de retención del cromolín = 5,5 minutos; absorbancia detectada a 240 nm). Estudios previos indicaron valores de línea base aproximadamente de cero.

Se promediaron los resultados de los animales en cada grupo para cada tiempo y el más alto de estos promedios (esto es, el pico promedio de la concentración de cromolín en suero) se reporta a continuación en la Tabla 2.

TABLA 2 Administración Oral de Cromolín

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Ejemplo 4 Administración Oral de la Hormona Recombinante de Crecimiento Humano (rhGH)

Las soluciones de dosificación por alimentación oral forzada (PO) del compuesto para administración del agente (preparadas como en el Ejemplo 1a ó 1b como se indica en la Tabla 3 más abajo) y se prepararon rhGH en amortiguador de fosfato. El ácido libre del compuesto para administración del agente fue convertido en la sal de sodio con un equivalente de hidróxido de sodio. Típicamente, se preparó una solución del compuesto en amortiguador de fosfato y se agitó, añadiendo un equivalente de hidróxido de sodio (1,0 N) cuando se elabora la sal de sodio. Adicionalmente, se añadió NaOH, si fuera necesario, para lograr una solubilidad uniforme, y se ajusta nuevamente el pH. Se prepararon las soluciones finales de dosificación mezclando la solución del compuesto con una solución patrón de rhGH (15 mg de rhGH/ml elaborada por medio de la mezcla de los siguientes componentes en polvo: 15 mg de rhGH, 75 mg de D-manitol, 15 mg de glicina y 3,39 mg de fosfato dibásico de sodio, diluyendo luego con glicerol al 2%) y diluyendo hasta el volumen deseado (usualmente 3,0 ml). Las dosis del compuesto y de la rhGH y los volúmenes de las dosis se enlistan más abajo en la Tabla 3.

La dosificación típica y los protocolos de muestreo fueron los siguientes. Se mantuvo en ayunas a las ratas macho Sprague-Dawley con un peso aproximadamente entre 200-250 g durante 24 horas y se administró ketamina (44 mg/kg) y clorpromazina (1,5 mg/kg) 15 minutos antes de la dosificación y nuevamente según se requirió para mantener la anestesia. A un grupo de dosificación de cinco animales se le administró una de las soluciones de dosificación. Para dosificación oral, se adaptó un catéter francés Rusch 8 de 11 cm a una jeringa de 1 ml con una punta de una pipeta. Se llenó la jeringa con solución de dosificación retirando la solución a través del catéter, que fue luego secado. Se colocó el catéter por debajo del esófago dejando 1 cm del tubo fuera de los incisivos. Se administró la solución presionando el émbolo de la jeringa.

Se recolectaron las muestras de sangre en forma serial a partir de la arteria de la cola, típicamente a los = 15, 30, 45 y 60 minutos después de la administración. Se cuantificaron las concentraciones en suero de la rhGH por medio de un kit para análisis de inmunoensayo de la rhGH (Kit # K1F4015 de Genzyme Corporation Inc., Cambridge, MA). Estudios previos indicaron valores de línea base aproximadamente de cero.

Se promediaron los resultados de los animales en cada grupo para cada tiempo. El más alto de estos promedios (esto es, el pico promedio de la concentración de rhGH en suero) se reporta más abajo en la Tabla 3. (En los casos en los que no se reporta más abajo la desviación estándar (SD) o el error estándar (SE), se reunieron las cinco muestras de cada período de tiempo antes del análisis).

TABLA 3 Administración Oral de la rhGH

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Ejemplo 5 Administración Oral de Interferón

Las soluciones de dosificación del compuesto para administración del agente (preparadas como en el Ejemplo 1b) y del interferón humano (IFN) se prepararon en agua desionizada. El ácido libre del compuesto para administración del agente fue convertido en la sal de sodio con un equivalente de hidróxido de sodio. Típicamente, se preparó una solución del compuesto para administración del agente en agua y se agitó, añadiendo un equivalente de hidróxido de sodio (1,0 N) cuando se elaboró la sal de sodio. Se sometió la mezcla a agitación tipo vórtice y se la colocó en un sonicador (aproximadamente 37ºC). Se ajustó el pH aproximadamente entre 7,0 y 8,5 con NaOH acuoso. Se sometió la mezcla a agitación tipo vórtice para producir una suspensión o una solución uniforme, utilizando también sonicación o calor si hubiera sido necesario. Se añadió NaOH adicional, si hubiera sido necesario, para lograr una solubilidad uniforme, y se ajustó nuevamente el pH. Se sometió a la solución del compuesto para administración del agente a una agitación tipo vórtice con una solución patrón de IFN (aproximadamente 22,0 a 27,5 mg/ml en solución salina amortiguada con fosfato) y se diluyó hasta el volumen deseado (usualmente 3,0 ml). Las dosis finales del compuesto para administración del agente y de IFN, y los volúmenes de las dosis se enlistan más bajo en la
Tabla 4.

Los protocolos típicos para dosificación y muestreo fueron los siguientes. Se mantuvo en ayunas a las ratas macho Sprague-Dawley con un peso aproximadamente entre 200-250 g durante 24 horas y se administró ketamina (44 mg/kg) y clorpromazina (1,5 mg/kg) 15 minutos antes de la dosificación y nuevamente según se requirió para mantener la anestesia. A un grupo de dosificación de cinco animales se le administró una de las soluciones de dosificación. Se adaptó un catéter francés Rusch 8 de 11 cm a una jeringa de 1 ml con la punta de una pipeta. Se llenó la jeringa con solución de dosificación retirando la solución a través del catéter, que fue luego secado. Se colocó el catéter por debajo del esófago dejando 1 cm del tubo fuera de los incisivos. Se administró la solución presionando el émbolo de la jeringa.

Se recolectaron las muestras de sangre en forma serial a partir de la arteria de la cola, típicamente a los = 0, 15, 30, 45, 60 y 90 minutos después de la administración. Se cuantificaron las concentraciones de IFN en suero utilizando Cytoscreen Immunoassay Kit para IFN-alfa humano (catálogo # KHC4012 de Biosource International, Camarillo, CA). Estudios previos indicaron valores de línea base aproximadamente de cero. Se promediaron los resultados de los animales en cada grupo para cada tiempo. El más alto de estos promedios (esto es, el pico promedio de la concentración de IFN en suero) se reporta a continuación en la Tabla 4.

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TABLA 4 Administración Oral de Interferón

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Las patentes anteriormente mencionadas, solicitudes, métodos de análisis, y publicaciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

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Referencias citadas en la descripción Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

\newpage

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5401516 A [0006]

\bullet WO 9630036 A [0007] [0017]

\bullet US 5443841 A [0006]

\bullet WO 9834632 A [0008]

\bullet US RE35862 E [0006]

\bullet WO 9736480 A [0017]

\bullet US 5629020 A [0006]

\bullet US 5650386 A [0017]

\bullet US 5643957 A [0006] [0017]

\bullet US 4421685 A [0023]

\bullet US 5766633 A [0006]

\bullet US 5474978 A [0023]

\bullet US 5776888 A [0006]

\bullet US 5534488 A [0023]

\bullet US 5866536 A [0006].

Literatura citada en la descripción que no es de patente

\bullet T.W. GREENE. Protecting Groups in Organic Synthesis. Wiley, 1981 [0017].

Claims (33)

1. Un compuesto de fórmula

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o una sal del mismo.

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2. Una composición que comprende:

(A) un agente biológicamente activo; y

(B) un compuesto que tiene la fórmula

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o una sal del mismo, o una mezcla de los mismos.

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3. La composición de la reivindicación 2, en donde el agente biológicamente activo contiene al menos una proteína, un péptido, una hormona, un polisacárido, un mucopolisacárido, un carbohidrato, o un lípido.

4. La composición de la reivindicación 2, en donde el agente biológicamente activo es seleccionado del grupo que consiste de:

hormonas de crecimiento, hormonas de crecimiento humano, hormonas recombinantes de crecimiento humano, hormonas de crecimiento bovino, hormonas de crecimiento porcino, hormonas para la liberación de la hormona de crecimiento, interferones, interferón \alpha, interferón \beta, interferón \gamma, interleuquina 1, interleuquina 2, insulina, insulina porcina, insulina bovina, insulina humana, insulina humana recombinante, factor de crecimiento tipo insulina, factor 1 de crecimiento tipo insulina, heparina, heparina no fraccionada, heparinoides, dermatanos, condroitinas, heparina de bajo peso molecular, heparina de muy bajo peso molecular, heparina de peso molecular ultra bajo, calcitonina, calcitonina de salmón, calcitonina de anguila, calcitonina humana; eritropoyetina (EPO), factor naturético atrial, antígenos, anticuerpos monoclonales, somatostatina, inhibidores de proteasa, adrenocorticotropina, hormona para liberación de gonadotropina, oxitocina, hormona para la liberación de hormona luteinizante, hormona para estimulación del folículo, glucocerebrosidasa, trombopoyetina, filgrastima, prostaglandinas, ciclosporina, vasopresina, cromolín sódico, cromoglicato sódico, cromoglicato disódico, vancomicina, desferrioxamina, hormona paratiroidea, fragmentos de la hormona paratiroidea, antimicrobianos, agentes antihongos, vitaminas; análogos, fragmentos, miméticos y derivados modificados de polietilén glicol de estos compuestos; y cualquier combinación de los mismos.

5. La composición de la reivindicación 2, en donde el agente biológicamente activo comprende insulina, hormona de crecimiento humano, interferón, cromolín sódico o combinaciones de los mismos.

6. La composición de la reivindicación 2, en donde el agente biológicamente activo comprende insulina.

7. La composición de la reivindicación 2, en donde el agente biológicamente activo comprende interferón.

\newpage

8. Una forma de dosificación unitaria que comprende:

(A) la composición de la reivindicación 2; y

(B):

(a)

un excipiente,

(b)

un diluyente,

(c)

un desintegrante,

(d)

un lubricante,

(e)

un plastificante,

(f)

un colorante,

(g)

un vehículo de dosificación, o

(h)

cualquier combinación de los mismos.

9. La forma de dosificación unitaria de la reivindicación 8, en donde el agente biológicamente activo comprende al menos una proteína, un polipéptido, un péptido, una hormona, un polisacárido, un mucopolisacárido, un carbohidrato, o un lípido.

10. La forma de dosificación unitaria de la reivindicación 8, en donde el agente biológicamente activo es seleccionado del grupo que consiste de:

hormonas de crecimiento, hormonas de crecimiento humano, hormonas recombinantes de crecimiento humano, hormonas de crecimiento bovino, hormonas de crecimiento porcino, hormonas para la liberación de la hormona de crecimiento, interferones, interferón \alpha, interferón \beta, interferón \gamma, interleuquina 1, interleuquina 2, insulina, insulina porcina, insulina bovina, insulina humana, insulina humana recombinante, factor de crecimiento tipo insulina, factor 1 de crecimiento tipo insulina, heparina, heparina no fraccionada, heparinoides, dermatanos, condroitinas, heparina de bajo peso molecular, heparina de muy bajo peso molecular, heparina de peso molecular ultra bajo, calcitonina, calcitonina de salmón, calcitonina de anguila, calcitonina humana; eritropoyetina, factor naturético atrial, antígenos, anticuerpos monoclonales, somatostatina, inhibidores de proteasa, adrenocorticotropina, hormona para liberación de gonadotropina, oxitocina, hormona para la liberación de hormona luteinizante, hormona para estimulación del folículo, glucocerebrosidasa, trombopoyetina, filgrastima, prostaglandinas, ciclosporina, vasopresina, cromolín sódico, cromoglicato sódico, cromoglicato disódico, vancomicina, desferrioxamina, hormona paratiroidea, fragmentos de la hormona paratiroidea, antimicrobianos, agentes antihongos, vitaminas; análogos, fragmentos, miméticos y derivados modificados de polietilén glicol de estos compuestos; y cualquier combinación de los mismos.

11. La forma de dosificación unitaria de la reivindicación 8, en donde el agente biológicamente activo comprende insulina, hormona de crecimiento humano, interferón, cromolín sódico o combinaciones de los mismos.

12. La forma de dosificación unitaria de la reivindicación 8, en donde el agente biológicamente activo comprende insulina.

13. La forma de dosificación unitaria de la reivindicación 8, en donde el agente biológicamente activo comprende interferón.

14. La forma de dosificación unitaria de la reivindicación 8, en donde la forma de dosificación unitaria es en la forma de una tableta, una cápsula, una partícula, un polvo, una bolsita, o un líquido.

15. La forma de dosificación unitaria de la reivindicación 8, en donde el vehículo de dosificación es un líquido seleccionado del grupo que consiste de agua, propilén glicol acuoso al 25%, amortiguador de fosfato, 1,2-propanodiol, etanol, y cualquier combinación de los mismos.

16. Un método para preparar una composición que comprende mezclar:

(A)

al menos un agente biológicamente activo,

(B)

el compuesto de la reivindicación 1, y

(C)

opcionalmente, un vehículo de dosificación.

\newpage

17. Un compuesto anhidro que tiene la fórmula

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11

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o una sal del mismo.

18. 4-[(4-cloro-2-hidroxi-benzoil)amino]butanoato sódico anhidro.

19. El compuesto de la reivindicación 1, en donde la sal es una sal monosódica.

20. Un hidrato de canal de 4-[(4-cloro-2-hidroxibenzoil)-amino)-butanoato que tiene un contenido de agua aproximadamente desde un 3% aproximadamente hasta un 6% en peso.

21. Solvato del isopropanol de 4-[(4-cloro-2-hidroxi-benzoil)amino]butanoato sódico.

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22. Una composición que comprende:

(a) un agente biológicamente activo; y

(b) el compuesto anhidro de la reivindicación 18.

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23. Una composición que comprende:

(a) un agente biológicamente activo; y

(b) el hidrato de canal de la reivindicación 20.

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24. Una composición que comprende:

(a) un agente biológicamente activo; y

(b) el solvato de isopropanol de la reivindicación 21.

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25. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el agente biológicamente activo es insulina.

26. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el agente biológicamente activo es hormona de crecimiento humano.

27. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el agente biológicamente activo es hormona recombinante de crecimiento humano.

28. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el agente biológicamente activo es cromolín sódico.

29. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el agente biológicamente activo es heparina.

30. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el agente biológicamente activo es calcitonina.

31. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el agente biológicamente activo es hormona paratiroidea.

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32. Una forma de dosificación sólida que comprende:

(A) la composición de cualquiera de las reivindicaciones 22-31; y

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(B):

(a)

un excipiente,

(b)

un diluyente,

(c)

un desintegrante,

(d)

un lubricante,

(e)

un plastificante,

(f)

un colorante,

(g)

un vehículo de dosificación, o

(h)

cualquier combinación de los mismos.

33. La forma de dosificación sólida de la reivindicación 32, en donde la forma de dosificación sólida unitaria es una tableta o una cápsula.