PT96841A

PT96841A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas de insulina contendo novos complexos insulinicos de co(iii)

Info

Publication number: PT96841A
Application number: PT96841A
Authority: PT
Inventors: Jorgen Frederik Hansen; Ulla Ribel-Madsen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1990-02-21
Filing date: 1991-02-21
Publication date: 1991-11-29
Also published as: AU641991B2; NZ237176A; WO1991012817A1; EP0516704B1; DK45590D0; ZA911279B; CA2075982A1; DE69100626D1; AU7337891A; IE910579A1; HUT63858A; EP0516704A1; JPH05503940A; HU9202721D0

Description

NOVO NORDISK A/S "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DE INSULINA CONTENDO NOVOS COMPLEXOS INSULlNICOS DE CO(III)"

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO 1. Âmbito da presente invenção A presente invenção refere-se a composições de insulina com acção prolongada, solúveis a pH fisiológico e que contem complexos insulínicos de Co(III) e â utilização desses complexos de insulina para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de diabetes mellitus. 2. Descrição da técnica anterior

Tratam-se muitos pacientes diabéticos com injecções de insulina várias vezes por dia num regimen constituído por uma ou duas injecções diárias de uma insulina de acção prolongada para cobrir as necessidades básicas, complementadas por injecções de uma insulina de actuação rápida que, por sua vez, cobre as necessi dades associadas às refeições.

As composições de insulina de acção prolongada são bem conhecidas na especialidade. Assim um dos tipos principais de -2- composições de insulina de acção prolongada engloba suspensões aquosas injectáveis de cristais de insulina ou de insulina amorfa. Nestas composições os compostos de insulina usualmente utilizados são a insulina de protamina, a insulina de zinco ou a insulina de protamina de zinco.

Existem algumas desvantagens associadas à utilização de suspensões de insulina. Deste modo, para assegurar uma dosagem rigorosa, as partículas de insulina devem ser suspensas de um modo homogéneo, agitando suavemente, antes de se retirar um determinado volume de uma ampola ou de se expelir o referido volume a partir de um cartuxo. Também para o armazenamento de suspensões de insulina a temperatura deve ser mantida dentro de limites mais restritos do que para as soluções de insulina, para evitar a formação de grânulos ou a coagulação.

Embora se pensasse anteriormente que as protaminas não eram imunogénicas, actualmente pensa-se que as protaminas podem ser imunogénicas no homem e que a sua utilização para finalidades médicas pode conduzir à formação de anticorpos (Samuel, T. e outros, "Studies on the immunogenecity of protamines in humans and experimental animais by means of a micro-complement fixation test.", Clin. Exp. Immunol. 33 /1978) 252-260).

Também se verificou que o próprio complexo protamina-insu-lina é por si mesmo imunogénico (Kurtz, A.B. e outros, "Circulating -3-

IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins", Diabetologica, 25 (1983) 322-324). Deste modo, com alguns pacientes deve evitar-se a utilização de composições de insulina de acção prolongada contendo protaminas.

Um outro tipo de composições de insulina de acção prolongada consiste em soluções que possuem um pH inferior ao pH fisiológico a partir do qual a insulina precipita devido ao aumento de pH quando se injecta a solução.

Uma desvantagem associada a estas soluções consiste no facto da distribuição do tamanho das partículas do precipitado formado no tecido a quando da injecção e, deste modo, o tempo de medicação depende do fluxo sanguíneo no sítio da injecção e de outros parâmetros de algum modo imprevisíveis.

Uma outra desvantagem, consiste no facto de existir a possibilidade de as partículas sólidas de insulina actuarem como um agente irritante local, originando inflamação do tecido no sítio da injecção. A administraçao de uma composição de insulina, de acordo com a técnica anterior, numa dose relativamente elevada pode sob condições adversas conduzir a hipoglicémia quando, por exemplo, a absorção ocorre mais rapidamente no sítio da injecção do que o pretendido. A hipoglicémia pode instalar-se de um modo bastante -4- rápido e os pacientes hipoglicémicos podem necessitar de tratamento imediato, uma vez que a hipoglicémia, se não for tratada, pode ser fatal.

De acordo com o anteriormente exposto, existe uma necessidade de composiçoes de insulina injectãveis, de acção prolongada, que consistam em soluções que contenham insulinas que permaneçam em solução, após a injecção e possuam propriedades inflamatórias e imunogénicas mínimas e que possuam uma tendência reduzida para causar hipoglicémia.

SUMARIO DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção baseia-se no facto surpreendente de determinados complexos de insulina de cobalto no estado de oxidação +3, também - de acordo com a nomenclatura de Stock -designadas como Co(III), possuírem um efeito de insulina de acção prolongada in vivo. Os complexos são solúveis a pH fisiológico. Deste modo, a injecção das suas soluções não conduz â formação de partículas sólidas inflamatórias nos tecidos no sítio da injecção. Quando se administraram as composições, de acordo com a presente invenção, a coelhos em doses que originariam normalmente hipoglicémia não se verificou qualquer sinal de hipoglicémia.

No contexto da presente invenção o termo insulina quando utilizado no sentido plural ou genérico abrange tanto as insulinas naturais como os análogos de insulina. -5-

No seu aspecto geral, a presente invenção proporciona novas composições de insulina de acçao prolongada que são constituídas por um complexo de insulina de fórmula geral (Ins)6(Co(III))2(L)m(M)n (I) na qual Ins representa uma insulina natural ou um análogo de insulina que possui o efeito da insulina nos seres humanos, L representa um ligando contendo azoto que se pode ligar ao Co(III) através de um átomo de azoto, M representa um ligando não azotado, tal como a molécula de água ou um anião que se pode ligar a Co(III) com a condição de que se n for igual a 2 ou superior, o símbolo M possa representar diferentes espécies ao mesmo tempo; A representa zero ou qualquer número inteiro compreendido entre 1 e 6 e o símbolo m representa 6-n quando L representa um ligando monodentado ou (6-n)/2 quando L representa um ligando bidentado.

Um primeiro grupo de composições preferenciais, de acordo com a presente invenção, contém complexos de insulina de fórmula geral I em que o símbolo m representa zero.

Um outro grupo de composições preferidas de acordo com a presente invenção contém complexos de insulina de fórmula geral I na qual o símbolo M representa água. -6- ϋπι outro grupo de composições preferenciais, de acordo com a presente invenção, contém complexos de insulina de fórmula geral I na qual Ins representa insulina de bovino.

Um outro grupo de composições preferenciais, de acordo com a presente invenção, contém complexos de insulina de fórmula geral I na qual Ins representa insulina de suíno.

Um outro grupo de composições preferenciais, de acordo com a presente invenção, contém complexos de insulina de fórmula geral I na qual Ins representa insulina humana.

Um outro grupo de composições preferenciais, de acordo com a presente invenção, contém complexos de insulina de fórmula geral I numa concentração compreendida entre 10 IU e 2000 IU de preferência entre 40 IU e 200 IU por ml.

Os ligandos coordenam Co(III) com tuna afinidade muito variável e por isso se considera que esta variação pode ser utilizada para se produzirem composições com características de libertação previamente fixadas.

Na fórmula geral I o símbolo L pode representar, por exemplo, amoníaco, TRIS, metilamina, etilamina, propilamina, etilenodiamina, 1,2-diaminopropano, 1,3-diaminopropano, imidazol ou histidina. -7-

Na formula geral I o símbolo M pode, por exemplo, representar água, OH", Cl”, Br", i", S0^~, HSO^”, PO^”, HPO^” ou ^PO^", de preferencia ^0, OH” ou Cl”.

As composições, de acordo com a presente invenção, são úteis para o tratamento de diabetes mellitus.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO A procura de novas insulinas e de composiçoes de insulina com propriedades melhoradas existe desde que se descobriu a insulina e efectua-se o rastreio básico de novas insulinas potenciais em modelos in vitro.

Parece evidente que uma condição necessária para que o fármaco possa exercer a sua actividade reside na ligação ao seu receptor. Deste modo, num modelo de rastreio básico investiga-se a ligação de novas insulinas potenciais ao receptor da insulina, in vitro. Descobriu-se, até à data, que novas insulinas potenciais com uma boa actividade insulínica em porcos, cães ou seres humanos apresentavam uma boa ligação ao receptor mesmo in vitro.

Um outro modelo in vitro que pode ser utilizado para se efectuar o rastreio da actividade da insulina é o ensaio de células gordas livres amplamente reconhecido (Moody, A.J. e outros, "A simple Free Fat Cell Bioassay for Insulin", Horm. Metab. Res. -8- (1974) 12-16). Neste ensaio a eficácia do composto de ensaio para mediar a incorporação de glicose nos lípidos de células gordas isoladas de ratazanas é tomada como uma medida da sua actividade insulínica.

Este ensaio modelo demonstrou, também, que apenas se pode esperar uma actividade insulínica favorável em suínos, cães ou seres humanos a partir de compostos de ensaio que se caracterizem bem neste ensaio, isto é, que sejam mediadores potentes de incorporação de glucose nos lípidos. A preparação de um complexo Co(III) de insulina de bovino de fórmula geral (Ins)6(Co(III))2 (II) na qual Ins representa insulina de bovino foi descrito (Storm, M.C. 5 e outros, "The Glu(Bl3) Carboxylates of the Insulin 2+ 2+

Hexamer Form a Cage for Gd and Ca Ions", Biochemistry, 24 (1985) 1749-1756). Obteve-se o complexo formando em primeiro lugar um complexo de Co(II) com insulina de bovino isenta de metal e subsequentemente oxidando o produto formado com perõxido de hidrogénio. 0 produto final é solúvel em água e a solução apresenta uma cor rosada. Não foi feita referência a qualquer actividade insulínica do complexo. -9-

Quando se ensaia o modelo de ligação ao receptor verifica-se que o complexo de fórmula geral (II) não se liga ao receptor da insulina.

Também quando se observou, de acordo com o ensaio de células gordas livres, o complexo de fórmula geral (II) indicou encontrar-se desprovido de actividade insulínica mensurável.

No entanto, de um modo surpreendente, verificou-se que quando se efectuava o ensaio da composição que englobava o complexo de fórmula geral (II), in vivo, por injecção em porcos e coelhos, esta exibia 50 a 100% de actividade insulínica com um perfil insulínico prolongado.

As experiências com animais indicaram que elevados níveis de dose de InSg(Co(III)em comparação com as composições insulínicas convencionais, não proporcionavam situações de hipogli cémia que constituem uma ameaça â vida. Deste modo, com as composições da presente invenção é possível proporcionar-se um tratamento mais seguro da diabetes. Dado que são soluções, as composições da presente invenção possuem uma absorção mais reprodutível do que as composições contendo cristais de insulina ou insulina amorfa.

Podem preparar-se as composições de insulina injectãvel da presente invenção, seguindo as técnicas convencionais da indústria -10- farmacêutica, que envolvem a dissolução e a mistura de ingredientes, conforme adequado para se proporcionar o produto final desejado.

Assim, de acordo com um dos procedimentos pode dissolver-se o complexo insulínico da fórmula geral I, numa quantidade de água que seja um pouco inferior ao volume final da composição que se pretende preparar. A seguir à possível adição de um agente isotó-nico, de um conservante e possivelmente de um tampão, de um ácido ou de uma base, pode ajustar-se o volume da solução com água de modo a obter-se a concentração desejada de ingredientes.

Constituem exemplos de conservantes o fenol, o cresol, o £-hidroxibenzoato de metilo e o álcool benzílico.

Pode referir-se como exemplos de tampões adequados o acetato de sódio e o fosfato de sódio.

De um modo preferencial, nenhum dos compostos auxiliares consiste em agentes fortemente redutores.

Podem utilizar-se as composições insulínicas da presente invenção no tratamento de diabetes. Recomenda-se que a dosagem das composições de insulina da presente invenção seja determinada por um médico, de modo similar ao das composições de insulina conhecidas . -11-

As características descritas antes, na presente memória descritiva, os exemplos que se seguem e as reivindicações podem, separadamente, ou em qualquer combinação constituir material para levar a efeito a presente invenção de diversas formas.

Os exemplos que se seguem não deverão ser considerados como um limite ã presente invenção mas apenas como uma ilustração de alguns dos seus aspectos preferenciais. EXEMPLO 1

Preparação de (Inh)g(Co(III))2 com água de coordenação A 4 ml de insulina humana isenta de metal (Inh) (100 mg/ml) adicionou-se 3 ml de cloreto de cobalto 0,01 M. Ajustou-se o pH para 7,5 com hidróxido de sódio 0,1 N e deixou-se a mistura em repouso durante 10 minutos. Adicionou-se peróxido de hidrogénio a 30%(70 ml) à solução incolor que desenvolveu tuna cor rosada. Agitou-se a mistura durante 1 hora após o que se separou por cromatografia de dimensões a insulina que não reagiu, numa coluna Sephadex ® G 100. Tampão: Tris 0,02 M mais EDTA 0,001 M. Agregaram-se as fracções que continham (Inh)g(Co(III))2, dializa-ram-se e concentraram-se por ultrafiltração. Finalmente liofili-zou-se o ultrafiltrado. -12- EXEMPLO 2

Preparação de (Inh)^(Co(III))2 com água de coordenação A uma solução de 55 mg (9,5 ^imoles) de insulina humana isenta de metal em 5 ml de água adicionou-se 60 jil de perclorato de cobalto 0,053 M e 50 pl de peróxido de hidrogénio a 30%. Ajustou-se o pH para 8,0 através de hidróxido de sódio 0,1 N e deixou-se a mistura em repouso a 25°C durante 3 horas. Interrompeu-se a reacção por gelfiltração numa coluna Sephadex ® G-25 (Eluente: água) após o que se separou a insulina que não reagiu por cromatografia de permuta iónica numa coluna Q-Sepharose ® , de Fluxo Rápido. Empregou-se um sistema de eluição em gradiente (Tampão A: HEPES 20 mM a pH 8,0 e Tampão B: HEPES 20 níM a pH 8,0 mais perclorato de sódio 1 Μ), A insulina que não reagiu eluiu a uma concentração de Tampão B de cerca de 15% enquanto o produto eluiu a uma concentração de cerca de 30% de Tampão B. Agregaram-se as fracçÕes que continham (Inh)6(Co(III))2, dessalinizaram-se numa coluna Sephadex® G-25 (Eluente: água) e concentraram-se por ultrafiltração. EXEMPLO 3

Preparação de (Inh)^(Co(III))^ com amoníaco de coordenação

Dissolveu-se 55 mg de insulina humana isenta de metal em 5 ml de amoníaco a 2,5% (ajustou-se o pH para 8,0 com ácido -13- perclorico) após o que se adicionou 60 pl de perclorato de cobalto 0,053 M e 50 pl de peróxido de hidrogénio a 30%. Deixou-se repousar a mistura durante 16 horas a 25°C após o que se interrompeu a reacção por gelfiltração numa coluna Sephadex ® G-25 (Eluente: água). Separou-se a insulina que não reagiu e obteve-se o produto tal como se descreveu no Exemplo 2. EXEMPLO 4

Preparação de (Inh)^(Co(III))g com TRIS de coordenação

Dissolveu-se 55 mg de insulina humana isenta de metal em 5 ml de TRIS 50 mM (ajustou-se o pH para 8,0 através de ácido perclórico) após o que se adicionou 60 pl de perclorato de cobalto 0,053 M e 50 pl de peróxido de hidrogénio a 30%. A parte seguinte do procedimento foi idêntica à descrita no Exemplo 3. EXEMPLO 5

Preparação de (Inh)^ ( Co (m))o com imidazol de coordenação A uma solução de 55 mg de insulina humana isenta de metal em 5 ml de água adicionou-se 60 pl de perclorato de cobalto 0,053 M e 14 mg (0,2 mmole) de imidazol e 50 jj.1 de peróxido de hidrogénio a 30%. A parte seguinte do procedimento foi idêntica â descrita no Exemplo 3. -14- EXEMPLO 6

Preparação de (Inh)^(Co(III))p com histidina de coordenação A uma solução de 55 mg de insulina humana isenta de metal em 5 ml de água adicionou-se 60 jul de perclorato de cobalto 0,053 M e 50 jil de peróxido de hidrogénio a 30%. Ajustou-se o pH para 8.0 com hidróxido de sódio 0,1 N e deixou-se a mistura em repouso a 25°C durante 3 horas. Depois removeu-se o peróxido de hidrogénio e o perclorato de cobalto em excesso a partir da mistura reaccional por gelfiltração numa coluna Sephadex ® G-25 (Eluente: água). Ã solução resultante contendo (Inh)g(Co(III)^ adicionou-se 80 mg de histidina (0,52 mmole) ajustou-se o pH para 8.0 com hidróxido de sódio e agitou-se a mistura durante 24 horas a 25°C. Separou-se a insulina que não reagiu e a histidina em excesso por cromatografia de permuta iónica, tal como se descreveu no Exemplo 2. EXEMPLO 7

Preparação de (Inh)^(Co(III)com etilenodiamina de coordenação A uma solução de 55 mg de insulina humana isenta de metal em 5 ml de água adicionou-se 60 jxl de perclorato de cobalto 0,053 M e 50 jil de peróxido de hidrogénio a 30%. Ajustou-se o pH para 8,0 com hidróxido de sódio 0,1 N e deixou-se a mistura em -15- repouso a 25°C durante 3 horas. Depois removeu-se o peróxido de hidrogénio e o perclorato de cobalto em excesso a partir da mistura reaccional por gelfiltração numa coluna Sephadex ® G-25 (Eluente: água). A solução resultante contendo (Inh)^(Co(III)>2 adicionou-se 40 pl de etilenodiamina, ajustou-se o pH para 8,0 com ácido perclórico e deixou-se a mistura em repouso durante 24 horas a 25°C. Separou-se a insulina que não reagiu e a etilenodiamina em excesso por cromatografia de permuta iónica tal como se descreveu no Exemplo 2. EXEMPLO 8

Preparação de (Inh)^(Co(III)2 com iões cloreto de coordenação

Dissolveu-se 55 mg de insulina humana isenta de metal em 5 ml de cloreto de sódio 1 M, ajustou-se o pH da solução para 8,0 com hidróxido de sódio, após o que se adicionou 60 pl de perclorato de cobalto 0,053 M e 50 pl de peróxido de hidrogénio a 30%. A parte seguinte do procedimento foi idêntica ã descrita no Exemplo 3. EXEMPLO 9

Preparação de uma solução inj ectável

Dissolveu-se 10 000 IU de um composto de fórmula geral I em 80 ml de água esterilizada. Adicionou-se 0,9 g de cloreto de -16- sódio e eventualmente um conservante e ajustou-se o pH para 7,4. Depois adicionou-se água esterilizada até um volume final de 100 ml. Esta solução contém 100 IU/mlde insulina.

CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS

Caracterizaram-se os produtos obtidos nos Exemplos 2-8 pelos seus espectros UV e CD e pelas suas características de retenção num sistema cromatográfico de exclusão por tamanho de alta resolução (HPSEC).

Apresentam-se os resultados nos Quadros seguintes. QUADRO 1

Tempos de retenção, HPSEC, dos produtos obtidos nos Exemplos 2-8 (Coluna: Protein Pak 125 (250 x 10 mm). Eluente: ácido acético 2,5 M, L-arginina 4 mM, acetonitrilo a 4%. Caudal, 1,0 ml/minuto. Detecção da absorção UV a 254 nm). -17-

Composto Tempo de retenção (minutos) Insulina humana (monómer o) 9,26 Co(II) insulina 9,25 Insulina humana (dímero covalente) 8,31 Exemplo 2 7,37 Exemplo 3 7,60 Exemplo 4 7,49 Exemplo 5 7,38 Exemplo 6 7,41 Exemplo 7 7,39 Exemplo 8 7,43 QUADRO 2

Absorção máxima de UV (400-700 nm) com os correspondentes coeficientes de extinção molar estimados (E) e bandas de absorção CD com os valores correspondentes estimados de delta epsilon (dE) para os produtos obtidos nos Exemplos 2-8. Os valores de E e de dE referem-se ã concentração de cobalto (calculado supondo haver 2,0 Co(III) por hexâmero de insulina) e exprimem-se em M ^ cm^. -18-

Composto UV -max CD * mm CDmáxl CDmáx2 nm E nm dE nm dE nm dE Exemplo 2 522 155 442 0,0465 529 0,575 sh581 0,434 Exemplo 3 508 260 447 0,0401 530 0,528 583 0,435 Exemplo 4 507 244 443 0,0315 529 0,534 sh581 0,401 Exemplo 5 523 165 485 -0,0295 551 0,418 ausente Exemplo 6 525 182 447 0,0560 529 0,638 sh585 0,389 Exemplo 7 511 306 444 0,0545 527 0,667 sh585 0,387 Exemplo 8 520 181 448 0,0756 531 0,504 584 0,435

sh refere-se a um ressalto no espectro de CD

ENSAIO IN VIVO DE Co(III)-INSULINA

Injectou-se por via subcutânea Co(III)-insulina produzido tal como se descreveu no Exemplo 1 em diferentes doses, em coelhos sob a forma de uma preparação de 100 IU/ml. Mediu-se a glucose sanguínea com intervalos de 7 horas após a injecção e comparou-se com os resultados obtidos após a injecção de insulina humana íb) *

Actrapid ^ . Utilizaram-se seis coelhos para cada nível de dosagem. Apresentam-se os resultados no Quadro 3. -19- QTJADRO 3

Efeito de cobalto(III) insulina de acordo com o Exemplo 1 no nível de glucose sanguínea após injecção subcutânea em coelhos em diferentes doses. Os dados fornecidos representam a média dos ensaios em seis coelhos.

Glucose sanguínea (% do nível às 0 horas)

Tempo (horas) 1 2 4 6 7 Preparação Dose (5) Actrapid ^ 2 IU 53,0 52,9 90,9 94,6 98,9 Co(III)-insulina 4 IU 68,7 57,5 63,8 76,1 81,2 Co(III)-insulina 6 IU 60,7 57,8 58,1 57,6 68,6 Co(III)-insulina 8 IU 63,6 53,0 52,5 53,5 64,3 Co(III)-insulina 10 IU 62,5 53,6 51,7 48,9 55,6

Todos os coelhos sobreviveram ao ensaio e mesmo perante a dose mais elevada da preparação de acordo com a presente invenção (r) não apresentaram sinais de hipoglicimia. 10 IU de Actrapid ^ teriam certamente originado hipoglicimia nos coelhos e mesmo 8 IU ou talvez 6 IU pudessem também causar este efeito.

Claims

20 - R Ε I V I N DICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de composições farmacêu ticas de insulina com acção prolongada/ apropriada para o trata mento de diabetes melitus, caracterizado pelo facto de se incor porar entre 10 UI e 2 000 UI por. ml, de preferência entre 10 UI e 1 000 UI, mais preferencialmente.ainda entre 10 UI e 300 UI por ml, de um complexo insulíníco de fórmula geral (Ins)6(Co(III)2(L)m(M)n (I) na qual Ins representa uma insulina de ocorrência natural ou um análogo de insulina que possui efeito insulínico nos seres humanos; L representa um átomo de azoto contendo um ligante que pode ligar a Co(III) por intermédio de um átomo 21 - de azoto; M representa um ligante não azotado tal como uma molécula de água ou um anião que pode ligar a Co(III) com a condição de se n for igual a 2 ou maior, M pode designar diferentes espécies ao mesmo tempo, e n representa zero ou um número inteiro compreendido entre 1 e 6, e m representa β-n, quando L representa um ligante monodentado ou (β-η)/2, quando L representa um ligan te bidentado, com agentes auxiliares de formulação apropriados.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo facto de se. incorporar um composto de formula geral I na qual m representa zero.
•3.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se incorporar um composto de formula geral I na qual Ins representa insulina humana.
4. - Processo de acordo com as reivindicações '1 ou 2, caracterizado pelo facto de se incorporar um composto de formula geral I na qual Ins representa insulina de porco.
5. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, 22 ff caracterizado pelo la geral I na qual facto de se incorporar um composto de fórmu-Ins representa um análogo de insulina. í, Ageníe Oficial da Propriedade Industria-