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Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Präparates Bekanntlich spielt
im gesunden Körper das Hormon Insulin eine wichtige Rolle im Zuckerstoffwechsel
und damit im Zusammenhang bei der Regelung des Blutzuckerspiegels. Ist dieses Hormon
nicht in genügenden Mengen vorhanden, so treten Störungen im Zuckerstoffwechsel
und in den hiermit zusammenhängenden anderen Stoffwechselvorgängen auf. Das Ergebnis
kann unter anderem sein, daß der Blutzuckergehalt iber den normalen Wert ansteigt
mit allen unerwünschten Folgeerscheinungen, z. B. der Ausscheidung von Glucose im
Harn. Durch Verabreichung von Insulin, normalerweise subcutan oder intramuskulär,
läßt sich der normale Zuckerstoffwechsel bei den Kranken einigermaßen wieder herstellen,
und auf diese Weise kann man einen zu hohen Blutzuckerspiegel erniedrigen. Darüber
hinaus können Maßnahmen ergriffen werden, um zu verhindern, daß der Blutzuckerspiegel
zu stark über seinen normalen Wert ansteigt.
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Weiter ist bekannt, daß im Körper noch andere Substanzen vorkommen,
die den Blutzuckerspiegel beeinflussen. Eine dieser Substanzen ist das Glucagon,
ein hyperglykämisch-glycogenolytischer Faktor, von dem bekannt ist, daß er den Blutzuckerspiegel
durch gesteigerte Umwandlung von in der Leber gespeichertem Glucogen in Glucose
zu erhöhen vermag. Diese Substanz kann z. B.
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Patienten verabfolgt werden, die an Hyperinsulinismus leiden und an
Patienten, die sich im Insulincoma befinden, z. B. bei der Behandlung von Schizophrenikern
mit der Insulinschocktherapie. In fast allen Fällen-wird-das Coma durch die Verabreichung
dieser Substanz beendet. In diesem Zusammenhang wird das Glucagon im allgemeinen
als Antagonist des Insulins aufgefaßt. Dementsprechend wurde bei der Herstellung
von Insulin danach getrachtet, das Glucagon so vollständig wie möglich von diesem
abzutrennen.
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Die Wirkung des Glucagons besteht jedoch nicht nur in einer Erhöhung
des Blutzuckerspiegels. Gleichzeitig fördert es zusammen mit dem Insulin den Verbrauch
von Glucose im Muskel, wodurch dieser Glucose für alle Arten von Reaktionsabläufen
besser ausnutzen kann. Im normalen Organismus herrscht auf diese Weise ein Zusammenspiel
der Wirkungen des Glucagons und des Insulins. Einerseits verursacht das Glucagon
die Bereitstellung von Glucose aus dem Leberglycogen, wodurch Glucose zur Verfügung
steht, während andererseits Glucagon den Verbrauch von Glucose fördert. Da eine
der Wirkungen des Insulins in der Umwandlung von Glucose in Glycogen besteht, wird
der Blutzuckerspiegel auf einem be-
stimmten Wert gehalten, da sich die beiden Wirkungen
die Waage halten.
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Sollte durch irgendeine Abweichung ein verminderter Zuckerverbrauch
vorkommen, so kann dies teilweise durch Verabreichung von Insulin wiederhergestellt
werden. Im allgemeinen wird die zu verabreichende Menge an Insulin so genau wie
möglich bei jedem Patienten eingehalten, und das gleiche ist auch bei der Diät der
Fall. Da jedoch die Verabreichung von Insulin nur eine einseitige Beeinflussung
des Zuckerstoffwechsels zur Folge hat, wird dieser trotz der Zufuhr von Insulin
bei Diabetikern häufig großen Schwankungen unterworfen. Aus diesem Grunde haben
diese Patienten im allgemeinen nicht eine ausreichende Menge an Glucose zur Verfügung,
wenn sie größere Leistungen vollbringen müssen.
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Durch Verabfolgung von Insulin in Kombination mit Glucagon ist es
moglich, dem Organismus eine größere Menge an Glucose zur Verfügung zu stellen,
ohne den Blutzuckerspiegel derartig zu erhöhen ; daß die Glucose nennenswert ausgeschieden
wird.
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Bisher konnt diese Wirkung nur durch Verabfolgung einer Mischung
von Insulin und Glucagon in einer verlängerten intravenösen Infusion erzielt werden.
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Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von neuen insulinhaltigen
injizierbaren Verbindungen entwickelt, die neben Insulin noch Glucagon enthalten,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein injizierbares Insulin mit Glucagon und
mindestens einem der Salze der Metalle Zink, Kobalt, Nickel, Kupfer, Mangan, Aluminium
und Eisen zur Reaktion
bringt. Das Glucagon liegt in einer Menge
von mindestens 1 Gewichtsprozent des Insulins vor, während das Metallsalz in einer
Menge von mindestens 0,3 mg Äquivalent je Gramm der Kombination von Insulin und
Glucagon anwesend ist. Der pH-Wert des Präparates wird auf einen Wert zwischen 3
und 9 eingesteilt. Die Kombination des Insulins mit dem Glucagon und dem Metallsalz
wird in einem wäßrigen injizierbaren Medium verteilt.
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Durch die Arbeiten von Sanger ist die Struktur des Insulins so gut
wie völlig aufgeklärt worden.
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Man weiß, daß Insulin pro Molekül (Molekulargewicht 5750) zwei Histidylreste
(Imidazolylaläuyireste) enthält. Das Zinkbindungsvermögen des Insulins wurde von
Scott 1934 bei Kristallisationsversuchen entdeckt.
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Der in den A-Zellen der Langerhansschen Inseln des Pancreas gebildete
blutzuckersteigernde Faktor, das Glucagon, liegt nach Weitzel und Mitarbeiter, Zeitschrift
für Angewandte Chemie, 68, S. 566 bis 573 (1956), insbesondere S. 570, rechte Spalte,
im Organismus als Zinkkomplexverbindung vor. Aus der Aminosäureanalyse des Glucagons
geht hervor, daß es sich um ein Polypeptid (Molekulargewicht etwa 4200) mit einem
Histidylrest am basischen Kettenende handelt.
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Die hohe Affinität des Imidazolrings zu Schwermetallen ist seit langem
aus präparativen Arbeiten bekannt. Titrimetrische Bestimmungen der Stabilitätskonstante
von, Doppelsalzen} vom Typ Imidazol2-Zn C12 ergaben, daß ein Zinkion maximal vier
Imidazolringe assoziiert. Koordinativ bindet ein Zinkion stets höchstens zwei Imidazolringe.
Durch Suspendieren von Insulinkristallen in Acetatpuffer + ZnC12 (pH 7,2) erhält
man Präparate mit etwa 2,2 °/0 Zink. Der Zinkgehalt ist vom PH der Lösung abhängig.
Ein maximaler Cehalt von 2,2°/o Zink pro Insulinmolekül entspricht der Aufnahme
von zwei Zinkionen, so daß auf die beiden Histidylreste des Insulins je ein Zinkion
entfallen würde. Da andere zinkbindende Konfigurationen in der Strukturformel des
Insulins nach den heutigen Kenntnissen nicht enthalten sind, liefert die mit 2,2°/o
ermittelte Zinksättigungsgrenze des Insulins ein wesentliches Argument für die Annahme,
daß das Zink im Insulin mit Hilfe der Imidazolringe des Histidins gebunden wird.
Zu demselben Ergebnis führen vergleichende potentiometrische Titrationen an zinkfreiem
und zinkhaltigem Insulin.
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Wie oben bereits angedeutet, enthält das Glucagon einen Histidylrest
am basischen Kettenende des Polypeptids. Derartige endständige Histidylreste in
der » Histaminkonfiguration « sind stark zinkaffin, wie dic Erfahrungen an synthetischen
Histidylpeptiden gezeigt haben.
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Bei der Herstellung der neuen insulinhaltigen mjizierbaren Verbindungen,
die neben Insulin noch Glucagon und Zink enthalten, erfolgt eine chemische Reaktion
zwischen den genannten Komponenten.
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Diese chemische Reaktion, die wahrscheinlich erheblich zur verlängerten
Wirkung des Präparates beiträgt geht aus den nachstehenden Versuchen hervor, derer
Ergebnisse in der Tabelle und dem Polarogramn zusammengestellt sind. Bei pH-Werten
von 5,0,7. 1 und 8,5 wurden Suspensionen von Glucagon mit Zink, Insulin mit Zink
sowie Glucagon mit Insulin und Zink hergestellt. Bei diesen Suspensionen, deren
Zusammensetzung aus den Reihen I bis III und V der Tabelle hervorgeht, wurde der
gesamte Zinkgehalt sowie der Zinkgehalt der Mutterlaugen bestimmt, die nach dem
Filtrieren erhalten wurden. Zur Herstellung wurden folgende Lösungen verwendet :
1.80 mg Insulin (25,6 E/mg, Zinkgehalt 0,43 °/0) in 10 ml 0,01 n-Salzsäure ; 2.50
mg kristallines Glucagon in 10 ml 0,01 n-Salzsaure ; 3.672 mg Zinkacetat 2 H20 p.
A. in 1GO ml Wasser ; 4.0,5 n-Natronlauge.
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Nachstehend wird als Beispiel für die Herstellung dieser Suspensionen
die Herstellung der Suspension A bei pli 5,0 erläutert : 2 ml Glucagonlösung und
0,5 ml Zinkacetatlosung werden in 5 ml Wasser gegeben und der pu-Art mit Natronlauge
auf 5,0 eingestellt. Hierauf wird die Lösung mit Wasser auf 10 ml verdünnt.
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Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Zink der Suspensionen werden
jedesmal 1 mi der Suspension mit 0,1 n-Salzsäure angesäuert und hierauf der Zinkgehalt
durch Komplexontitration bestimmt. Der Zinkgehalt der Mutterlauge wird unmittelbar
durch Komplexontitration bestimmt. Der Zinkgehalt des Präzipitats bzw. der Fällung
wird aus der Differenz des gesamten Zinkgehalts und des Zinkgehalts der Mutterlauge
berechnet. Die Extinktion wird in der Mutterlauge nach dem Ansäuern auf pn 2,8 gemessen.
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Einfluß von Zinkionen auf die Fällbarkeit bzw. Löslichkeit von Insulin
und bzw. oder Glucagon in wäßriger Lösung bei verschiedenen pH-Werten
| I | II III IV V VI |
| PH Insulin Glucagon k als y Zink/mg y Zinka) Extinktion |
| Zinkacetat Protein im Präzipitat der Mutterlauge |
| mg/ml mg (ml y/ml |
| -1, 00 103, 5 103, 5 4, 9 0, 400 A |
| 5, J1, 60-106, 966, 84, 80, 044 B |
| 1, 60 1, 00 105, 0 40, 4 8, 0 0, 424 C |
| 1, 60 1, 00 13, 6 5, 2 3, 8 1, 100 D |
| -0, 74 400 540 17, 1 0, 125 A |
| 7 56-406 260 44, 9 0, 013 B |
| 1, 56 0, 74 406 176 55, 4 0, 066 C |
| 1, 56 0, 74 6, 5 2, 8 3, 4 1, 880 D |
| -1, 00 35, 5 35, 5 27, 8 0, 059 A |
| 8, 60-39, 9 25, 0 28, 1 0, 296 B |
| 1, 60 1, 00 40, 6 15, 6 35, 5 0, 256 C |
| 1, 60 1, 00 12, 5 4, 8 12, 5 2, 060 D |
a) Zink im Prazipitat ist berechnet pro Millimeter Suspension.
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Aus der Tabelle ergibt sich, daß der Gesamtzinkgehalt praktisch konstant
bleibt. Darüber hinaus wurde bei jedem pH-Wert ein Versuch D mit einem sehr niedrigen
Zinkgehalt durchgeführt. Der Mindestmetallgehalt der Präparate nach der Erfindung
beträgt 0,3 mg Äquivalente je Gramm der Kombination Glucagon + Insulin, d. h. 0,3-32,7
mg = 9,80 mg Zink je Gramm der Kombination oder 9,8 Fg Zink je Milligramm Protein.
Alle Suspensionen A, B und C der Tabelle erfüllen diese Bedingungen. Nur die Suspension
D weist einen Metallgehalt auf, der unter diesem Mindestwert liegt. Aus der Reihe
VI geht klar hervor, daß bei einem praktisch konstanten gesamten Zinkgehalt die
Extinktion der Mutterlauge in den Versuchen C in allen Fällen niedriger ist als
die Summe der Extinktionen in den Versuchen A und B. Dies ist um so mehr überraschend,
wenn man diese Ergebnisse vergleicht mit der Reihe IV. Berechnet auf Milligramm
Protein, ist der verfügbare Zinkgehalt in den Versuchen C immer am niedrigsten.
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Dies deutet klar auf eine Wechselwirkung zwischen den Komponenten
Glucagon, Zink und Insulin.
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Weitere Argumente für diese Annahme finden sich in Reihe V. Hier ergibt
sich, daß der Zinkgehalt im Präzipitat in den Versuchen C immer höher liegt als
in den Versuchen A und B. Aus den Versuchen D geht klar hervor, daß bei einem sehr
niedrigen Zinkgehalt, der niedriger ist als der Mindestwert in den Präparaten der
Erfindung, die Extinktion in der Mutterlauge hoch ist. Somit erfüllen diese Suspensionen
nicht die Bedingungen der Erfindung.
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Daß die Extinktion der Mutterlauge im Versuch D bei pH 5, 0 niedriger
liegt als bei den anderen Versuchen D, befindet sich in Übereinstimmung mit den
Erwartungen, da etwa bei diesem pH-Wert das Insulin zum größten Teil ausfällt. Der
isoelektrische Bereich des Insulins liegt zwischen 5,2 und 5,4. Weiterhin
kann man
feststellen, daß insbesondere im Versuch C bei pu7, 1 die Extinktion sehr niedrig
und sogar niedriger liegt als bei den anderen pH-Werten. Hieraus geht hervor, daß
die betreffenden Präparate bei physiologischen pH-Werten praktisch unlöslich sind.
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Da man bei niedrigem p-Wert keine Suspension erhalten kann, wurde
ein anderer Versuch ausgearbeitet, um eine Wechselwirkung zwischen den drei Komponenten
Insulin, Zink und Glucagon zu zeigen.
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Es wurde untersucht, wie weit die im Polarogramm auftretende Zinkwelle
unter den herrschendenBedingungen bei-1, 04 V (El/2) durch ein Gemisch von Insulin
und Glucagon unterdrückt wird, gegenüber der Unterdrückung der Zinkwelle, die bei
Anwesenheit von Insulin oder Glucagon allein auftritt. Für diese Versuche wurden
die nachstehend genannten Verbindungen verwendet : 1. Zinkfreies Insulin einer Reinheit
von 25, 8 E/mg, 2. kristallines Glucagon ; 3. eine Lösung von 20,5 mg Zinkacetat
im Millimeter Puffer ; 4. ein Puffer aus 0, 01molarer Natriumacetat-und 0, lmolarer
Kaliumchloridlösung vom pe 3,5.
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Insulin und Glucagon werden im Puffer bei pn 3,5 in einer Konzentration
von 2mg pro 10 ml gelöst.
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Zur Herstellung der Kombination von Glucagon und Insulin werden beide
Lösungen miteinander gemischt, so dans 10 mol der Lösung I mg Glucagon und I mg
Insulin ehalten.
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In dem nachstehenden Polarogramm ist gezeigt a) die Höhe der Welle
zwischen-0, 9 und-1, 2 V für eine ansteigende Zinkkonzentration im Puffer ; b) die
Höhe der Welle in Glucagonlösung ; c) die Höhe der Welle in Insulinlösung ; d) die
Höhe der Welle in der Glucagon und Insulin enthaltenden Lösung.
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WELLENHDHE (Emplindlichkeit 1)
Wurde keine chemische Umsetzung in Gegenwart der Kombination erfolgen,
so sollte man erwarten, daß die Höhe der Welle zwischen der für Insulin und für
Glucagon liegt. Da dies nicht der Fall ist, erfolgt offensichtlich eine Wechselwirkung
zwischen Glucagon, Zink und Insulin unter Bildung eines Chelats.
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Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate geeigneten Salze
sind die Salze der obenerwähnten Metalle mit pharmazeutisch verträglichen Anionen,
z. B. die Acetate, Propionate, Sulphate, Chloride und Bromide. Von den erwähnten
Salzen werden die Acetate bevorzugt.
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Unter einem injizierbaren Medium wird eine sierile Lösung verstanden,
die pharmazeutisch verträgliche Substanzen enthalten kann, die die Lösung praktisch
isotonisch machen, z. B. Natriumchlorid und Glycerin sowie ein Konservierungsmittel,
wie Phenol und Trikresol, wobei der pu-Wert der Lösung derartig eingestellt ist,
daß bei der Injektion keine ernstliche Zellschädigung erfolgt.
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Unter dem Gewicht von Insulin und Glucagon ist dasjenige Gewicht
verstanden, das die anwesenden Mengen aufweisen würden, wenn sie in reiner Form
orlägen.
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Die Kombination von Insulin und Glucagon in den auf diese Weise hergestellten
Präparaten zeigt die Eigenschaft, beim physiologischen-p-Wert unlöslich zu sein.
Daß dies der Fall ist, war nicht vorauszusehen, da eine Kombination von Glucagon
und Zink ohne Insulin unter den gleichen Bedingungen teilweise lëslich ist. Dementsprechend
zeigt in den erfindungsgemäßen Präparaten nicht nur das Insulin, sondern auch das
Glucagon eine verlängerte Wirkung.
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Man erhält eine viel wirkungsvollere Ausnützung von Kohlehydraten
bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Präparate gegenüber der Verabreichung von
Präparaten, die nur Insulin enthalten. Aus diesem Grunde kann der Patient größere
Leistungen vollbringen, als es ihm nach der Behandlung mit den bisherigen Präparaten
möglich war.
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Der pH-Wert der Präparate kann zwischen etwa 3 und 9 liegen. Vorzugsweise
wählt man einen p-Wert, der nicht zu stark vom pH-Wert der Zellflüssigkeiten abweicht.
Es wurde festgestellt, daß der pH-Bereich zwischen 6 und 8 sehr günstig ist. In
diesem Bereich liegen die aktiven Substanzen in einer suspendierten Form vor. Die
Art der Wirkung dieser Suspensionen läßt sich dadurch variieren, daß man den suspendierten
Teilchen eine bestimmte Form verleiht. Die Wirkung einer Suspension, in der die
Fällung amorph vorliegt, ist weniger lang als die einer Suspension, bei der die
Teilchen kristallin vorliegen. Mischungen von Insulin und Glucagon lassen sich in
kristalliner Form erhalten, da Glucagon in Insulinkristalle eingebaut werden kann
und Insulin auch in das Glucagonkristallgitter paßt. Die Art der Wirkung läßt sich
auch in der Weise variieren, daß man eine Fällung bereitet, die teilweise amorph
und teilweise kristallin ist. Weiterhin gelangt man zum gleichen Ergebnis, wenn
man suspendierte Teilchen eines bestimmten Größenbereiches auswählt, was durch Anwendung
besonderer Kristallisationsmaßnahmen oder mechanisch, z. B. durch Mahlen einer groben
Fällung, erreicht werden kann. Die Teilchengröße der Kristalle kann von etwa 0,1
bis etwa 100 u schwanken, wobei die verlängerte Wirkung der sehr kleinen Teilchen
weniger stark hervortritt als die der größeren Kristalle. Sehr große Kristalle von
mehr als 100, u haben den Nachteil, daß
sie sich in der Fällung rasch absetzen. Für
praktische Zwecke sind die Größen von 10 bis 40, u bevorzugt.
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Bei der Einstellung des pH-Wertes auf einen Bereich von 6 bis 8 kann
man von Puffersubstanzen Gebrauch machen, da man auf dieser Weise unerwünschte pH-Schwankungen
vermeidet, durch die die Wirkung des Präparates verändert werden könnte.
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Das Gewichtsverhältnis von Insulin zu Glucagon in den erfindungsgemäßen
Präparaten liegt vorzugsweise zwischen etwa 0,5 : 1 und 20 : 1. Wenn dieses Verhältnis
100 überschreitet, so beobachtet man praktisch keinen günstigen Einfluß mehr auf
den Kohlehydratstoffwechsel im Vergleich mit üblichen Insulinpräparaten.
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Wenn das Medium nicht irgendwelche Verbindungen enthält, die eine
größere Affinität gegenüber den erwähnten Metallionen aufweisen als Insulin und
Glucagon, sollte die Menge an Metallsalzen mindestens 0,3 mg Äquivalent je Gramm
der Kombination von Insulin und Glucagon betragen. Liegen derartige metallbindende
Substanzen vor, so muß allerdings die Mindestmenge an Metallsalz höher liegen. Vorzugsweise
beträgt der Metallsalzgehalt etwa 1 bis 10 mg Äquivalente je Gramm der Kombination
von Insulin und Glucagon.
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In manchen Fällen ist es zweckmäßig, den Präparaten mit einem pH-Bereich
von 6 bis 8 einen Komplexbildner für das vorliegende Metallion zuzusetzen. Der Komplexbildner
soll jedoch nicht derartig stark sein oder in derartiger Menge vorliegen, daß keine
Metallionen mehr für das Insulin und Glucagon zur Verfügung stehen. Beispiele für
brauchbare Komplexbildner sind Glycokoll, Leucin, Asparaginsäure Glutaminsäure,
Äpfelsäure und Weinsäure. Durch die Anwesenheit des Komplexbildners in den vorliegenden
Suspensionen wird eine latente Versorgung von Metallionen ge. vährleistet. Unter
bestimmten Bedingungen können daher Metallionen zugeführt werden, wobei die Metallionenkonzentration
gepuffert ist. Durch das Mischen mit anderen Insulinpräparaten, insbesondere mit
klaren zinkarmen Insulinlösungen, ist es leicht möglich, die Art der Wirkung zu
variieren. Darüber hinaus können bei den Präparaten, bei denen eine a-Aminosaure,
z. B. Glycokoll, verwendet wird, in Folge der puffernden Wirkung des löslichen Metallkomplexes
mit der Aminosäure keine unerwünschten pH-Schwankungen erfolgen.
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Der Zusatz von Verbindungen mit resorptionsverzögernder Wirkung zu
den erfindungsgemäßen Präparaten ist möglich. Dies gestattet, die Wirkung der Präparate
noch weiter auszudehnen. Für diesen Zweck kommen z. B. Gelatine und Dextrane in
Betracht.
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In gleicher Weise kann man dem Präparat auch Konservierungsmittel,
z. B. Phenol, Nipagin, der p-Hydroxybenzoesäuremethylester und Trikresol sowie Mittel,
die den Präparaten isotonische Eigenschaften verleihen, wie Natriumchlorid, Natriumacetat
und Glycerin, zusetzen. Von den obenerwähnten Metallsalzen werden die Zinksalze
bevorzugt.
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Es gibt viele Variationsmöglichkeiten, in welcher Reihenfolge man
die verschiedenen Komponenten der erfindungsgemäßen Präparate zueinandergibt. Dies
gilt sowohl für die Herstellung von Lösungen als auch von Suspensionen von amorphen
und kristallinen Teilchen. Beispielsweise ist es möglich, die gewünschten Mengen
an Glucagon und Metallsalz in einer sauren Insulinlösung aufzulösen. Gegebenenfalls
kann man dann den px-Wert z. B. auf 7 bringen. Wird die Wasserstoffionenkonzentration
sehr schnell auf diesen Wert
gebracht, so bildet sich eine amorphe
Fällung. Bei langsamerer oder stufenweiser Einstellung des pH-Wertes fällt die Fällung
völlig oder teilweise in kristalliner Form an.
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Eine andere Art der Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate in
Form von Kristallsuspensionen ist die, bei der Insulin, Glucagon und ein Metallsalz
in saurer Lösung zueinander gegeben werden, hierauf die Wasserstoffionenkonzentration
auf einen Wert von etwa 6 gebracht wird, worauf man die Mischung bei diesem pH-Wert
stehenläßt, bis genügend Kristallisation erfolgt ist und man dann gegebenenfalls
den pH-Wert auf den physiologischen pH-Wert erhöht.
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Selbstverständlich müssen bei der Herstellung der Präparate die notwendigen
Maßnahmen beobachtet werden, um die Sterilität der Endprodukte zu gewährleisten.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
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Beispiel 1 156,5 mg Insulinpulver einer biologischen Aktivität von
25,6 E/mg und einem Zinkgehalt von 0,42°/o sowie 80 mg reines kristallisiertes Glucagon
werden in 40 ml 0,01 n-Salzsäure gelöst, die 0,1 °/o Nipagin enthält. Mit 0,1 n-Natronlauge
wird die Lösung auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt.
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Zu dieser Lösung werden 40 ml einer 2,650 g Glycerin, 32,5mg Zinkacetat
2H2O und 60 mg Nipagin enthaltenden, auf einen pH-Wert von 3,0 mit 0,1 n-Salzsäure
eingestellten Lösung gegeben. Hierauf wird mit destilliertem Wasser, das mit 0,1
n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt war, auf 100 ml aufgefüllt.
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Beispiel 2 326,5 mg zinkfreies Insulinpulver einer biologischen Aktivität
von 24,5 E/mg und 40 mg reines kristallisiertes Glucagon werden in 40 ml destilliertem
Wasser suspendiert. Unter Rühren wird tropfenweise genügend 1 n-Salzsäure zugesetzt,
bis das Protein völlig in Lösung geht. Hierauf wird das Volumen mit destilliertem
Wasser auf 20 ml aufgefüllt. Je 2 ml der Lösung werden in Röhrchen abgefüllt und
lyophilisiert.
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Hierauf werden je Reagenzglas der lyophilisierten Mischung von Insulin
und Glucagon 10 ml eines Lösungsmittels folgender Zusammensetzung gegeben : Glycerin.......................
2550 mg Kobalt-2-chlorid-6H2O 58,2 mg Trikresol...................... 300 mg Salzsäure,
0,1 n................. 2, 0 Teile pro Million Mit destilliertem Wasser auffüllen
auf 100 ml.
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Nach dem Schütteln wird eine Lösung erhalten, die sich zur Injektion
eignet.
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Beispiel 3 In 40ml destilliertem Wasser, das 0,1% Nipagin enthält,
werden 334,8 mg kristallines Insulin einer biologischen Aktivität von 23,9 E/mg
und einem Zinkgehalt von 0,52 °/o sowie 400 mg 80°/oig reines Glucagon suspendiert.
Hierauf werden unter Rühren so viel 1 n-Salzsäure zugesetzt, um beide Substanzen
völlig in Lösung zu bringen. Nun werden 40 ml einer wäßrigen Lösung, die 850 mg
Eisessig, 63 mg Zinkchlorid (wasserfrei) und 60 mg Nipagin enthielt, zugesetzt.
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Unter heftigem Rühren wird der pH-Wert schnell mit 1 n-Natronlauge
auf 7,1 gebracht. Das Volumen
der nur amorphe Teilchen enthaltenden Suspension wird
schließlich mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
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Beispiel 4 Auf die gleiche Weise wie im Beispiel 3 wird ein Präparat
hergestellt, das statt 63 mg des Zinkchlorids 99 mg Mangan (II)-chlorid 2H2O enthält.
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Beispiel 5 Auf die gleiche Weise wie im Beispiel 3 wird ein Präparat
hergestellt, das statt des Zinkchlorids 145 mg Nickelchlorid 6 H2 O enthält.
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Beispiel 6 In 5 ml einer 400 mg Eisessig enthaltenden Lösung werden
nacheinander 156,3 mg kristallisiertes Insulin einer biologischen Aktivität von
25,6 E/mg und einem Zinkgehalt von 0,42°/o sowie 40 mg reines kristallisiertes Glucagon
gelöst. Hierauf werden 50ml einer wäßrigen Lösung zugegeben, die 40 mg Eisessig,
150 mg Glycokoll, 92 mg Zinkacetat 2H2O und 60 mg Nipagin enthält.
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Unter gleichmäßigem Rühren wird 0,5 n-Natronlauge bis zu einem pH-Wert
von 5,9 zugegeben.
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Hierauf läßt man unter gelegentlichem Rühren die Flüssigkeit 4 Tage
bei Zimmertemperatur stehen. In dieser Zeit bilden sich Kristalle.
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Danach wird unter heftigem Rühren 0,5 n-Natronlauge vorsichtig zugegeben,
bis der p-Wert 7,2 erreicht hat. Nun wird die Flüssigkeit mit 1400 mg Glycerin und
40 mg Nipagin in 20 ml destilliertem Wasser versetzt und auf 100 ml mit destilliertem
Wasser aufgefüllt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension enthält vorwiegend kristalline
Teilchen.
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Beispiel 7 156,2mg des im Beispiel6 erwähnten kristallinen Insulins
und 30 mg kristallines Glucagon werden in 5 ml einer wãßrigen Lösung gelöst, die
400 mg Eisessig enthält. Hierauf werden 50 ml einer wäßrigen Lösung zugesetzt, in
der 40 mg Eisessig, 150 mg Glycokoll, 92 mg Zinkacetat 2H2O und 60 mg Nipagin gelöst
sind.
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Unter Rühren werden langsam und gleichmäßig 0,5 n-Natronlauge derartig
zugegeben, daß der pH-Wert innerhalb etwa 24 Stunden von etwa 3 auf etwa 7,3 ansteigt.
Hierauf wird die Flüssigkeit mit 1400 mg Glycerin und 40 mg Nipagin in 20 ml destilliertem
Wasser versetzt und das Endvolumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml gebracht.
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Wie im Beispiel 6 erhält man eine annähernd isotonische Suspension
mit vorwiegend kristallinen Teilchen.
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Beispiel 8 194,2 mg der im Beispiel 7 erhaltenen Insulin-Glucagonkristalle,
die 15°/o Glucagon enthalten, werden in einer wäßrigen Lösung, die einen pH-Wert
von 7,0 zeigt, suspendiert. Die Lösung enthielt folgende Bestandteile : Zinkacetat
2H20............... 65 mg Glycerin....................... 2800 mg Phenol.........................
500 mg Sie wurde mit destilliertem Wasser auf 100 ml Volumen gebracht. Die erhaltene
Suspension zeigt eine
Aktivität, die vergleichbar ist mit den in
den Beispielen 6 und 7 beschriebenen Kristallsuspensionen, und sie enthält 40 Einheiten
Insulin je Millimeter.
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Beispiel 9 Zu einer Lösung von 165mg kristallinem Insulin einer biologischen
Aktivität von 24,2 E/mg und einem Zinkgehalt von 0,47 °/o sowie 80 mg kristallinem
Glucagon in 5 ml 0,1 n-Salzsäure werden 85 mI einer 300 mg Trikresol, 760 mg Natriumchlorid,
150 mg Glycokoll und 45 mg Aluminium in Form von Aluminiumchlorid enthaltenden Lösung
zugegeben.
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Mit Hilfe von 1 n-Natronlauge wird der plr-wert schnell auf 7,5 gebracht
und das Volumen der Suspension amorpher Teilchen mit destilliertem Wasser auf 100
ml aufgefüllt.
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Beispiel 10 Zu einer Lösung von 156,2 mg kristallinem Insulin einer
biologischen Aktivität von 25,6 E/mg und einem Zinkgehalt von 0,42 °/o sowie 5 mg
reinem kristallinem Glucagon in 5 ml 0,1 n-Salzsäure werden 85 ml einer 500 mg Phenol,
760 mg Natriumchlorid und 4,2 mg Zinkchlorid (wasserfrei) enthaltenden Lösung zugegeben.
Mit 1 n-Natronlauge wird der p-Wert der Lösung schnell auf 7,1 gebracht und hierauf
das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
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Die entstehende Suspension enthält amorphe Teilchen.