DE2107282A1

DE2107282A1 - Verfahren zur Verstärkung und Ver langerung der Wirkung von synthetischem Corticotropin und von seinen Segmentden vaten

Info

Publication number: DE2107282A1
Application number: DE19712107282
Authority: DE
Inventors: Frederik Dr med 2271 Alkersum Paulsen geb Frandsen Eva Wolf Dipl Ing Ferring Paulsen (Schweden)
Original assignee: Paulsen, Frederik, Dr med , 2271 Alkersum
Priority date: 1970-02-16
Filing date: 1971-02-16
Publication date: 1971-09-02
Also published as: GB1345573A; SE396693B; NL7102023A

Description

Anmelder: Dr. med. Frederik Paulsen, Alkersum/Föhr. O^rl"¹ⁱU"ⁱ'¹''

Verfahren zur Verstärkung und Verlängerung der Wirkung von synthetischem Corticotropin und von seinen Öegmentderivaten

Priorität der schwedischen Patentanmeldung Nr. 1975/70 vom 17.2.1970

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verstärkung und Verlängerung der Wirkung von synthetischem Corticotropin (= adrenocorticotropes Hormon ACTH) und seinen Segmentderivaten.

In den schwedischen Patenten 179 879 und I83 147 sowie in dem deutschen Patent 1 028 7^2 werden Verfahren zur Herstellung von Hypophysenhormonpräparaten mit langdauernder Wirkung beschrieben, wobei diese Hormone in wässriger Lösung oder in anderer Lösung mit hoher Dielektrizitätskonstante mit einerLösung von gewissen hochmolekularen Säuren zusammengebracht v/erden.

Die dort beschriebenen Verfahren gelten für Hypophysenhormone natürlichen Ursprungs wie z. B. für solche, die aus Drüsen von Schweinen, Schafen oder anderen Säugetieren gewonnen werden können. Später ist es gelungen, einige dieser Hypophysenhormone, u.a. ACTH,zu synthetisieren.

Ee hat sich jetzt gezeigt, daß synthetisch nach den Verfahren der oben genannten Patente hergestelltes ACTH nicht die gleiche Verlängerung

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der Wirkung zur Folge hat wie natürliches Corticotropin.

ACTH ist ein Peptid, das aus 39 Aminosäureestern in bekannter Sequenz mit folgender Formel besteht:

5 11

S er-Tyr-Se r-Me t-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys

23 21 16 15 f

Tyr-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Lys-Gly-Val
t

¹ 33

Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-GluCNHO-Ser-Ala-Glu
25 " 28 ·

AIa

59 ³⁶ '
Püe-Glu-Leu-Pro-Phe

Ss hat sich gezeigt, daß synthetische Peptide, die kürzere Segmente der

η 4., 4.4. * ■ -π 1-T8 ¹-20 1-23 1-24 1-25 , 1-28, ,. Gesamtkette umfassen, z.B. , , , , und die Hormonaktivität des ACTHs haben. Vom therapeutischen Standpunkt aus ist es also nicht notwendig, die Synthese des gesamten ACTH-Moleküls bis zum Ende durchzuführen. Mit dem Ausdruck "Segmentderivate" werden also teils kürzere Segmente der Aminosäurensequenz des ACTHs und teils Derivate davon bezeichnet, beispielsweise solche, in denen einzelne Aminosäuren in der Sequenz gegen andere ausgetauscht sind, was in gewissen Fällen unter Beibehaltung oder Verstärkung der Aktivität möglich ist.

Als weitere Beispiele für "Segmentderivate" nach der vorliegenden Erfindung seien genannt:

a) Peptide, in denen die N-terminale Aminosäure desaminiert ist;

b) Peptide, bei denen die N-terminale Aminosäure durch den Anbau einer oder mehrerer Aminosäuren geschützt ist.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung kann daher auf beliebige Segmentderivate des ACTH angewendet werden, unabhängig davon, wo die Sequenz unterbrochen worden ist.

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Um die verstärkte und verlängerte Wirkung des synthetischen ACTHs zu erreichen, hat also das erfindungsgemäße Verfahren die im Patentanspruch 1 angegebenen Cha-rakteristika erhalten.

Bei einigen der synthetischen ACTH-Peptide kann die Peptidkette z.B. aufgrund innerer Salzbindungen so gebogen sein, daß ein sterisches Hindernis besteht, das eine sofortige Reaktion zwischen dem synthetischen ACTH-Peptid und der hochmolekularen Säure, z.B. Carboxylmethylcellulose - im folgenden CMC genannt - verhindert. Die Folge davon ist, daß die Verlängerung der biologischen Wirkung des ACTH wesentlich verringert ist oder ganz fehlt. So hat z.B. das ACTH ~ -Peptid mit der oben angegebe-. nen Sequenz Glutaminsäure in Position Nr. 28, die zwei freie Carboxylgruppen aufweist. Diese Carboxylgruppen können innere Salze mit einer der freien Imino- bzw. Aminogruppen in den Aminosäuren Nr. 1, 6, 8, 11, 15» 16, 17, 18 und 21 bilden, wobei ein sterisches Hindernis für die Bildung von Salzbindungen zwischen den freien Aminogruppen im Peptid und den Carboxylgruppen im CMC entstehen kann. Der Komplex zwischen dem Peptid und der hochmolekularen Säure bildet sich dann sehr langsam. Da die synthetischen Peptide in wässriger Lösung weniger haltbar sind als natürliches ACTH, müssen sie als Trockensubstanz aufbewahrt werden, und die Injektionslösung muß gefriergetrocknet in Ampullen dispensiert werden zur ex tempore Lösung unmittelbar vor der Injektion.

Wenn nicht besondere Maßnahmen ergriffen werden, läuft man Gefahr, daß der Komplex zwischen dem Peptid und der hochmolekularen Säure nicht rechtzeitig entstehen kann, ehe die Lösung gefriergetrocknet werden muß·

Es kann deshalb notwendig sein, die Bedingungen bei der Herstellung, z.B. der AGTH-Peptid-CMC-Lösung zu variieren, um die sterischen Hindernisse zu brechen. Nach der vorliegenden Erfindung kann das'Verfahren unter folgenden Bedingungen durchgeführt werden:

1 0 9 β :-i ο / 1 6 8 3

I« das pH wird variiert,
II. die Temperatur wird variiert,

Hi. die freien Carboxylgruppen des Peptids werden ganz oder teilweise blockiert.

I. Wenn das pH der Peptid-Lösung durch Zusatz von Säure gesenkt wird, werden Protonen an die freien Aminogruppen gebunden, und allmählich v/erden die inneren Salzbindungen gelöst. Es ist nicht notwendig, den pH-Wert unter pH 1 au senken, und in vielen Fällen reicht es, auf pH 2 bis 2,5 zu gehen. Wenn der pH-Wert in entsprechender Weise durch ™ Zusatz von Alkali erhöht wird, werden die Protonen der freien Carboxylgruppen entfernt, und die inneren Salzbindungen werden allmählich gelöst. Es ist nicht notwendig, höher als auf pH 10 zu gehen, und

ist
in manchen Fällen/pH 8 bis 9 ausreichend. Wenn eine solche Lösung - mit entweder niedrigem oder hohem pH - mit einer CMC-Lösung gemischt wird, so bekommt man keine sterischen Hindernisse gegen die Bildung des Peptid-CMC-Komplexes, wenn der pH-Wert nachher auf einen Wert zwischen 5 und 8 korrigiert wird, da dieses Gebiet sowohl für die Komplexbildung wie für die Haltbarkeit und die physiologische Verträglichkeit der Lösung am besten geeignet ist.

Wenn ein großer Überschuß von CMC angewendet wird, ist die nachträg- || ' liehe Korrektur des pH der Mischung nicht immer notwendig, da das pH der gemischten Lösungen doch innerhalb des optimalen Gebietes liegt.

Das Verfahren nach der Erfindung kann auch so ausgeführt werden, daß die beiden Komponenten bei einem pH-Wert, bei dem sterische Hindernisse vorliegen, gemischt werden, und das pH danach durch Zusatz von Säure gesenkt bzw. von Alkali erhöht und dann langsam in das optimale Gebiet zurückgebracht wird.

Beispiel 1

100 mg ACTH -Peptid werden in 10 ml Wasser gelöst» und der pH- Wert

109836/1683 - 5 .

wird mittels verdünnter Salzsäure oder einer anderen Säure auf 1 eingestellt. Die Lösung wird dann langsam unter ständigem Umrühren einer Lösung von 1 g NaCMC in 100 ml Wasser bei pH 6,5 zugetropft. An der Eintropfstelle bildet sich, eine feine Fällung des Peptid-CMC-Komplexes, die unmittelbar danach im Überschuß von CMC wieder in Lösung geht. Nachdem alle Peptid-Lösung hinzugetropft ist, wird das pH kontrolliert und auf 6,5 eingestellt. Die Lösung wird mit einer weiteren CMC-Lösung auf eine geeignete Konzentration gebracht, nach Zusatz von geeigneten Constituentia und Konservierungsmitteln steril filtriert, in Ampullen dispensiert und gefriergetrocknet.

Beispiel 2

100 mg ACTH -Peptid werden in 10 ml Wasser gelöst und das pH mittels verdünnter NaOH-Lösung auf 9 eingestellt. Die Lösung wird langsam unter ständigem Rühren zu einer Lösung von ^V1 g NaCMC in 100 ml Wasser bei einem pH von etwa 6,5 hinzugetropft. An der Eintropfstelle bildet sich eine feine Fällung des Peptid-CMC-Komplexes, die unmittelbar darauf im Überschuß von CMC wieder in Lösung geht. Nachdem alle Peptid-Lösung hinzugetropft ist, wird das pH auf 6,5 korrigiert und die Lösung wie im Beispiel 1 behandelt.

Beispiel 3

100 mg ACTH -Peptid werden in 10 ml Wasser gelöst und das pH mittels verdünnter Salzsäure auf 2 eingestellt. Zu dieser Lösung wird sehr langsam unter leichtem Umrühren eine Lösung von 1 g CMC in 100 ml Wasser bei pH 6_t5 hinzugetropft. Während die ersten 10 ml CMC-Lösung hinzugegeben werden, entsteht eine starke Fällung. Diese Fällung geht durch Umrühren nach Zusatz der restlichen CMC-Lösung langsam wieder in Lösung. Diese Lösung kann.dann auf pH 5»3 eingestellt und weiter wie im Beispiel 1 behandelt werden.

10 9836/1683

- 6 -
Beispiel k

Ί Ρ Pi

100 mg ACTH ~ -Peptid werden in 10 ml Wasser gelöst und auf pH 8 eingestellt. Eine Lösung von 1 g CMC in 100 ml Wasser wird bei pH 5,3 tropfenweise unter leichtem Umrühren hinzugesetzt. Während des Hinzutropfens der ersten 10 ml entsteht eine Fällung, die sich danach unter Umrühren im Rest der Lösung langsam wieder auflöst. Diese wird auf pH 6,5 korrigiert und wie im Beispiel 1 behandelt.

Anstatt die in den Beispielen 3 und k entstandenen Fällungen im tiberschuß der CMC-Lösung- zu lösen, kann man die Fällungen auch in einer wässrigen Lösung von 5 % Glukose aufschlämmen. In diesem Fall muß man aber von sterilen Lösungen ausgehen und sowohl die beiden Fällungen wie die Suspension unter aseptischen Bedingungen herstellen. Die Suspension wird in Ampullen dispensiert und gefriergetrocknet.

Beispiel 5

1,0 g ACTH ~ -Peptid werden in 100 ml Wasser gelöst und das pH auf 1 eingestellt. Die Lösung wird langsam unter Umrühren zu einer Lösung von 10 g Natriumalginat in 1 1 Wasser bei pH 6,5 hinzugetropft. An der Eintropfstelle bildet sich eine feine Fällung von Peptidalginat, die unmittelbar im Überschuß des Alginate wieder in Lösung geht. Nachdem alle Lösung hinzugesetzt ist, wird das pH kontrolliert und - falls notwendig - auf pH 5»5 bis 6,5 korrigiert. Die Lösung wird durch mehr Alginatlösung auf die gewünschte Konzentration gebracht, geeignete Constituentia und Konservierungsmittel werden hinzugefügt. Die fertige Lösung wird - falls "nicht Mt sterilen Lösungen gearbeitet worden ist - steril filtriert, in Ampullen dispensiert und gefriergetrocknet.

Beispiel 6

1 g ACTH -Peptid wird in 100 ml Wasser gelöst und das pH mit

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verdünnter Alkalilösung auf pH 8 eingestellt. Die Lösung wird langsam unter Umrühren zu einer Lösung von 5 g Natriumalginat in 1 1 Wasser bei einem pH von 6_%5 hinzugetropft« An der Eintropfstelle bildet sich eine feine Fällung von Peptidalginat, die unmittelbar im Überschuß des Natriumalginats wieder in Lösung geht» Nachdem alle Peptid-Lösung hinzugefügt ist, wird das pH auf 6_t3 korrigiert und die Lösung wie im Beispiel 5 behandelt.

Beispiel 7 „

λ -zn

1g ACTH -Peptid wird in 100 ml Wasser gelöst und auf pH 8 eingestellt. Eine Lösung von 10 g Natriumalginat in 1 1 Wasser wird auf pH 5,3 eingestellt. Beim Hinzutropfen der ersten 100 ml Alginatlösung entsteht eine Fällung, die sich unter Umrühren in dem Rest der Lösung allmählich wieder auflöst. Diese wird dann auf pH 6,5 korrigiert und wie im Beispiel 5 weiter behandelt.

Die in diesem Beispiel entstandene Fällung kann - wie im Beispiel k beschrieben - statt im Überschuß des Fällungsmxttels gelöst zu werden auch in Glukoselösung suspendiert und als Suspension gebraucht werden.

II· Nach der Erfindung kann man die Komplexbildung auch dadurch befördern, daß man die Temperaturen auf über 50 erhöht. Jedoch darf der pH-Wert hierbei nicht zu niedrig sein und soll am besten bei pH 7 bis 7,5 liegen} aber auch höhere Vierte sind erlaubt.

Beispiel 8

100 mg ACTH -Peptid werde» in 10 ml Wasser gelöst. Unter Umrühren wird eine Lösung von 2 g CMC in 200 ml Wasser langsam hinzugesetzt. Die Lösung wird auf pH 7,5 eingestellt und auf einem Wasserbad bei 60° zwei Stunden lang erwärmt gehalten, wonach die Lösung abgekühlt und das pH auf 6,5 gesenkt wird. Dann wird die Lösung wie im Beispiel 1 weiter behandelt*

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Beispiel 9

1-28
10 g ACTH -Peptid werden in 1 1 Wasser gelöst und langsam unter Umrühren einer Lösung von 100 g Natriumalginat in 10 1 Wasser zugesetzt. Das" pH der Lösung wird auf pH 7»O eingestellt. Sie wird auf dem V/asserbad bei 70 eine Stunde lang erwärmt, danach abgekühlt und wie im Beispiel 5 weiter behandelt.

In den Beispielen 1 bis 9 ist nur die Herstellung von Komplexen zwischen ACTH und Alginsäure bzw. CMC beschrieben worden. Das gleiche Ergebnis wird indessen erreicht, wenn man statt dieser Substanzen andere Polyuronsäuren wie z.B. Hyaluronsäure, Arabinsäure, Pektin in der Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Amonium- oder anderer leichtlöslicher Salze, oder die leichtlöslichen Salze jedes beliebigen mit einer R-COOH-Gruppe substituiierten Polysaccharide - wobei R eine Alkyl- oder Alkylengruppe bedeutet - verwendet.

Die Konzentrationen der Alginat- oder CMC-Lösungen, die in den Beispielen genannt werden, geben nicht die Grenzen der Konzentrationsgebiete an, die erfindungsgemäß benutzt werden können. In der Tat haben viel niedrige Konzentrationen der hochmolekularen Säure, zum Beispiel 0,1 bis 0,2 %_t wie auch Konzentrationen über 2 % volle Prolongierungswirkung gezeigt.

III· Als Beispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens, wonach die eterischen Hindernisse für die Komplexbildung mit den hochmolekularen Säuren dadurch entfernt werden können, daß die freien Carboxylgruppen ganz oder teilweise blockiert werden, seien folgende genannt:

Beispiel 10

1 ?8

100 mg ACTH -Peptid-28-NH₂, wobei in Position 28 statt Glutaminsäure Glutamin zum schrittweisen Aufbau des Peptidmoleküls ange-

1 0 9 ö ;? 6 / 1 6 8 3

wandt wurde, werden in 10 ml Wasser gelöst und langsam unter kräftigem Umrühren einer Lösung'von 1 g Natriumalginat, eingestellt auf pH 6,5» zugesetzt. Die an der Eintropfstelle gebildete Fällung wird "im Überschuß des Fällungsmittels gelöst, und eine klare Lösung wird erhalten, die weiterhin - wie im Beispiel k beschrieben - behandeltjird·

Beispiel 11

1 g AGTH 1-28-Peptid, an dem die drei freien Carboxylgruppen in Positon 5, 25 und 28 amidiert sind, wird in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird langsam unter Umrühren einer Lösung von 10 g Natriumalginat in 1 1 Wasser - eingestellt auf pH 6 - zugetropft, wobei ein Komplex von ACTH 1-28-Peptid-triamid gebildet und im Überschuß von Natriumalginat gelöst wird. Die Lösung wird weiter wie im Beispiel k behandelt.

.Patentansprüche

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Claims

P_a_t_e_n_t_a_n_s_p__r_ü_c_h_e

1.) Verfahren zur Verstärkung und Verlängerung der Wirkung von synthetischen Corticotropin-Peptiden, deren Segmentderivaten oder anderen aktiven Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung der synthetischen Corticotropin-Peptide, ihrer Segmentderivate oder anderer aktiver Derivate mit einer Lösung einer Polyuronsäure oder einer anderen hochmolekularen Säure vom Polysaccharidtyp zusammengebracht wird, bei der die Carboxylgruppe durch Substitution mit E-COOH-Gruppen eingeführt ist, wobei R eine Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder Methylen-, Äthylen- oder Propylen-Gruppe bedeutet, und zwar unter solchen Bedingungen, daß das synthetische Corticotropin-Peptid oder dessen. Segmentderivat sich chemisch mit der genannten Säure oder deren Salz verbindet.

2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Corticotropin-Lösung vor dem Zusatz der hochmolekularen Säure oder ihres Salzes angesäuert wird, und das pH der so erhaltenen Mischung danach - vorzugsweise auf pH 5 bis 8 - erhöht wird.

3·) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Corticotropin-Lösung vor dem Zusatz der hochmolekularen Säure oder ihres Salzes alkalisch gemacht wird, und das pH der so erhaltenen Mischung dann - vorzugsweise auf pH 5 bis 8 - gesenkt wird.

km) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Corticotropin-Lösung und die Säurelösung bei einem pH-Wert gemischt werden, bei dem sterische Hindernisse vorliegen, wonach das pH durch Zusatz von Säure gesenkt oder durch Zusatz von Alkali erhöht wird, und daß danach das pH der Mischung auf einen Wert eingestellt wird, der geeignet ist, eine Komplexbildung in der Mischung herbeizuführen.

5·) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennezeichnet, daß die Lösungen bei Temperaturen zwischen ^fO und 100 zusammengebracht werden.

6.) Verbindungen von synthetischen Corticotropin-Peptiden, ihren Segmentderivaten oder anderen aktiven Derivaten mit hochmolekularen Säuren vom Polysaccharidtyp·

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