DE69313138T2

DE69313138T2 - Oligosaccharide mit biologischer aktivität und verfahren zur herstellung aus glykosaminoglykanen

Info

Publication number: DE69313138T2
Application number: DE69313138T
Authority: DE
Inventors: Gianni Ferrari
Original assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Current assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Priority date: 1992-12-23
Filing date: 1993-12-21
Publication date: 1997-12-11
Anticipated expiration: 2013-12-22
Also published as: ES2108418T3; IT1256236B; ITMI922950A1; WO1994014850A1; DE69313138D1; ITMI922950A0; US5705493A; CA2151610A1; ATE156842T1; AU5833694A; EP0675905A1; EP0675905B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einige Oligosaccharide mit biologischer Aktivität und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus Glykosaminoglykanen (GAGS).
Es ist bekannt, daß GAGS aufgrund ihrer biologischer Aktivität pharmazeutisch brauchbar sind für die Behandlung arterieller und venöser thrombotischer Zustände, von Atherosklerose, Lipoidoproteinose, ischämischer Zustände im allgemeinen, Hypofibrinolyse und ganz allgemein von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einer Koagulation und Hämostase stehen.
Die therapeutische Verwendung von GAGS ist deshalb sehr interessant: deshalb sind umfangreiche Untersuchungen durchgeführt worden, um ihre Struktur zu definieren. Eine vollständige Strukturbestimmung ist bisher jedoch nicht durchgeführt worden, da die Extrakte verschiedene Substanzen sehr ähnlicher Strukturen enthalten, dessen Vorhandensein von den Methoden der verwendeten Extraktion und den tierischen Geweben, aus denen die Extrakte gewonnen werden, abhängen.
Diese Schwierigkeiten, die typisch für dieses Gebiet sind, haben bisher eine vollständige Synthese der Testprodukte verhindert, sowie eine annähernd richtige Voraussage dafür, was auftreten würde, wenn verschiedene GAGS der gleichen chemischen Behandlung unterworfen würden.
Stand der Technik
Da GAGS in zunehmendem Maß in der medizinischen Praxis verwendet werden, wurden verbesserte Extraktions- und Reinigungsverfahren für Extrakte aus verschiedenen tierischen Organen in industriellem Maßstab entwickelt. Da GAGS-Extrakte ein hohes Molekulargewicht besitzen, wurden Versuche unternommen, die Molekularstruktur von GAGS zu spalten, um Fraktionen mit niedrigerem Molekulargewicht zu erhalten, wie z.B. Dermatansulfat oder Heparansulfat.
Die Armelderin hat dies mehrere Jahren lang untersucht und besitzt mehrere Patente, die die erhaltenen Ergebnisse beschreiben und beanspruchen (vgl. die US-Patente Nr. 4783447, Nr. 4870166, Nr. 4987222 und Nr. 5116963).
In diesen Patenten sind verschiedene Behandlungen von GAGS beschrieben, angefangen von der auf Enzymen beruhenden Behandlung bis zu der auf Oxidationamitteln beruhenden, einschließlich der Herstellung von Oligosaccharidfraktionen von Dermatansulfat unter Verwendung von γ- Strahlung aus Kobalt 60.
Das Problem der Bioverfügbarkeit von handelsüblichen GAGS wurde bis jetzt nicht optimal gelöst: die Anmelderin sowie andere Firmen arbeiten deshalb noch daran, neue von den bereits bekannten Oligosacchariden abgeleitete neue Oligosaccharide aufzufinden, die die gleiche biologische Aktivität wie die Ausgangsmaterialien besitzen und gleichzeitig eine höhere Bioverfügbarkeit aufweisen.
Verfahren zur Verringerung des Molekulargewichts von Heparin (das am besten bekannten Glykosaminglykan, verwendet in der Antikoagulansantithrombotischen Therapie) durch Veresterung, nachfolgende Depolymerisierung und Hydrolyse der Ester in einem wässerigen Medium werden veranschaulicht in den Europäischen Patentanmeldungen EP-A-40144 und EP- A-44228, und in der Französischen Patentanmeldung 2548672. Das wässerige Medium und die verwendeten hohen Temperaturen ergeben Produkte, die bemerkenswerte Aktivitätsverluste im Hinblick auf das Ausgangs-Heparin zeigen.
Diese Verfahren besitzen, obwohl sie die Herstellung einer Reihe von Oligosacchariden mit im Hinblick auf das Ausgangsheparin niedrigerem Molekulargewicht erlauben, den großen Nachteil, daß sie eine starke Verringerung in ihrer biologischen Aktivität, einer nützlichen Eigenschaft für ihre therapeutische Verwendung, verursachen.
Darüberhinaus konnten solche von der Anmelderin angewandte Verfahren im Gegensatz zu Heparin Dermatansulfat und Chrondroitinsulfat nicht depolymerisieren.

Technisches Problem

Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung des technischen Problems bereit und besteht in der Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Behandlung natürlicher oder vorher supersulfatierter GAGS oder Mischungen davon, das es erlaubt neue Oligosaccharide zu erhalten, die im Hinblick auf die Ausgangsprodukte ein deutlich niedrigeres Molekulargewicht, eine höhere Bioverfügbarkeit und gleichzeitig die gleiche oder eine verbesserte biologische Aktivität besitzen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Hauptcharakteristika der erfindungsgemäßen Oligosacchariden ist eine biologische Aktivität, die gleich ist wie oder höher als die der Ausgangs-GAGS (oder GAGS-Mischungen). Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein geeignetes Herstellungsverfahren. Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Oligosacchariden als Ausgangsmaterialien bevorzugt verwendete GAGS sind natürliches oder supersulfatiertes, d.h. vorher zur Erhöhung des Schwefelsäuregruppengehaltes behandeltes Chondroitinsulfat und Dermatansulfat.
Der Ausdruck "supersulfatierte Glykosaminglykane", wie er hier verwendet wird, bedeutet natürliche Glykosaminglykane, die gemäß einem bekannten Verfahren behandelt wurden, z.B. mit Trimethylamin/Schwefeltrioxid in einer Formamidlösung, um den Sulfatgruppengehalt im Ausgangs- GAGS-Molekül von 15 % auf 100 Gew.-% zu erhöhen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für Polysaccharidmischungen natürlichen Ursprungs, abgeleitet von verschiedenen GAGS, die auch supersulfatiert sein können, verwendet werden.
Die beanspruchten Oligosaccharide weisen die folgenden Haupteigenschaften auf:
- mittleres Molekulargewicht zwischen 2500 und 15000 Dalton, wobei die Molekulargewichtsverteilung so ist, daß mindestens 50 Gew.-% der Verbindung ein Molekulargewicht im ± 20 %-Bereich, bezogen auf das mittlere Molekulargewicht, besitzen;
- spezifische UF-Absorption bei 230 nm E (1 %-ige Lösung in einer 1 cm- Zelle) zwischen 6 und 30;
- spezifische Drehung bei 20 ºC [α]D von -70 º bis +30º,
- Uronsäuregehalt zwischen 23 und 35 Gew.-%;
- Sulfatgruppengehalt (ausgedruckt als organischer Schwefel) zwischen 6 % bis 12 %;
- anti-Xa-Faktor-Aktivität zwischen 5 und 50 UaXa/mg;
- Antithrombinaktivität gleich oder höher als die der Ausgangs-GAGS.
In den bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist die Molekulargewichtsverteilung eine solche, daß mehr als 80 Gew.-% der Verbindung ein Molekulargewicht im ± 20 %-Bereich, bezogen auf das mittlere Molekulargewicht, besitzen.
Die aus supersulfatierten GAGS erhaltenen Oligosaccharide zeigen eine deutlich höhere Aktivität in vitro als die nicht sulfatierten Ausgangsprodukte; ihre Aktivität besitzt die gleiche Größenordnung wie die von natürlichen GAGS.
In jedem Fall zeigen die erfindungsgemäßen Oligosaccharide eine höhere biologische Aktivität in vivo und eine höhere Bioverfügbarkeit als die Ausgangs-GAGS.
Das mittlere Molekulargewicht der aus Dermatansulfat oder Chondroitinsulfat erhaltenen Oligosaccharide liegt typischerweise zwischen 4000 und 12000 Dalton, während das von GAGS-Mischungen typischerweise zwischen 3000 und 10000 Dalton liegt.
Eine besonders bevorzugte Oligosaccharidmischung wird, wie dies im US-Patent Nr. 4783447 veranschaulicht wird, aus einem aus Aorta, Myocardium und anderen vaskularisierten Organen von Säugern extrahierten Produkt erhalten.
Gemäß eines erfindungsgemäßen Grundcharakteristikums verwendet das Verfahren zur Herstellung der vorstehend genannten Oligosaccharide p- Eliminierungsreaktionen hauptsächlich in organischen Lösungsmitteln oder, im Falle von supersulfatierten GAGS, auch in wässerigen Lösungsmitteln, über ein direktes Verfahren, das ein depolymerisiertes Produkt ergibt, oder über die Isolierung veresterter Zwischenprodukte.
Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt Oligosaccharide, die eine geringe Molekulargewichtsverteilung (d.h. geringe Polydispersion) zeigen, und eine hervorragende Reproduzierbarkeit im Hinblick auf das Molekulargewicht und die biologische Aktivität.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Erfolg angewandt werden auf natürliche Produkte, auf supersulfatierte Produkte, die einen verschiedenen Schwefelgehalt (%) besitzen, und auf Mischungen, die verschiedene Mengen (%) an GAGS (Heparin, Heparansulfat, Dermatansulfat und Chrondroitinsulfat) enthalten.
Die GAGS, die untersucht und für dieses Verfahren verwendet wurden (Dermatan, Chrondroitin und GAGS-Mischungen) wurden aus Organen verschiedener Säuger, z.B. der Darmschleimhaut des Schweines, Rindes, Schafes, der Rinder- und Schweinehaut, Rindertrachea und Schweineaorta, isoliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus den folgenden Stufen: (a) natürliche oder supersulfatierte GAGS oder GAGS-Mischungen werden in einem wässerigen Lösungsmittel mit quaternären Ammoniumbasen bei einer
(b) die resultierenden Salze werden in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 20 ºC bis 55 ºC bei Reaktionszeiten von 1 bis 48 Stunden verestert, um einen Gehalt an veresterten Carboxylgruppen von 5 bis 70 Gew.-%, und vorzugsweise von 10 bis 50 Gew. %, bezogen auf die ursprünglich in der Verbindung enthaltenen Gruppen, zu ergeben;
(c) die resultierenden Ester werden in der gleichen organischen Lösung in Gegenwart einer Base bei einer Temperatur von 0 ºC bis 35 ºC, und vorzugsweise von 0 ºC bis 30 ºC, während 1 bis 48 Stunden direkt depolymerisiert unter Freisetzung der gebildeten Oligosaccharide. Diese werden gesammelt und gereinigt durch fraktionierte alkoholische Fällungen, Entfärbungsbehandlung mit Peroxiden, Ultrafiltration und Umkehrosmose. Gemäß einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens kann das in (b) erhaltene veresterte Produkt vor seiner Behandlung in einem Lösungsmittel mit den Basen von (c) gereinigt werden.
Bevorzugte quaternäre Ammoniumbasen für Stufe (a) sind Benzethoniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid, quaternäre Ammoniumbasen, der Molekül mindestens 15 Kohlenstoffatome enthält.
Für Stufe (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die normalerweise in organischen Synthesen verwendeten Veresterungsmittel geeignet. Unter ihnen sind bevorzugt Alkyl- und Alkylarylhalogenide und insbesondere Methyl-, Ethyl- und Benzylchloride, -bromide und -jodide.
Besonders bevorzugte Basen für Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natrium- oder Kaliumalkoholate oder -methylate, Alkalimetallcarbonate, quaternäre Ammoniumhydroxide, wie z.B. Benzyltrimethylammoniumhydroxid (Triton B).
Die Stufen (b) und (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden typischerweise in organischen Lösungsmitteln, insbesondere Dimethylformamid, Formamid, Methylchlorid, Dimethylsulfoxid oder, im Fall von supersulfatierten Produkten, auch in wässerigen Lösungsmitteln, durchgeführt.
In den nachfolgend zur Veranschaulichung der Erfindung angegebenen Beispielen besaßen die verwendeten Ausgangsprodukte die folgenden Hauptcharakteristika:
1. Dermatansulfat, isoliert aus Darmschleimhaut von Rind, Schwein und Schaf und der Haut von Rind und Schwein:
Heparingehalt < 1%
Gehalt an organischem Schwefel 5,5 % bis 7,5 %
Spezifische Drehung -45º bis -75º
Uronsäuregehalt 25 % bis 37 %
Mittleres Molekulargewicht 16000 bis 40000 Dalton
Antithrombinaktivität (via Heparin Cofaktor II) IC&sub5;&sub0; 0,3 bis 0,8 µg/ml
2. Supersulfatiertes Dermatan:
Heparingehalt < 1%
Gehalt an organischem Schwefel 7,5 % bis 12 %
Spezifische Drehung -25º bis -65º
Uronsäuregehalt 23 % bis 37 %
Mittleres Molekulargewicht 16000 bis 40000 Dalton
Antithrombinaktivität (via Heparin Cofaktor II) IC&sub5;&sub0; 0,01 bis 0,5 µg/ml
3. Chondroitinsulfat, isoliert aus Darmschleimhaut von Rind und Schwein und aus Schweinetrachea:
Dermatansulfatgehalt < 1 %
Gehalt an organischem Schwefel 5 % bis 7 %
Spezifische Drehung -20º bis -35º
Uronsäuregehalt 24 % bis 33 %
Mittleres Molekulargewicht 16000 bis 40000 Dalton
Antithrombinaktivität (via Heparin Cofaktor II) IC&sub5;&sub0; 70 bis 120 µg/ml
4. Supersulfatiertes Chondroitin:
Dermatangehalt < 1%
Gehalt an organischem Schwefel 7 % bis 12 %
Spezifische Drehung -10º bis -30º
Uronsäuregehalt 23 % bis 33 %
Mittleres Molekulargewicht 16000 bis 40000 Dalton
Antithrombinaktivität (via Heparin Cofaktor II) IC&sub5;&sub0; 0,1 bis 30 µg/ml

Beispiel 1

Dermatanbenzethoniumsalz (100 g), erhalten aus aus Schleimhaut vom Schwein isoliertem Dermatan, mit einem mittleren Molekulargewicht von 23500 Dalton, wurde in Dimethylformamid (500 ml) gelöst, mit Benzylchlorid (25 ml) versetzt, 3 Stunden lang bei 25º ± 1 ºC stehengelassen, und dann Benzyltrimethylammoniumhydroxid (20 ml) (40 % in Methanol) (Triton B) zugegeben. Die Lösung wurde 2 Stunden bei 25º ± 1 ºC stehen gelassen und dann langsam in Methanol (1100 ml), das, 10 % Natriumacetat enthielt, gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt, mit Methanol und Ethanol gewaschen, und unter Vakuum bei 35 ºC bis 40 ºC getrocknet.
Es wurden 65 g rohes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht erhalten.
Das erhaltene Produkt wurde mit 0,2 N Natriumhydroxid (1300 ml) bei 25 ºC ± 1 ºC 2 Stunden lang behandelt. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäurelösung neutralisiert, dann Wasserstoffperoxid (110 Vol) (6,5 ml) zugegeben, 4 Stunden bei 4 ºC stehen gelassen, auf Raumtemperatur erwärmt, dann mit 10 % (Gew/Vol) Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol (3 l) gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und im Vakuum bei 40 ºC bis 45 ºC getrocknet.
Es wurden 25 g des gereinigten Dermatans mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Uronsäuregehalt 27,5 %
- Spezifische Drehung - 60,5 º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 8,4
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,54 µg/ml

Beispiel 2

Dermatanbenzethoniumsalz (100 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Rind isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika und mit einem mittleren Molekulargewicht von 24500 Dalton, wurde wie im Beispiel 1 beschrieben depolymerisiert, mit der Ausnahme, daß Benzylchlorid (30 ml) verwendet wurde und die Reaktionszeit von 3 Stunden auf 1 Stunde verringert wurde. Es wurden 66 g rohes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht erhalten, wie im Beispiel 1 gereinigt, und 31 g gereinigtes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 9800 Dalton
- Uronsäuregehalt 27,8 %
- Gehalt an organischem Schwefel 6,8 %
- Spezifische Drehung -62,5º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 6,65
- Antithrombinaktivität (via HC II) 1C&sub5;&sub0; 0,73 µg/ml

Beispiel 3

Dermatanbenzethoniumsalz (100 g), erhalten aus aus Schweinehaut isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika und einem mittleren Molekulargewicht von 26700 Dalton, wurde wie im Beispiel 1 beschrieben depolymerisiert mit der Ausnahme, daß Benzylchlorid (20 ml) verwendet wurde und die Veresterungszeit von 3 Stunden auf 1,5 Stunden verringert wurde, und die Temperatur 35 ºC ± 1 ºC betrug.
Es wurden 70 g rohes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht erhalten, die wie im Beispiel 1 gereinigt wurden, und 33 g gereinigtes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 13600 Dalton
- Uronsäuregehalt 31,2 %
- Gehalt an organischem Schwefel 6,8 %
- Spezifische Drehung -63,2º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 3,72
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,49 µg/ml

Beispiel 4

Dermatanbenzethoniumsalz (50 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, wurde wie im Beispiel 1 beschrieben depolymerisiert, mit der Ausnahme, daß Methyljodid (12,5 ml) anstelle von Benzylchlorid verwendet wurde.
Es wurden 23 g rohes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht erhalten, die wie im Beispiel 1 gereinigt wurden und 16 g gereinigtes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika ergaben:
- Mittleres Molekulargewicht 14300 Dalton
- Uronsäuregehalt 30,8 %
- Gehalt an organischem Schwefel 6,5 %
- Spezifische Drehung -56,8º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 2,05
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,3 µg/ml

Beispiel 5

Dermatanbenzethoniumsalz (50 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, wurde in Dimethylformamid (250 ml) gelöst, mit Benzylchlorid (12,5 ml) versetzt, und bei 25 º ± 1 ºC 3 Stunden lang stehengelassen. Die resultierende Lösung wurde durch Zugabe von Methanol (500 ml), das 10 % Natriumacetat enthält, gefällt. Der Niederschlag wurde durch Waschen mlt Methanol und dann mit Ethanol isoliert. Es wurden 25 g Dermatanbenzylester erhalten.
Es wurde das Benzethoniumsalz des erhaltenen Esters hergestellt, dann in Dimethylformamid (250 ml) gelöst, mit Triton B versetzt und bei 25 º ± 1 ºC 2 Stunden lang stehengelassen. Die resultierende Lösung wurde in Ethanol (2 l), das 10 % Natriumacetat enthielt, gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen und in einem Ofen bei 35 ºC bis 40 ºC getrocknet.
Es wurden 15 g rohes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht erhalten.
Das Rohprodukt wurde mit 5 % Natriumcarbonat (300 ml) behandelt und 4 Stunden lang bei 25 ºC ± 1 ºC stehengelassen. Die Lösung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, mit Wasserstoffperoxid (110 Vol) (1,5 ml) versetzt, 4 Stunden bei 4 ºC stehengelassen, auf Raumtemperatur erwärmt, mit 10 % (Gew/Vol) Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und in einem Ofen bei 35 ºC bis 40 ºC getrocknet.
Es wurden 10 g gereinigtes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 8500 Dalton
- Uronsäuregehalt 31,8 %
- Gehalt an organischem Schwefel 6,9 %
- Spezifische Drehung -54,5º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 9,0
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,45 µg/ml

Beispiel 6

Dermatanbenzethoniumsalz (50 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, wurde wie im Beispiel 5 beschrieben depolymerisiert, mit der Ausnahme, daß das Dermatanesterbenzethoniumsalz in Methylenchlond anstelle von Dimethylformamid gelöst wurde.
Es wurden 16 g rohes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht erhalten, die wie im Beispiel 5 gereinigt wurden, und 13 g gereinigtes Der matan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika ergaben:
- Mittleres Molekulargewicht 11300 Dalton
- Uronsäuregehalt 32,1 %
- Gehalt an organischem Schwefel 6,8 %
- Spezifische Drehung -58,8º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 3,45
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,35 µg/ml

Beispiel 7

Aus der Darmschleimhaut vom Schwein isoliertes Dermatan (50 g) mit den vorstehend angegebenen Charakteristika wurd in Formamid (666 ml) bei 60 ºC und dann in Trimethylamin/Schwefeltrioxid (116 g) gelöst. Die Lösung wurde während 3 Stunden bei 60 ºC ± 1 ºC reagieren gelassen, und danach wurde die Lösung rasch abgekühlt und mit Methanol (2 l), das 10 % Natriumacetat enthält, gefällt. Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol (oder Aceton) gewaschen. Der Niederschlag wurde getrocknet und in Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch ein Ultrafilter hindurchgeführt, durch Umkehrosmose konzentriert, mit 5 % Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol (2 Vol) gefällt. Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und in einem Ofen bei 35 ºC bis 45 ºC getrocknet.
Es wurden 49 g supersulfatiertes Dermatan mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 12,4 %
- Uronsäuregehalt 28,0 %
Das erhaltene Produkt (50 g) wurde in Dimethylformamid (250 ml) gelöst, mit Benzylchlorid (12,5 ml) versetzt, und bei 25 ºC ± 1 ºC 3 Stunden lang stehen gelassen, dann Benzyltrimethylammoniumhydroxid (10 ml) (40 % in Methanol) zugegeben und bei 25 º ± 1 ºC 2 Stunden lang stehengelassen. Die Lösung wurde in Methanol (600 ml), das 10 % Natriumacetat enthält, gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und bei 35 ºC bis 40 ºC im Vakuum getrocknet.
Es wurden 37 g rohes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht erhalten.
Das Rohprodukt wurde mlt 0,5 N Natriumhydroxid (650 ml) während 2 Stunden bei 4 ºC ± 1 ºC behandelt. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1 N HCl-Lösung neutralisiert, mit Wasserstoffperoxid (110 Vol) (3 ml) versetzt, 4 Stunden lang bei 4 ºC stehengelassen, auf Raumtemperatur erwärmt, mit 10 % (Gew/Vol) Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol (1500 ml) gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen und im Vakuum bei 40 ºC bis 45 ºC getrocknet.
Es wurden 12,5 g gereinigtes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 10900 Dalton
- Uronsäuregehalt 28,1 %
- Gehalt an organischem Schwefel 11,9 %
- Spezifische Drehung -35,7º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 2,55
- Antithrombinaktivität (via HC II) 1C&sub5;&sub0; 0,018 µg/ml

Beispiel 8

Dermatansulfat (50 g), isoliert aus Darmschleimhaut vom Schwein, mit den vorstehend beschriebenen Charakteristika, wurde wie im Beispiel 7 beschrieben sulfatiert, mit der Ausnahme, daß die Menge an Trimethylamin/ Schwefeltrioxid 75 g und die Reaktionszeit 5 Stunden betrug.
Es wurden 49,6 g supersulfatiertes Dermatan mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 10,7 %
- Uronsäuregehalt 28,4 %
Das erhaltene Produkt (50 g) wurde wie im Beispiel 7 beschrieben depolymerisiert, mit der Ausnahme, daß Methyljodid (12,5 ml) anstelle von Benzylchlorid verwendet wurde.
Es wurden 14 g gereinigtes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 12700 Dalton
- Uronsäuregehalt 28,9 %
- Gehalt an organischem Schwefel 10,2 %
- Spezifische Drehung -36,6º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 2,8
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,024 µg/ml

Beispiel 9

Dermatansulfat (50 g), isoliert aus Schweinehaut, mit den vor stehend angegebenen Charakteristika, wurde wie im Beispiel 7 beschrieben sulfatiert, mit der Ausnahme, daß die Menge an Trimethylamin/Schwefeltrioxid 33 g betrug und die Reaktionszeit auf 1 Stunde verkürzt wurde.
Es wurden 49 g supersulfatiertes Dermatan mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 8,2 %
- Uronsäuregehalt 33,2 %
Das erhaltene Produkt (50 g) wurde wie im Beispiel 7 beschrieben depolymerisiert, mit der Ausnahme, daß Methyljodid (12,5 ml) anstelle von Benzylchlorid verwendet wurde.
Es wurden 16,5 g gereinigtes supersulfatiertes Dermatan mit nie drigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 14500 Dalton
- Uronsäuregehalt 30,45 %
- Gehalt an organischem Schwefel 8,0 %
- Spezifische Drehung -48,6º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 2,65
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,24 µg/ml

Beispiel 10

Supersulfatiertes Dermatanbenzethoniumsalz (50 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, und wie im Beispiel 7 sulfatiert, mit einem Schwefelgehalt von 10,7 %, wurde in Dimethylformamid (250 ml) gelöst, mit Benzylchlorid (12,5 ml) versetzt, bei 35 ºC ± 1 ºC 1,5 Stunden lang stehengelassen, und die Lösung dann mit Methanol (500 l), das 10 % Natriumacetat enthält, gefällt. Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol gewaschen und in einem Ofen bei 35 ºC bis 45 ºC getrocknet.
Der Niederschlag wurde in Wasser (300 ml) gelöst, mit 10 % (Gew/ Vol) Natriumchlorid versetzt und mit Methanol (600 ml) gefällt. Die Lösung wurde futriert und der Niederschlag gesammelt, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und in einem Ofen bei 35 ºC bis 45 ºC getrocknet.
Es wurden 18 g gereinigter Benzylester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 10,0 %
- Veresterungsgrad 24,5 %
Das erhaltene Produkt (50 g) wurde in Dimethylformamid (250 ml) gelöst, mit Triton B (10 ml) versetzt, bei 25 0 ± 1 ºC 3 Stunden lang stehengelassen, und dann wurde die Lösung mit Methanol (500 ml), das 10 % Natriumacetat enthält, gefällt. Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und in einem Ofen bei 35 ºC bis 40 ºC getrocknet.
Es wurden 17,5 g rohes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht erhalten.
Der Niederschlag wurde in 0,5 N Natriumhydroxid (350 ml) gelöst und 2 Stunden lang bei 4 ºC stehengelassen. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, mit Wasserstoffperoxid (110 Vol) (1,5 ml) versetzt, bei 4 ºC 4 Stunden lang stehengelassen, und dann mit 10 % (Gew/Vol) Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol (800 ml) gefällt. Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und in einem Ofen bei 35 ºC bis 45 ºC getrocknet.
Es wurden 13 g gereinigtes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 9970 Dalton
- Uronsäuregehalt 27,25 %
- Gehalt an organischem Schwefel 10,2 %
- Spezifische Drehung -36,6º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 5,45
- Antithrombinaktivität (via HC II) 1C&sub5;&sub0; n.d. (nicht bestimmt)

Beispiel 11

Supersulfatiertes Dermatanbenzethoniumsalz (50 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika und insbesondere wie im Beispiel 8 angegeben sulfatiert, mit einem Schwefelgehalt von 8,2 %, wurde wie im Beispiel 10 beschrieben behandelt.
Es wurden 20,2 g gereinigter Dermatanbenzylester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 7,6 %
- Veresterungsgrad 24,6 %
Dieser Ester wurde wie im Beispiel 10 beschrieben depolymerisiert, mit der Ausnahme, daß der Ester bei einer Konzentration von 7,5 % in Methylenchlorid anstelle von Dimethylformamid gelöst wurde.
Es wurden 15,2 g rohes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht und 12 g gereinigtes Produkt mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 13600 Dalton
- Uronsäuregehalt 33,55 %
- Gehalt an organischem Schwefel 8,2 %
- Spezifische Drehung -31,80º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) n.d.
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; n.d.

Beispiel 12

Supersulfatiertes Dermatanbenzethoniumsalz (50 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, und insbesondere wie im Beispiel 7 sulfatiert, mit einem Schwefelgehait von 10,7 %, wurde wie im Beispiel 10 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß Methyljodid (12,5 ml) anstelle von Benzylchlorid verwendet wurde.
Es wurden 17 g gereinigter Dermatanmethylester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 10,4 %
- Veresterungsgrad 72,5 %
Es wurde weiter wie im Beispiel 10 beschrieben verfahren, mlt der Ausnahme, daß der Ester bei einer Konzentration von 7,5 % in Methylenchlorid anstelle von Dimethylformamid gelöst wurde.
Es wurden 9 g rohes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht und 6,5 g des gereinigten Produktes mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 7200 Dalton
- Uronsäuregehalt 27,3 %
- Gehalt an organischem Schwefel 10,4 %
- Spezifische Drehung -33,2º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 7,95
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,19 pg/ml

Beispiel 13

Supersulfatiertes Dermatanbenzethoniumsalz (50 g), erhalten aus aus Schweinehaut isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, und wie im Beispiel 8 beschrieben sulfatiert, mit einem Schwefelgehalt von 8,2 %, wurde wie im Beispiel 12 beschrieben behandelt. Es wurde ein Methylester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 7,3 %
- Veresterungsgrad 71,8 %
Das Verfahren wurde dann wie im Beispiel 10 beschrieben fortgesetzt.
Es wurden 8,5 g rohes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht und 4,5 g des gereinigten Produktes mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 10600 Dalton
- Uronsäuregehalt 31,2 %
- Gehalt an organischem Schwefel 7,9 %
- Spezifische Drehung -48º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 3,5
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,64 µg/ml

Beispiel 14

Supersulfatiertes Dermatanbenzethoniumsalz (25 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Dermatan, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, und wie im Beispiel 7 sulfatiert, mit einem Schwefelgehalt von 10,7 %, wurde in Dimethylformamid (125 ml) gelöst, mit Benzylchlorid (20 ml) versetzt und bei 25 ºC ± 1ºC 5 Stunden lang stehengelassen, wonach die Lösung mit Methanol (250 ml), das 10 % Natriumacetat enthält, gefällt wurde. Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol gewaschen und in einem Ofen bei 35 ºC bis 40 ºC getrocknet.
Es wurden 11 g roher Ester erhalten.
Das Produkt wurde in Wasser (150 ml) gelöst, mit 10 % (Gew/Vol) Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol (250 ml) gefällt. Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen und in einem Ofen getrocknet.
Es wurden 8,75 g gereinigter Dermatanbenzylester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 10,5 %
- Veresterungsgrad 51,2 %
Der gereinigte Ester wurde in 0,1 N Natriumhydroxid (175 ml) gelöst, bei 60 ºC ± 1 ºC 1 Stunde lang stehengelassen, danach rasch abgekühlt, durch Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, mit Wasserstoffperoxid (110 Vol) (0,9 ml) versetzt, und bei 4 ºC 4 Stunden lang stehengelassen. Die Lösung wurde mit 10 % (Gew/yol) Natriumchlorid versetzt und mit Methanol (350 ml) gefällt. Der Niederschlag wurde mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen und in einem Ofen getrocknet.
Es wurden 6,53 g gereinigtes supersulfatiertes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 12500 Dalton
- Uronsäuregehalt 30,75 %
- Gehalt an organischem Schwefel 10,7 %
- Spezifische Drehung -28,1º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 3,0
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; n.d.

Beispiel 15

Chondroitinsulfatbenzethoniumsalz (25 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Chondroitin, mlt einem mittleren Molekulargewicht von 19000 Dalton, wurde in Dimethylformamid (125 ml) gelöst, mit Benzylchlorid (6,25 ml) versetzt, bei 25 ºC ± 1 ºC 3 Stunden lang stehengelassen, und mit Triton B (5 ml) versetzt. Die resultierende Lösung wurde bei 25 ºC ± 1 ºC 2 Stunden lang stehengelassen, mit Methanol (270 ml), das 10 % Natriumacetat enthält, gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Futration abgetrennt, mit Methanol gewaschen und in einem Ofen bei 35 ºC bis 40 ºC getrocknet.
Es wurden 8,65 g rohes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewiclit erhalten.
Das Rohprodukt wurde mit 0,2 N Natriumhydroxid (175 ml) behandelt und bei 25 ºC ± 1 ºC 2 Stunden lang stehengelassen.
Die Lösung wurde durch Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, mit Wasserstoffperoxid (110 Vol) (0,9 ml) versetzt, bei 4 ºC 4 Stunden lang stehengelassen, auf Raumtemperatur erwärmt, mit 10 % (Gew/ Vol) Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol (350 ml) gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und in einem Ofen bei 40 ºC - 45 ºC getrocknet.
Es wurden 4 g gereinigtes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 9100 Dalton
- Uronsäuregehalt 24 %
- Gehalt an organischem Schwefel 7,2 %
- Spezifische Drehung 240
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 9,55
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 52,4 µg/ml

Beispiel 16

Chondroitinbenzethoniumsalz (25 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Rind isoliertem Chondroitin, mit einem mittleren Molekulargewicht von 20500 Dalton, wurde im Beispiel 15 beschrieben depolymerisiert mit der Ausnahme, daß Methyljodid (5 ml) anstelle von Benzylchlorid verwendet wurde und die Veresterung bei 35 ºC ± 1 ºC 1,5 Stunden lang durchgeführt wurde. Es wurden 4,2 g gereinigtes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 12100 Dalton
- Uronsäuregehalt 24 %
- Gehalt an organischem Schwefel 7,2 %
- Spezifische Drehung -22,4º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 6,7
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 71,8 ):g/ml

Beispiel 17

Chondroitinsulfatbenzethoniumsalz (25 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Schwein isoliertem Chondroitin, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, wurde wie im Beispiel 15 beschrieben depolymensiert, mit der Ausnahme, daß nach Behandlung mit Benzylchlorid die Lösung mit Methanol (250 ml), das 10 % Natriumacetat enthält, ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen, und in einem Ofen getrocknet.
Es wurden 10 g roher Benzylester erhalten.
Der Ester wurde in Wasser (100 ml) gelöst, mit 10 % (Gew/Vol) Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol (200 ml).
Der Niederschlag wurde isoliert, mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen und getrocknet.
Es wurden 8,75 g gereinigter Ester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 6,3 %
- Veresterungsgrad 18 %
Der gereinigte Ester wurde wie im Beispiel 15 beschrieben depolymerisiert.
Es wurden 2,8 g gereinigtes Chondroltin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 7700 Dalton
- Uronsäuregehalt n.d.
- Gehalt an organischem Schwefel 6,5 %
- Spezifische Drehung -21,8º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 11,2
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 43,7 µg/ml

Beispiel 18

Chondroitinsulfat (25 g), isoliert aus Darmschleimhaut vom Rind, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, wurde in Formamid (333 ml) bei 60 ºC gelöst, mit Trimethylamin/Schwefeltrioxid (12,5 g) versetzt. Die Lösung wurde bei 60 ºC ± 1 ºC 2 Stunden lang stehen gelassen, dann rasch abgekühlt, und mit Methanol (2 l), das 10 % Natriumacetat enthält, gefällt.
Das Verfahren wurde wie im Beispiel 7 beschrieben fortgesetzt.
Es wurden 18,5 g supersulfatiertes Chondroitin mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 7,6 %
- Uronsäuregehalt 25,5 %
Wie im Beispiel 7 beschrieben wurde ein Benzethoniumsalz dieses Produktes hergestellt, mit der Ausnahme, daß Benzylchlorid (5 ml) verwendet wurde und die Reaktionszeit 2 Stunden betrug.
Es wurden 5 g gereinigtes supersulfatiertes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 9800 Dalton
- Uronsäuregehalt 25,2 %
- Gehalt an organischem Schwefel 7,3 %
- Spezifische Drehung -20,4º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 7,25
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 17,5 µg/ml

Beispiel 19

Chondroitin (25 g), erhalten aus Schweinetrachea, mit einem Mole kulargewicht von 22000 Dalton, wurde wie im Beispiel 18 beschrieben sulfatiert, mit der Ausnahme, daß Trimethylamin/Schwefeltrioxid (75 g) verwendet wurde und die Reaktionszeit 3 Stunden betrug.
Es wurden 22 g supersulfatiertes Chondroitin mit den folgenden Charakteristika erhalten.
- Schwefelgehalt 11,3 %
- Uronsäuregehalt 28,9 %
Es wurde ein Benzethoniumsalz dieses Produktes hergestellt und wie im Beispiel 7 beschrieben depolymerisiert.
Es wurden 8,9 g gereinigtes supersulfatiertes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 8700 Dalton
- Uronsäuregehalt 29 %
- Gehalt an organischem Schwefel 10,9 %
- Spezifische Drehung 12,20
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 6,6
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,09 µg/ml

Beispiel 20

Chondroitin (25 g), erhalten aus Darmschleimhaut vom Schwein, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika, wurde wie im Beispiel 18 beschrieben sulfatiert und wie im Beispiel 18 beschrieben depolymerisiert, mit der Ausnahme, daß Methyljodid (5 ml) anstelle von Benzylchlorid verwendet wurde.
Es wurden 3 g gereinigtes supersulfatiertes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 9600 Dalton
- Uronsäuregehalt n.d.
- Gehalt an organischem Schwefel 7 %
- Spezifische Drehung n.d.
- UV-Absorption (E bei 230 nm) n.d.
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 12,6 µg/ml

Beispiel 21

Supersulfatiertes Chondroitinbenzethoniumsalz (25 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Rind isoliertem Chondroitin, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika und insbesondere wie im Beispiel 18 beschrieben sulfatiert, mit einem Schwefelgehalt von 11,7 %, wurde wie im Beispiel 10 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß Benzylchlorid (5 ml) verwendet wurde und die Reaktionszeit 3,5 Stunden betrug.
Es wurden 8,2 g gereinigter Benzylester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 6,8 %
- Veresterungsgrad 23,3 %
Es wurde das Benzethoniumsalz des Esters hergestellt und das Verfahren wie im Beispiel 10 beschrieben fortgesetzt, und 3 g gereinigtes supersulfatiertes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 8500 Dalton
- Uronsäuregehalt 24,2 %
- Gehalt an organischem Schwefel 7,7 %
- Spezifische Drehung -20,9º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 18
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 15,3 pg/ml

Beispiel 22

Supersulfatiertes Chondroitinbenzethoniumsalz (25 g), erhalten aus aus Darmachleimhaut vom Schwein isoliertem Chondroitin, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika und insbesondere wie im Beispiel 19 beschrieben sulfatiert, mit einem Schwefelgehalt von 10,6 %, wurde wie im Beispiel 11 beschrieben depolymerisiert, mit der Ausnahme, daß Benzylchlorid (5 ml) verwendet wurde und die Reaktionszeit 3,5 Stunden betrug.
Es wurden 7,55 g gereinigter Benzylester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 10,75 %
- Veresterungsgrad 19,6 %
Es wurde das Benzethoniumsalz dieses Produktes hergestellt und das Verfahren wie im Beispiel 11 beschrieben fortgesetzt.
Es wurden 2,95 g gereinigtes supersulfatiertes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 8600 Dalton
- Uronsäuregehalt 30,7 %
- Gehalt an organischem Schwefel 11,1 %
- Spezifische Drehung -13,9º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 6,0
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,11 µg/ml

Beispiel 23

Supersulfatiertes Chondroitinbenzethoniumsalz (25 g), erhalten aus aus Schweinetrachea isoliertem Chondroitin mit den vorstehend angegebenen Charakteristika und insbesondere mit einem Schwefelgehalt von 10,6 %, wurde wie im Beispiel 22 beschrieben depolymerisiert mit der Ausnahme, daß Methylchlorid (5 ml) anstelle von Benzylchlorid verwendet wurde.
Es wurden 7,5 g Methylester mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Schwefelgehalt 10,95 %
- Veresterungsgrad 48,6 %
Das Verfahren wurde wie im Beispiel 22 beschrieben forgesetzt und 3,2 g gereinigtes supersulfatiertes Chondroitin mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 7000 Dalton
- Uronsäuregehalt 30,1 %
- Gehalt an organischem Schwefel 10,2 %
- Spezifische Drehung -10,25º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 14,35
- Antithrombinaktivität (via HC II) IC&sub5;&sub0; 0,13 µg/ml

Beispiel 24

Benzethoniumsalz einer Glykosaminoglykan (GAGS)-Mischung (50 g), erhalten aus aus Darmschleimhaut vom Rind isolierten GAGS, mit den vorstehend angegebenen Charakteristika und der folgenden Zusammensetzung:
- Heparansulfat ähnliche Fraktion: 50 %
- Dermatansulfatfraktion: 50 %
wurde in Dimethylformamid (250 ml) gelöst, mit Benzylchlorid (7,5 ml) versetzt, bei 25 ºC ± 1 ºC 2 Stunden lang stehengelassen, und mit Triton B (10 ml) versetzt. Die Lösung wurde bei 25 ºC ± 1 ºC 2 Stunden lang stehengelassen, dann in Methanol (500 ml), das 10 % Natriumacetat enthält, gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt, mit Methanol gewaschen und unter Vakuum bei 35 ºC bis 40 ºC getrocknet.
Es wurden 18 g einer Mischung aus GAGS mit niedrigem Molekulargewicht erhalten.
Das erhaltene Produkt wurde mit 0,5 N Natriumhydroxid (400 ml) bei 4 ºC 2 Stunden lang behandelt. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, mit Wasserstoffperoxid (110 Vol) (1,6 ml) versetzt, bei 4 ºC 4 Stunden lang stehengelassen, auf Raumtemperatur erwärmt, mit 10 % (Gew/Vol) Natriumchlorid versetzt, und mit Methanol (800 ml) gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt, gewaschen und in einem Ofen bei 40 ºC bis 45 ºC getrocknet.
Es wurden 18 g eines Produktes erhalten, das gereinigt wurde, und 13 g reines Produkt mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika ergab:
- Mittleres Molekulargewicht 7300 Dalton
- Uronsäuregehalt 30,3 %
- Gehalt an organischem Schwefel 8,6 %
- Spezifische Drehung -2,2º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 13,4
- Antithrombinaktivität in Plasma (IC&sub5;&sub0;) 8,8 µg/ml
- Anti-Xa Faktor Aktivität 34 Uaxa/mg

Beispiel 25

Benzethoniumsalz einer Glykosaminoglykan (GAGS)-Mischung (50 g), erhalten aus von Rinderaorta isolierten GAGS, mit der folgenden Zusammensetzung:
- Langsamwandernde Heparinfraktion: 7 %
- Heparansulfat-ähnliche Fraktion: 52 %
- Dermatansulfatfraktion: 35 %
- Chondroitinsulfat: 6 %
wurde wie im Beispiel 24 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß Benzylchlorid (5 ml) verwendet wurde und die Reaktionszeit 4 Stunden betrug.
Es wurden 20 g eines Produktes erhalten und mit 5 % Natriumcarbonat bei 25 ºC während 4 Stunden gereinigt und 15 g reines Produkt mit niedrigem Molekulargewicht mit den folgenden Charakteristika erhalten:
- Mittleres Molekulargewicht 7700 Dalton
- Uronsäuregehalt 29,5 %
- Gehalt an organischem Schwefel 8,75 %
- Spezifische Drehung +14,9º
- UV-Absorption (E bei 230 nm) 7,25
- Antithrombinaktivität in Plasma (IC&sub5;&sub0;) 10 µg/ml
- Anti-Xa-Faktor Aktivität 23 UaXa/mg

Biologische Aktivität

Die erfindungsgemäßen Oligosaccharide zeigen in vitro eine biologische Aktivität, die der der Ausgangsprodukte ähnlich ist.
Zunächst durchgeführte pharmakologische Untersuchungen an Tieren zeigten, daß Oligosaccharide, die auf extravaskulärem Weg verabreicht wurden, eine außergewöhnlich gute Bioverfügbarkeit und eine höhere Aktivität im Hinblick auf ihre biologische Wirkung zeigen.
Diese Untersuchungen bestätigen, daß die erfindungsgemäßen Oligosaccharide erfolgreich zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, die zur Prophylaxe und Behandlung arterieller und venöser thrombotischer Zustände geeignet sind.
Die aus Tests der Bioverfügbarkeit beim Kaninchen erhaltenen Ergebnisse und die antithrombotische Aktivität bei der Ratte sind nachfolgend angegeben.
Die verwendeten Produkte und die für diese Tests angewandte Bedingungen sind die folgenden:
- Wie im Beispiel 1 hergestelltes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht (DS1)
- Wie im Beispiel 2 hergestelltes Dermatan mit niedrigem Molekulargewicht (D52)
- Ausgangsdermatan (DS)
- Dosierung: 20 und 60 mg/kg beim Kaninchen 10 und 30 mg/kg bei der Ratte
- Verabreichungsweg beim Kaninchen: subkutan
- Verabreichungsweg bei der Ratte: subkutan, 40', 60' und 90' vor Induzieren der Stase.
- Bestimmung der Dermatan-Blutspiegel im Kaninchen.

Thrombinzeittest (TT)

Thrombin-Inhibierungstest via HC II (Stachrom DS - Stago France)
- Bestimmung der antithrombotischen Aktivität bei der Ratte: Kombiniertes Modell einer venösen Stase und eines thrombogenen Stimulus.
Entfernung des gebildten Thrombus, 15' nach Start der Stase. Tabelle 1: Blutspiegel im Kaninchen (Nr. 7 bis 8), gemessen durch TT und Stachrom DS (Dosis: 60 mg/kg) Tabelle 2: Antithronbotische Aktivität bei der Ratte (Nr. 10) (Dosis 30 mg)

Claims

1. Oligosaccharide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dermatansulfat, supersulfatiertem Dermatan, Chrondroitinsulfat und supersulfatiertem Chondroitin, abgeleitet von den entsprechenden natürlichen oder supersulfatierten GAGS mit einem Heparingehalt von weniger als 1 Gew.-%, und mit den folgenden Hauptcharakteristika:

- mittleres Molekulargewicht zwischen 2500 und 15000 Dalton mit einer Molekulargewichtsverteilung von mindestens 50 Gew.-% im ± 20 %-Bereich bezogen auf das mittlere Molekulargewicht;

- spezifische UV-Absorption bei 230 nm E (1 %-ige Lösung, in einer 1 cm- Zelle) zwischen 6 und 30;

- spezifische Drehung bei 20 ºC [α]D zwischen -70 º bis +30 º;

- Uronsäuregehalt zwischen 23 und 35 Gew.-%;

- Sulfatgruppengehalt (ausgedrückt als organischer Schwefel) von 6 % bis 12 % für Dermatansulfat, Dermatansupersulfat, und Chondroitinsulfat, und von 7 % bis 8 % für Chondroitinsupersulfat;

- anti-Xa-Faktoraktivität zwischen 5 und 50 UaXa/mg;

- Antithrombinaktivität gleich oder höher als die des Ausgangsmaterials.

2. Oligosaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als 80 Gew.-% der Oligosaccharide ein Molekulargewicht im 120 %-Bereich, bezogen auf das durchschnittliche Molekulargewicht, aufweisen.

3. Oligosaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangs-GAGS aus Dermatansulfat mit den folgenden Charakteristika bestehen:

Heparingehalt < 1%

Gehalt an organischem Schwefel 5,5 % bis 7,5 %

Spezifische Drehung -45º bis -75º

Uronsäuregehalt (ausgedrückt als Carboxyle) 25 % bis 37 %

Mittleres Molekulargewicht 16000 bis 40000 Dalton

Antithrombinaktivität (via Heparin Cofaktor II) IC&sub5;&sub0; 0,3 bis 0,8 µg/ml

4. Oligosaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangs-GAGS aus supersulfatiertem Dermatan mit den folgenden Charakteristika bestehen:

Heparingehalt < 1%

Gehalt an organischem Schwefel 7,5 % bis 12 %

Spezifische Drehung -25º bis -65º

Uronsäuregehalt (ausgedrückt als Carboxyle) 23 % bis 37 %

Mittleres Molekulargewicht 16000 bis 40000 Dalton

Antithrombinaktivität (via Heparin Cofaktor II) IC&sub5;&sub0; 0,01 bis 0,5 µg/ml

5. Oligosaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangs-GAGS aus Chondroitinsulfat mit den folgenden Charakteristika bestehen:

Dermatansulfatgehalt < 1 %

Gehalt an organischem Schwefel 5 % bis 7 %

Spezifische Drehung -20º bis -35º

Uronsäuregehalt (ausgedrückt als Carboxyle) 24 % bis 33 %

Mittleres Molekulargewicht 16000 bis 40000 Dalton

Antithrombinaktivität (via Heparin Cofaktor II) IC&sub5;&sub0; 70 bis 120 µg/ml

6. Oligosaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangs-GAGS aus supersulfatiertem Chondroitin mit den folgenden Charakteristika bestehen:

Dermatansulfatgehalt < 1 %

Gehalt an organischem Schwefel 7 % bis 8 %

Spezifische Drehung -10º bis -30º

Uronsäuregehalt (ausgedrückt als Carboxyle) 23 % bis 33 %

Mittleres Molekulargewicht 16000 bis 40000 Dalton

Antithrombinaktivität (via Heparin Cofaktor II) IC&sub5;&sub0; 0,1 bis 30 µg/ml

7. Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide mit den in Anspruch 1 beschriebenen Charakteristika, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den folgenden Stufen besteht:

(a) natürliche oder supersulfatierte GAGS oder GAGS-Mischungen mit einem Heparingehalt von weniger als 1 Gew.-% werden in einem wässerigen Lösungsmittel mit quaternären Ammoniumbasen bei einer Temperatur von 10 ºC bis 40 ºC versalzt;

(b) die resultierenden Salze werden in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 20 ºC bis 55 ºC und mit Reaktionszeiten zwischen 1 bis 48 Stunden verestert, um einen Gehalt an veresterten Carboxylgruppen von 4 bis 70 Gew.-%, und vorzugsweise von 10 bis 50 Gew. %, bezogen auf die ursprünglich in der Verbindung enthaltenen Gruppen, zu ergeben;

(c) die resultierenden Ester werden in der gleichen organischen Lösung in Gegenwart einer Base bei einer Temperatur von 0 ºC bis 35 ºC, und vorzugsweise von 0 ºC bis 30 ºC, während 1 bis 48 Stunden direkt polymensiert unter Freisetzung der gebildeten Oligosaccharide, die gesammelt und gereinigt werden durch fraktionierte alkoholische Fällungen, Entfärbungsbehandlung mit Peroxiden, Ultrafiltration und Umkehrosmose.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das in (b) erhaltene veresterte Produkt vor der Behandlung mit den Basen der Stufe (c) gereinigt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die quaternären Ammoniumbasen für Stufe (a) Benzethoniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid, quaternäre Ammoniumbasen, der Molekül mindestens 15 Kohlenstoffatom enthält, sind.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Veresterungsmittel für Stufe (b) Alkyl- und Alkylarylhalogenide, und insbesondere Methyl-, Ethyl- und Benzylbromide und -jodide, sind.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen für Stufe (c) Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natrium- oder Kaliumalkoholate oder -methylate, Alkalimetallcarbonate, quaternäre Ammoniumhydroxide, wie z.B. Benzyltrimethylammoniumhydroxid, sind.

12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die in Stufe (b) und (c) verwendeten organischen Lösungsmittel Dimethylformamid, Formamid, Mehylenchlorid, Dimethylsulfoxid oder, im Falle von supersulfatierten Produkten, auch wässerige Lösungsmittel sind.

13. Pharmazeutische zusammensetzungen zur Prophylaxe und Behandlung arterieller und venöser thrombotischer Zustände, dadurch gekennzeichnet, daß sie wirksame Mengen an Oligosacchariden gemäß Anspruch 1 und geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger oder Hilfs-stoffe enthalten.

14. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Prophylaxe und Behandlung arterieller und venöser thrombotischer Zustände, dadurch gekennzeichnet, daß sie wirksame Mengen an gemäß Anspruch 7 erhaltenen Oligosacchariden und geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger oder Hilfsstoffe enthalten.