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Diese
Erfindung betrifft Polysaccharide mit aufgepfropften Antioxidantien
und vorzugsweise Hyaluronsäure
oder vernetzte Hyaluronsäure
mit aufgepfropften gehinderten Phenolen.
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Die
Synovialflüssigkeit,
die in den Gelenken von Säugern
gefunden wird, wirkt als Schmiermittel und Stossdämpfer. Die
wichtigste Komponente der Synovialflüssigkeit ist Natriumhyaluronat,
welches den grössten Beitrag
zu den mechanischen Eigenschaften der Flüssigkeit leistet. Hyaluronsäure ist
ein natürlich
vorkommendes Glykosaminoglycan mit hohem Molekulargewicht, das eine
Disaccharid-Repetiereinheit von 2-Amino-2-desoxy-3-O-(β-D-glucopyranosyluronsäure)-D-glucose
besitzt. Die Disaccharide sind verknüpft und bilden so durch β1-4-glykosidische
Bindungen eine unverzweigte unvernetzte Polysaccharidkette. Zusätzlich zu ihrem
Vorkommen in Synovialflüssigkeit
tritt Hyaluronsäure
in Zellhüllen,
perizellulären
Gelen, der extrazellulären
Matrixsubstanz der Bindegewebe von Wirbeltieren, dem Glaskörper des
Auges, dem menschlichen Nabelschnurgewebe, in Hahnenkämmen und
in einigen Bakterien auf.
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Während der
Entzündung
eines Gelenks, die beispielsweise durch Osteo-oder rheumatische Arthritis verursacht
wird, verringern sich sowohl das Molekulargewicht der Hyaluronsäure als
auch ihre Konzentration. Diese Verringerung des Molekulargewichts
verringert die Fähigkeit
der Synovialflüssigkeit
als Stossdämpfer zu
wirken, und so liefert die Flüssigkeit
keinen adäquaten
Schutz für
den Knorpel des Gelenks. Darüber
hinaus reduziert die Verringerung des Molekulargewichts auch die
Viskosität
und fördert
so ein Auslaufen aus dem Gelenk. Im Fall fortgeschrittener Arthritis
wird der Knorpel weggefressen, was zu Schmerzen führt, wenn
das Gelenk in Bewegung ist (siehe z.B. "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy-16th
Edition", Seiten 1338-42).
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Einer
der Gründe
für die
Verringerung des Molekulargewichts und für die hohe Rate des Verlusts
von Natriumhyaluronat aus der Synovialhöhle ist der Abbau des Moleküls durch
Hydroxylradikale. Hydroxylradikale stammen aus zwei Quellen. Die
erste Quelle sind weisse Blutzellen, welche in die Gelenke eindringen
wenn sie entzündet
sind und Xanthinperoxidase und andere En zyme unter Bildung von Superoxidanionen,
Wasserstoffperoxid und Hypochlorit, welche beim Auseinanderbrechen
Hydroxylradikale bilden, freisetzen. Eine andere Quelle für Hydroxylradikale
ist die Reduktion von Sauerstoff durch Reduktionsmittel in Gegenwart
von Eisen. Ein häufiges
Reduktionsmittel im Körper
ist Ascorbinsäure.
Sauerstoff wird durch Eisen(II) unter Bildung des Superoxidanions
reduziert, welches dann mit Eisen(III) unter Bildung von Wasserstoffperoxid
reagiert. Wasserstoffperoxid wird zum Hydroxylradikal reduziert.
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Über die
Verwendung von Natriumhyaluronat mit recht niedrigem Molekulargewicht
als Ergänzungssynovialflüssigkeit
im Beingelenk von Rennpferden wurde berichtet (Balazs et al, J.
Equine Vet. Sci, Seiten 217-228, 1985). Die Synovialflüssigkeit
in den Gelenken von Menschen enthält jedoch Natriumhyaluronat
mit wesentlich höherem
Molekulargewicht als das von Pferden.
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Lösungen von
Natriumhyaluronat wurden auch als Ergänzungssynovialflüssigkeit
für menschliche
osteoarthritische Gelenke mittels Injektion in die Gelenke getestet.
Die Behandlung von Arthritis durch Injektion von Natriumhyaluronat
wurde von Weiss et al, Semin. Arthritis Rheum., 11, Seite 143 (1981);
Nakimi et al, J. Clin. Pharmacol. Therapy Toxicology, 20, Seite
501 (1982); Grecomoro et al, Pharmatherapeutica, 5, Seite 137 (1987)
und Briganiti et al, Clinical Trials Journal, 24, Seite 333 (1987),
offenbart. Es wurde jedoch berichtet, dass intraartikuläre Injektionen
von Natriumhyaluronatlösungen
nicht messbar verschieden von Plazebos wirken (Dahlberg et al in "Arthritis & Rheumatism", 37, Seite 521,
1994). Brown et al in Exp. Physiol. 76, Seite 125 (1991), berichteten,
dass die Halbwertszeit von Hyaluronsäure, die in ein Gelenk injiziert
wurde, nur etwa 13 Stunden beträgt.
Dahlberg, siehe oben, hat offenbart, dass eine Halbwertszeit von
13 Stunden für
einen therapeutischen Wert kurz ist. Vermutlich ist die kurze Halbwertszeit
von injizierter Hyaluronsäure
teilweise eine Folge des Abbaus durch Hydroxylradikale (J.M. McCord,
Science, 185, Seite 529, 1974).
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Diese
Erfindung betrifft neue Wege, die Beständigkeit von Polysacchariden,
insbesondere Hyaluronsäure
und Natriumhyaluronat, gegen Hydroxylradikale zu erhöhen, indem
Antioxidantien auf sie aufgepfropft werden.
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Diese
Erfindung betrifft Pfropfpolysaccharid-Zusammensetzungen, die Polysaccharid
umfassen, wobei auf mindestens eine Hydroxylgruppe des Polysaccharids
ein Antioxidans aufgepfropft ist, wie in Anspruch 1 definiert.
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Das
Polysaccharid umfasst Polysaccharid, das saure Gruppen enthält. In der
am meisten bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Polysaccharid Hyaluronsäure oder ein Salz der Hyaluronsäure; das
Antioxidans umfasst gehindertes Phenol; und die Pfropfzusammensetzung
hat wesentlich grössere
Beständigkeit
gegen Hydroxylradikale als ungepfropfte Hyaluronsäure oder
ihr Natriumsalz.
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In
einer anderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur
Behandlung der Entzündung
von Säugergelenken,
z.B. Arthritis, zur Verhinderung postoperativer Adhäsionsbildung
und zur Förderung
der Heilung chronischer Wunden, umfassend als Wirkstoff das erfindungsgemässe Polysaccharid
mit aufgepfropftem Antioxidans.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung Drug-Delivery-Systeme,
umfassend ein vernetztes, mit einem Antioxidans gepfropftes Polysaccharid.
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Die
Erfindung betrifft auch kosmetische Zusammensetzungen, umfassend
das erfindungsgemässe Pfropfpolysaccharid.
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In
einer anderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung der Entzündungen von
Säugergelenken,
z.B. Arthritis, zur Verhinderung des Auftretens postoperativer Adhäsionsbildung
und zur Förderung
der Heilung von chronischen Wunden und Geschwüren, umfassend die Injektion
oder Applikation einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung,
die als Wirkstoff das erfindungsgemässe, mit einem Antioxidans
gepfropfte Polysaccharid umfasst.
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Die
erfindungsgemässen
Zusammensetzungen umfassen Stoffe mit einer Formel, die ausgewählt ist aus
der Gruppe bestehend aus:
worin
R für das
Rückgrat
des Polysaccharids oder des vernetzten Polysaccharids, das saure
Gruppen enthält, oder
Salze davon steht, -(O)- der Rest einer Polysaccharidhydroxylgruppe
ist, R
1 Wasserstoff, C
1-20-Alkyl,
Phenyl oder substituiertes Phenyl ist, R
2 C
1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl
ist und Ar Aryl oder substituiertes Aryl ist.
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Vorzugsweise
umfassen die erfindungsgemässen
Zusammensetzungen Stoffe mit einer Formel, die ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus:
worin R für das Rückgrat eines Polysaccharids
oder vernetzten Polysaccharids, enthaltend saure Gruppen oder Salze
davon, steht, -(0)- der Rest einer Polysaccharidhydroxylgruppe ist;
R
1 Wasserstoff, C
1-20-Alkyl,
Phenyl oder substituiertes Phenyl ist; und R
2 C
1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl
ist.
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In
den Formeln (I) bis (V) wird R1 vorzugsweise
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, i-Propyl
und t-Butyl und R2 wird ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Methyl, Ethyl, i-Propyl und t-Butyl.
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Besonders
bevorzugt umfassen die Zusammensetzungen Stoffe der Formeln (I),
(II) und (IV), worin R1 und R2 t-Butyl
sind und worin das Polysaccharid Hyaluronsäure umfasst.
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Die
Polysaccharide für
die erfindungsgemässe
Verwendung, die eine saure Gruppe enthalten, schliessen Vertreter
ein, die ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Keratansulfat,
Dermatansulfat, Heparansulfat, Heparin, Carboxymethylcellulose,
Hydroxyethylcarboxymethylcellulose, Carboxymethylstärke, Pectin,
Xanthan, Alginsäure,
Polygalacturonsäure,
Polymannuronsäure,
Polyglucuronsäure
und Karrageen. Das am meisten bevorzugte ist Hyaluronsäure.
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Die
bevorzugten Salze in Übereinstimmung
mit der Erfindung umfassen Salze eines Alkali- oder Erdalkalimetalls,
von Aluminium oder Ammonium. Das am meisten bevorzugte Salz ist
ein Natriumsalz.
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Die
erfindungsgemässen
Pfropfpolysaccharide können
auch vernetzt sein. Vernetzte Polysaccharide können durch ein beliebiges Verfahren
des Standes der Technik hergestellt werden. Sakurai et al offenbaren in
US-PS 4 716 224 vernetzte
Hyaluronsäure
oder Salze davon, die durch Vernetzung von Hyaluronsäure oder ihrer
Salze mit einem polyfunktionellen Epoxid hergestellt werden. In
US-PS 4 863 907 offenbaren
Sakurai et al vernetztes Glukosaminoglycan oder Salze davon, das
durch Vernetzung eines Glukosaminoglycans oder eines Salzes davon
mit einer polyfunktionellen Epoxyverbindung hergestellt wird. Huang
et al offenbaren in EP-A2-0 507 604 ionisch ver netzte carboxylhaltige
Polysaccharide, worin das Vernetzungsmittel eine Verbindung ist,
die ein dreiwertiges Kation enthält.
Mälson
et al offenbaren in
US-PS 4 716
154 die Vernetzung von Hyaluronsäure mit bi- oder polyfunktionellen
Epoxiden oder ihrer korrespondierenden Halohydrine, Epihalohydrine
oder Halogenide, und Divinylsulfon. Mälson et al offenbaren in
US-PS 4 772 419 auch die
Vernetzung von Hyaluronsäure
mit polyfunktionellen Epoxiden. In
US-PS
4 957 744 offenbaren della Valle et al vernetzte Ester
von Hyaluronsäure,
die durch Veresterung der Carboxylgruppen von Hyaluronsäure mit
mehrwertigen Alkoholen hergestellt werden. Balazs et al offenbaren
in US-PSen 4 582 865, 4 605 691 und 4 636 524 die Vernetzung von
Hyaluronsäure
und ihrer Salze und von anderen Polysacchariden durch Reaktion mit
Divinylsulfon. In US-PSen 5 128 326 und 4 582 865 offenbaren Balazs
et al die Vernetzung von Hyaluronsäure mit Formaldehyd, Epoxiden,
Polyaziridylverbindungen und Divinylsulfon. In
US-PS 4 713 448 offenbaren Balazs et
al die chemische Modifizierung von Hyaluronsäure durch Reaktion mit Aldehyden,
wie Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal, und beschreiben die
Möglichkeit,
dass eine Vernetzung stattgefunden hat. In
US-PS 5 356 883 beschreiben Kuo et
al die Vernetzung von Hyaluronsäure
durch Reaktion mit Biscarbodiimiden.
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Ein
bevorzugtes Verfahren zur Vernetzung von Polysacchariden ist durch
ihre Reaktion mit Carbonsäure-di-
oder -polyanhydriden. Eine bevorzugte vernetzte Zusammensetzung
umfasst einen Stoff der Formel (I) von oben, wo R1 und
R2 t-Butyl sind und das Polysaccharid Hyaluronsäure oder
sein Natriumsalz ist, das durch Umsetzung mit Pyromellitsäuredianhydrid
vernetzt wurde.
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In
den Pfropfzusammensetzungen wird der Pfropflevel am einfachsten
als Zahl der Äquivalente
von Antioxidans angegeben, die pro Äquivalent der Polysaccharid-Repetiereinheit
vorliegen. Für
den erfindungsgemässen
Zweck kann der minimale Pfropflevel nur etwa 1 Äquivalent Antioxidans pro 1000 Äquivalente
der Polysaccharid-Repetiereinheiten sein. Ein bevorzugter Minimallevel
ist etwa 1 Äquivalent
pro 700 und der am meisten bevorzugte Minimallevel etwa 1 Äquivalent
pro 600 Polysaccharid-Repetiereinheiten.
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Der
maximale Pfropflevel kann so hoch wie etwa 1 Äquivalent pro 10 Äquivalente
der Polysaccharid-Repetiereinheiten sein. Ein bevorzugter Maximallevel
ist etwa 1 Äquivalent
pro 100 und der am meisten bevorzugte Maximallevel etwa 1 Äquivalent
pro 400 Polysaccharid-Repetiereinheiten.
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Wie
festgestellt wurde, hat die erfindungsgemässe Zusammensetzung mit aufgepfropftem
Antioxidans, wenn sie sich von Hyaluronsäure oder ihren Sal zen ableitet,
eine wesentlich grössere
Beständigkeit
gegen durch Hydroxylradikale verursachten Abbau als ungepfropfte
Hyaluronsäure
oder ihre Salze.
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In
Tests zum Abbau durch Hydroxylradikale wurden die Hydroxylradikale
durch Reaktion von Eisen(III)chlorid mit Ascorbinsäure erzeugt,
wie von Wong et al, Inorganic Biochemistry, 14, Seite 127 (1981), beschrieben.
In einem typischen Test betrug die Halbwertszeit der Viskosität für Hyaluronsäure 0,9
Stunden. Wenn der gleiche Test unter den gleichen Bedingungen sowohl
an vernetzten als auch unvernetzten, erfindungsgemässen Pfropfzusammensetzungen
mit Formel (I) durchgeführt
wurde, worin das Polysaccharid R Hyaluronsäure war und R1 und
R2 t-Butyl waren, reichten die Halbwertszeiten
der Viskosität
von 3 bis 48 Stunden, was ein Indiz für die wesentlich grössere Beständigkeit
der Pfropfzusammensetzungen gegen den Abbau durch Hydroxylradikale
war.
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Die
mit Antioxidans gepfropften Zusammensetzungen wurden durch Reaktion
von Polysacchariden mit hydroxylreaktiven Antioxidansderivaten hergestellt.
Die Bezeichnung "hydroxylreaktives
Antioxidansderivat" soll
ein Antioxidans bedeuten, das eine funktionelle Gruppe enthält, die
mit Hydroxylgruppen reagieren kann, die in einem Polysaccharid enthalten
sind.
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Die
bevorzugten hydroxylreaktiven Antioxidantien zur Herstellung der
erfindungsgemässen
Zusammensetzungen werden ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus:
worin
R
1 Wasserstoff, C
1-20-Alkyl,
Phenyl oder substituiertes Phenyl ist; R
2 C
1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl
ist; A -C(O)X, -C(O)OCH
2CH
2OCH
2CH
2Y, -C(O)NHCH
2CH
2CH
2Y,
-OCH
2CH
2OCH
2CH
2Y oder -CH
2Y ist; B -C(O)X, -CH
2Y
oder X ist; X Halogen, 1-Imidazol, Phenoxy, Nitrophenoxy, p-Toluolsulfonat,
Methansulfonat oder Alkyl- oder Arylcarboxylat ist; Y Halogen, p-Toluolsulfonat
oder Methansulfonat ist.
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Die
bevorzugten hydroxylreaktiven Antioxidantien umfassen hydroxylreaktive
gehinderte Phenole der Struktur (XII), worin R1 Wasserstoff, Methyl,
Ethyl, i-Propyl oder t-Butyl ist und R2 Methyl, Ethyl, i-Propyl
oder t-Butyl ist. Die Bezeichnung "gehindertes Phenol" bezieht sich auf Phenole in denen mindestens
eine Position ortho zur Hydroxylgruppe durch einen Phenyl-, substituierten
Phenyl- oder C1-20-Alkylsubstituenten besetzt
ist.
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Bevorzugte
hydroxylreaktive gehinderte Phenole der Struktur (XII) umfassen
diejenigen, worin R1 und R2 t-Butyl
sind und A -C(O)X, -CH2Y oder -C(O)OCH2CH2OCH2CH2Y ist, worin X Chlor oder 1-Imidazol und
Y Brom ist. Speziell bevorzugte hydroxylreaktive gehinderte Phenole
sind 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid,
2,6-Di-t-butyl-4-brommethylphenol, 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-2-[2-(chlorethoxy)ethoxy]ethylester und
3,5-Di-tbutyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol.
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Da
hydroxylreaktive Antioxidansderivate leicht mit Wasser reagieren,
wird ihre Reaktion mit dem Polysaccharid vorzugsweise in einem trockenen,
polaren, aprotischen Lösungsmittel
durchgeführt.
Bevorzugte Lösungsmittel
sind N-Methylpyrrolidinon, N-Ethylpyrrolidinon, N-Cyclohexylpyrrolidinon,
4-Methylmorpholin-N-oxid, Dimethylformamid, Sulfolan und Dimethylsulfoxid.
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Salze
der sauren Polysaccharide können
in den bevorzugten Lösungsmitteln
unlöslich
sein. Insbesondere ist das Natriumsalz von Hyaluronsäure nicht
löslich
in den bevorzugten Lösungsmitteln
und so ist es im allgemeinen für
den Zweck dieser Ausführungsform
zweckdienlich, das Natriumsalz zur Erhöhung der Löslichkeit in ein Tetraalkylammoniumsalz
zu überführen. Nach
der Pfropfreaktion des Tetraalkylammoniumsalzes und hydroxylreaktiven
Antioxidansderivats kann das Produkt mittels Ionenaustausch zurück in die
Natriumform überführt werden.
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Wenn
die Herstellung einer vernetzten Zusammensetzung mit aufgepfropftem
Antioxidans gewünscht ist,
kann die Vernetzungsreaktion entweder vor oder nach der Pfropfreaktion
durchgeführt
werden. Sie kann auch gleichzeitig mit der Pfropfreaktion durchgeführt werden,
in solchen Fällen,
wo die für
die Vernetzung verwendeten Lösungsmittel
die gleichen sind wie die für
die Pfropfreaktion verwendeten.
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In
der Pfropfreaktion wird das Verhältnis
des hydroxylreaktiven Antioxidansderivats zum Polysaccharid am einfachsten
bezogen auf die molaren Mengen des verwendeten Antioxidansderivats
pro Äquivalent
der Repetiereinheit in dem Polysaccharid angegeben. Für den erfindungsgemässen Zweck
kann der Minimallevel des hydroxylreaktiven Antioxidansderivats
nur etwa 1 Äqui valent
pro 1000 Äquivalente
Polysaccharid-Repetiereinheiten sein. Ein bevorzugter Minimallevel
ist etwa 1 Äquivalent
pro 700, und der am meisten bevorzugte Minimallevel etwa 1 Äquivalent
pro 600 Polysaccharid-Repetiereinheiten.
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Der
Maximallevel des hydroxylreaktiven Antioxidansderivats kann so hoch
wie etwa 1 Äquivalent
pro 10 Äquivalente
Polysaccharid-Repetiereinheiten sein. Ein bevorzugter Maximallevel
ist etwa 1 Äquivalent
pro 100 und der am meisten bevorzugte Maximallevel etwa 1 Äquivalent
pro 400 Polysaccharid-Repetiereinheiten.
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Wie
zuvor festgestellt, betrifft die Erfindung in anderen Ausführungsformen
Zusammensetzungen zur Behandlung entzündeter Gelenke von Säugern, z.B.
Arthritis, zur Verhinderung postoperativer Adhäsionen und zur Förderung
der Heilung chronischer Wunden und Geschwüre. Der Wirkstoff dieser Zusammensetzungen
umfasst die erfindungsgemässen
Polysaccharide mit aufgepfropftem Antioxidans. Die bevorzugten Polysaccharide
mit aufgepfropftem Antioxidans sind Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem
Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure
mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable
Salze davon.
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Pharmazeutisch
akzeptable Salze schliessen Salze eines Alkali- oder Erdalkalimetalls,
von Aluminium oder Ammonium ein. Das bevorzugte pharmazeutisch akzeptable
Salz ist Natrium.
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Die
erfindungsgemässen
Polysaccharid-Zusammensetzungen mit aufgepfropftem Antioxidans können zur
Verhinderung postoperativer Adhäsionen
in jedem Tier verwendet werden, das nach Operationen zur Ausbildung
ungewollter Adhäsionen
neigt. Die Zusammensetzungen werden verwendet, um die Entwicklung von
Adhäsionen
in Säugern,
vorzugsweise Menschen, zu verhindern. Sie sind nützlich bei allen Arten von
Operationen, wo es wünschenswert
ist, die Bildung postoperativer Adhäsionen zu unterdrücken, z.B.
Operationen des Abdomens, gynäkologische
Operationen, Toraxoperationen, orthopädische Operationen, neurologische Operationen
und Augenoperationen. Die bevorzugten Zusammensetzungen für diese
Verwendung sind Hyaluronsäure
mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit
aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable
Salze davon.
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Adhäsionsverhinderer
können
auf die Stelle der operativen Verletzung auf jede geeignete Weise,
wie beispielsweise durch Spülung,
durch direktes Aufbringen als Schicht in einem Gel, einer Creme,
einem Film oder Schaum oder durch jedes andere geeignete Verfahren
aufgebracht werden. Die Verabreichung von Adhäsionsverhinderern kann zu jeder
Zeit erfolgen bevor sig nifikante Wundheilung stattfindet. Vorzugsweise
wird er am Ende der Operation direkt vor dem Verschliessen der Wunde
verabreicht. In einigen Fällen
kann es jedoch gewünscht
sein, den Verhinderer kontinuierlich über einen Zeitraum zu verabreichen.
Eine wirksame Menge eines Adhäsionsverhinderers
ist eine Menge, die notwendig ist, um eine Verringerung im Auftreten postoperativer
Operationsadhäsionen
zu bewirken. Vorzugsweise sollte die Menge ausreichen, um die gesamte
der operativen Verletzung ausgesetzte Fläche zu bedecken und gewünschtenfalls
wird eine zusätzliche Menge
verwendet, die ausreicht, um das an die Fläche der Verletzung angrenzende
Körpergewebe
zu bedecken.
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Die
erfindungsgemässen
Polysaccharid-Zusammensetzungen mit aufgepfropftem Antioxidans können auch
verwendet werden, um die Heilung chronischer Wunden, z.B. Verbrennungen,
und Geschwüre,
z.B. Diabetes-Fussgeschwüre
bei Säugern,
insbesondere Menschen, zu fördern.
Die bevorzugten Zusammensetzungen für diese Verwendung sind Hyaluronsäure mit
aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit
aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable
Salze davon. Hyaluronsäure
hält Feuchtigkeit
zurück
und besitzt ausserdem Gefässbildungseigenschaften,
die es für
diese Anwendung nützlich
machen. Wenn sie für
die Wundheilung verwendet werden, können die Zusammensetzungen
allein in wässriger
Lösung,
vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung, verwendet werden oder
die Lösungen
können
mit Arzneimitteln für
die Wundheilung und anderen wasserlöslichen Polymeren kombiniert
werden. Sie können
auf die Stelle der Wunde oder des Geschwürs auf jede geeignete Weise,
z.B. durch Spülung, durch
direktes Aufbringen auf die Stelle als Schicht in einem Gel, einer
Creme, einem Film oder Schaum, durch Imprägnierung in einer Bandage oder
einem Wundverband, die/der auf die Wunde oder das Geschwür angelegt
wird, oder durch jedes andere geeignete Verfahren aufgebracht werden.
Eine wirksame Menge zur Förderung
der Heilung reicht aus, um die gesamte Fläche der Wunde oder des Geschwürs zu bedecken
und gewünschtenfalls
wird eine zusätzliche
Menge zugesetzt, die ausreicht, um an die wunde oder das Geschwür angrenzendes
Körpergewebe
zu bedecken. Ein typisches Polysaccharid mit aufgepfropftem Antioxidans
kann als andere Bestandteile wasserlösliche Polymere, Antibiotika,
Immunosuppressiva und Schmerzmittel enthalten.
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Bei
der Anwendung der erfindungsgemässen
gepfropften Hyaluronsäure
oder vernetzten gepfropften Hyaluronsäure für die Behandlung entzündeter Gelenke,
z.B. Arthritis, bei Säugern,
insbesondere Menschen, wird das Hyaluronsäurederivat üblicherweise in physiologischer
Kochsalzlösung
bis zu einer Viskosität
aufgelöst,
die ausreicht, um eine Injektionsnadel passieren zu können. Die
maximale Viskosität
ist etwa 50.000 cps, vorzugsweise etwa 30.000 cps. Die minimale
Viskosität
ist etwa 5.000 cps. Die Behandlungslösung wird dann in das erkrankte
Gelenk injiziert.
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Ein
typisches Injektionsverfahren für
Ergänzungssynovialflüssigkeit
in das Kniegelenk ist dem von Miller et al in J. Bone and Joint
Surgery, 40, Seite 636 (1985), beschriebenen ähnlich. In diesem Verfahren
werden 2,5 ml einer sterilen Lösung
des Natriumsalzes der Hyaluronsäure
mit aufgepfropftem Antioxidans (Konzentration der gepfropften Hyaluronsäure: 10
mg/ml) in gepufferter Kochsalzlösung
(Natriumchlorid 8,5 mg/ml, dibasisches Natriumphosphat 0,537 mg/ml,
Natriumdihydrogenphosphat 0,016 mg/ml) langsam in eine Spritze gezogen,
um die Abwesenheit von Lufteinschlüssen sicherzustellen. Das Knie
wird dann durch Reinigung mit Seife, Abwischen mit Cetyltrimethylammoniumbromid
und Aufpinseln von Iodtinktur für
die Injektion vorbereitet. Durch einen vorher markierten dreieckförmigen Bogen
an der lateralen Seite des Gelenks, der durch das Tibialplateau,
den Rand des Bandes der Kniescheibe (ligamentum patellae) und die
Krümmung
des lateralen femoralen Gelenkkopfes eingefasst ist, wird die Lösung in
eine Synovialhöhle
injiziert. Lokalanästhesie
kann vor der Injektion angewendet werden. In bestimmten Fällen kann
vor der Ergänzungsinjektion
mit Synovialflüssigkeit
die Punktion des Knies mit der gepufferten Kochsalzlösung notwendig
sein. Ein derartiges Verfahren wird von Dahlberg et al in Arthritis & Rheumatism, 37,
1994, Seite 521, beschrieben.
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Die
injizierbare Lösung
kann zusätzlich
zur Pfropfzusammensetzung weitere Stoffe enthalten. Diese schliessen
wasserlösliche
Polymere, wie Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und/oder ein Phospholipid
zur Verbesserung der Schmierfähigkeit
der Lösung
ein. Anästhetika,
entzündungshemmende
Mittel, Antibiotika, antibakterielle Mittel, Cytotoxine und Zucker
können
ebenso zugesetzt werden.
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Die
erfindungsgemässen
Polysaccharide mit aufgepfropftem Antioxidans können insbesondere in der vernetzten
Form als Drug-Delivery-System verwendet werden. Die bevorzugten
Zusammensetzungen für
diese Verwendung sind Hyaluronsäure
mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit aufgepfropftem
gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon. Vernetzte
Hyaluronsäure bildet
einen molekularen Käfig,
in dem Moleküle
mit pharmakologischer Aktivität
dispergiert werden können. Die
im Käfig
enthaltenen Substanzen werden durch Diffusion in die Umgebung freigesetzt.
Das Wirkstoffmolekül
oder die Mischung der Wirkstoffmoleküle kann kovalent oder nicht-kovalent
an die Hyaluronsäure
gebunden sein. Die kovalente Bindung kann durch Anbindung an die
Carbonsäure-
oder Hydroxylgruppen der Hyaluronsäureeinheiten erfolgen. Die
Gele, Filme, Fäden,
Partikel oder Schwämme
der Zusammensetzung auf Hyaluronsäurebasis können plaziert, aufgesprüht, mit
der Nahrung aufgenommen, injiziert oder implantiert werden an die
Stelle, wo die enthaltene pharmakologische Substanz gebraucht wird.
Diese Substanzen können
therapeutische Arzneimittel (wie Anästhetika, Analgetika, entzündungshemmende
Mittel, Diuretika, Antagonisten, Antibiotika, Hormone, Antirheumatika,
adrenergische Antagonisten, Cytostatika, Antihypertonika oder Immunosuppressiva),
Wachstumsfaktoren, Enzyme oder Verbindungen gegen die zelluläre Adhäsion sein.
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Erfindungsgemässe Polysaccharide
mit aufgepfropftem Antioxidans können
auch als Komponenten von Kosmetika für topische Verwendungen fungieren.
Die bevorzugten Zusammensetzungen für diese Verwendung sind Hyaluronsäure mit
aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit
aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable
Salze davon. Da gezeigt wurde, dass Hyaluronsäure unter den Bedingungen einer
niedrigen relativen Luftfeuchtigkeit Feuchtigkeit speichern kann
und bei hoher relativer Luftfeuchtigkeit ein angenehmes und weiches
Gefühl
ergibt, wird sie als Feuchthaltemittel in kosmetischen Formulierungen
verwendet. Die erfindungsgemässen
Zusammensetzungen erreichen ähnliche
Effekte. Mischungen der gepfropften Hyaluronsäure-Zusammensetzungen mit anderen
preiswerten wasserlöslichen
Polymeren, wie Carboxymethylcellulose, Pectin, Alginat, Sojaprotein,
Casein und Gelatine, können
ebenso verwendet werden.
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Natürliche Extrakte
aus Pflanzenquellen, wie Kaktus Aloe Vera, Mesquitebaum, Matricaria
chamomilla, Gelbwurz, Karotte, Simmondsia chinensis ("jojoba"), Rose und anderen
können
einer kosmetischen Formulierung, die gepfropfte Hyaluronsäure enthält, zugemischt
werden. α-Hydroxysäuren, wie
Milch- und Hydroxyethansäure,
können
der Formulierung zugesetzt werden, um die Plastizität der Haut
zu verbessern.
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Eine
typische kosmetische Zusammensetzung gegen die Alterung ist: 7 2-Hydroxyethansäure, 15
% Propylenglykol, 1 % Hyaluronsäurelösung mit
aufgepfropftem gehindertem Phenol (1 g/100 ml), 60 % Wasser und
17 % Ethylalkohol, wobei alle Prozentangaben gewichtsbezogen sind.
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Eine
Formulierung für
ein Gesichtssoftgel ist: 25 % wässrige
Aufschlämmung
von Carboxymethylcellulose (3 g/100 ml), 11 % wässrige Triethanolaminlösung (10
g/100 ml), 5 % Methyl Gluceth-10, 1 % wässrige Hyaluronsäurelösung mit
aufgepfropftem gehindertem Phenol (1 g/100 ml), 1 % Parfüm und Konservierungsmittel,
57 % Wasser, wobei alle Prozentangaben gewichtsbezogen sind.
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Eine
typische essentielle Hautfeuchtigkeitszusammensetzung ist 0,5 %
Hydroxyethylcellulose, 2 % Methyl Gluceth-10, 2 % Glycerin, 1 %
wässrige
Hyaluronsäurelösung mit
aufgepfropftem gehindertem Phenol (1 g/100 ml), 94 % Wasser, 0,5
% Konservierungsmittel und Parfüm,
wobei alle Prozentangaben gewichtsbezogen sind.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, welche zum Zweck der
Darstellung gegeben werden und nicht als den erfindungsgemässen Bereich
begrenzend angesehen werden sollen. Alle Teile und Prozentangaben
in den Beispielen sind gewichtsbezogen wenn nicht anders angegeben.
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BEISPIEL 1
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Synthese von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid
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Eine
Mischung von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure (4 g), 20 ml Hexan und
20 ml Thionylchlorid wurde 4,5 Stunden lang gekocht. Das Lösungsmittel
und überschüssiges Thionylchlorid
wurden durch Destillation entfernt, wobei ein Feststoff zurückblieb,
der ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Um die Identität des Säurechlorids
zu bestätigen,
wurde eine kleine Probe mit einem Überschuss an wasserfreiem Ethanol
und Triethylamin gequencht. Die gequenchte Probe wurde mit Wasser
und Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels
wurde ein Öl
erhalten. Das 1H-NMR-Spektrum (CDC13, ppm bezogen auf TMS) bestätigte, dass
das Öl
der korrespondierende Ester war: 7,9 ppm (s, Ar, 2), 5,25 ppm (s,
OH, 1), 4,3 ppm (q, CH3, 18) und 1,44 ppm
(t, CH3, 3). Dieses Ergebnis bestätigt, dass
sich 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid gebildet hatte.
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BEISPIEL 2
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Synthese von 2,6-Di-t-butyl-4-brommethylphenol
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Eine
Mischung von 1 g 2,6-Di-t-butyl-4-methylphenol, 0,9 g N-Bromsuccinimid
und 40 ml Tetrachlorkohlenstoff wurde 1,5 Stunden lang gekocht.
Succinimid wurde durch Filtration entfernt und die erhaltene organische
Lösung
verdampft, wobei eine viskose Flüssigkeit
mit dem folgenden 1H-NMR-Spektrum
(CDC13, ppm bezogen auf TMS) erhalten wurde: 7,05 ppm (s, ArH, 2),
5,15 ppm (s, OH, 1), 4,35 ppm, (s, CH2Br,
2) und 1,3 ppm (s, CH3, 18).
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BEISPIEL 3
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Synthese von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-2-[2-(2-chlorethoxy)-ethoxy]ethylester
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In
einem mit einer Dean-Stark-Falle ausgerüsteten 250 ml-Kolben wurde
eine Mischung von 5 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure, 3,7
g 2-[2-(2- Chlorethoxy)ethoxy]ethanol,
0,1 g p-Toluolsulfonsäure
und 60 ml Toluol 4 Tage lang zum Sieden erhitzt. Die resultierende
Mischung wurde mit Wasser und Methylenchlorid extrahiert und dann
die Methylenchloridlösung über MgSO4 getrocknet. Verdampfen des Lösungsmittels
ergab 6,97 g des Esters mit dem folgenden 1H-NMR-Spektrum
(CDCl3, ppm bezogen auf TMS): 7,9 ppm (s,
ArH, 2), 5,72 ppm (s, OH, 1), 5,45 ppm (m, CH2,
2), 3,86 ppm (m, CH2, 2), 3,7 ppm (m, CH2, 6), 3,6 ppm (m, CH2, 2)
und 2,45 ppm (s, CH3, 18).
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BEISPIEL 4
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Synthese von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol
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Eine
Mischung von 1 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure, 0,7 g 1,1'-Dicarbonyldiimidazol
und 50 ml Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur 17 Stunden lang
zusammen gerührt.
Nach Entfernen des Lösungsmittels
wurde das Produkt aus Toluol und Hexan umkristallisiert und so ein
hygroskopischer Feststoff erhalten. Eine kleine Probe des Feststoffs
wurde mit 0,2 g Ethanol und 2 ml Methylenchlorid vermischt und 10 Stunden
stehen gelassen. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde wie in Beispiel
1 nur der korrespondierende Ethylester durch 1H-NMR
identifiziert. Dieses Ergebnis zeigt, dass sich 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol
gebildet hatte.
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BEISPIEL 5
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Herstellung des Methyltricaprylammoniumsalzes
von Hyaluronsäure
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Zu
einer Lösung
von 10 g Natriumhyaluronat (Fermentationsprodukt, Chisso Corporation,
Chiba, Japan) in 1000 ml Wasser wurde eine Lösung von 50 g Methyltricaprylammoniumchlorid
(Aliquat 336, Aldrich Chemical, Milwaukee, Wisconsin) in 50 ml Aceton
gegeben. Die Mischung wurde über
Nacht gerührt
und dann der gummiartige Niederschlag abfiltriert, mit Wasser und
Aceton gewaschen und danach über
Nacht im Vakuum getrocknet. Er wurde erneut in 500 ml Aceton 7 Stunden
lang getränkt, über Nacht
im Vakuum getrocknet und so 46,9 g eines gummiartigen Stoffs erhalten.
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BEISPIEL 6
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Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid
auf Hyaluronsäure
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Zu
einer Lösung
von 10 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt
nach dem Verfahren von Beispiel 5) in 1000 ml trockenem N-Methylpyrrolidinon
(NMP) wurden 0,4 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid (Beispiel
1) gegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang geschüttelt und
dann 16 Stunden lang bei 10°C
aufbewahrt. Für
den Ionenaustausch zurück
zum Natriumsalz wurde hierauf eine wässrige Lösung von NaCl (15 g in 250
ml Wasser) der Reaktionsmischung zugesetzt. Nach 1-ständigem Rühren der
erhaltenen Lösung
wurden 3 g Natriumbicarbonat und 200 ml Aceton zugesetzt, um das
Produkt auszufällen.
Das Polymer wurde filtriert und 5 mal mit Aceton/Wasser (Verhältnis 4:1,
200 ml) und dann mit 100 ml Aceton gewaschen . Das Produkt wurde
weiter gereinigt, indem es in 1 l Wasser wieder aufgelöst und dann in
einem grossen Volumen von Methanol ausgefällt wurde. 5 g Produkt wurden
erhalten.
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BEISPIEL 7
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Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol
auf Hyaluronsäure
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Zu
einer Lösung
von 2 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt
nach dem Verfahren von Beispiel 5) in 280 ml NMP wurden 0,25 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol
(Beispiel 4) gegeben. Die Mischung wurde 20 Stunden lang bei 45°C gehalten
und dann mittels Ionenaustausch zurück in die Natriumsalzform überführt, wie
in Beispiel 6 beschrieben. Das Gewicht des Produkts betrug 0,92 g.
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BEISPIEL 8
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Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid
auf mit dem Diglycidylether von Bisphenol A vernetzter Hyaluronsäure
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Zuerst
wurde die Vernetzungsreaktion durchgeführt, indem 2 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von
Hyaluronsäure
(hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 5), 0,2 g Diglycidylether
von Bisphenol A und 280 ml NMP gemischt wurden und die Mischung
für 24
Stunden bei 45°C
gehalten wurde. Zu dieser Mischung wurden hierauf 0,2 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid
gegeben und dann die gesamte Reaktionsmischung für 17 Stunden bei Raumtemperatur
gehalten. Das Produkt wurde in das Natriumsalz überführt und aufgearbeitet wie für Beispiel
6 beschrieben.
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BEISPIEL 9
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Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid
auf mit 1,2,4,5-Benzoltetracarbonsäuredianhydrid vernetzter Hyaluronsäure
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Zu
einer Lösung
von 5 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt
nach dem Verfahren von Beispiel 5) in 700 ml NMP wurden 0,5 g 1,2,4,5-Benzoltetracarbonsäuredianhydrid
gegeben. Die Mischung wurde für
7 Tage bei 10°C
gehalten. Triethylamin (1 ml) und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid (0,5 g) wurden
dann der Reaktionsmischung zugesetzt. Nach 16 Stunden wurde das
Produkt mit einer Lösung
von NaCl (0,5 g) und NaHCO3 (0,5 g) in 50
ml Wasser ionenausgetauscht und hierauf durch Zusatz von 400 ml
Aceton ausgefällt.
Das Produkt wurde filtriert und mit 4:1 Aceton/Wasser und danach
reinem Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen wurden 2,9 g des Polymers
erhalten.
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BEISPIEL 10
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Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-2-[2-(2-chlorethoxy)-ethoxy]ethylester
auf Hyaluronsäure
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Eine
Mischung von 2 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt
nach dem Verfahren von Beispiel 5) und 0,25 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-2-[2-(2-chlorethoxy)ethoxy]ethylester
in 280 ml NMP wurde für
20 Stunden bei 45°C
gehalten. Die Mischung wurde mit einer Lösung von 0,1 g NaCl und 0,1
g NaHCO3 in 20 ml Wasser behandelt und wie
in Beispiel 9 aufgearbeitet. Nach dem Trocknen wurden 1,0 g eines
Polymers erhalten.
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BEISPIEL 11
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Beständigkeit der gepfropften Hyaluronsäure gegen
Abbau durch Hydroxylradikale
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Hydroxylradikale
wurden durch die Reaktion von Eisen(III)ionen mit Ascorbinsäure erzeugt,
wie von Wong et al, Inorganic Biochemistry, 14, Seite 127 (1981),
beschrieben.
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Zu
100 ml einer wässrigen
Lösung
des Natriumsalzes von Hyalunorat mit aufgepfropftem gehindertem Phenol
(0,3 bis 0,6 % Gew./Vol. wie angegeben, gepuffert bei pH 7,4) wurden
0,25 ml einer Eisen(III)chlorid-Lösung (1,1 g in 20 ml Wasser)
und 0,25 ml einer Ascorbinsäurelösung (0,64
g in 20 ml Wasser) gegeben. Die Mischung wurde etwa 10 Sekunden
geschüttelt
und hierauf wurde nach 10 Minuten die erste Viskosität (Brookfield)
gemessen. Es wurde angenommen, dass die Viskosität an diesem Punkt 100 % betrug.
Die Beständigkeit
der Probe gegen Abbau wurde beurteilt, indem die Zeit gemessen wurde,
die zur Verringerung der Viskosität auf 50 % des 10 Minuten-Wertes (Viskositäts-Halbwertszeit)
erforderlich war. Die Kontrolle bestand aus Natriumhyaluronat. Die
Resultate sind in Tabelle 1 angegeben.
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